CN103266077B - 太空诱变高效长双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法 - Google Patents
太空诱变高效长双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103266077B CN103266077B CN201310228827.3A CN201310228827A CN103266077B CN 103266077 B CN103266077 B CN 103266077B CN 201310228827 A CN201310228827 A CN 201310228827A CN 103266077 B CN103266077 B CN 103266077B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- longum
- bifidus
- bifidobacterium longum
- application
- efficient
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明涉及太空诱变高效长双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法。双歧杆菌是一种严格的厌氧菌，其活菌制剂生产较困难，且由于活菌对酸、碱、热均敏感，使得保存和口服易致失活。本发明提供了一株长双歧杆菌（Bifidobacteriumlongum）S7-T6，可应用于制备调节肠道菌群平衡、治疗腹泻的药物和保健品。本发明所述长双歧杆菌耐氧特性、耐盐特性增强，可稳定遗传至30代无退化；能够在含量为6%NaCl的培养条件下生长；甲基红实验和VP实验呈阳性，表明其产酸能力得到提高。经临床验证，其活菌制剂能促进消化，有效调节肠道菌群平衡，能够用于制备保健品或药品。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株太空诱变高效长双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法。
背景技术
长双歧杆菌，拉丁学名为Bifidobacterium longum，属于双歧杆菌属，双歧杆菌（Bifidobacterium Orla-Jensen）是1899年由法国学者Tissier从母乳营养儿的粪便中分离出的一种厌氧的革兰氏阳性杆菌，末端常常分叉，故名双歧杆菌。随着近二十年来微生态学的崛起和医学革命的进展，双歧杆菌研究的重要性越来越被认识。
双歧杆菌是人胃肠中的一种生理性细菌，是有益菌，它与人体的健康密不可分，分布最多的是母乳营养儿。双歧杆菌对婴幼儿有许多好处，如营养、免疫及抗感染作用，并且还具有抗过敏、抗肿瘤、保护肝脏、调整肠道功能及改善营养的作用等。
在治疗慢性腹泻中，双歧杆菌增殖后，扶植肠道中的原籍菌，使机体定植抗力升高，有利于拮抗致病菌和条件致病菌的定植，从而达到治疗效果。
在治疗功能性便秘时，其产生乙酸和乳PH值为2.8~3.1，使肠道呈酸性，控制由有害菌引起的异常发酵，并且刺激肠蠕动，从而减少水分的过度吸收；它还可以复活机体免疫功能，有利于调整内分泌-免疫功能恢复，恢复肠道蠕动功能从而缓解便秘等症状。
在肿瘤防治方面，双歧杆菌还具有辅助性治疗作用。双歧杆菌与诱变原具有高吸附性，从而保护机体细胞免受这些致癌物质损害，同时双歧杆菌可通过调整肠道正常菌群，抑制肠道许多腐败菌生长，从而减少一些致癌物质产生，从而大大降低了癌症的发生率；双歧杆菌还可激活机体巨噬细胞或LAK细胞的吞噬活性，并产生一定量的活性因子直接杀死肿瘤细胞。
双歧杆菌可以抑制产生毒素的有害菌数量，从而对肝脏患者起到良好的治疗作用。双歧杆菌在乳制品发酵过程中可以产生乳糖酶，帮助患者消化乳糖，改善乳糖消化不良症。
由于双歧杆菌具有多种有益作用，使其在双歧杆菌保健品与双歧杆菌药品的开发等领域有着广阔的开发前景。
虽然双歧杆菌具有如此之多的优点，但是其分布在胃肠的数量会随年龄阶段的增长而减少，这种减少甚至消失是“不健康”状态的标志。为了维持体内健康的微生态环境，人们随着年龄的增长需要不断补充体内的双歧杆菌。
提高双歧杆菌在体内的数量有两种方法：“活菌体外补养”和“活菌体内增殖”。“活菌体外补养”就是口服有一定数量双歧杆菌的活菌制剂。现在国内活菌制剂产品主要有丽珠肠乐、新大地生命源和双歧王，此类产品中均含有活性菌，使双歧杆菌活性菌直接作用于人的肠胃环境。在此基础上，还有一类双歧复合制剂，这类制剂中除了含有双歧杆菌外，还含有其他多种菌种，使它们共同发挥作用，协同维持体内的微生态平衡，该类药剂主要有三株口服液和双歧天宝；而“活菌体内增殖”是指将大量双歧杆菌的营养成分送入肠内，使原来就生存在肠内的双歧杆菌增殖。这类产品主要有双歧尔寿和豆王神口服液，它们均是通过双歧因子来促使人体内双歧杆菌的生长，进而达到药效。
目前的双歧杆菌产品，主要是维持双歧杆菌在肠道内的数量，提高其在生长能力。通过“活菌体内增殖”方法能够促使双歧杆菌增殖，但作为促使双歧杆菌增值的营养成分-双歧因子，不仅能成为双歧杆菌的营养成分，同时也可能成为一部分有害菌的营养，这就使其安全性大大降低。虽然“活菌体外补养”避免了“活菌体内增殖”方法带来的不安全问题，但是双歧杆菌是一种严格的厌氧菌，其活菌制剂生产较困难，且由于活菌对酸、碱、热均敏感，使得保存和口服易致失活。同时，常规诱变的双歧杆菌突变株不稳定，产量不高，这就对活菌制剂的生产造成了更大的困难。
发明内容
本发明的目的是提供一株耐氧特性、耐盐特性和产酸能力均显著提高、且具有遗传稳定性的太空诱变高效长双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法。
本发明所采用的技术方案是：
太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6，于2011年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4887，其特征在于：
其16SrDNA序列为SEQ ID NO.2。
所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备药物中的应用。
所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备保健品中的应用。
所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备药物中的应用，其特征在于：
所述的药物为长双歧杆菌活菌制剂。
所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备药物中的应用，其特征在于：
其在制备调节肠道菌群平衡药物中的应用。
所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备药物中的应用，其特征在于：
其在制备治疗腹泻药物中的应用。
所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备保健品中的应用，其特征在于：
所述的保健品为长双歧杆菌活菌制剂。
所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备保健品中的应用，其特征在于：
其在制备调节肠道菌群平衡保健品中的应用。
所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备保健品中的应用，其特征在于：
其在制备治疗腹泻保健品中的应用。
利用所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6制备胶囊制剂的方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：将长双歧杆菌在发酵罐中培养20-24h，调节发酵液pH7.0-7.2，于4℃、 8000 r/min离心10min，收集菌体，清洗后加入脱脂奶粉10％、谷氨酸钠1.5％、异麦芽低聚糖3% 、柠檬酸3%复配的冻干保护剂；
步骤一中，发酵培养基的配方为：蛋白胨2%、蔗糖2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4.7H2O 0.05%、VB1 0.005%、水余量；
步骤二：于低温冰箱-20℃预冻2-3 h，然后置冻干机中-60℃冻干24-28 h，制得冻干菌粉，活菌数达1×1010cfu/g；
步骤三：将制得的冻干菌粉按0.5g/粒装入胶囊，制成胶囊制剂。
本发明具有以下优点：
本发明所述长双歧杆菌耐氧特性增强，在有氧和pH值7.0或有氧和pH值5.0的培养条件下能够生长；可稳定遗传至30代无退化；且耐盐特性增强，能够在含量为6%NaCl的培养条件下生长，虽然地面对照长双歧杆菌在含量为3.5%NaCl的培养条件下能够生长，但在含量为6%NaCl的培养条件下不能生长；甲基红实验和VP实验呈阳性，表明其产酸能力得到提高。经临床验证，其活菌制剂能促进消化，有效调节肠道菌群平衡，能够用于制备保健品或药品，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1 示本发明所述长双歧杆菌扫描电镜照片，放大倍数为10000倍；
图2 示地面对照长双歧杆菌扫描电镜照片，放大倍数为10000倍；
图3 示本发明所述长双歧杆菌菌株蛋白电泳图；
泳道1：分子量Marker，从上至下依次为97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、 30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
泳道2：地面对照长双歧杆菌蛋白；
泳道3：本发明所述长双歧杆菌第1代菌株蛋白；
泳道4：本发明所述长双歧杆菌第30代菌株蛋白。
图4 示本发明所述长双歧杆菌和地面对照长双歧杆菌的16SrDNA的二级结构V1区结构；
A：地面对照长双歧杆菌；
B：本发明所述长双歧杆菌；
图5 示本发明所述长双歧杆菌和地面对照长双歧杆菌的16SrDNA的二级结构V2区结构；
A：地面对照长双歧杆菌；
B：本发明所述长双歧杆菌；
图6 示本发明所述长双歧杆菌和地面对照长双歧杆菌的16SrDNA的二级结构V3区结构；
A：地面对照长双歧杆菌；
B：本发明所述长双歧杆菌；
图7 示本发明所述长双歧杆菌和地面对照长双歧杆菌的16SrDNA的二级结构V4区结构；
A：地面对照长双歧杆菌；
B：本发明所述长双歧杆菌；
图8 示本发明所述长双歧杆菌和地面对照长双歧杆菌的16SrDNA的二级结构V5区结构；
A：地面对照长双歧杆菌；
B：本发明所述长双歧杆菌；
图9 示本发明所述长双歧杆菌和地面对照长双歧杆菌的16SrDNA的二级结构V6区结构；
A：地面对照长双歧杆菌；
B：本发明所述长双歧杆菌；
图10 示本发明所述长双歧杆菌和地面对照长双歧杆菌的16SrDNA的二级结构V7区结构；
A：地面对照长双歧杆菌；
B：本发明所述长双歧杆菌；
图11 示本发明所述长双歧杆菌和地面对照长双歧杆菌的16SrDNA的二级结构V8区结构；
A：地面对照长双歧杆菌；
B：本发明所述长双歧杆菌；
图12 示本发明所述长双歧杆菌和地面对照长双歧杆菌的16SrDNA的二级结构V9区结构。
A：地面对照长双歧杆菌；
B：本发明所述长双歧杆菌。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明所述的长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6，于2011年5月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 4887。
下述内容中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
一、长双歧杆菌的诱变：
将保藏编号为CGMCC 1.2186的长双歧杆菌作为出发菌株，编号为S7-D6分为2份，1份作为地面对照菌株于4℃保存，1份作为搭载菌株搭载神舟七号载人航天器进行空间诱变。
二、菌液的制取和培养：
在无菌条件下取空间搭载菌株和地面对照菌株S7-D6，加入10ml无菌生理盐水，激烈振荡制成均匀菌悬液，取1ml，由10-1依次稀释菌液，至10-7左右，各取0.1ml稀释液涂布于筛选平板，地面对照组每稀释梯度3个重复，搭载组分为两个平行组，每组每稀释梯度3个重复。对照组和搭载组 1于37℃厌氧培养，搭载组2在有氧条件下进行培养。
三、搭载菌株与地面对照菌株S7-D6的死亡率统计：
分别取等量搭载菌株（搭载组1）与地面对照菌株S7-D6稀释至10-6和10-7的菌液，将两组菌液在相同厌氧培养的平板中培养48h后，统计太空诱变后搭载菌株相对于地面对照菌株S7-D6的死亡率，死亡率（%）= （地面对照平皿菌落平均数-空间搭载平皿菌落平均数）/地面对照平皿菌落平均数，结果参见表1。
表1 搭载菌株相对于地面对照菌株S7-D6的死亡率统计
由表1可知，搭载菌株经太空诱变后，大部分菌落（90.82%）死亡，少部分通过突变存活下来，说明太空诱变能诱使搭载菌株发生变异。
四、耐氧耐酸特性菌株的筛选：
经太空诱变后搭载菌株（搭载组2）在有氧培养的平板中培养48h后，无菌落长出。同时将搭载菌液和对照菌液各吸取0.1ml，接入5ml液体培养基，有氧培养24h后，分别在600nm处测量OD值（以空白培养基OD值为0）分别进行活菌计数（个/ml），结果参见表2。
表2 有氧培养OD值和活菌数
将有氧条件下经液体培养好的搭载菌株转接入不同pH梯度的液体培养基内，有氧条件下培养24h，观察菌种生长情况，在600nm处测OD值（以空白培养基OD值为0），并进行活菌计数（个/ml），结果参见表3。
表3 不同pH梯度的液体培养基有氧培养OD值和活菌数
将经过耐氧和耐酸筛选出的菌株经过复筛和遗传稳定性考察，筛选出一株在pH5.0和有氧条件下生长较好的菌株，将其确定为目的菌株，编号S7-T6。
五、地面对照菌株S7-D6与本发明所述菌株S7-T6形态特征和生理生化特征对比
依照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》、《常见细菌系统鉴定手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》等有关内容对S7-D6菌株和S7-T6菌株进行形态特征、生理生化特征观察和鉴定。
1、地面对照菌株S7-D6与本发明所述菌株S7-T6形态特征对比
在有机物琼脂平板上37℃厌氧培养2天后，分别取S7-D6和S7-T6菌样进行相应处理后用电子扫描显微镜观察S7-T6与S7-D6细胞生长形态特征，进行对比并拍照，结果参见图1和图2。
结果表明，本发明所述菌株S7-T6与地面对照菌株相比，形态发生了变化，菌体均有所延长，提高了其增殖能力。
2、地面对照菌株S7-D6与本发明所述菌株S7-T6生理生化特征对比
表4 S7-D6菌株与S7-T6菌株生理生化特征差异
结果参见表4， 由表4得知S7-T6菌株VP实验和甲基红实验呈阳性，而其他生理生化特征无差异，如硝酸盐还原实验，S7-T6菌株和S7-D6菌株均呈阴性；硫化氢产生实验中，两株菌株均不产生硫化氢气体。并且S7-T6菌株能够在含量为6%NaCl的培养条件下生长。表明S7-T6菌株产酸能力比S7-D6菌株更强，耐盐特性明显提高，但与S7-D6菌株相比未发生本质上的突变。
六、地面对照菌株S7-D6与本发明所述菌株S7-T6耐氧、耐酸比较实验：
分别将S7-D6菌株和S7-T6菌株置于液体试管培养24h，培养液装量为8ml/管，结果如表5。
表5 菌株S7-D6与S7-T6耐氧、耐酸比较实验
本发明所述菌株S7-T6与地面对照菌株S7-D6相比，耐氧性有了明显增强：在有氧条件下，pH5.0时S7-T6菌株生长较好，菌株活菌数达到2.32×104个/ml；pH7.0时S7-T6菌株活菌数达到8.36×106个/ml，而S7-D6菌株在pH5.0和pH7.0时均不生长。在厌氧条件下， pH5.0时S7-D6菌株活菌数为5.66×105/ml，S7-T6菌株活菌数达到6.62×106个/ml；pH7.0时S7-D6菌株活菌数为4.45×107/ml，S7-T6菌株活菌数达到6.94×107个/ml，S7-D6菌株和S7-T6菌株活菌数没有明显差异。
七、本发明所述菌株S7-T6的工业特征稳定性的研究：
将S7-T6在固体培养基中连续进行30代的传代培养，每10代按照相同的方法将S7-T6与其对照菌株S7-D6同时培养24h，对其耐氧特性进行稳定性研究，每批测定重复3次，计算平均值，实验结果如表6所示，结果显示S7-T5菌株第10代、第20代和第30代在有氧和pH值5.0或厌氧和pH值5.0的培养条件下，活菌数均无明显差异，表明经过多次传代，S7-T6菌株的工业特性稳定。
表6 S7-T6菌株工业特征稳定性的研究
八、本发明所述菌株S7-T6基因稳定性的研究：
1、16SrDNA测序研究基因组的稳定性
将S7-T6在PDA固体培养基中进行30代的传代培养，第一代和第三十代的菌株分别进行基因组的提取和16SrDNA序列的测定，测定结果显示第一代和第三十代16SrDNA序列完全一致，如SEQ ID NO.2所示，说明经多次传代S7-T5的基因是稳定的。
2、蛋白电泳研究突变株遗传稳定性
对地面对照菌株S7-D6、第一代的S7-T6和第30代的S7-T6进行液体培养，5天后收集菌体，液氮磨碎后加入无菌水，置-20℃冷冻60min，4℃融化后再次进行研磨。12000rpm，4℃离心20min，常规条件下进行12%SDS-PAGE，结果参见图3，发现与地面对照菌株S7-D6相比在大约44.3KD处有条带缺失，且经30代传代培养，电泳条带无变化，说明S7-T6具有遗传稳定性。
九、地面对照菌株S7-D6与本发明所述菌株S7-T6的16SrDNA序列差异：
S7-D6菌株和S7-T6菌株16SrDNA序列通过ABI3730XL测序仪测序和ContigExpress序列分析软件进行拼接，所得S7-D6菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，S7-T6菌株16SrDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
表7 S7-D6菌株与S7-T6菌株16SrDNA序列差异
参见表7，通过16S rDNA测序分析，经过太空搭载后S7-T6菌株与地面对照菌株S7-D6相比，其序列有11个位点差异。
十、地面对照菌株S7-D6与本发明所述菌株S7-T6的16S rDNA二级结构差异：
RNA有两大主要功能：一是某些病毒的遗传物质；二是参与蛋白质的合成。这些与细胞分化、代谢、记忆的储存等有重要关系。这些功能与RNA二级结构的稳定性，自由能密切相关。常用的计算自由能的方法有热力学微扰法及热力学微积分法等。16S rRNA二级结构，是在菌株16S rDNA碱基序列（一级结构）基础上，用最小自由能（ENERGY）算法或比较序列分析方法预测的，菌株S7-D6与菌株S7-T6的16S rDNA二级结构可变区最小自由能参见表8。
表8 菌株S7-D6与菌株S7-T6的16S rDNA二级结构可变区最小自由能（ENERGY）
用16SrRNA可变区二级结构图形分析，比较S7-T6菌株与S7-D6菌株二级结构在9个可变区二级结构中茎的长度、环的数目和类型、茎的碱基对、以及环内部碱基是否有不同，以此来判定菌株的变异程度。因为通常菌株的16SrRNA二级结构比其一级结构具有更高的保守性，16SrDNA碱基序列（一级结构）的改变并不一定会引起其二级结构的改变。如果菌株的16SrRNA二级结构也发生了比较明显的变化，则说明菌株的变异比较显著，不仅发生了16SrDNA碱基序列改变，还发生了空间构象的改变。
通过RNA structure 4.6和RnaViz 2.0分析软件对S7-D6菌株和S7-T6菌株的16SrDNA二级结构的9个可变区分析，结果参见图4-图12，显示在V6、 V7、V8和V9区存在差异。
十一、地面对照菌株S7-D6与本发明所述菌株S7-T6在耐盐生长上的差异：
表9 不同盐浓度下S7-D6菌株与S7-T6菌株生长差异
在培养基中附加不同浓度的NaCl，结果参见表9，S7-D6菌株在6%的NaCl浓度下不能生长，而S7-T6菌株由于诱变，能够耐受6%的NaCl浓度，显著提高了其耐盐能力。
十二、地面对照菌株S7-D6与本发明所述菌株S7-T6的甲基红实验：
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
表10 S7-D6菌株与S7-T6菌株甲基红实验和VP实验结果
取4支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管， S7-D6菌株与S7-T6菌株各2支，以无菌操作分别接种少量S7-D6菌和S7-T6菌至以上相应试管中，置37℃恒温箱中，一支试管厌氧培养2d，另一支试管厌氧培养4d，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示，结果参见表10，加入甲基红试剂后，S7-T6菌培养2d和4d的培养液上层均呈浅红色，而S7-D6菌株培养2d和4d的培养液上层均无变化，表明S7-T6菌株在分解葡萄糖过程中产生大量乳酸，其产酸能力比S7-D6菌株更强。
十三、地面对照菌株S7-D6与本发明所述菌株S7-T6的VP实验：
乙酰甲基甲醇试验，简称VP实验，肠杆菌科各菌属在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP反应。
表11 S7-D6菌株与S7-T6菌株甲基红实验和VP实验结果
取4支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管， S7-D6菌株与S7-T6菌株各2支，以无菌操作分别接种少量S7-D6菌和S7-T6菌至以上相应试管中，置37℃恒温箱中，厌氧培养24-48h，取出以上试管，振荡2min。另取4支空试管相应标记菌名，分别加入3-5ml以上对应管中的培养液，再加入40％NaOH溶液10-20滴，并用牙签挑入约0.5-1mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，两菌株中一支试管置37℃恒温箱中保温10min， 另一支试管置37℃恒温箱中保温20min，若培养液呈红色，记录为VP实验呈阳性（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为VP实验呈阴性（用“－”表示）。结果参见表11，S7-T6菌株葡萄糖蛋白胨培养液在加入氢氧化钠10min后，培养液呈橘黄色，在加入氢氧化钠30min后，培养液呈红色，而S7-D6菌株葡萄糖蛋白胨培养液均无变化，表明S7-T6菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力比S7-D6菌株强。
十四、本发明所述菌株S7-T6活菌制剂的生产工艺
将长双歧杆菌S7-T6在发酵罐中培养20-24h，调节发酵液pH7.0-7.2，于4℃、 8000 r/min离心10min，收集菌体，清洗后加入脱脂奶粉10％ 、谷氨酸钠1.5％、异麦芽低聚糖3% 、柠檬酸3%复配的冻干保护剂。于低温冰箱-20℃预冻2-3 h，然后置冻干机中-60℃冻干24-28 h，制得冻干菌粉，活菌数达1×1010cfu/g。将制得的冻干菌粉按0.5g/粒装入胶囊，制成胶囊制剂。检验存活率，结果显示长双歧杆菌的存活率达到90%以上。
十五、本发明所述菌株S7-T6活菌制剂的疗效实验：
1、治疗腹泻
参照《中药新药治疗泄泻的临床研究指导原则》标准：泻下急迫或泻下不爽，大便色黄秽臭，肛门灼热，烦热口渴，脘腹胀痛，恶心呕吐，小便短黄，舌苔黄腻，脉濡数或滑数。经检查排除为中毒性痢疾、霍乱、伤寒、副伤寒等引起的腹泻；溃疡性结肠炎、克隆病、肿瘤及药物等因素引起的腹泻；合并心脑血管、肝、肾、内分泌和造血系统严重原发性疾病，体温超过39 ℃、重度脱水或有明显中毒症状者；妊娠或准备妊娠妇女，哺乳期妇女等。
给符合上述标准的80名患者服用实施例14所制的活菌胶囊制剂，服药期间禁用其他抗生素及治疗腹泻类药物，用量为每次3粒，每日三次，疗程为一个月。疗效标准为痊愈：大便性状、次数恢复正常，大便常规及细菌培养阴性；显效：大便性状及次数明显好转，全身症状明显改善，大便每日2～3 次， 近似成形，大便常规及细菌培养复查基本接近正常；有效：大便性状、次数、大便常规及细菌培养复查好转；无效：大便性状、次数及全身症状均无好转甚至恶化，大便常规及细菌培养均无改善。
80名患者中痊愈2人，显效51人，有效16人，无效11人，总有效率为86.25%。结果表明利用本发明所述菌株S7-T6生产的活菌胶囊制剂能抑制肠道腐败菌的数量，调节菌群平衡，从而治疗腹泻。
2、治疗消化不良
参照世界胃肠大会制定的功能性胃肠疾病的诊断标准-罗马Ⅲ诊断标准即：①有上腹痛、腹胀、早饱、嗳气、恶心、呕吐、厌食症状至少持续4周或12月中累计12周；②内窥镜检查未发现胃及十二指肠溃疡、糜烂、肿瘤等器质性病变,未发现食管炎,也无上述疾病病史；③实验室、B超、X射线等检查排除肝、胆、胰及肠道器质性病变；④无糖尿病、肾脏病、结缔组织病、精神病等全身性疾病；⑤无腹部手术史,无肠易激综合征。给符合上述标准的80名患者服用实施例14所制的活菌胶囊制剂，服药期间禁用其他肠道消化类药物，禁食辛辣油腻食物，用量为每次4粒，每日两次，疗程为一个月。
80名患者中，4名患者痊愈，67名患者症状明显好转，9名患者无效。治疗总有效率为88.75%。同时，长双歧杆菌胶囊剂在对消化不良治疗过程中无明显的不良作用。
以上结果说明，本发明所述菌株S7-T6比地面对照菌株S7-D6耐氧能力（有氧和pH5.0或pH7.0培养条件下仍能生长）显著提高。影响双歧杆菌制剂应用的一个很大的限制因素就是其对氧气的敏感，通过诱变使S7-T6的耐氧能力提高，便于生产活菌制剂，提高双歧杆菌类产品的效果，为产业化打下了坚实的基础；S7-T6由于诱变，能够耐受6%的NaCl浓度，显著提高了其耐盐能力，这也说明其抗逆能力的改善，能够适应高渗的环境提高其在肠道内的存活时间，可以减少双歧因子的添加量，从而减少生产成本。S7-T6通过搭载后，甲基红实验及VP实验呈阳性，说明其产酸能力的提高，从而说明其更能有效的利用葡萄糖进行发酵。同时利用本发明所述菌株S7-T6生产的活菌胶囊制剂能促进消化，调节肠道菌群平衡，治疗腹泻。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 神舟太空产品高科技成果推广中心集团有限公司
<120> 太空诱变高效长双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法
<130> 2013-6
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1424
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）
<400> 1
ccccttagac ggctccatcc cacaaggggt taggccaccg gcttcgggtg ctgcccactt 60
tcatgacttg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgc attcaccgcg acgttgctga 120
ttcgcgatta ctagcgactc cgccttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccgaactg 180
agaccggttt tcagggatcc gctccgcgtc gccgcgtcgc atcccgttgt accggccatt 240
gtagcatgcg tgaagccctg gacgtaaggg gcatgatgat ctgacgtcat ccccaccttc 300
ctccgagtta accccggcgg tcccccgtga gttcccggca taatccgctg gcaacacggg 360
gcgagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacga 420
ccatgcacca cctgtgaacc cgccccgaag ggaagccgta tctctacgac cgtcgggaac 480
atgtcaagcc caggtaaggt tcttcgcgtt gcatcgaatt aatccgcatg ctccgccgct 540
tgtgcgggcc cccgtcaatt tctttgagtt ttagccttgc ggccgtactc cccaggcggg 600
atgcttaacg cgttagctcc gacacggaac ccgtggaacg ggccccacat ccagcatcca 660
ccgtttacgg cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc 720
tcagcgtcag taacggccca gagacctgcc ttcgccattg gtgttcttcc cgatatctac 780
acattccacc gttacaccgg gaattccagt ctcccctacc gcactcaagc ccgcccgtac 840
ccggcgcgga tccaccgtta agcgatggac tttcacaccg gacgcgacga accgcctacg 900
agccctttac gcccaataat tccggataac gcttgcaccc tacgtattac cgcggctgct 960
ggcacgtagt tagccggtgc ttattcaacg ggtaaactca ctctcgcttg ctccccgata 1020
aaagaggttt acaacccgaa ggcctccatc cctcacgcgg cgtcgctgca tcaggcttgc 1080
gcccattgtg caatattccc cactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tatctcagtc 1140
ccaatgtggc cggtcgccct ctcaggccgg ctacccgtcg aagccacggt gggccgttac 1200
cccgccgtca agctgatagg acgcgacccc atcccatacc gcgaaagctt tcccagaaga 1260
ccatgcgatc aactggaaca tccggcatta ccacccgttt ccaggagcta ttccggtgta 1320
tggggcaggt cggtcacgca ttactcaccc gttcgccact ctcaccacca agcaagcttg 1380
atggatcccg tcgacgagca ttgtatgcga gccccggcaa accc 1424
<210> 2
<211> 1435
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）
<400> 2
gggtcctgtg agctcacaat acaatgttcg tcgacgggat ccatcaagct tgcttggtgg 60
tgagagtggc gaacgggtga gtaatgcgtg accgacctgc cccatacacc ggaatagctc 120
ctggaaacgg gtggtaatgc cggatgttcc agttgatcgc atggtcttct gggaaagctt 180
tcgcggtatg ggatggggtc gcgtcctatc agcttgacgg cggggtaacg gcccaccgtg 240
gcttcgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ttgggactga gatacggccc 300
agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc 360
gacgccgcgt gagggatgga ggccttcggg ttgtaaacct cttttatcgg ggagcaagcg 420
agagtgagtt tacccgttga ataagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480
cgtagggtgc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag ggctcgtagg cggttcgtcg 540
cgtccggtgt gaaagtccat cgcttaacgg tggatccgcg ccgggtacgg gcgggcttga 600
gtgcggtagg ggagactgga attcccggtg taacggtgga atgtgtagat atcgggaaga 660
acaccaatgg cgaaggcagg tctctgggcc gttactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg 720
gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acggtggatg ctggatgtgg 780
ggcccgttcc acgggttccg tgtcggagct aacgcgttaa gcatcccgcc tggggagtac 840
ggccgcaagg ctaaaactca aagaaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgcg 900
gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctgggcttg acatgttccc gacggtcgta 960
gagatacggc ttcccttcgg ggcgggttca caggtggtgc atggtcgtcg tcagctcgtg 1020
tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc tcgccccgtg ttgccagcgg 1080
attatgccgg gaactcacgg gggaccgccg gggttaactc ggaggaaggt ggggatgacg 1140
tcagatcatc atgcccctta cgtccagggc ttcacgcatg ctacaatggc cggtacaacg 1200
ggatgcgacg cggcgacgcg gagcggatcc ctgaaaaccg gtctcagttc ggatcgcagt 1260
ctgcaactcg actgcgtgaa ggcggagtcg ctagtaatcg cgaatcagca acgtcgcggt 1320
gaatgcgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcaagtc atgaaagtgg gcagcacccg 1380
aagccggtgg cctaacccct tgtgggatgg agccgtctaa gggaggcctc gaatt 1435
Claims (10)
1.太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6，于2011年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4887，其特征在于：
其16SrDNA序列为SEQ ID NO.2。
2.权利要求1所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备药物中的应用。
3.权利要求1所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备保健品中的应用。
4.根据权利要求2所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备药物中的应用，其特征在于：
所述的药物为长双歧杆菌活菌制剂。
5.根据权利要求2所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备药物中的应用，其特征在于：
其在制备调节肠道菌群平衡药物中的应用。
6.根据权利要求2所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备药物中的应用，其特征在于：
其在制备治疗腹泻药物中的应用。
7.根据权利要求3所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备保健品中的应用，其特征在于：
所述的保健品为长双歧杆菌活菌制剂。
8.根据权利要求3所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备保健品中的应用，其特征在于：
其在制备调节肠道菌群平衡保健品中的应用。
9.根据权利要求3所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6在制备保健品中的应用，其特征在于：
其在制备治疗腹泻保健品中的应用。
10.利用权利要求1所述的太空诱变高效长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）S7-T6制备胶囊制剂的方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：将长双歧杆菌在发酵罐中培养20-24h，调节发酵液pH7.0-7.2，于4℃、 8000 r/min离心10min，收集菌体，清洗后加入脱脂奶粉10％、谷氨酸钠1.5％、异麦芽低聚糖3% 、柠檬酸3%复配的冻干保护剂；
步骤一中，发酵培养基的配方为：蛋白胨2%、蔗糖2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4.7H2O 0.05%、VB1 0.005%、水余量；
步骤二：于低温冰箱-20℃预冻2-3 h，然后置冻干机中-60℃冻干24-28 h，制得冻干菌粉，活菌数达1×1010cfu/g；
步骤三：将制得的冻干菌粉按0.5g/粒装入胶囊，制成胶囊制剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310228827.3A CN103266077B (zh) | 2013-06-04 | 2013-06-04 | 太空诱变高效长双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310228827.3A CN103266077B (zh) | 2013-06-04 | 2013-06-04 | 太空诱变高效长双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103266077A CN103266077A (zh) | 2013-08-28 |
| CN103266077B true CN103266077B (zh) | 2014-08-06 |
Family
ID=49009742
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310228827.3A Active CN103266077B (zh) | 2013-06-04 | 2013-06-04 | 太空诱变高效长双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103266077B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110438042A (zh) * | 2019-07-23 | 2019-11-12 | 广东益可维健康科技有限公司 | 一株长双歧杆菌及其应用 |
| CN112625933B (zh) * | 2019-09-24 | 2022-04-26 | 南京盛德生物科技研究院有限公司 | 一种长双歧杆菌诱变菌株h8 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102206599A (zh) * | 2011-04-11 | 2011-10-05 | 天津科技大学 | 一种耐氧耐酸性长双歧杆菌 |
-
2013
- 2013-06-04 CN CN201310228827.3A patent/CN103266077B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102206599A (zh) * | 2011-04-11 | 2011-10-05 | 天津科技大学 | 一种耐氧耐酸性长双歧杆菌 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 双歧杆菌的耐氧机制;桂仕林 等;《食品工业科技》;20080725(第7期);280-283 * |
| 双歧杆菌耐氧性研究及其应用;赵建云 等;《食品与发酵工业》;20101231;第36卷(第12期);15-19 * |
| 桂仕林 等.双歧杆菌的耐氧机制.《食品工业科技》.2008,(第7期), |
| 赵建云 等.双歧杆菌耐氧性研究及其应用.《食品与发酵工业》.2010,第36卷(第12期), |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103266077A (zh) | 2013-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107893044B (zh) | 一株长双歧杆菌及其应用 | |
| CN106399141B (zh) | 一种脆弱拟杆菌及其应用 | |
| CN1297653C (zh) | 包含戊糖乳杆菌菌株的组合物及其用途 | |
| CN103013879B (zh) | 一株具有高产γ-氨基丁酸能力的菌株 | |
| CN107619811A (zh) | 植物乳杆菌ccfm200菌株与应用 | |
| CN103146620A (zh) | 具有益生菌特性的脆弱拟杆菌 | |
| CN112175864A (zh) | 动物双歧杆菌及其选育方法和应用 | |
| CN106399154B (zh) | 乳酸杆菌益生菌cgmcc no.12422及在制备降脂药物中的应用 | |
| CN103421715A (zh) | 一种鼠李糖乳杆菌及其应用 | |
| CN101671638A (zh) | 一种双歧杆菌新菌株及其发酵制备方法与应用 | |
| CN109161509A (zh) | 一株能防治牛羊腹泻病的菌株 | |
| CN103099821B (zh) | 一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物及其制备方法和用途 | |
| CN106434427A (zh) | 乳酸杆菌益生菌cgmcc no.12421及在制备降脂药物中的应用 | |
| CN105420150A (zh) | 一种嗜酸乳杆菌及其应用 | |
| CN105434477A (zh) | 脆弱拟杆菌在抗水产病原菌中的应用 | |
| CN114480214A (zh) | 一株西藏阿里牦牛奶疙瘩中分离的副干酪乳杆菌及应用 | |
| CN109022313A (zh) | 一株植物乳杆菌 | |
| CN103266076B (zh) | 太空诱变高效两歧双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法 | |
| CN105433170A (zh) | 一种多菌种微生物和小球藻复合饮料制剂及其制备方法 | |
| CN104877940B (zh) | 一株嗜热链球菌 | |
| CN103266077B (zh) | 太空诱变高效长双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法 | |
| CN103275901B (zh) | 太空诱变高效纳豆芽孢杆菌、其应用及其片剂的制备方法 | |
| CN112574924A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌菌株及其微生态制剂和应用 | |
| CN115895966A (zh) | 一株辅助缓解痛风的两歧双歧杆菌bl002及其应用 | |
| CN105274032A (zh) | 一种拮抗空肠弯曲杆菌及抑制其flaA基因表达的罗伊氏乳杆菌 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20130828 Assignee: Shenzhou space products high tech achievements promotion business network Co.,Ltd. Assignor: SHENZHOU SPACE PRODUCTS HIGH TECHNOLOGY ACCOMPLISHMENT POPULARIZATION CENTER GROUP Co.,Ltd. Contract record no.: 2014610000144 Denomination of invention: Space-induced efficient bifidobacterium longum, application thereof, and preparation method of capsule preparation thereof Granted publication date: 20140806 License type: Exclusive License Record date: 20140917 |
|
| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230921 Address after: 518000 Room 201, building A, No. 1, Qian Wan Road, Qianhai Shenzhen Hong Kong cooperation zone, Shenzhen, Guangdong (Shenzhen Qianhai business secretary Co., Ltd.) Patentee after: Shenzhou Space Group (Shenzhen) High tech Co.,Ltd. Address before: Floor 17, E-Yang International, No. 27 Keji Road, High tech Zone, Xi'an City, Shaanxi Province, 710075 Patentee before: SHENZHOU SPACE PRODUCTS HIGH TECHNOLOGY ACCOMPLISHMENT POPULARIZATION CENTER GROUP Co.,Ltd. |