CN103289942A - 一种抗氧化的动物双歧杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种抗氧化动物双歧杆菌菌株，其保藏编号为CCTCC NO: M 2013282。本发明的动物双歧杆菌可用于制备药品、食品或保健品。本发明的动物双歧杆菌可以显著提高机体内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的酶活性，降低机体内丙二醛的水平，从而有效提高机体的抗氧化能力，增强机体的免疫力，可以广泛应用于药品、食品或保健品中。

Description

一种抗氧化的动物双歧杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，特别是涉及一种抗氧化的动物双歧杆菌及其应用。

背景技术

自由基是人体正常的代谢产物，正常情况下人体内自由基是处于不断产生与清除的动态平衡中。少量的自由基不但对人体不构成威胁，而且可以促进细胞增殖，刺激白细胞和吞噬细胞杀灭细菌、消除炎症、分解毒物；但如果人体内自由基的数量过多、就会破坏细胞结构，引起脂质过氧化，干扰人体的正常代谢活动，引起疾病，加速人体衰老进程。

自由基几乎和人类的大部分常见疾病都有关系，如对人类健康和生命威胁甚大的心血管疾病、癌症、艾滋病，都与氧自由基有密切关系。人类的神经系统疾病（早老性痴呆症、震颤麻痹症等），循环系统疾病（动脉粥样硬化，血栓等），以及肝炎、糖尿病、眼病等疾病的发生，均有自由基的参与。

乳酸菌是一大类能够发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称，大多数不运动，少数以周毛运动。乳酸菌属于化能异养型革兰氏阳性菌，有微好氧菌和专性厌氧菌。乳酸菌具有调节肠道菌群，增强免疫力，降低血清胆固醇、降血压，防癌抗癌众多益生功效。近些年来，也有相关研究表明乳酸菌可以清除自由基，改善肠道菌群达到抗氧化的功效。但目前还没有耐过氧化氢能力强、清除自由基效果好的抗氧化动物双歧杆菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗氧化动物双歧杆菌菌株，以及该菌株在制备药品、食品或保健品中的用途，从而弥补现有技术的不足。

本发明一个方面提供一种具有抗氧化能力的动物双歧杆菌YJM-Bi01（Bifidobacterium animalis YJM-Bi01），已于2013年06月24日保存于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2013282。

本发明的动物双歧杆菌可用于制备药品、食品或保健品。

本发明另一方面提供一种食品或保健品、药品，它含有有效剂量的动物双歧杆菌，以及食品、保健食品、药品上可接受的载体或赋形剂。

所述的动物双歧杆菌为菌粉形态，是将含动物双歧杆菌的菌液通过冻干处理所得到的冻干粉，或采用其它方法处理得到的粉剂。

所述的载体或赋形剂是一种或多种选自在药品或食品制备中通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸收载体、润滑剂或矫味剂的载体，例如填充剂如淀粉、蔗糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物和明胶；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素、琼脂和碳酸钙；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇、十二烷基硫酸钠；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、微粉硅胶和聚乙二醇；其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

所述组合物中动物双歧杆菌的活菌数为1.0×10⁵cfu/g~1.0×10⁸cfu/g。

所述组合物的形态为粉剂、颗粒剂、胶囊剂或片剂。

本发明的动物双歧杆菌可以显著提高机体内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的酶活性，降低机体内丙二醛的水平，从而有效提高机体的抗氧化能力，增强机体的免疫力，可以广泛应用于药品、食品或保健品中。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或者修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明实施例中选用的培养基配方如下：

BBL选择性培养基：

蛋白胨 15.0g；酵母粉 2.0g；葡萄糖 20.0g；可溶性淀粉 0.5g；氯化钠 5.0g；5%半胱氨酸 10.0mL；西红柿浸出液 400.0mL；吐温80 1.0mL；肝提取液 80.0mL；琼脂 20.0g；蒸馏水 520.0mL；pH7.0。

MRS液体培养基：

蛋白胨 10.0 g；牛肉膏 10.0 g；酵母膏 5.0 g；柠檬酸氢二铵 2.0 g；葡萄糖20.0 g；吐温80 1.0 Ml；乙酸钠 5.0 g；磷酸氢二钾 2.0 g；硫酸镁 0.58 g；硫酸锰0.25 g；蒸馏水1 000 mL；pH 6.2-6.6。

实施例1动物双歧杆菌的筛选与鉴定

采集母乳喂养的健康婴儿新鲜粪便中后段，以无菌玻璃棒将粪便捣碎，加入10倍重量PBS缓冲液，剧烈震荡30min，2000g离心5min，收集上清液；将上清液5000g离心10min，收集沉淀；用PBS缓冲液反复洗涤沉淀2次；加少量PBS缓冲液充分悬浮沉淀；将悬浮液涂布于BBL选择性培养基，37℃厌氧培养48h；挑起菌落大、生长快的菌株，进一步划线纯化。

将分离得到的一株菌命名为YJM-Bi01。该菌株为多形态杆菌，呈Y字形、V字形、弯曲状、刮勺状，其典型的形态特征是具有分叉的杆菌；菌落光滑，凸圆，边缘完整，乳脂呈白色，闪光并有柔软质地。从下表所述生理生化鉴定结果初步鉴定该菌为动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）。

YJM-Bi01菌株生理生化特性鉴定结果

同时采用PCR扩增该菌16S rRNA序列，进行比对分析，鉴定为动物双歧杆菌，命名为动物双歧杆菌YJM-Bi01（Bifidobacterium animalis YJM-Bi01），并于2013年6月24日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2013282。

实施例2 动物双歧杆菌YJM-Bi01耐酸、耐胆盐实验

2.1 耐酸实验

将MRS液体培养基的pH值分别调整为2.0、3.0、4.0；121℃灭菌15min；将活化的动物双歧杆菌按照2%接种量接种到已冷却的培养基中，置于37℃恒温培养箱培养，分别于0h、1h、2h时取样，平板计数测定活菌数，结果见表1。

表1：动物双歧杆菌耐酸性实验

从表1可以看出，本发明的动物双歧杆菌在pH2.0的MRS培养基中培养1h后，活菌率高达86.75%，从而说明该菌株具有较强的耐酸能力，能够有效抵抗胃液的。

2.2 耐胆汁盐实验

微生物对于胆盐的抗性是其能够在肠道存活、生长并发挥功效的先决条件之一。胆盐对菌株的抑制作用取决于胆盐的浓度和菌株本身的特性，不同消化道部位胆盐的含量不同，人体小肠中胆盐含量在 0.03％~0.3％之间波动。能够在正常生理胆盐浓度中生长和代谢的菌株才可能在肠道中存活。

在MRS液体培养基中加入牛胆汁粉，使其质量分数分别为0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，按照2%接种量接种本发明的动物双歧杆菌，37℃厌氧培养，以溴甲酚紫为指示剂，观察培养基颜色变化，结果见表2。

原理：双歧杆菌产酸，会导致培养基pH值下降，指示剂将由紫色变为黄色。

表2：动物双歧杆菌耐胆盐实验

胆盐浓度（%）	生长情况
		0.0	++
0.1	++
		0.2	+
0.3	+
		0.4	-
0.5	-

注：++为培养基在24h之内变色，+为在48h之内变色，-为培养基不变色

从表2可以看出，本发明的动物双歧杆菌在胆盐浓度为0.3%的环境中仍能存活，并生长良好，使培养基在48小时内变色，从而说明该菌株对胆盐具有很强的耐受性，能够在小肠环境中有效定殖。

实施例3 动物双歧杆菌YJM-Bi01体外抗氧化实验

将动物双歧杆菌活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h；将培养液4000r/min离心10min，分离得到上清液，即为无细胞抽提物；将菌体沉淀用PBS洗涤两次，再将菌体重悬，调整菌体浓度约为10⁹cfu/mL；所得菌悬液分为两组，一组作为菌体活细胞，另一组超声粉碎10min，显微镜下检查没有完整菌体，然后4℃、6000r/min离心10min，收集上清液，即为细胞裂解液。

3.1动物双歧杆菌清除 DPPH·自由基能力的测定

取上述无细胞抽提物、细胞裂解液和菌体活细胞各2mL，分别加入0.2mmol/L DPPH·无水乙醇溶液各1mL，混匀后在室温下避光反应30min，6000r/min离心10min，取上清液在517nm测定吸光度Ai，平行测3次，取其平均值。空白组以等体积无水乙醇代替DPPH·溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零。实验结果见表3。

清除率按下式计算：清除率=[1-（Ai-Aj）]÷A0×100%

其中: A0为对照组吸光度，Ai为样品组吸光度，Aj为空白组吸光度。

表3 动物双歧杆菌DPPH·自由基清除率

样品	DPPH·自由基清除率
		无细胞抽提物	85%
细胞裂解液	40%
		菌体活细胞	30%

从表3可以看出，本发明的动物双歧杆菌能有效清除DPPH·自由基，其中该菌的无细胞抽提物对自由基的清除能力最强，清除率高达85%，细胞裂解液次之。

3.2铁离子螯合试验

分别量取上述无细胞抽提物、细胞裂解液和菌体活细胞0 ml、0.25ml、0.5 ml、0.75 ml、1.0ml，用PBS缓冲液补足至1ml；各加入2ml质量体积比为0.2%的硫酸亚铁溶液，37℃反应30min；再各加入0.5ml 0.3%邻二氮菲，37℃反应10min；离心取上清，测定510nm处吸光值。以1% 的螯合剂EDTA 作为阳性对照，实验结果见表4。

Fe²⁺螯合率(%)=[1－A_510(样品)/A_510(空白)]×100

式中，A_510(样品)为加样品组反应后的吸光值；A_510(空白)为空白对照组反应后的吸光值。

表4 动物双歧杆菌对亚铁离子的螯合率

样品	对亚铁离子的螯合率
		无细胞抽提物	25%
细胞裂解液	33%
		菌体活细胞	54%

从表4可以看出，本发明的动物双歧杆菌对亚铁离子具有很强的螯合能力，其中该菌的菌体活细胞螯合能力最强，螯合率高达54%，细胞裂解液次之。

实施例4 体内抗氧化动物实验

4.1 实验设计

体内抗氧化功能实验采用高脂氧化应激模型。实验动物使用健康昆明种小鼠40只，雌雄各半，体重23士2g，由江苏无锡惠山江南实验动物场提供。小鼠在室温下饲养，自由采食饮水，经3d的适应性饲养后，随机分成4组，每组10只，饲喂基础饲料（配方：89.5%普通饲料、10%猪油、0.5%胆固醇），对照组每日灌胃0.2mL生理盐水，其余三组分低中高三剂量灌胃不同浓度动物双歧杆菌，如表5所示，每日0.2mL/只，连续4周。末次给样后禁食24h，迅速采集血液，分离红细胞和血清，检测红细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性、全血谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、血浆过氧化氢酶（CAT）活性、血浆丙二醛（MDA）含量，所有数据均用统计软件SPSS进行统计学处理。试剂盒购于南京建成生物工程公司。

表5 抗氧化功能评价的动物实验

组别	饲喂方式
		对照组	0.2ml生理盐水/只+基础饲料
低剂量	0.2ml菌液（细胞浓度0.01g/ml）/只+高脂饲料
		中剂量	0.2ml菌液（细胞浓度0.02g/ml）/只+高脂饲料
高剂量	0.2ml菌液（细胞浓度0.04g/ml）/只+高脂饲料

4.2 结果分析

4.2.1超氧化物歧化酶（SOD）

超氧化物歧化酶（SOD），是具有专一清除生物体内的超氧离子，能平衡机体的氧自由基。它可以清除过度超氧阴离子自由基，减少由超氧阴离子自由基产生的疾病。本发明中灌胃动物双歧杆菌对小鼠红细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响见表6。

表6 动物双歧杆菌对小鼠红细胞SOD活力影响

组别	SOD活性（U/mgHb）
		对照组	219.72±1.52
低剂量	234.58±2.01
		中剂量	256.65±2.56*
高剂量	296.84±1.87*

*P＜0.05

从表6可以看出，相对于对照组，中剂量和高剂量小鼠的红细胞SOD酶活力存在显著性差异，酶活力得到较大提高，从而说明本发明的动物双歧杆菌能显著提高SOD酶活力，具有较强的抗氧化能力。

4.2.2谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构和功能的作用。灌胃动物双歧杆菌对小鼠红细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响见表7。

表7 动物双歧杆菌对小鼠红细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力影响

组别	GSH-Px（酶活力单位）
		对照组	130.26±0.87
低剂量	143.21±2.43
		中剂量	165.48±3.02*
高剂量	182.97±2.45*

*P＜0.05

从表7可以看出，高剂量组小鼠红细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力高达182.97，比对照组高50，从而说明本发明的动物双歧杆菌可以显著提高小鼠红细胞谷胱甘肽过氧化物酶的活力。

4.2.3过氧化氢酶

过氧化氢酶在机体内普遍存在，催化过氧化氢分解为水和氧气。过氧化氢是机体代谢的有毒副产物，经过过氧化氢酶催化转化成其它低毒的化学物，防止机体受到损伤。灌胃动物双歧杆菌对小鼠过氧化氢酶活性影响见表8。

表8 灌胃动物双歧杆菌对小鼠过氧化氢酶活性影响

组别	CAT活性（U/ml）
		对照组	1.67±1.23
低剂量	1.86±2.01
		中剂量	2.52±3.21*
高剂量	2.86±2.67*

*P＜0.05

从表8可以看出，只有中剂量组和高剂量组与对照组存在显著性差异。相对于对照组，高剂量组过氧化氢酶的活性提高了71.2%，从而说明本发明的动物双歧杆菌能显著提高小鼠机体内过氧化氢酶的活性，高剂量的动物双歧杆菌可以有效改善小鼠的抗氧化能力。

4.2.4 丙二醛

丙二醛水平反应了机体内脂质过氧化，间接地反映出细胞损伤的程度。灌胃动物双歧杆菌对小鼠红细胞丙二醛水平的影响见表9。

表9 灌胃动物双歧杆菌对小鼠红细胞丙二醛水平影响

组别	丙二醛含量（nmol/ml）
		对照组	3.42±1.51
低剂量	3.02±1.83
		中剂量	2.84±0.76
高剂量	1.69±2.12*

*P＜0.05

从表9可以看出，高剂量动物双歧杆菌能显著降低小鼠红细胞内丙二醛的含量，从而说明本发明的动物双歧杆菌可以有效减轻小鼠体内自由基对细胞的损伤，保护小鼠的正常细胞。

综上所述，本发明提供的动物双歧杆菌可以显著提高高脂氧化模型小鼠体内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的酶活性，降低机体内丙二醛的水平，从而有效提高小鼠的抗氧化能力。

本发明的动物双歧杆菌可以广泛应用于药品、食品或保健品中，用于提高机体的抗氧化能力，增强机体的免疫力。

Claims (8)

1.一种动物双歧杆菌，其保藏编号为CCTCC NO: M2013282。

2.权利要求1所述的动物双歧杆菌在药品、食品或保健品制备中的应用。

3.一种组合物，所述的组合物包含有有效剂量的权利要求1所述的动物双歧杆菌的活菌，以及食品、保健食品、药品上可接受的载体或赋形剂。

4.权利要求3所述的组合物为食品、保健品或药品。

5.如权利要求3所述的组合物，其特征在于所述的动物双歧杆菌的形态为菌粉。

6.如权利要求3所述的组合物，其特征在于所述载体或赋形剂是一种或多种在药品或食品制备中使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸收载体、润滑剂或矫味剂的载体。

7.如权利要求3所述的组合物，其特征在于所述组合物中动物双歧杆菌的活菌数为1.0×10⁵cfu/g~1.0×10⁸cfu/g。

8.权利要求3所述的组合物的形态为粉剂、颗粒剂、胶囊剂或片剂。