CN102533719A - 一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，属于生物技术领域。为了解决现有技术中的纳豆芽孢杆菌的抗菌性能较差的技术问题，提供一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，该方法通过对出发纳豆芽孢杆菌菌种进行A、活化；B、复合诱变：接种到含8-Mop的菌悬液中，进行长波紫外线辐照，再进行培养得到诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体；然后进行C、种子培养；D、发酵培养；E、提取、筛选：对发酵液进行离心分离，提取上清液，对上清液进行检测分析，得到高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌。本发明的方法具有原料易得，设备简单，成本低廉，且工艺过程简单的优点；通过复合诱变、筛选后得到的纳豆芽孢杆菌具有抗菌活性高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳豆芽孢杆菌，尤其涉及一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，属于生物技术领域。
背景技术
纳豆芽孢子杆菌是1905年东京大学的泽村教授(Sawamura)从纳豆中首次发现并分离出来的，并将该菌株命名为Bacillusnatto Sawamura。此后于1946年经美国Smith等人的研究，认为纳豆芽孢杆菌应属于枯草杆菌的亚种，因此，此后，在分类上将纳豆菌归属于枯草杆菌。但由于纳豆菌的维生素要求性或以γ-聚谷氨酸为主要成分的粘质物生产特性，以及噬菌体的感染特异性显然与枯草杆菌不同，故还是将纳豆菌与枯草杆菌区别，使用纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto或Bacillus natto)的名称。
纳豆芽孢杆菌能够产生多种酶，能分解脂肪、碳水化合物、蛋白质等大分子物质，从而使用于发酵时发酵产品中含有丰富的寡聚糖、有机酸、氨基酸等多种容易被人体吸收的成分。因此，具有较高的营养保健等功效。纳豆芽孢杆菌还具有抗菌活性的作用，纳豆芽孢杆菌抗菌代谢产物对人体或畜牧均无毒副作用，因此，可作为天然的防腐剂来开发应用。如将它运用在食品添加剂方面，其作用可相当于防腐剂，由于其无毒无副作用，特别适合广大消费者对天然食品防腐剂这一特点的要求。虽然纳豆芽孢杆菌具有较多的优点，但是由于其抗菌性能存在效果不佳的缺陷，在应用上存在一定的限制性。
发明内容
本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提供一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，该方法具有提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的目的。
本发明的目的之一是通过下列技术方案来实现的：一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，该方法包括以下步骤：
A、活化：将纳豆芽孢杆菌菌种接种到斜面培养基上进行活化培养，从斜面上刮取活化后的纳豆芽孢杆菌，用无菌生理盐水配制成菌悬液；
B、复合诱变：取上述菌悬液与8-Mop混合制成含8-Mop的菌悬液，振摇，放入无菌平皿内，进行长波紫外线辐照，然后将上述经过长波紫外线辐照后的含8-Mop的菌悬液稀释后，涂布于平板培养基上进行培养，生长成熟后，挑选正常型单菌落接种到斜面培养基进行培养，在培养温度为25℃～35℃的条件下培养40～60小时，得到诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体；
C、种子培养：将上述步骤B中诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体接种到液体种子培养基进行摇床培养，培养温度为25℃～35℃，培养时间为24～48小时，培养结束后得到种子液；
D、发酵培养：将上述步骤C中得到的种子液接种到液体发酵培养基中进行摇床培养，培养温度为28～35℃，培养时间为36～60小时，培养结束后得到发酵液；
E、提取、筛选：将上述的发酵液进行离心分离，提取上清液，对上清液进行检测分析，筛选得到高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌。
本发明的上述一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法中所述的纳豆芽孢杆菌的保藏编号为：CGMCC 1.1086。所述的斜面培养基及平板培养基都是采用本领域常规的培养基，所述的斜面培养基及平板培养基均为普通营养肉汤琼脂培养基。所述的普通营养肉汤琼脂培养基中含有以下组份的质量含量：蛋白胨：10.0g/L；牛肉膏粉：3.0g/L；氯化钠：5.0g/L；琼脂：14.0g/L；pH值为7.2±0.2；其余为蒸馏水。上述所述的液体种子培养基为LB液体培养基。所述的LB液体培养基中含有以下组份的质量含量：胰蛋白胨：10g/L；酵母提取物：5g/L；氯化钠：10g/L；调节pH值为7.0，其余为蒸馏水。利用本发明的方法对纳豆芽孢杆菌进行诱变培养后，并通过对诱变后的纳豆芽孢杆菌进行筛选，通过对其代谢产物的抗菌性能进行检测分析，确定具有高抑菌性能的诱变后的纳豆芽孢杆菌，上述步骤C至步骤E实质上是对诱变后的纳豆芽孢杆菌的筛选，通过筛选后得到诱变后的纳豆芽孢杆菌具有更高的抗菌性能，有利于提高其在产业上的应用。
上述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法步骤A中所述的菌悬液的浓度为107～108个细胞/mL。
上述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法步骤B中所述的含8-Mop的菌悬液中8-Mop的质量浓度为1.0％～7.0％。采用上述浓度的含8-Mop的菌悬液能够更好的实现诱变效果，并与长波紫外线辐照相结合，达到复合诱变的效果，从而提高纳豆芽孢杆菌的抑菌活性，所述的8-Mop是8-甲氧基补骨脂素的简写。作为进一步的优选，所述的含8-Mop的菌悬液中8-Mop的质量浓度为3.0％～5.0％。8-甲氧基补骨脂素具有光敏性，紫外辐照下突变效果更好。
上述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法步骤B中所述的长波紫外线辐照的时间为5s～125s。长波紫外线辐照是为了对纳豆芽孢杆菌进行诱变，提高纳豆芽孢杆菌的抑菌性能，同时与8-Mop相结合使用，起到复合诱变的效果。作为进一步的优选，所述的长波紫外线辐照的时间为45s～85s。
上述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法步骤B中所述的挑选正常型单菌落接种到斜面培养基进行培养，所述的培养温度为28℃～30℃的条件下培养45～48小时。
上述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法步骤C中所述的培养温度为28℃～30℃，培养时间为30～40小时。
上述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法步骤D中所述的液体发酵培养基中含有以下组成的质量含量：胰蛋白胨：1～5g/L；酵母膏：1～20g/L；玉米浆：1～10g/L；葡萄糖：5～15g/L；甘油5～30g/L；可溶性淀粉：5～20g/L；CaCO3：5～8g/L；NaCl：2～5g/L；pH值为7.0～7.4；其余为蒸馏水。
作为进一步的优选，所述的液体发酵培养基中含有以下组成的质量含量：胰蛋白胨：3～4g/L；酵母膏：4～10g/L；玉米浆：3～6g/L；葡萄糖：8～12g/L；甘油10～15g/L；可溶性淀粉：10～15g/L；CaCO3：6～7g/L；NaCl：3～4g/L；pH值为7.0～7.4；其余为蒸馏水。
上述所述的以上清液进行检测分析，是采用杯盘法对上清液的抗菌活性进行测定，即以大肠杆菌作为指示菌，在盛有普通营养肉汤琼脂培养基的平皿上涂上浓度为106～107/mL的指示菌悬液，放置牛沣杯，直接吸取上述提取得到的上清液200ul至牛沣杯中，在37℃的条件下培养24小时，观察抑菌圈状况，测定透明抑菌圈直径。从而确定其抗菌活性，从而实现筛选得到高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌。
综上所述，与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明的方法所用的原料易得，设备简单，成本低廉，且工艺过程简单，有利于工业化生产。
2.本发明的方法所得到的纳豆芽孢杆菌抑菌性能高，对其筛选过程中产生的代谢产物进行检测分析，即对提取得到的上清液进行检测分析，其抗菌活性能够达到出发纳豆芽孢杆菌菌株的抗菌性能的1.2～1.5倍左右。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
以下实施例中所述的斜面培养基及平板培养基均采用普通营养肉汤琼脂培养基；所述的普通营养肉汤琼脂培养基中含有以下组份的质量含量：蛋白胨：10.0g/L；牛肉膏粉：3.0g/L；氯化钠：5.0g/L；琼脂：14.0g/L；pH值为7.2±0.2；其余为蒸馏水。所述的普通营养肉汤琼脂培养基的配制方法为本领域的常规方法。
以下实施例中所述的液体种子培养基为LB液体培养基，所述的LB液体培养基中含有以下组份的质量含量：胰蛋白胨：10g/L；酵母提取物：5g/L；氯化钠：10g/L；调节pH值为7.0，其余为蒸馏水。所述的LB液体培养基的配制方法为本领域的常规方法。
以下实施例中所述的纳豆芽孢杆菌菌种是购买自江苏绿科生物技术有限公司，所述的纳豆芽孢杆菌菌种的保藏编号为：CGMCC1.1086。
实施例1
活化：将纳豆芽孢杆菌菌种接种到斜面培养基上进行活化培养，在室温下，从斜面上刮取活化后的纳豆芽孢杆菌，用无菌生理盐水配制成浓度为107～108个细胞/mL菌悬液；
复合诱变：取上述浓度的菌悬液与8-Mop混合制成含8-Mop浓度为2.2mg/mL的菌悬液，振摇1.5h后，吸取4mL放入至无菌平皿内，进行长波紫外线辐照65s，然后将经过长波紫外线辐照后的含8-Mop的菌悬液稀释后，涂布于平板培养基上进行培养，待生长成熟后挑选正常型单菌落接种到斜面培养基进行培养，在培养温度为30℃的条件下培养48h后，得到诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体；
种子培养：挑取几环上述的诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体接种到装有30mL液体种子培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度30℃，摇床转速为150rpm的条件下培养36小时，培养结束后得到种子液；
发酵培养：取上述得到的种子液2mL接种到装有30mL液体发酵培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度28℃，摇床转速180rpm的条件下培养48小时，培养结束后得到发酵液；所述的液体发酵培养基中含有以下组成的质量含量：
胰蛋白胨：4g/L；酵母膏：2g/L；玉米浆：2g/L；葡萄糖：10g/L；甘油：5g/L；可溶性淀粉：15g/L；CaCO3：8g/L；NaC l：3g/L；初始pH值为7.4；其余为蒸馏水。
提取：将上述的发酵液在转速为10000rpm的条件下，离心分离25m i n，提取上清液，对上清液进行检测分析，筛选得到高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌。
将上述上清液的抑菌性进行检测分析，采用杯盘法进行测定，即以大肠杆菌作为指示菌，在盛有普通营养肉汤琼脂培养基的平皿上涂上浓度为106～107/mL的指示菌悬液，放置牛沣杯，直接吸取上述提取得到的上清液200u l至牛沣杯中，在37℃的条件下培养24小时，观察抑菌圈状况，测定透明抑菌圈直径，抗菌活性同出发菌株的抗菌活性相比提高1.28倍。
实施例2
活化：将纳豆芽孢杆菌菌种接种到斜面培养基上进行活化培养，在室温下，从斜面上刮取活化后的纳豆芽孢杆菌，用无菌生理盐水配制成浓度为107～108个细胞/mL菌悬液；
复合诱变：取上述浓度的菌悬液与8-Mop混合制成含8-Mop浓度为4.2mg/mL的菌悬液，振摇1.0h后，吸取4mL放入至无菌平皿内，进行长波紫外线辐照45s，然后将经过长波紫外线辐照后的含8-Mop的菌悬液稀释后，涂布于平板培养基上进行培养，待生长成熟后挑选正常型单菌落接种到斜面培养基进行培养，在培养温度为35℃培养40小时后，得到诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体；
种子培养：挑取几环上述的诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体接种到装有30mL液体种子培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度28℃，摇床转速为150rpm的条件下培养40小时，培养结束后得到种子液；
发酵培养：取上述得到的种子液3ml接种到装有30mL液体发酵培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度32℃，摇床转速150rpm的条件下培养48小时，培养结束后得到发酵液；所述的液体发酵培养基中含有以下组成的质量含量：
胰蛋白胨：5g/L；酵母膏：1g/L；玉米浆：4g/L；葡萄糖：15g/L；甘油：15g/L；可溶性淀粉：10g/L；CaCO3：6g/L；NaCl：4g/L；初始pH值为7.2；其余为蒸馏水。
提取：取上述的发酵液在转速为10000rpm的条件下，离心分离25min，提取上清液，对上清液进行检测分析，筛选得到高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌。
上述对上清液的抑菌性进行检测分析，采用杯盘法进行测定，具体的测定方法同实施例1中的一致，不再赘述，其抗菌活性同出发菌株抗菌活性相比提高1.32倍。
实施例3
活化：将纳豆芽孢杆菌菌种接种到斜面培养基上进行活化培养，在室温下，从斜面上刮取活化后的纳豆芽孢杆菌，用无菌生理盐水配制成浓度为107～108个细胞/mL菌悬液；
复合诱变：取上述浓度的菌悬液与8-Mop混合制成含8-Mop浓度为1.2mg/mL的菌悬液，振摇1.5h后，吸取4mL放入至无菌平皿内，进行长波紫外线辐照85s，然后将经过长波紫外线辐照后的含8-Mop的菌悬液稀释后，涂布于平板培养基上进行培养，待生长成熟后挑选正常型单菌落接到斜面培养基上进行培养，在培养温度为28℃的条件下培养52小时后，得到诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体；
种子培养：挑取几环上述的诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体接种到装有30mL液体种子培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度35℃，摇床转速为150rpm的条件下培养24小时，培养结束后得到种子液；
发酵培养：取上述得到的种子液1mL接种到装有30mL液体发酵培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度30℃，摇床转速为200rpm的条件下培养48小时，培养结束后得到发酵液；所述的液体发酵培养基中含有以下组成的质量含量：
胰蛋白胨：3g/L；酵母膏：4g/L；玉米浆：5g/L；葡萄糖：5g/L；甘油：10g/L；可溶性淀粉：5g/L；CaCO3：7g/L；NaCl：5g/L；初始pH值为7.0；其余为蒸馏水。
提取：取上述的发酵液在转速为10000rpm的条件下，离心分离25min，提取上清液，对上清液进行检测分析，筛选得到高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌。
对上述上清液的抑菌性进行检测分析，采用杯盘法进行测定，具体的测定方法同实施例1中的一致，不再赘述，其抗菌活性同出发菌株的抗菌活性相比提高1.43倍。
实施例4
活化：将纳豆芽孢杆菌菌种接种到斜面培养基上进行活化培养，在室温下，从斜面上刮取活化后的纳豆芽孢杆菌，用无菌生理盐水配制成浓度为107～108个细胞/mL菌悬液；
复合诱变：取上述浓度的菌悬液与8-Mop混合制成含8-Mop浓度为1.0mg/mL的菌悬液，振摇2.0h后，吸取4mL放入至无菌平皿内，进行长波紫外线辐照125s，然后将经过长波紫外线辐照后的含8-Mop的菌悬液稀释后，涂布于平板培养基上进行培养，待生长成熟后挑选正常型单菌落接到斜面培养基上进行培养，在培养温度为25℃的条件下培养60小时后，得到诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体；
种子培养：挑取几环上述的诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体接种到装有30mL液体种子培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度28℃，摇床转速为150rpm的条件下培养45小时，培养结束后得到种子液；
发酵培养：取上述得到的种子液1mL接种到装有30mL液体发酵培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度35℃，摇床转速为200rpm的条件下培养36小时，培养结束后得到发酵液；所述的液体发酵培养基中含有以下组成的质量含量：
胰蛋白胨：2g/L；酵母膏：10g/L；玉米浆：10g/L；葡萄糖：15g/L；甘油：5g/L；可溶性淀粉：15g/L；CaCO3：5g/L；NaCl：2g/L；初始pH值为7.2；其余为蒸馏水。
提取：取上述的发酵液在转速为10000rpm的条件下，离心分离25min，提取上清液，对上清液进行检测分析，筛选得到高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌。
上述对上清液的抑菌性进行检测分析，采用杯盘法进行测定，具体的测定方法同实施例1中的一致，不再赘述，其抗菌活性同出发菌株抗菌活性相比提高1.5倍。
实施例5
活化：将纳豆芽孢杆菌菌种接种到斜面培养基上进行活化培养，在室温下，从斜面上刮取活化后的纳豆芽孢杆菌，用无菌生理盐水配制成浓度为107～108个细胞/mL菌悬液；
复合诱变：取上述浓度的菌悬液与8-Mop混合制成含8-Mop浓度为5.0mg/mL的菌悬液，振摇2.0h后，吸取4mL放入至无菌平皿内，进行长波紫外线辐照100s，然后将经过长波紫外线辐照后的含8-Mop的菌悬液稀释后，涂布于平板培养基上进行培养，待生长成熟后挑选正常型单菌落接到斜面培养基上进行培养，在培养温度为30℃的条件下培养40小时后，得到诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体；
种子培养：挑取几环上述的诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体接种到装有30mL液体种子培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度28℃，摇床转速为150rpm的条件下培养40小时，培养结束后得到种子液；
发酵培养：取上述得到的种子液1mL接种到装有30mL液体发酵培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度30℃，摇床转速为200rpm的条件下培养50小时，培养结束后得到发酵液；所述的液体发酵培养基中含有以下组成的质量含量：
胰蛋白胨：1g/L；酵母膏：20g/L；玉米浆：3g/L；葡萄糖：12g/L；甘油：20g/L；可溶性淀粉：5g/L；CaCO3：6g/L；NaCl：2g/L；初始pH值为7.4；其余为蒸馏水。
提取：取上述的发酵液在转速为10000rpm的条件下，离心分离25m i n，提取上清液，筛选得到高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌。
将上述得到的高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌的抑菌性进行检测，采用杯盘法进行测定，具体的测定方法同实施例1中的一致，不再赘述，其抗菌活性同出发菌株抗菌活性相比提高1.42倍。
实施例6
活化：将纳豆芽孢杆菌菌种接种到斜面培养基上进行活化培养，在室温下，从斜面上刮取活化后的纳豆芽孢杆菌，用无菌生理盐水配制成浓度为107～108个细胞/mL菌悬液；
复合诱变：取上述浓度的菌悬液与8-Mop混合制成含8-Mop浓度为7.0mg/mL的菌悬液，振摇2.0h后，吸取4mL放入至无菌平皿内，进行长波紫外线辐照5s，然后将经过长波紫外线辐照后的含8-Mop的菌悬液稀释后，涂布于平板培养基上进行在30℃条件下培养，待生长成熟后挑选正常型单菌落接到斜面培养基上进行培养，在培养温度为30℃的条件下培养48小时后，得到诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体；
种子培养：挑取几环上述的诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体接种到装有30mL液体种子培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度28℃，摇床转速为150rpm的条件下培养48小时，培养结束后得到种子液；
发酵培养：取上述得到的种子液1mL接种到装有30mL液体发酵培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度28℃，摇床转速为200rpm的条件下培养60小时，培养结束后得到发酵液；所述的液体发酵培养基中含有以下组成的质量含量：
胰蛋白胨：2g/L；酵母膏：15g/L；玉米浆：6g/L；葡萄糖：8g/L；甘油：30g/L；可溶性淀粉：20g/L；CaCO3：5g/L；NaCl：3g/L；初始pH值为7.2；其余为蒸馏水。
提取：取上述的发酵液在转速为10000rpm的条件下，离心分离25min，提取上清液，对上清液进行检测分析，筛选得到高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌。
将上述得到的高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌的抑菌性进行检测，采用杯盘法进行测定，具体的测定方法同实施例1中的一致，不再赘述，其抗菌活性同出发菌株抗菌活性相比提高1.38倍。
实施例7
活化：将纳豆芽孢杆菌菌种接种到斜面培养基上进行活化培养，在室温下，从斜面上刮取活化后的纳豆芽孢杆菌，用无菌生理盐水配制成浓度为107～108个细胞/mL菌悬液；
复合诱变：取上述浓度的菌悬液与8-Mop混合制成含8-Mop浓度为6.2mg/mL的菌悬液，振摇2.0h后，吸取4mL放入至无菌平皿内，进行长波紫外线辐照105s，然后将经过长波紫外线辐照后的含8-Mop的菌悬液稀释后，涂布于平板培养基上进行在30℃条件下培养，待生长成熟后挑选正常型单菌落接到斜面培养基上进行培养，在培养温度为28℃的条件下培养48小时后，得到诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体；
种子培养：挑取3环上述的诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体接种到装有30mL液体种子培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度28℃，摇床转速为150rpm的条件下培养35小时，培养结束后得到种子液；
发酵培养：取上述得到的种子液2mL接种到装有30mL液体发酵培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度32℃，摇床转速为200rpm的条件下培养45小时，培养结束后得到发酵液；所述的液体发酵培养基中含有以下组成的质量含量：
胰蛋白胨：3g/L；酵母膏：5g/L；玉米浆：1g/L；葡萄糖：9g/L；甘油：12g/L；可溶性淀粉：12g/L；CaCO3：5g/L；NaCl：2g/L；初始pH值为7.2；其余为蒸馏水。
提取：取上述的发酵液在转速为10000rpm的条件下，离心分离25m i n，提取上清液，筛选得到高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌。
将上述得到的高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌的抑菌性进行检测，采用杯盘法进行测定，具体的测定方法同实施例1中的一致，不再赘述，其抗菌活性同出发菌株抗菌活性相比提高1.45倍。
实施例8
活化：将纳豆芽孢杆菌菌种接种到斜面培养基上进行活化培养，在室温下，从斜面上刮取活化后的纳豆芽孢杆菌，用无菌生理盐水配制成浓度为107～108个细胞/mL菌悬液；
复合诱变：取上述浓度的菌悬液与8-Mop混合制成含8-Mop浓度为5.2mg/mL的菌悬液，振摇2.0h后，吸取4mL放入至无菌平皿内，进行长波紫外线辐照65s，然后将经过长波紫外线辐照后的含8-Mop的菌悬液稀释后，涂布于平板培养基上进行在30℃条件下培养，待生长成熟后挑选正常型单菌落接到斜面培养基上进行培养，在培养温度为28℃的条件下培养48小时后，得到一级种子菌体；
种子培养：挑取3环上述的一级种子菌体接种到装有30mL液体种子培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度30℃，摇床转速为150rpm的条件下培养30小时，培养结束后得到种子液；
发酵培养：取上述得到的种子液2mL接种到装有30mL液体发酵培养基的250mL摇瓶内进行摇床培养，培养温度32℃，摇床转速为200rpm的条件下培养45小时，培养结束后得到发酵液；所述的液体发酵培养基中含有以下组成的质量含量：
胰蛋白胨：4g/L；酵母膏：3g/L；玉米浆：4g/L；葡萄糖：11g/L；甘油：13g/L；可溶性淀粉：11g/L；CaCO3：7g/L；NaCl：4g/L；初始pH值为7.0；其余为蒸馏水。
提取：取上述的发酵液在转速为10000rpm的条件下，离心分离25m i n，提取上清液，筛选得到高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌。
将上述得到的高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌的抑菌性进行检测，采用杯盘法进行测定，具体的测定方法同实施例1中的一致，不再赘述，其抗菌活性同出发菌株的抗菌活性相比提高1.43倍。
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (10)
1.一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
A、活化：将纳豆芽孢杆菌菌种接种到斜面培养基上进行活化培养，从斜面上刮取活化后的纳豆芽孢杆菌，用无菌生理盐水配制成菌悬液；
B、复合诱变：取上述菌悬液与8-Mop混合制成含8-Mop的菌悬液，振摇，放入无菌平皿内，进行长波紫外线辐照，然后将上述经过长波紫外线辐照后的含8-Mop的菌悬液稀释后，涂布于平板培养基上进行培养，生长成熟后，挑选正常型单菌落接种到斜面培养基进行培养，在培养温度为25℃～35℃的条件下培养40～60小时，得到诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体；
C、种子培养：将上述步骤B中的诱变后的纳豆芽孢杆菌菌体接种到液体种子培养基进行摇床培养，培养温度为25℃～35℃，培养时间为24～48小时，培养结束后得到种子液；
D、发酵培养：将上述步骤C中得到的种子液接种到液体发酵培养基中进行摇床培养，培养温度为28～35℃，培养时间为36～60小时，培养结束后得到发酵液；
E、提取、筛选：将上述的发酵液进行离心分离，提取上清液，对上清液进行检测分析，筛选得到高抗菌性能的纳豆芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，其特征在于：步骤A中所述的菌悬液的浓度为107～108个细胞/mL。
3.根据权利要求1所述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，其特征在于：步骤B中所述的含8-Mop的菌悬液中8-Mop的质量浓度为1.0％～7.0％。
4.根据权利要求3所述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，其特征在于：步骤B中所述的含8-Mop的菌悬液中8-Mop的质量浓度为3.0％～5.0％。
5.根据权利要求1所述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，其特征在于：步骤B中所述的长波紫外线辐照的时间为5s～125s。
6.根据权利要求5所述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，其特征在于：所述的长波紫外线辐照的时间为45s～85s。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，其特征在于：步骤B中所述的挑选正常型单菌落接种到斜面培养基进行培养，所述的培养温度为28℃～30℃的条件下培养45～48小时。
8.根据权利要求1-6中任意一项所述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，其特征在于：步骤C中所述的培养温度为28℃～30℃，培养时间为30～40小时。
9.根据权利要求1-6中任意一项所述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，其特征在于：步骤D中所述的液体发酵培养基中含有以下组成的质量含量：胰蛋白胨：1～5g/L；酵母膏：1～20g/L；玉米浆：1～10g/L；葡萄糖：5～15g/L；甘油5～30g/L；可溶性淀粉：5～20g/L；CaCO3：5～8g/L；NaCl：2～5g/L；pH值为7.0～7.4；其余为蒸馏水。
10.根据权利要求9所述的一种提高纳豆芽孢杆菌抗菌性能的方法，其特征在于：步骤D中所述的液体发酵培养基中含有以下组成的质量含量：胰蛋白胨：3～4g/L；酵母膏：4～10g/L；玉米浆：3～6g/L；葡萄糖：8～12g/L；甘油10～15g/L；可溶性淀粉：10～15g/L；CaCO3：6～7g/L；NaCl：3～4g/L；pH值为7.0～7.4；其余为蒸馏水。
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| CN104522796A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-04-22 | 杭州元佩特生物科技有限公司 | 一种食疗黄米汁的制备方法 |
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