CN103266076B - 太空诱变高效两歧双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株太空诱变高效两歧双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法。双歧杆菌是一种严格的厌氧菌，其活菌制剂生产较困难，且由于活菌对酸、碱、热均敏感，使得保存和口服易致失活。本发明提供了一株两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5，可应用于制备调节肠道菌群平衡的药物和保健品。本发明所述两歧双歧杆菌耐氧、耐酸和耐盐特性显著提高，并且具有稳定的遗传性和工业特征，经临床验证，本发明所述菌株S7-T5生产的活菌胶囊制剂能促进消化，调节肠道菌群平衡，治疗腹泻以及消化不良，能够应用于双歧杆菌保健品和双歧杆菌药品中，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株太空诱变高效两歧双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法。
背景技术
两歧双歧杆菌，拉丁学名为Bifidobacterium bifidum，属于双歧杆菌属模式种。双歧杆菌（Bifidobacterium Orla-Jensen）是1899年由法国学者Tissier从母乳营养儿的粪便中分离出的一种厌氧的革兰氏阳性杆菌，末端常常分叉，故名双歧杆菌。双歧杆菌是人胃肠中的一种生理性细菌，是有益菌，它与人体的健康密不可分，分布最多的是母乳营养儿。双歧杆菌不但对婴幼儿有许多好处，如营养、免疫及抗感染作用，并且还具有抗过敏、抗肿瘤、保护肝脏、调整肠道功能及改善营养的作用等。
在治疗慢性腹泻中，双歧杆菌增殖后，扶植肠道中的原籍菌，使机体定植抗力升高，有利于拮抗致病菌和条件致病菌的定植，从而达到治疗效果。
在治疗功能性便秘时，其产生乙酸和乳PH值为2.8~3.1,使肠道呈酸性，其结果能控制由有害菌引起的异常发酵，并且刺激肠蠕动，从而减少水分的过度吸收，还可以复活机体免疫功能，有利于调整内分泌-免疫功能恢复，恢复肠道蠕动功能从而缓解便秘等症状。
在肿瘤防治方面，双歧杆菌还具有辅助性治疗作用，双歧杆菌与诱变原具有高吸附性，从而保护机体细胞免受这些致癌物质损害，同时双歧杆菌可通过调整肠道正常菌群，抑制肠道许多腐败菌生长，从而减少一些致癌物质产生，从而大大降低了癌症的发生率。双歧杆菌还可激活机体巨噬细胞或LAK细胞的吞噬活性，并产生一定量的活性因子直接杀死肿瘤细胞。
双歧杆菌可以抑制产生毒素的有害菌数量，从而对肝脏患者起到良好的治疗作用。双歧杆菌在乳制品发酵过程中可以产生乳糖酶，帮助患者消化乳糖，改善乳糖消化不良症。
由于双歧杆菌具有多种有益作用，使其在双歧杆菌保健营养品、新型酸奶的开发与应用和双歧杆菌药品的开发等领域有着广阔的开发前景。
虽然双歧杆菌具有如此之多的优点，但是其分布在胃肠的数量会随年龄阶段的增长而减少，这种减少甚至消失是“不健康”状态的标志。为了维持体内健康的微生态环境，人们随着年龄的增长需要不断补充体内的双歧杆菌。
提高双歧杆菌在体内的数量有两种方法：“活菌体外补养”和“活菌体内增殖”。“活菌体外补养”就是口服有一定数量双歧杆菌的活菌制剂。现在国内活菌制剂产品主要有丽珠肠乐、新大地生命源和双歧王，此类产品中均含有活性菌，使双歧杆菌活性菌直接作用于人的肠胃环境。在此基础上，还有一类双歧复合制剂，这类制剂中除了含有双歧杆菌外，还含有其他多种菌种，使它们共同发挥作用，协同维持体内的微生态平衡，该类药剂主要有三株口服液和双歧天宝；而“活菌体内增殖”是指将大量双歧杆菌的营养成分送入肠内，使原来就生存在肠内的双歧杆菌增殖。这类产品主要有双歧尔寿和豆王神口服液，它们均是通过双歧因子来促使人体内双歧杆菌的生长，进而达到药效。
目前的双歧杆菌产品，主要是维持双歧杆菌在肠道内的数量，提高其生长能力。通过“活菌体内增殖”方法能够促使双歧杆菌增殖，但作为促使双歧杆菌增值的营养成分-双歧因子，不仅能成为双歧杆菌的营养成分，同时也可能成为一部分有害菌的营养，这就使其安全性大大降低。虽然“活菌体外补养”避免了“活菌体内增殖”方法带来的不安全问题，但是双歧杆菌是一种严格的厌氧菌，其活菌制剂生产较困难，且由于活菌对酸、碱、热均敏感，使得保存和口服易致失活。同时，常规诱变的双歧杆菌突变株不稳定，这就对活菌制剂的生产造成了更大的困难。
发明内容
本发明的目的是提供一株耐氧、耐酸和耐盐特性显著提高、且具有更高遗传稳定性的太空诱变高效两歧双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法。
本发明所采用的技术方案是：
太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5，于2011年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4886，其特征在于：
其16SrDNA序列为SEQ ID NO.2。
所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5在制备药物中的应用。
所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5在制备保健品中的应用。
所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5在制备药物中的应用，其特征在于：
所述的药物为两歧双歧杆菌活菌制剂。
所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5在制备药物中的应用，其特征在于：
其在制备调节肠道菌群平衡药物中的应用。
所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5在制备保健品中的应用，其特征在于：
所述的保健品为两歧双歧杆菌活菌制剂。
所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5在制备保健品中的应用，其特征在于：
其在制备调节肠道菌群平衡保健品中的应用。
所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5制备胶囊制剂的方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：将两歧双歧杆菌S7-T5在发酵罐中培养20-24h，调节发酵液pH7.0-7.2，于4℃、 8000 r/min离心10min，收集菌体；
步骤二：清洗后加入脱脂奶粉10％ 、谷氨酸钠1.5％、异麦芽低聚糖3% 、柠檬酸3%复配的冻干保护剂，于低温冰箱-20℃预冻2-3 h，然后置冻干机中-60℃冻干24-28 h，制得冻干菌粉，活菌数达1×1010cfu/g；
步骤三：将制得的冻干菌粉按0.5g/粒装入胶囊，制成胶囊制剂。
步骤一中，发酵培养基的配方为：蛋白胨2%、蔗糖2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4.7H2O 0.05%、VB1 0.005%、水余量。
本发明具有以下优点：
本发明所述两歧双歧杆菌耐氧、耐酸和耐盐特性显著提高，并且具有稳定的遗传性和工业特征，经临床验证，本发明所述菌株S7-T5生产的活菌胶囊制剂能促进消化，调节肠道菌群平衡，治疗腹泻以及消化不良，能够应用于双歧杆菌保健品和双歧杆菌药品中，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1 示本发明所述两歧双歧杆菌扫描电镜照片，放大倍数为10000倍；
图2 示地面对照两歧双歧杆菌扫描电镜照片，放大倍数为10000倍；
图3 示本发明所述两歧双歧杆菌菌株蛋白电泳图；
泳道1：分子量Marker，从上至下依次为97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、 30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
泳道2：地面对照两歧双歧杆菌蛋白；
泳道3：本发明所述两歧双歧杆菌第1代菌株蛋白；
泳道4：本发明所述两歧双歧杆菌第30代菌株蛋白。
图4 示本发明所述两歧双歧杆菌和地面对照两歧双歧杆菌的16S rDNA的二级结构V1区结构；
A：地面对照两歧双歧杆菌；
B：本发明所述两歧双歧杆菌；
图5 示本发明所述两歧双歧杆菌和地面对照两歧双歧杆菌的16S rDNA的二级结构V2区结构；
A：地面对照两歧双歧杆菌；
B：本发明所述两歧双歧杆菌；
图6 示本发明所述两歧双歧杆菌和地面对照两歧双歧杆菌的16S rDNA的二级结构V3区结构；
A：地面对照两歧双歧杆菌；
B：本发明所述两歧双歧杆菌；
图7 示本发明所述两歧双歧杆菌和地面对照两歧双歧杆菌的16S rDNA的二级结构V4区结构；
A：地面对照两歧双歧杆菌；
B：本发明所述两歧双歧杆菌；
图8 示本发明所述两歧双歧杆菌和地面对照两歧双歧杆菌的16S rDNA的二级结构V5区结构；
A：地面对照两歧双歧杆菌；
B：本发明所述两歧双歧杆菌；
图9 示本发明所述两歧双歧杆菌和地面对照两歧双歧杆菌的16S rDNA的二级结构V6区结构；
A：地面对照两歧双歧杆菌；
B：本发明所述两歧双歧杆菌；
图10 示本发明所述两歧双歧杆菌和地面对照两歧双歧杆菌的16S rDNA的二级结构V7区结构；
A：地面对照两歧双歧杆菌；
B：本发明所述两歧双歧杆菌；
图11 示本发明所述两歧双歧杆菌和地面对照两歧双歧杆菌的16S rDNA的二级结构V8区结构；
A：地面对照两歧双歧杆菌；
B：本发明所述两歧双歧杆菌；
图12 示本发明所述两歧双歧杆菌和地面对照两歧双歧杆菌的16S rDNA的二级结构V9区结构。
A：地面对照两歧双歧杆菌；
B：本发明所述两歧双歧杆菌。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明所述的一株太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5于2011年5月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 4886。
一、两歧双岐杆菌的诱变：
将保藏编号为CGMCC 1.2212的两歧双歧杆菌作为出发菌株，编号为S7-D5分为2份，1份作为地面对照菌株于4℃保存，1份作为搭载菌株搭载神舟七号载人航天器进行空间诱变。
二、菌液的制取和培养：
在无菌条件下取空间搭载菌株和地面对照菌株S7-D5，加入10ml无菌生理盐水，激烈振荡制成均匀菌悬液，取1ml，由10-1依次稀释菌液，至10-7左右，各取0.1ml稀释液涂布于筛选平板，地面对照组每稀释梯度3个重复，搭载组分为两个平行组，每组每稀释梯度3个重复。对照组和搭载组 1于37℃厌氧培养，搭载组2在有氧条件下进行培养。
三、搭载菌株与地面对照菌株S7-D5的死亡率统计：
分别取等量搭载菌株（搭载组1）与地面对照菌株S7-D5稀释至10-6和10-7的菌液，将两组菌液在相同厌氧培养的平板中培养48h后，统计太空诱变后搭载菌株相对于地面对照菌株S7-D5的死亡率，死亡率（%）= （地面对照平皿菌落平均数-空间搭载平皿菌落平均数）/地面对照平皿菌落平均数，结果参见表1。
表1 搭载菌株相对于地面对照菌株S7-D5的死亡率统计
由表1可知，搭载菌株经太空诱变后，大部分菌落死亡（90.82%），少部分通过突变存活下来，说明太空诱变能诱使搭载菌株发生变异。
四、耐氧耐酸特性菌株的筛选：
经太空诱变后搭载菌株（搭载组2）在有氧培养的平板中培养48h后，在原液和10-1浓度平板上共有5个单菌落长出，挑取这5个单菌落接入装有液体培养基的试管，有氧培养24h后，分别进行活菌计数（个/ml），结果参见表2。
表2 有氧培养活菌数
将生长较好的2、4和5号搭载菌株和地面对照菌株S7-D5分别以相同OD值转接入不同pH梯度的液体培养基内，有氧条件下培养24h，观察菌种生长情况，在600nm处测OD值（以空白培养基OD值为0），并进行活菌计数（个/ml），结果参见表3。
表3 不同pH梯度的液体培养基有氧培养OD值和活菌数
经过菌株耐酸性实验，筛选出的5号搭载菌株同时具备耐酸和耐氧的特性，将其确定为目的菌株，编号S7-T5。
五、地面对照菌株S7-D5与本发明所述菌株S7-T5形态特征和生理生化特征对比：
依照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》、《常见细菌系统鉴定手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》等有关内容对S7-D5菌株和S7-T5菌株进行形态特征、生理生化特征观察和鉴定。
1、地面对照菌株S7-D5与本发明所述菌株S7-T5形态特征对比
在有机物琼脂平板上37℃厌氧培养2天后，分别取S7-D5和S7-T5菌样进行相应处理后用电子扫描显微镜观察S7-T5与S7-D5细胞生长形态特征，进行对比并拍照，结果参见图1和图2。
结果表明，本发明所述菌株S7-T5与地面对照菌株相比，形态发生了变化，菌体均有所延长，提高了其增殖能力。
2、地面对照菌株S7-D5与本发明所述菌株S7-T5生理生化特征对比：
表4 S7-D5菌株与S7-T5菌株生理生化特征差异
结果参见表4， 由表4得知S7-T5菌株耐酸和耐盐能力比S7-D5菌株更强，而其他生理生化特征无差异，如甲基红实验，S7-T5菌株和S7-D5菌株均呈阴性，硫化氢产生实验中，两株菌株均不产生硫化氢气体，表明S7-T5菌株耐酸和耐盐特性明显提高，但与S7-D5菌株相比未发生本质上的突变。
六、地面对照菌株S7-D5与本发明所述菌株S7-T5耐氧、耐酸比较实验：
分别将S7-D5菌株和S7-T5菌株置于液体试管培养24h，培养液装量为8ml/管，结果如表5。
表5 菌株S7-D5与S7-T5耐氧、耐酸比较实验
本发明所述菌株S7-T5与地面对照菌株S7-D5相比，耐氧性和耐酸性都有了明显增强：在有氧条件下，pH4.0时S7-D5菌株在平板上不生长，S7-T5菌株生长较好，菌株活菌数达到2.32×106个/ml；pH7.0时S7-T5菌株活菌数达到8.65×107个/ml，而S7-D5菌株活菌数只有2.25×102个/ml，S7-T5菌株活菌数至少是S7-D5菌株活菌数的10万倍。在厌氧条件下， pH4.0时S7-D5菌株不生长，S7-T5菌株活菌数达到6.62×106个/ml；pH7.0时S7-D5菌株和S7-T5菌株活菌数没有明显差异。
七、本发明所述菌株S7-T5的工业特征稳定性的研究：
将S7-T5在固体培养基中连续进行30代的传代培养，每10代按照相同的方法将S7-T5与其对照菌株S7-D5同时培养24h，对其耐氧与耐酸特性进行稳定性研究，每批测定重复3次，计算平均值，实验结果如表6所示，结果显示S7-T5菌株第10代、第20代和第30代在有氧和pH值4.0或厌氧和pH值7.0的培养条件下，活菌数均无明显差异，表明经过多次传代，S7-T5菌株的工业特性稳定。
表6 S7-T5菌株工业特征稳定性的研究
八、本发明所述菌株S7-T5基因稳定性的研究：
1、16S rDNA测序研究基因组的稳定性
将S7-T5在PDA固体培养基中进行30代的传代培养，第一代和第三十代的菌株分别进行基因组的提取和16S rDNA序列的测定，测定结果显示第一代和第三十代16S rDNA序列完全一致，如SEQ ID NO.2所示，说明经多次传代S7-T5的基因是稳定的。
2、蛋白电泳研究突变株遗传稳定性
对地面对照菌株S7-D5、第一代的S7-T5和第30代的S7-T5进行液体培养，5天后收集菌体，液氮磨碎后加入无菌水，置-20℃冷冻60min，4℃融化后再次进行研磨。12000rpm，4℃离心20min，常规条件下进行12%SDS-PAGE，结果参见图3，发现与地面对照菌株S7-D5相比在大约44.3KD处有条带缺失，且经30代传代培养，电泳条带无变化，说明S7-T5具有遗传稳定性。
九、地面对照菌株S7-D5与本发明所述菌株S7-T5的16S rDNA序列差异：
S7-D5菌株和S7-T5菌株16SrDNA序列通过ABI3730XL测序仪测序和ContigExpress序列分析软件进行拼接，所得S7-D5菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，S7-T5菌株16SrDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
表7 S7-D5菌株与S7-T5菌株16S rDNA序列差异
参见表7，通过16S rDNA测序分析，经过太空搭载后S7-T5菌株与地面对照菌株S7-D5相比，其序列有4个位点差异。
十、地面对照菌株S7-D5与本发明所述菌株S7-T5的16S rDNA二级结构差异：
RNA有两大主要功能：一是某些病毒的遗传物质；二是参与蛋白质的合成。这些与细胞分化、代谢、记忆的储存等有重要关系。这些功能与RNA二级结构的稳定性，自由能密切相关。常用的计算自由能的方法有热力学微扰法及热力学微积分法等。16S rRNA二级结构，是在菌株16S rDNA碱基序列（一级结构）基础上，用最小自由能（ENERGY）算法或比较序列分析方法预测的，菌株S7-D5与菌株S7-T5的16S rDNA二级结构可变区最小自由能参见表8。
表8 菌株S7-D5与菌株S7-T5的16S rDNA二级结构可变区最小自由能（ENERGY）
用16S rRNA可变区二级结构图形分析，比较S7-T5菌株与S7-D5菌株二级结构在9个可变区二级结构中茎的长度、环的数目和类型、茎的碱基对、以及环内部碱基是否有不同，以此来判定菌株的变异程度。因为通常菌株的16S rRNA二级结构比其一级结构具有更高的保守性，16S rDNA碱基序列（一级结构）的改变并不一定会引起其二级结构的改变。如果菌株的16S rRNA二级结构也发生了比较明显的变化，则说明菌株的变异比较显著，不仅发生了16S rDNA碱基序列改变，还发生了空间构象的改变。
通过RNA structure 4.6和RnaViz 2.0分析软件对S7-D5菌株和S7-T5菌株的16S rDNA二级结构的9个可变区分析，结果参见图4-图12，显示在V5区存在差异。
十一、地面对照菌株S7-D5与本发明所述菌株S7-T5耐盐差异
表9 不同盐浓度下S7-D5菌株与S7-T5菌株生长差异
在培养基中附加不同浓度的NaCl，结果参见表9，S7-D5菌株在15%的NaCl浓度下不能生长，而S7-T5菌株由于诱变，能够耐受15%的NaCl浓度，显著提高了其耐盐能力。
十二、本发明所述菌株S7-T5活菌制剂的生产工艺：
将两歧双歧杆菌S7-T5在发酵罐中培养20-24h，发酵培养基的配方为：蛋白胨2%、蔗糖2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4.7H2O 0.05%、VB1 0.005%、水余量。调节发酵液pH7.0-7.2，于4℃、 8000 r/min离心10min，收集菌体，清洗后加入脱脂奶粉10％ 、谷氨酸钠1.5％、异麦芽低聚糖3% 、柠檬酸3%复配的冻干保护剂。于低温冰箱-20℃预冻2-3 h，然后置冻干机中-60℃冻干24-28 h，制得冻干菌粉，活菌数达1×1010cfu/g。将制得的冻干菌粉按0.5g/粒装入胶囊，制成胶囊制剂。检验存活率，结果显示两歧双歧杆菌的存活率达到90%以上。
十三、本发明所述菌株S7-T5活菌制剂的疗效实验
1、治疗腹泻
参照《中药新药治疗泄泻的临床研究指导原则》标准：泻下急迫或泻下不爽，大便色黄秽臭，肛门灼热，烦热口渴，脘腹胀痛，恶心呕吐，小便短黄，舌苔黄腻，脉濡数或滑数。经检查排除为中毒性痢疾、霍乱、伤寒、副伤寒等引起的腹泻；溃疡性结肠炎、克隆病、肿瘤及药物等因素引起的腹泻；合并心脑血管、肝、肾、内分泌和造血系统严重原发性疾病，体温超过39 ℃、重度脱水或有明显中毒症状者；妊娠或准备妊娠妇女，哺乳期妇女等。
给符合上述标准的80名患者服用实施例12所制的活菌胶囊制剂，服药期间禁用其他抗生素及治疗腹泻类药物，用量为每次3粒，每日三次，疗程为一个月。疗效标准为痊愈：大便性状、次数恢复正常，大便常规及细菌培养阴性；显效：大便性状及次数明显好转，全身症状明显改善，大便每日2～3 次， 近似成形，大便常规及细菌培养复查基本接近正常；有效：大便性状、次数、大便常规及细菌培养复查好转；无效：大便性状、次数及全身症状均无好转甚至恶化，大便常规及细菌培养均无改善。
80名患者中痊愈3人，显效49人，有效15人，无效13人，总有效率为83.75%。结果表明利用本发明所述菌株S7-T5生产的活菌胶囊制剂能抑制肠道腐败菌的数量，调节菌群平衡，从治疗腹泻。
2、治疗消化不良
参照世界胃肠大会制定的功能性胃肠疾病的诊断标准-罗马Ⅲ诊断标准即：①有上腹痛、腹胀、早饱、嗳气、恶心、呕吐、厌食症状至少持续4周或12月中累计12周；②内窥镜检查未发现胃及十二指肠溃疡、糜烂、肿瘤等器质性病变,未发现食管炎,也无上述疾病病史；③实验室、B超、X射线等检查排除肝、胆、胰及肠道器质性病变；④无糖尿病、肾脏病、结缔组织病、精神病等全身性疾病；⑤无腹部手术史,无肠易激综合征。给符合上述标准的80名患者服用实施例12所制的活菌胶囊制剂，服药期间禁用其他肠道消化类药物，禁食辛辣油腻食物，用量为每次4粒，每日两次，疗程为一个月。
80名患者中，5名患者痊愈，67名患者症状明显好转，8名患者无效。治疗总有效率为90%。同时，两歧双歧杆菌胶囊剂在对消化不良治疗过程中无明显的不良作用。
以上结果说明，本发明所述菌株S7-T5比地面对照菌株S7-D5耐酸、耐氧能力（有氧、pH4.0培养条件下仍能生长）显著提高。影响双歧杆菌制剂应用的一个很大的限制因素就是其对氧气和胃酸的敏感，通过诱变使S7-T5的耐酸和耐氧能力提高，便于生产活菌制剂，同时保证其顺利通过胃酸，提高从胃到肠道的存活率，提高双歧杆菌类产品的效果，为产业化打下了坚实的基础；S7-T5由于诱变，能够耐受15%的NaCl浓度，显著提高了其耐盐能力，这也说明其抗逆能力的改善，能够适应高渗的环境提高其在肠道内的存活时间，可以减少双歧因子的添加量，从而减少生产成本。同时利用本发明所述菌株S7-T5生产的活菌胶囊制剂能促进消化，调节肠道菌群平衡，治疗腹泻。
综上可知：
本发明所述两歧双歧杆菌在有氧和pH值4.0或厌氧和pH值4.0的培养条件下能够生长，地面对照两歧双歧杆菌在有氧和pH值7.0或厌氧和pH值7.0的培养条件下能够生长，但在有氧和pH值4.0或厌氧和pH值4.0的培养条件下均不能生长。在有氧和pH值7.0的培养条件下，本发明所述两歧双歧杆菌活菌数至少为地面对照两歧双歧杆菌活菌数的10万倍。
经工业特征稳定性和基因稳定性的研究，本发明所述两歧双歧杆菌稳定遗传至30代无退化，同时能够在含量为15%NaCl的培养条件下生长，地面对照两歧双歧杆菌在含量为10%NaCl的培养条件下能够生长，但在含量为15%NaCl的培养条件下不能生长。
本发明所述两歧双歧杆菌耐氧、耐酸和耐盐特性显著提高，并且具有稳定的遗传性和工业特征，经临床验证，本发明所述菌株S7-T5生产的活菌胶囊制剂能促进消化，调节肠道菌群平衡，治疗腹泻以及消化不良，能够应用于双歧杆菌保健品和双歧杆菌药品中，具有广泛的应用前景。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 神舟太空产品高科技成果推广中心集团有限公司
<120> 太空诱变高效两歧双歧杆菌、其应用及其胶囊制剂的制备方法
<130> 2013-3
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1460
<212> DNA
<213> 两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）
<400> 1
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ccaccaaggc gttgacgggt agccggcctg agagggtgac cggccacatt gggactgaga 300
tacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct 360
gatgcagcga cgccgcgtgc gggatggagg ccttcgggtt gtaaaccgct tttgttcaag 420
ggcaaggcac ggtttcggcc gtgttgagtg gattgttcga ataagcaccg gctaactacg 480
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ccgggtacgg gcgggctgga gtgcggtagg ggagactgga attcccggtg taacggtgga 660
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acggtggatg ctggatgtgg ggccctttcc acgggtcccg cgtcggagcc aacgcgttaa 840
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atggtcgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080
tcgccgcatg ttgccagcgg gtgatgccgg gaactcatgt gggaccgccg gggtcaactc 1140
ggaggaaggt ggggatgacg tcagatcatc atgcccctta cgtccagggc ttcacgcatg 1200
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gtctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa ggcggagtcg ctagtaatcg 1320
cggatcagca acgccgcggt gaatgcgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcaagtc 1380
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<210> 2
<211> 1460
<212> DNA
<213> 两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）
<400> 2
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ggcaaggcac ggtttcggcc gtgttgagtg gattgttcga ataagcaccg gctaactacg 480
tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc gagcgttatc cggatttatt gggcgtaaag 540
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Claims (9)
1.太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5，于2011年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4886，其特征在于：
其16SrDNA序列为SEQ ID NO.2。
2.权利要求1所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5在制备药物中的应用。
3.权利要求1所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5在制备保健品中的应用。
4.根据权利要求2所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5在制备药物中的应用，其特征在于：
所述的药物为两歧双歧杆菌活菌制剂。
5.根据权利要求2所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5在制备药物中的应用，其特征在于：
其在制备调节肠道菌群平衡药物中的应用。
6.根据权利要求3所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5在制备保健品中的应用，其特征在于：
所述的保健品为两歧双歧杆菌活菌制剂。
7.根据权利要求3所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5在制备保健品中的应用，其特征在于：
其在制备调节肠道菌群平衡保健品中的应用。
8.利用权利要求1所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5制备胶囊制剂的方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：将两歧双歧杆菌S7-T5在发酵罐中培养20-24h，调节发酵液pH7.0-7.2，于4℃、 8000 r/min离心10min，收集菌体；
步骤二：清洗后加入脱脂奶粉10％ 、谷氨酸钠1.5％、异麦芽低聚糖3% 、柠檬酸3%复配的冻干保护剂，于低温冰箱-20℃预冻2-3 h，然后置冻干机中-60℃冻干24-28 h，制得冻干菌粉，活菌数达1×1010cfu/g；
步骤三：将制得的冻干菌粉按0.5g/粒装入胶囊，制成胶囊制剂。
9.根据权利要求8所述的太空诱变高效两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）S7-T5制备胶囊制剂的方法，其特征在于：
步骤一中，发酵培养基的配方为：蛋白胨2%、蔗糖2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4.7H2O 0.05%、VB1 0.005%、水余量。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1310016A (zh) * | 2001-02-13 | 2001-08-29 | 华南理工大学 | 活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊及其制备方法 |
| WO2009111177A2 (en) * | 2008-03-05 | 2009-09-11 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Compositions and methods comprising genetically enhanced obligate and facultative anaerobic bacteria for oncopathic cancer therapy |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1310016A (zh) * | 2001-02-13 | 2001-08-29 | 华南理工大学 | 活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊及其制备方法 |
| WO2009111177A2 (en) * | 2008-03-05 | 2009-09-11 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Compositions and methods comprising genetically enhanced obligate and facultative anaerobic bacteria for oncopathic cancer therapy |
| EP2270133A1 (en) * | 2008-04-22 | 2011-01-05 | Corporación Alimentaria Peñasanta (Capsa) | Method for obtaining a novel strain of bifidobacterium bifidum with activity against infection by helicobacter pylori |
| EP2481299A1 (en) * | 2011-01-31 | 2012-08-01 | Naturwohl Pharma GmbH | Bifidobacterium bifidum strains for application in gastrointestinal diseases |
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|---|
| 两歧双歧杆菌耐氧耐酸优良菌株的选育;杜少平;《现代食品科技》;20091231;916-919 * |
| 杜少平.两歧双歧杆菌耐氧耐酸优良菌株的选育.《现代食品科技》.2009,916-919. |
| 益生菌调节肠道菌群的研究现状;赵胜娟 等;《中国乳业》;20071231;28-31 * |
| 赵胜娟 等.益生菌调节肠道菌群的研究现状.《中国乳业》.2007,28-31. |
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