CN103275901B - 太空诱变高效纳豆芽孢杆菌、其应用及其片剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株太空诱变高效纳豆芽孢杆菌、其应用及其片剂的制备方法。常规诱变获得高效率的纳豆生产菌株，需对大批量的原始菌株进行诱变，且筛出的菌株变异幅度较小，很难大规模的提高发酵的产率。本发明通过一株纳豆芽孢杆菌（Bacillusnatto）S7-T3，可应用于制备降血脂、降血压的药物和保健品。本发明的纳豆芽孢杆菌产酶活性和增殖能力都大大提高，能稳定遗传至30代无退化，能够更好地利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物，分解含硫氨基酸；能够应用于制备保健品和药品，特别是降血压或降血脂的保健品和药品中。

Description

太空诱变高效纳豆芽孢杆菌、其应用及其片剂的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株太空诱变高效纳豆芽孢杆菌、其应用及其片剂的制备方法。

背景技术

纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto），别名纳豆菌，在分类学上属枯草芽孢杆菌的一种，拉丁学名为Bacillus subtilis。是从纳芽豆制品中或从自然界的稻、谷分离得到。大豆经纳豆芽孢杆菌发酵可制成纳豆，纳豆是一种具有很高药用价值的保健食品。

研究表明，纳豆的保健功能主要与纳豆芽孢杆菌发酵产生的纳豆激酶、纳豆异黄酮、皂青素、维生素K2等多种功能因子有关。1987年，H.sumi等人在experientia杂志上报道了在纳豆中发现了一种新的纤维蛋白酶——纳豆激酶，并成功提取了纳豆激酶活性物质，实验中发现纳豆激酶有很强的溶栓作用。纳豆激酶的溶栓能力比尿激酶强，每克湿纳豆溶栓效果相当于尿激酶1600IU，在胃肠中不失活。纳豆激酶对血栓的作用时间长，与尿激酶3～5分钟作用时间相比，纳豆激酶作用长达8小时，而且安全、无副作用。食用纳豆后，测定血液中形成血栓的物质会慢慢减少，溶解血栓的物质会越来越多，达到动态平衡。在此之后，人们在分析纳豆的过程中发现了更多的有益物质，纳豆含有19种氨基酸和维生素K2、叶酸、生育酚等多种维生素，22种矿物元素，并富含不饱和脂肪酸、食用纤维素等。因此，纳豆被制成各种类别的保健产品、生物制剂，越来越被人们广泛接受。

纳豆芽孢杆菌是进行纳豆生产的主要菌株，但现有的纳豆生产菌株在发酵大豆过程中，纳豆激酶、维生素、氨基酸及其它纳豆特有的营养素和生理活性物质等的含量比较低，而且在不同菌株之间也存在差异，为了提高纳豆芽孢杆菌的发酵产量，人们通过各种方法进行改进，主要包括对菌株进行常规的诱变、利用基因工程技术对菌株进行改造和优化菌株发酵过程条件这三个方面。

对菌株进行常规的诱变效率很低，如想获得高效率的纳豆生产菌株，需要对大批量的原始菌株进行诱变，才能获得目的产物产量有所提高的菌株。并且该方法筛出的菌株的变异幅度较小，很难大规模的提高发酵的产率，难以提高目的产物在保健品中的含量，影响保健品的功效。常规诱变经常发生“表型延迟”效应，即当代菌株并不表现出产量提高的优点，不能及时对其进行选育，易被丢弃；还易发生“遗传分离现象”，即突变株并不稳定，不能长久的用于大规模的工业保健品生产。

利用基因工程技术对菌株进行改造技术要求高，且获得的菌株遗传上不稳定，不能很好的实际应用。

优化菌株发酵条件过程繁琐，且不能面面俱到，得到的最适生产条件总是存有不足，且没有从根本上对菌株进行改造，因而产率的提高有限。

纳豆芽孢杆菌的发酵效率、遗传稳定性和工业特征稳定性等问题是进行大规模高质量纳豆生产的瓶颈，是以纳豆激酶为主要成分的保健品的功效不高的主要原因。

发明内容

本发明的目的是提供一株产酶活性、增殖能力和耐碱特性显著提高、且具有遗传稳定性的纳豆芽孢杆菌、其应用及其片剂的制备方法。

本发明所采用的技术方案是：

太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3，于2011年5月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4884，其特征在于：

其16SrDNA序列为SEQ ID NO.2。

所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备药物中的应用。

所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备保健品中的应用。

所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备药物中的应用，其特征在于：

所述的药物为纳豆芽孢杆菌活菌制剂。

所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备药物中的应用，其特征在于：

其在制备降血脂药物中的应用。

所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备药物中的应用，其特征在于：

其在制备降血压药物中的应用。

所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备保健品中的应用，其特征在于：

所述的保健品为纳豆芽孢杆菌活菌制剂。

所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备保健品中的应用，其特征在于：

其在制备降血脂保健品中的应用。

所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备保健品中的应用，其特征在于：

其在制备降血压保健品中的应用。

利用所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3制备片剂的方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：纳豆芽孢杆菌在发酵罐中发酵44-48h，放罐后向发酵液中加入复合保护剂：20%脱脂奶粉、2.0%麦芽糊精和2.0%蔗糖，混合均匀后，先在-20℃条件下预冻12h-14h，后移至真空冷冻干燥机，在-65℃下进行冻干20-24h，制得冻干菌粉；

发酵培养基的配方为：蛋白胨2%、蔗糖2%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄.7H₂O 0.05%、VB₁ 0.005%、水余量；

步骤二：向冻干菌粉中按比例加入辅料：可压性淀粉6%和聚乙二醇4000 1.5%，进行压片，制成片剂规格为0.25g/片。

本发明具有以下优点：

本发明所述纳豆芽孢杆菌的产酶活性比地面对照纳豆芽孢杆菌产酶活性提高82.37%；增殖能力强，其对数生长期比地面对照纳豆芽孢杆菌提前了2h，且相同生长阶段本发明所述纳豆芽孢杆菌活菌数更多；能稳定遗传至30代无退化；VP实验呈阳性，并且硫化氢产生实验结果显著，表明其能够更好地利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物，分解含硫氨基酸；能够应用于制备保健品和药品，特别是降血压或降血脂的保健品和药品中。

附图说明

图1 示本发明所述纳豆芽孢杆菌扫描电镜照片，放大倍数为10000倍；

图2 示地面对照纳豆芽孢杆菌扫描电镜照片，放大倍数为10000倍；

图3 示本发明所述纳豆芽孢杆菌培养特征；

图4 示地面对照纳豆芽孢杆菌培养特征；

图5 示本发明所述纳豆芽孢杆菌与地面对照纳豆芽孢杆菌生长曲线；

图6 示本发明所述纳豆芽孢杆菌随机扩增多态性DNA琼脂糖凝胶电泳图；

泳道1：DNA片段Marker，从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp。

泳道2：地面对照纳豆芽孢杆菌扩增结果；

泳道3：本发明所述纳豆芽孢杆菌第1代菌株扩增结果；

泳道4：本发明所述纳豆芽孢杆菌第30代菌株扩增结果。

图7 示本发明所述纳豆芽孢杆菌和地面对照纳豆芽孢杆菌的16S rDNA的二级结构V1区结构；

A：地面对照纳豆芽孢杆菌；

B：本发明所述纳豆芽孢杆菌；

图8 示本发明所述纳豆芽孢杆菌和地面对照纳豆芽孢杆菌的16S rDNA的二级结构V2区结构；

A：地面对照纳豆芽孢杆菌；

B：本发明所述纳豆芽孢杆菌；

图9 示本发明所述纳豆芽孢杆菌和地面对照纳豆芽孢杆菌的16S rDNA的二级结构V3区结构；

A：地面对照纳豆芽孢杆菌；

B：本发明所述纳豆芽孢杆菌；

图10 示本发明所述纳豆芽孢杆菌和地面对照纳豆芽孢杆菌的16S rDNA的二级结构V4区结构；

A：地面对照纳豆芽孢杆菌；

B：本发明所述纳豆芽孢杆菌；

图11 示本发明所述纳豆芽孢杆菌和地面对照纳豆芽孢杆菌的16S rDNA的二级结构V5区结构；

A：地面对照纳豆芽孢杆菌；

B：本发明所述纳豆芽孢杆菌；

图12 示本发明所述纳豆芽孢杆菌和地面对照纳豆芽孢杆菌的16S rDNA的二级结构V6区结构；

A：地面对照纳豆芽孢杆菌；

B：本发明所述纳豆芽孢杆菌；

图13 示本发明所述纳豆芽孢杆菌和地面对照纳豆芽孢杆菌的16S rDNA的二级结构V7区结构；

A：地面对照纳豆芽孢杆菌；

B：本发明所述纳豆芽孢杆菌；

图14 示本发明所述纳豆芽孢杆菌和地面对照纳豆芽孢杆菌的16S rDNA的二级结构V8区结构；

A：地面对照纳豆芽孢杆菌；

B：本发明所述纳豆芽孢杆菌；

图15 示本发明所述纳豆芽孢杆菌和地面对照纳豆芽孢杆菌的16S rDNA的二级结构V9区结构。

A：地面对照纳豆芽孢杆菌；

B：本发明所述纳豆芽孢杆菌。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明所述的一株太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3，于2011年5月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 4884。

纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）在分类学上为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

下述内容中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。

一、纳豆芽孢杆菌的诱变：

将常规纳豆芽孢杆菌（保藏编号为CGMCC 1.1086）作为出发菌株，编号为S7-D3分为2份，1份作为地面对照菌株于4℃保存，1份作为搭载菌株搭载神舟七号载人航天器进行空间诱变。

二、纤维蛋白原平板的配制

1、巴比妥钠缓冲液的配制：将169ml 0.1M盐酸加入331ml 0.1M巴比妥钠溶液中，然后用160ml水稀释，即为0.05mol/L pH7.8的巴比妥钠缓冲液。 2、将60mg纤维蛋白原溶于24ml pH7.8的巴比妥钠缓冲液中，得2.5mg/ml的纤维蛋白原缓冲液。 3、将210U凝血酶溶于7ml pH7.8的巴比妥钠缓冲液中，制得30U/ml的凝血酶缓冲液。 4、将6ml的纤维蛋白缓冲液加入直径为60mm的无菌平皿中，再加入0.3ml的30U凝血酶缓冲液，小心振荡使之混匀，25℃下过夜，使之生成乳白色薄层。

三、菌液的制取和培养：

在无菌条件下取空间搭载菌株和地面对照菌株S7-D3，加入10ml无菌生理盐水，激烈振荡制成均匀菌悬液，取1ml，由10^-1依次稀释菌液，至10^-8个/ml左右，各取0.1ml稀释液涂布于纤维蛋白原平板，每稀释梯度4个重复，37℃培养。

四、搭载菌株与地面对照菌株S7-D3的死亡率统计：

分别取等量搭载菌株与地面对照菌株S7-D3稀释至10^-7和10^-8的菌液，将两组菌液在相同条件下培养48h后，统计太空诱变后搭载菌株相对于地面对照菌株S7-D3的死亡率，死亡率（%）= （地面对照平皿菌落平均数-空间搭载平皿菌落平均数）/地面对照平皿菌落平均数，结果参见表1。

表1 搭载菌株相对于地面对照菌株S7-D3的死亡率统计

由表1可知，搭载菌株经太空诱变后，大部分菌落（86.50%）死亡，少部分通过突变存活下来，说明太空诱变能诱使搭载菌株发生变异。

四、高产菌株筛选及稳定性研究

用直径为6mm的打孔器将平皿上分离出的经太空诱变后的搭载菌株打出单菌落琼脂块，将琼脂块37℃保湿培养，待菌体长满琼脂块后将其放置于纤维蛋白原平板上，37℃培养18h，将酶活最高的菌株（水解圈直径最大）接种于试管斜面，根据水解圈直径我们筛选出4、6、7、11、31、32、36和48号菌株为初筛菌株，结果参见表2。

表2 筛选菌株水解圈直径

将初筛菌株接入已灭菌含50ml发酵培养液的三角瓶中，37℃，转速为200r/min发酵培养72h，测定酶活。酶活测定方法如下：

标准曲线的制作：用PBS（pH7.4）溶液将标准尿激酶配制成5、10、15、20、25IU/ml 5个浓度梯度，将这5个浓度梯度的尿激酶溶液用微量进样器注入平板孔内，10μl/孔，37℃培养18h，游标卡尺测量每个水解圈的垂直直径，计算水解圈面积。以水解圈面积为横坐标，以尿激酶活力单位数为纵坐标，绘制标准曲线。

纳豆激酶活性的测定：将初筛菌株发酵液于4000r/min离心15min，取上清液进行适当稀释后，用微量进样器按10μl/孔注入平板孔内，37℃培养18h，游标卡尺测量每个水解圈的垂直直径，计算水解圈面积。根据已绘制的标准曲线，测出发酵液中纳豆激酶的活性。

测定酶活后酶活比对地面对照菌株S7-D3高10%的菌株为高产菌株。应用摇瓶发酵法进行反复筛选，最终获得较高产突变株。对该菌株进行遗传稳定性试验，每24h转接一次，每连续6次测定一次酶活。经过多次复筛和稳定性试验，最终确定32号菌株为我们筛选的目的菌株，编号S7-T3，结果参见表3。

表3 筛选菌株酶活测定结果

五、地面对照菌株S7-D3与本发明所述菌株S7-T3形态特征和生理生化特征对比：

依照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》、《常见细菌系统鉴定手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》等有关内容对S7-D3菌株和S7-T3菌株进行形态特征、生理生化特征观察和鉴定。

1、地面对照菌株S7-D3与本发明所述菌株S7-T3形态特征对比

在有机物琼脂平板上37℃厌氧培养2天后，分别取S7-D3和S7-T3菌样进行相应处理后用电子扫描显微镜观察S7-T3与S7-D3细胞生长形态特征，进行对比并拍照，结果参见图1和图2。

S7-T3菌株通常为（0.7-0.8）um×(1.0-3.0)um，生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀，芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。细胞生长密集，形态规则，芽孢着色清晰。

S7-D3菌株通常为（0.5-0.7）um×(2.0-3.0)um，生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀，芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。存在两端较尖的细胞，芽孢着色较浅。

2、地面对照菌株S7-D3与本发明所述菌株S7-T3培养特征对比

在有机物琼脂平板上比较S7-D3与 S7-T3菌落生长大小、颜色及可溶性色素的产生，结果参见图3和图4。

S7-T3菌株在有机物平板上生长饱满丰茂，菌落圆形，较大，表面光滑，乳脂色，不透明，菌膜生长有一定厚度，无色素产生。

S7-D3菌株在有机物平板上生长较丰满，菌落圆形，较大，表面光滑，乳脂色，不透明，菌膜生长有一定厚度，无色素产生。

3、地面对照菌株S7-D3与本发明所述菌株S7-T3生理生化特征对比

表4 S7-D3菌株与S7-T3菌株生理生化特征

结果参见表4， 由表4得知S7-T3菌株VP实验呈阳性，硫化氢产生实验结果显著，并且S7-T3菌株能够在pH10.0的培养条件下生长，S7-D3菌株在含量为pH10.0的培养条件下不能生长。在其他生理生化特征方面，两株菌株无差异，如硝酸盐还原实验、甲基红实验，S7-T3菌株和S7-D3菌株均呈阴性。表明S7-T3菌株利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力、分解含硫氨基酸能力增强，耐碱特性提高，但与S7-D3菌株相比未发生本质上的突变。

六、地面对照菌株S7-D3与本发明所述菌株S7-T3生长曲线比较实验：

将对照菌株S7-D3和筛选菌株S7-T3同时活化16h，以相同OD值按2%的接种量转种，培养基装量50ml/300ml，pH7.0，37℃、220r/min培养24h。从0h开始，每隔2h取样一次，测培养液在600nm处测定OD值（以0h的OD值为0），并进行活菌计数，并根据统计数据生成生长曲线图，结果参见表5和图5。

表5 S7-D3和S7-T3 OD值与活菌计数结果

根据菌种OD值、活菌计数与生长曲线结果可知，菌株S7-T3的对数生长期为4h～12h，比对照菌株S7-D3的6h～14h提前了2h，且相同生长阶段菌株S7-T3的活菌数更多，表明菌株S7-T3突变后，增殖能力比菌株S7-D3更强。

七、本发明所述菌株S7-T3与对照菌株S7-D3产酶活性对比实验：

表6 对照菌株S7-D3和筛选菌株S7-T3产酶活性对比实验

依据实施例4中的酶活测定方法测定酶活，参见表6，经过三批对比实验结果可知，经太空搭载筛选到的菌株S7-T3产酶活性达到4749 IU/ml，比地面对照菌株S7-D3产酶活性（2640 IU/ml）提高了82.37%。

八、本发明所述菌株S7-T3的工业特征稳定性的研究

将S7-T3在固体培养基中连续进行30代的传代培养，每10代按照相同的方法将S7-T3和S7-D3培养，并进行发酵培养测定菌株活菌数和产酶活性，每批测定重复3次，计算平均值，实验结果如表7所示，结果显示S7-T3菌株第10代、第20代和第30代产酶活性和活菌数均无明显差异，表明经过多次传代，S7-T3菌株的工业特性稳定。

表7 S7-T3菌株工业特征稳定性的研究

九、本发明所述菌株S7-T3基因稳定性的研究：

1、16SrDNA测序研究基因组的稳定性

将S7-T3在PDA固体培养基中进行30代的传代培养，第一代和第三十代的菌株分别进行基因组的提取和16S rDNA序列的测定，测定结果显示第一代和第三十代16S rDNA序列完全一致，如SEQ ID NO.2所示，说明经多次传代S7-T3的基因是稳定的。

2、随机扩增多态性DNA(RAPD)法测定S7-T3遗传稳定性

筛选获得的随机引物P2：GAAGGAGGCA，分别对S7-D3，第1代的S7-T3以及第30代的S7-T3基因组进行PCR扩增，扩增程序为：94℃预变性3 min，94℃变性50 s，36℃复性1 min，72℃延伸2 min，循环40次，最后72℃延伸5 min， 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增，结果如图6所示，结果说明经过多次传代S7-T3的基因是稳定的。

十、本发明所述S7-T3菌株与对照S7-D3菌株16SrDNA的相关研究

利用16SrDNA通用引物27F和1492R，由于菌株目标片段大小约为1.5 kb，所以每个产物需用ABI3730XL测序仪测两个反应，再对结果进行拼接，使用ContigExpress序列分析软件拼接。运用MEGA 4.0分析软件，对16SrDNA进行核苷酸差异分析。利用RNA structure 4.6和RnaViz 2.0分析软件对16S rDNA二级结构可变区进行分析。

1、地面对照菌株S7-D3与本发明所述菌株S7-T3的16S rDNA序列差异

S7-D3菌株和S7-T3菌株16SrDNA序列通过测序分析，所得S7-D3菌株16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示，S7-T3菌株16SrDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

表8 S7-T3菌株和S7-D3菌株16SrDNA序列差异

参见表8，通过16SrDNA测序分析，经过太空搭载后S7-T3菌株与地面对照菌株S7-D3相比，其序列有12个位点差异。

2、地面对照菌株S7-D3与本发明所述菌株S7-T3的16SrDNA二级结构差异

RNA有两大主要功能：一是某些病毒的遗传物质；二是参与蛋白质的合成。这些与细胞分化、代谢、记忆的储存等有重要关系。这些功能与RNA二级结构的稳定性，自由能密切相关。常用的计算自由能的方法有热力学微扰法及热力学微积分法等。16SrRNA二级结构，是在菌株16SrDNA碱基序列（一级结构）基础上，用最小自由能（ENERGY）算法或比较序列分析方法预测的，菌株S7-D3与菌株S7-T3的16SrDNA二级结构可变区最小自由能参见表9。

表9 菌株S7-D3与菌株S7-T3的16SrDNA二级结构可变区最小自由能（ENERGY）

用16SrRNA可变区二级结构图形分析，比较S7-T3菌株与S7-D3菌株二级结构在9个可变区二级结构中茎的长度、环的数目和类型、茎的碱基对、以及环内部碱基是否有不同，以此来判定菌株的变异程度。因为通常菌株的16SrRNA二级结构比其一级结构具有更高的保守性，16SrDNA碱基序列（一级结构）的改变并不一定会引起其二级结构的改变。如果菌株的16SrRNA二级结构也发生了比较明显的变化，则说明菌株的变异比较显著，不仅发生了16SrDNA碱基序列改变，还发生了空间构象的改变。

通过对S7-D3菌株和S7-T3菌株的16SrDNA二级结构的9个可变区分析，结果参见图7-图15，显示在V2、 V3、V5和V9区存在差异。

十一、地面对照菌株S7-D3与本发明所述菌株S7-T3的VP实验

乙酰甲基甲醇试验，简称VP实验，肠杆菌科各菌属在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP反应，测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。

表10 S7-D3菌株与S7-T3菌株甲基红实验和VP实验结果

取4支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，S7-D3菌株与S7-T3菌株各2支，以无菌操作分别接种少量S7-D3菌和S7-T3菌至以上相应试管中，置37℃恒温箱中，厌氧培养24-48h，取出以上试管，振荡2min。另取4支空试管相应标记菌名，分别加入3-5ml以上对应管中的培养液，再加入40％NaOH溶液10-20滴，并用牙签挑入约0.5-1mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，两菌株中一支试管置37℃恒温箱中保温10min，另一支试管置37℃恒温箱中保温20min，若培养液呈红色，记录为VP实验呈阳性（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为VP实验呈阴性（用“－”表示）。结果参见表10，S7-T3菌株葡萄糖蛋白胨培养液在加入氢氧化钠10min后，培养液呈橘黄色，在加入氢氧化钠30min后，培养液呈红色，而S7-D3菌株葡萄糖蛋白胨培养液均无变化，表明S7-T3菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力比S7-D3菌株强。

十二、地面对照菌株S7-D3与本发明所述菌株S7-T3的硫化氢产生实验

有些杆菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。

在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于36±1℃培养24-28h，培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。也可用醋酸铅纸条法，将待试菌接种于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度，用管塞压住置36±1℃培养1-6天，纸条变黑为阳性。

表11 S7-D3菌株与S7-T3菌株硫化氢产生实验结果

结果参见表11，S7-T3菌株硫化氢产生实验结果比对照菌株，表明S7-T3菌分解含硫氨基酸能力比S7-D3菌株强。

十三、本发明所述菌株S7-T3活菌制剂的生产工艺

纳豆芽孢杆菌在发酵罐中发酵44-48h，放罐后向发酵液中加入复合保护剂(20%脱脂奶粉+2.0%麦芽糊精+2.0%蔗糖)，混合均匀后，先在-20℃条件下预冻12h-14h，后移至真空冷冻干燥机，在-65℃下进行冻干20-24h，制得冻干菌粉。

向冻干菌粉中按比例加入辅料：可压性淀粉6%，聚乙二醇4000 1.5%，进行压片，制成片剂规格为0.25g/片，检验存活率，结果显示纳豆芽孢杆菌的存活率达到90%以上。

十四、本发明所述菌株S7-T3活菌制剂的降血脂疗效实验

实验采用5月龄雄小白鼠，活菌制剂来自于实施例13所制备的片剂。将老鼠分为A和B两组，均喂食胆固醇与脂肪，使其肥胖和患上高血脂症。然后，对A组老鼠喂食纳豆芽孢杆菌片剂，B组则不喂食纳豆芽孢杆菌片剂，用量为一日三次，每次2片。历时35天后，比较两组喂食结果：A组老鼠腹腔脂肪降低35%，血清中总胆固醇含量降低20%，中性脂肪降低70%，均恢复正常值。但对人体有益的磷脂和高密度脂蛋没有影响；而没有喂食纳豆芽孢杆菌片剂的B组老鼠的肥胖与高血脂症状没有丝毫改善。另外，A组老鼠肝脏中的中性脂肪仅为B组老鼠的一半，纳豆芽孢杆菌片剂大大降低了与脂肪肝形成密切相关的肝脏中甘油三酯以及胆固醇的含量，表明纳豆芽孢杆菌片剂对高胆固醇和高甘油三酯症以及导致动脉硬化和缺血性心脏病，均有一定的预防作用。从而证实纳豆芽孢杆菌活菌制剂具有降低血脂功能。

十五、本发明所述菌株S7-T3活菌制剂的降血压疗效实验

以3个月疗程为重点观察，106名高血压患者在服用纳豆芽孢杆菌片剂前均做查体、心电图、心脏X线检查、眼底血管检查和血、尿常规和血脂（胆固醇、β-脂蛋白、甘油三酯）测定等辅助检查，以作对照。服用纳豆芽孢杆菌片剂期间，用量为一日三次，每次4片，并认真记录血压、舌象、脉象变化，以及头错、头痛、眩晕、耳鸣、失眠、多梦、腰膝酸软、心悸、四肢麻困、浮肿、夜尿等症状。服药期间停用其他降压药和镇静药，正常生活工作。观察期结束后停用一切降压药，继续观察血压变化一个月。

106名高血压患者中，血压降至正常水平的人数为91名，占总人数的85.85%，血压明显下降的人数为5名，占总人数的4.72%，无效人数为10名，占总人数的9.43%，降血压总有效率为90.57%；服用纳豆芽孢杆菌片剂后对高血压患者有大幅度的血压（收缩压和舒张压）下降作用（约23/11毫米汞柱）；

对服用纳豆芽孢杆菌片剂3个月后停药一月内血压变化的观察结果显示：患者血压较稳定，维持正常范围，表明纳豆芽孢杆菌片剂有较稳定的降血压作用；同时，纳豆芽孢杆菌片剂在对高血压治疗过程中无明显的不良作用。

以上结果说明，本发明所述菌株S7-T3比地面对照菌株S7-D3产纳豆激酶活性提高了82.37%；对数生长期提前了2h，相应的生长阶段活菌数明显增多，增殖能力变强；稳定遗传至30代无退化，具有遗传稳定性；S7-T3由于诱变，能够耐受10%的NaCl浓度，显著提高了其耐碱能力，这也说明其抗逆能力的改善，能够适应碱性的环境提高其生存能力。S7-T3通过搭载后，VP实验呈阳性，硫化氢产生实验结果显著，说明其更能有效的利用葡萄糖进行发酵。同时，利用本发明所述菌株生产的活菌制剂对降血脂和降血压有明显的疗效。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 神舟太空产品高科技成果推广中心集团有限公司

<120> 太空诱变高效纳豆芽孢杆菌、其应用及其片剂的制备方法

<130> 2013-5

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1456

<212> DNA

<213> 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）

<400> 1

catattctgt ccaccttcgg cggctggctc ctaaaaggtt acctcaccga cttcgggtgt 60

tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg 120

catgctgatc cgcgattact agcgattcca gcttcacgca gtcgagttgc agactgcgat 180

ccgaactgag aacagatttg tgggattggc ttaacctcgc ggtttcgctg ccctttgttc 240

tgtccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc 300

ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa 360

ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 420

cgacaaccat gcaccacctg tcactctgcc cccgaagggg acgtcctatc tctaggattg 480

tcagaggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc 540

caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca gtcttgcgac cgtactcccc 600

aggcggagtg cttaatgcgt tagctgcagc actaaggggc ggaaaccccc taacacttag 660

cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt 720

cgctcctcag cgtcagttac agaccagaga gtcgccttcg ccactggtgt tcctccacat 780

ctctacgcat ttcaccgcta cacgtggaat tccactctcc tcttctgcac tcaagttccc 840

cagtttccaa tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc acatcagact taagaaaccg 900

cctgcgagcc ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg 960

gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttaggta ccgtcaaggt accgccctat 1020

tcgaacggta cttgttcttc cctaacaaca gagctttacg atccgaaaac cttcatcact 1080

cacgcggcgt tgctccgtca gactttcgtc cattgcggaa gattccctac tgctgcctcc 1140

cgtaggagtc tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga tcaccctctc aggtcggcta 1200

cgcatcgtcg ccttggtgag ccgttacctc accaactagc taatgcgccg cgggtccatc 1260

tgtaagtggt agccgaagcc accttttatg tttgaaccat gcggttcaaa caaccatccg 1320

gtattagccc cggtttcccg gagttatccc agtcttacag gcaggttacc cacgtgttac 1380

tcacccgtcc gccgctaaca tcagggagca agctcccatc tgtccgctcg actgcatgta 1440

tagcacccgc ccttcc 1456

<210> 2

<211> 1471

<212> DNA

<213> 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）

<400> 2

caccccaatc atctgtccca ccttcggcgg ctggctccta aaaggttacc tcaccgactt 60

cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc 120

accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccagct tcacgcagtc gagttgcaga 180

ctgcgatccg aactgagaac agatttgtgg gattggctta acctcgcggt ttcgctgccc 240

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gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc ttagagtgcc caactgaatg 360

ctggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac 420

gagctgacga caaccatgca ccacctgtca ctctgccccc gaaggggacg tcctatctct 480

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tccatctgta agtggtagcc gaagccacct tttatgtttg aaccatgcga ttcaaacaac 1320

catccggtat tagccccggt ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg 1380

tgttactcac ccgtccgccg ctaacatcag ggagcaagct cccatctgtc cgctcgactt 1440

gcatgtatta ggcacgccgc cagcgttcgt c 1471

Claims (10)

1.太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3，于2011年5月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4884，其特征在于：

其16SrDNA序列为SEQ ID NO.2。

2.权利要求1所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备药物中的应用。

3.权利要求1所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备保健品中的应用。

4.根据权利要求2所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备药物中的应用，其特征在于：

所述的药物为纳豆芽孢杆菌活菌制剂。

5.根据权利要求2所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备药物中的应用，其特征在于：

其在制备降血脂药物中的应用。

6.根据权利要求2所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备药物中的应用，其特征在于：

其在制备降血压药物中的应用。

7.根据权利要求3所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备保健品中的应用，其特征在于：

所述的保健品为纳豆芽孢杆菌活菌制剂。

8.根据权利要求3所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备保健品中的应用，其特征在于：

其在制备降血脂保健品中的应用。

9.根据权利要求3所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3在制备保健品中的应用，其特征在于：

其在制备降血压保健品中的应用。

10.利用权利要求1所述的太空诱变高效纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）S7-T3制备片剂的方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：纳豆芽孢杆菌在发酵罐中发酵44-48h，放罐后向发酵液中加入复合保护剂：20%脱脂奶粉、2.0%麦芽糊精和2.0%蔗糖，混合均匀后，先在-20℃条件下预冻12h-14h，后移至真空冷冻干燥机，在-65℃下进行冻干20-24h，制得冻干菌粉；

发酵培养基的配方为：蛋白胨2%、蔗糖2%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄.7H₂O 0.05%、VB₁ 0.005%、水余量；

步骤二：向冻干菌粉中按比例加入辅料：可压性淀粉6%和聚乙二醇4000 1.5%，进行压片，制成片剂规格为0.25g/片。