CN101979531A - 一种高产纳豆激酶液体发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产纳豆激酶液体发酵方法，包括发酵的配方和条件。本发明选用纳豆固体发酵高产菌株，对其进行诱变驯化，筛选出纳豆激酶的高产菌株，再将其接入液体培养基进行发酵，在摇瓶液体发酵下酶活可以达到1400IU/mL。本发明采用了豆粕酶解液来作为中试发酵的氮源，在10L发酵罐中，发酵单位可以达到2650IU/mL。采用本技术方案，得到的发酵产物的纳豆激酶产率高，酶活力强，节省原料，节省能源，所用的原料来源方便且丰富，成本低，提取工艺简便易行。

Description

一种高产纳豆激酶液体发酵方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域。涉及纳豆激酶高产菌株的选育，豆粕酶解液制品和纳豆激酶的液体发酵方法。

背景技术

血栓性疾病严重威胁着人类的生命与健康，其发病率和死亡率居各种疾病之首。溶解血栓是治疗这类疾病的首选方法。目前临床上治疗血栓主要是通过注射链激酶(Streptokinase，SK)、尿激酶(Urokinase，UK)、组织型纤溶酶原激活剂(Tissue-type Plasminogen Activator，t-PA)和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(Single-chain Urokinase Type Plasminogen Activator，scu-PA)等。这些药物均为纤溶酶原激活剂，通过激活纤溶酶原生成纤溶酶而降解纤维蛋白。但在实际应用中它们都具有一定的局限性，或毒性强，副作用大，或体内半衰期比较短，或生产成本高，价格昂贵等，难以成为适用的大众药品。

1987年须见洋行在日本的传统发酵食品纳豆中发现了一种具有强烈纤溶活性的酶，定名为纳豆激酶(Nattokinase，NK)，是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，它可分泌到细胞外。研究表明，NK是一种丝氨酸蛋白酶，能显著溶解体内外血栓，具有很强的纤溶活性，不但能直接作用于纤溶蛋白，而且还能激活体内纤溶酶原，从而增加内源性纤溶酶的量与作用。纳豆激酶在人体的活性半衰期远远超过目前临床上治疗血栓所使用的溶栓制剂和半衰期，一般在8～10小时。此外纳豆激酶也具有一定的激酶作用，可激活内源酶原。具有安全性好，作用迅速，成本低，可由细菌发酵生产等优点，可用于开发新一代溶栓剂或保健食品，是一种很有潜力的新型口服溶栓药物，具有极为广阔的前景。

由于纳豆激酶具有目前市场上正在使用的溶栓药物所不具有的优点，那么提高纳豆激酶的单位产物的酶活力和生产效率对纳豆激酶的推广具有重要的意义。在发酵的方式上，纳豆激酶现在的生产方式主要是以发酵为主，发酵工艺有液体发酵和固体发酵两种。传统发酵方式为固体发酵即直接以黄豆为原料进行发酵产酶，产物即传统食品纳豆。这种方式的特点是操作比较简便、工艺简单，但是若想进一步分离提取纳豆激酶却十分复杂，同时，纳豆具有的特殊气味直接影响人们对它的接受程度。从工业角度考虑，由于固态发酵易染菌，难散热，回收率低，很难满足有严格要求的药品尤其是生物制品的生产要求，因此我公司采用纳豆激酶的液态发酵方式，解决了纳豆激酶工业化放大的技术难题，同时也为后期提取纯化降低了成本。目前关于纳豆激酶的液体发酵的专利有：申请号为02116667的发明专利申请、申请号为02121352.6的发明专利申请、申请号为200610129353.7的发明专利申请，以及

纳豆激酶液体发酵的优化和分离纯化及酶学性质的研究》、《纳豆激酶高产菌株筛选及发酵工艺优化研究》、《纳豆激酶的发酵工艺及其制剂学研究》等文章。分别介绍了不同纳豆激酶液体发酵的方法，其所用主要原料为大豆蛋白胨，酵母膏、牛肉膏为原料直接进行发酵，这些方法生产的纳豆激酶的酶活并不高，而且价格较贵，因此在纳豆激酶的工业化生产上受到了一定的限制。本发明的目的就是针对液体发酵方法的不足，提供一种自己筛选的纳豆激酶的高产菌株，并采用豆粕酶解液作为氮源进行液体发酵的方法，，节约了成本的同时也提高了纳豆激酶的生产效率和酶活。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产纳豆激酶液体发酵方法，克服现有技术的不足，提供一种产酶率高，酶活力强的纳豆激酶菌株，提供一种提取工艺简便易行，节省能源和原料，成本低，对环境的污染少的液体发酵工艺。采用纳豆激酶的固体发酵高产菌株H-13，经诱变驯化筛选得到的用于液体发酵的高产菌株W-0923，以大豆蛋白胨为氮源进行摇瓶阶段的发酵，以豆粕的胰蛋白酶解液作为主要的氮源进行10L液体发酵。

本发明的技术方案为：一种高产纳豆激酶液体发酵方法，包括以下步骤：

(1)纳豆激酶液体发酵菌株的筛选及诱变驯化

选用纳豆固体发酵高产菌株H-13，采用紫外，微波诱变，高浓度纤维蛋白原驯化平板的方法进行纳豆激酶高产菌株的筛选，得到高产菌株W-0923。确定了紫外线诱变菌株的最适条件为40W紫外灯，照射距离为30cm，菌悬液浓度为100个/mL，照射时间为20s。微波诱变的最适条件为：频率为2450MHz的700W微波炉进行微波诱变，最适菌悬液浓度10⁴个/mL，作用时间为5s。

(2)豆粕酶解液的制备

取豆粕(蛋白含量约为43％)，磨碎，加水拌匀，调节pH值，加入胰蛋白酶，加入量为豆粕重量的2％，水浴5～7个小时，反应结束后，在加热灭活，冷却至室温，再经板框过滤，即得豆粕酶解液。过滤后的豆粕酶解液呈黄色，pH值在7左右，其氨基氮的含量为0.2％，胨的含量7％。按照大豆蛋白胨相关指标：氨基氮为3.1％(干基)，胨含量为80％(干基)，本发明加入20％的豆粕酶解液作为氮源代替2％的大豆蛋白胨。

(3)发酵

1)摇瓶发酵工艺

摇瓶液体发酵培养基的组成：1％麦芽糖，2％大豆蛋白胨、0.4％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄、0.02％CaCl₂；摇瓶发酵的最优条件为：温度为37℃，初始pH为7.2，培养基装液量为20mL/100mL三角瓶，接种量2％，摇床转速为120r/min。在最优摇床发酵条件下，结合经过优化后的液体发酵工艺，摇瓶液体发酵酶活可以达到1400IU/mL。

2)10L发酵罐的发酵工艺

在10L发酵罐中，我们用豆粕的蛋白酶解液来代替大豆蛋白胨作为氮源，搅拌联动控制溶氧，分阶段控制溶氧在30％以上，发酵周期为65-80h，发酵单位可以达到2650IU/mL，基本解决了纳豆激酶液体发酵工业化生产的瓶颈问题。

与已有的纳豆激酶发酵技术相比，本发明的优点在于：产酶率高，酶活力强，提取工艺简便易行，节省能源和原料，在提高NK产量的同时，降低了生产成本，对环境的污染少为工业化生产奠定了基础。

具体实施方式

1、纳豆激酶液体发酵菌株诱变驯化

1)菌悬液的制备方法：

将经新鲜斜面活化24h的菌体接人液体种子培养基中，于37℃、200r/min振荡培养至指数生长期，离心收集菌体，用灭菌的生理盐水洗涤2-3次后，移入装有灭菌玻璃珠的三角瓶内振荡，制成细胞浓度为10⁶-10⁸个/mL的菌悬液。

2)紫外微波诱变：

将种子液的稀释度为100个/mL，在超净工作台上，取5mL即处理时的菌悬液的浓度在菌悬液于无菌平板中，置于磁力搅拌器上，调整培养皿至紫外灯(40W)的距离为30cm。打开紫外灯预热20-30min，然后在黑暗条件下，打开皿盖，边搅拌边用紫外线照射，时间为20s。

3)微波诱变：

调整700W微波炉频率为2450MHz，取10ml细胞浓度为10⁴个/mL的菌悬液细胞悬液置于灭过菌的直径为90mm的培养皿中，将培养皿置于微波炉中，开启微波炉，作用时间为5s，关闭微波炉。

4)高浓度纤维蛋白平板驯化：

纤维蛋白平板法：称取标准纤维蛋白原粉，溶于0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中，配制成高浓度的纤维蛋白原溶液，取9mL该溶液与1mL20U/mL的凝血酶溶液，混匀后倒平板置于37℃下温育，至凝结成乳白色凝块。将上述诱变后的菌株取0.2mL涂于板上，37℃恒温培养，筛选出具有抗高浓度纤维蛋白原的菌株。

2、摇瓶发酵工艺实施例

培养基的配置：麦芽糖10g，大豆蛋白胨20g、KH₂PO₄ 4g、MgSO₄ 0.5g、CaCl₂ 0.2g、蒸馏水1000mL，用NaOH调pH至7.2，加热沸腾，放置室温，分装到50个100mL的三角瓶中，高温灭菌30min，放置室温。

发酵：在超净工作台上，将菌种接入上述的三角瓶中，温度控制37℃，培养基装液量为20mL/100mL三角瓶，接种量2％，摇床转速为120r/min，时间为24h。

3、10L发酵罐的发酵工艺实施例

豆粕酶解液的制备：取豆粕(蛋白含量约为43％)1kg，磨碎，加入50kg水拌匀，调节pH值至7.0-7.5左右，加入20g胰蛋白酶，55℃水浴5～7个小时，反应结束后，在100℃沸水浴中加热灭活10min，冷却至室温，再经板框过滤，即得豆粕酶解液。将上述豆粕酶解液直接打入配料罐中备用。

发酵液的配置：豆粕的蛋白酶解液(代替大豆蛋白胨作为氮源)2kg，麦芽糖100g，KH₂PO₄40g、MgSO₄ 5g、CaCl₂ 2g、蒸馏水8L，调pH至7.2左右，定容到10L，高压灭菌，放置室温。

发酵：按接种量2％的比例接入菌种，温度控制37℃，搅拌联动控制溶氧在30％以上，发酵周期为65-80h。

上述实施例，只是本发明的较适实施例，并非用来限制本发明的实施范围，故凡以本发明权利要求所述的构造、特征及其原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求之内。

Claims (7)

1.一种高产纳豆激酶液体发酵方法，其特征在于采用自选纳豆激酶的高产菌株，以大豆蛋白胨为氮源进行摇瓶阶段的发酵。以豆粕酶解液作为主要的氮源进行10L液体发酵，其过程包括：菌种的选育，豆粕酶解液的制备，高压灭菌，接种，发酵。

2.关于权利要求1的一种高产纳豆激酶液体发酵方法，其特征在于所用菌株为纳豆固体发酵高产菌株H-13经诱变驯化得到的用于液体发酵的高产菌株W-0923，该菌株属枯草芽孢杆菌属纳豆亚种(Bacillus 

natto)。

3.关于权利要求1所述的摇瓶发酵，其特征在于摇瓶液体发酵培养基的组成为：1％麦芽糖，2％大豆蛋白胨、0.4％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄、0.02％CaCl₂。

4.关于权利要求1所述的摇瓶发酵，其特征在于摇瓶发酵的条件为：温度37℃，初始pH为7.2，培养基装液量为20mL/100mL三角瓶，接种量2％，摇床转速为120r/min，发酵周期为24h。

5.关于权利要求1所述的10L发酵，其特征在于所用的氮源为豆粕酶解液，其制备过程是：将豆粕磨碎后加水拌匀，调节pH值至7.0-7.5左右，加入胰蛋白酶，加入量为豆粕重量的2％，55℃水浴5～7个小时，反应结束后，在100℃沸水浴中加热灭活10min，冷却至室温，再经板框过滤，即得豆粕酶解液。

6.关于权利要求1所述的10L发酵，其特征在于10L发酵罐中培养基的组成为：1％麦芽糖，20％豆粕酶解液、0.4％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄、0.02％CaCl₂。

7.关于权利要求1所述的10L发酵，其特征在于10L发酵罐中发酵条件为：温度37℃，pH为7.2，接种量2％，搅拌联动控制溶氧，分阶段控制溶氧在30％以上，发酵周期为65-80h。