CN104830819B - 一种液态发酵生产木聚糖酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过溶氧和搅拌联动提高木聚糖酶活的液态发酵方法，属于生物化工技术领域。本发明根据木聚糖酶发酵过程的菌种生长和产酶特性，利用溶氧与搅拌联动分时段控制溶氧的调节方法，极大提高木聚糖酶的酶活，降低生产成本。该方法简单，易操作，适用于木聚糖酶生产的工艺调控，对于木质纤维素的生物加工和饲料行业酶制剂的研究与开发，具有重要的理论意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种液态发酵生产木聚糖酶的溶氧和搅拌联动分时段控制方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
木聚糖是植物半纤维素的主要成分，是仅次于纤维素的第二丰富的可再生资源。木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称。随着资源和环境压力在人类文明发展中日益加剧，木聚糖酶的研究与应用越来越重要。目前，木聚糖酶在造纸、食品、饲料、保健品、生物化工等方面都具有很好的应用价值，因此开发高效的木聚糖酶具有重要意义。
木聚糖酶发酵属于好氧发酵，发酵液中的溶氧浓度的高低和时段控制会直接影响木聚糖酶的发酵产量。
目前生产木聚糖酶的技术领域，涉及溶氧间接控制有三个相关专利报道，河南天冠企业集团有限公司申报的专利“一种液体木聚糖酶的发酵生产方法”（CN200810231567.4）报道利用玉米芯制备木聚糖酶的发酵方法：按通风量0.2～0.6v/v、搅拌转速150～350rpm进行通风搅拌发酵。沈阳市信利生物技术发展有限公司申报了“制备木聚糖酶的液态深层发酵方法”（CN200710158066.3）提出培养发酵在30℃，150-200rpm下，通风0.1-1.5vvm，70-80h，在发酵中后期40-60h之间补充营养物质。河南仰韶生化工程有限公司申报了“食品级液体木聚糖酶生产新工艺”（CN200610017837.2），提出了采用稀醪发酵，温度30±1℃，罐压0.06-0.08Mpa，通风量60-90m3/hr，培养约30hr接入大发酵罐，温度控制在30±1℃，罐压0.06-0.08Mpa，通风量600-1000m3/hr，控制pH值4.6-4.8。上述三篇文献通过通风比或搅拌转速调整，来生产木聚糖酶，但是均没有提出通过溶氧与搅拌联动分时段控制溶氧的调节方法，因此本发明根据菌体生长和产酶两个过程对氧气的需求不一样特点，采用溶氧电极和搅拌转速联动控制，提出动态调整溶氧，提高酶量、降低能耗的控制方法，在专利或文献中均未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种将溶氧和搅拌联动分时段控制发酵罐内溶氧的方法，以达到提高木聚糖酶的产量、生产效率的技术效果。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
利用实验室保藏的里氏木霉菌种制作斜面，培养3-5天，接种到摇瓶中，在28～32℃的温度条件下培养1～2天，然后将培养瓶菌种按培养基10％（重量百分比）接种到灭菌好的种子罐中，在28～34℃温度下，根据菌体在不同时段生长和产酶特点，调节通风比，并将溶氧和搅拌转速联动，确保发酵前期菌体生长较好，在后期产酶较多。而传统工艺搅拌转速维持150-200rpm很难保证菌体生长和产酶需要。
研究发现，在发酵0~4.5h，发酵液体粘度较小，只要在较低转速下即可保证菌体生长速率快，而在对数生长和发酵后期，菌体浓度不断升高，流体粘度增加，一方面需要大量溶氧，另一方面氧气的传质阻力增大，菌体摄氧能力下降。仅靠转速盲目提高，无法真正反应发酵罐内的溶氧真实情况。因此依靠溶氧参数控制，让发酵罐内搅拌转速随着菌体的生长和产酶需要时时调整，不仅可以提高菌体的生物量，还可提高了木聚糖酶的酶活性。
一种液态发酵生产木聚糖酶的方法，采用溶氧和搅拌联动控制法制得，具体步骤如下：
1）将里氏木霉在斜面试管内，28℃下培养3-5天得到里氏木霉菌种，将里氏木霉菌种用无菌生理盐水冲洗，稀释配制成108cfu/mL的孢子悬乳液；
2）将该孢子悬乳液以发酵培养基重量的10%的接种量接入装有发酵培养基的摇瓶内，在28～32℃条件下，培养1～2天得到培养瓶菌种；
3）再将培养瓶菌种按种子培养基重量的10%接种到预制有种子培养基的种子罐中，在28-34℃下，调节pH值为5.0，在转速为200rpm-400rpm、通风比为1.0vvm-2.0vvm、溶氧参数为15%-40%的条件下发酵120h-150h即可得到木菌糖酶，其中，该发酵过程包括发酵前期，发酵中期，发酵后期。
发酵前期，将培养瓶菌种接种到预制有种子培养基的种子罐的0-4h，控制搅拌速度为200rpm，当进入发酵4h-5h后，控制发酵罐内的温度为28℃，溶氧参数为15%-20%，搅拌速度为200-300rpm，通风比控制为1-2vvm，罐内压力为0.1MPa；发酵至28h，28h-34h内，增加溶氧参数至30%-45%，搅拌转速控制为300-400rpm，通风比控制为1-1.5vvm，罐内压力为0.1MPa，即为发酵中期；发酵至40h-42h后，将搅拌速度为200-400rpm，溶氧参数控制为25-35%，通风比控制为1-2vvm下，继续发酵至120h-150h即可得到木聚糖酶，也为发酵后期。
本申请针对里氏木霉发酵产木聚糖酶在发酵罐上的涉及溶氧的相关工艺条件进行了研究。搅拌转速和通风比通过影响溶氧水平从而影响产酶，单独控制搅拌转数和通风比对产酶的影响不大。通过溶氧与搅拌联动并配合通风比的调节实现分段控氧，可以有效的提高产酶。优化后最大酶活提升到2406.175U/mL。比优化前酶活提升50%及以上。
附图说明
图1为不同搅拌转速下菌体生物量的变化。
图2为不同搅拌转速下酶活的变化。
图3不同通风比条件下菌体生物量的变化。
图4 不同通风比条件酶活的变化。
具体实施方式
实施例1：30L全自动发酵罐中进行木聚糖酶的液态发酵
本发明所有实施例中的所有培养基均可在市场上买到。本实例的条件如下：
1)斜面培养基：即PDA培养基，新鲜去皮土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂粉20g/L，pH自然。
2)种子培养基：木糖20g/L，酵母膏20g/L，（NH4)2SO4 0.5g/L，NaNO3 0.5g/L，pH自然。
3)摇瓶发酵培养基：乳糖45.13g/L，玉米浆15.94g/L，（NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 2.73g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，无水CaCl2 0.6g/L，吐温-80 1mL/L，灭菌前pH调4.0。
将里氏木霉在斜面试管内，28℃下培养3-5天得到里氏木霉菌种，将里氏木霉菌种用无菌生理盐水冲洗，稀释配制成108cfu/mL的孢子悬乳液；
将该孢子悬乳液以发酵培养基重量的10%的接种量接入装有发酵培养基的摇瓶内，在28℃条件下，180r/min下培养38h得到培养瓶菌种；
再将培养瓶菌种按种子培养基重量的10%接种到预制有种子培养基的种子罐中，发酵前期，控制搅拌速度为200rpm，当进入发酵4h-5h后，控制发酵罐内的温度为28℃，溶氧参数为15%，搅拌速度为300rpm，通风比控制为1.5vvm，罐内压力为0.1MPa；
确定罐内液体达到饱和时的溶氧为100ppm，为最大饱和浓度。保持罐内溶氧参数始终维持在最大饱和浓度的20%，发酵至28h，28h-34h内，保持溶氧参数至40%，搅拌转速控制为380rpm，通风比控制为1.3vvm，罐内压力为0.1MPa， 继续发酵至40h-42h，即为发酵中期；
发酵至40h-42h后，将搅拌速度为250rpm，溶氧参数为30%，通风比控制为1.4 vvm，继续发酵至120h即可得到木菌糖酶，酶活提高50%，溶氧的分段控制不仅提高了菌体的生物量，还大大提高了木聚糖酶的酶活性，使酶活增至未控制溶氧时的1.87倍。
实施例2：300L 全自动发酵罐中进行木聚糖酶的液态发酵
本发明所有实施例中的所有培养基原料均可在市场上买到，步骤1）、2）及相关配方同例1。
仅步骤3）中，再将培养瓶菌种按种子培养基重量的10%接种到预制有种子培养基的种子罐中，首先确定当罐内液体达到饱和时的溶氧为100ppm，为最大饱和浓度。发酵前期，控制搅拌速度为200rpm，当进入发酵4h-5h后，控制发酵罐内的温度为28℃，溶氧参数为18%，搅拌速度为250rpm，通风比控制为1.2vvm，罐内压力为0.1MPa；
保持罐内溶氧参数始终维持在最大饱和浓度的20%，发酵至28h，28h-34h内，调整溶氧参数至36%，搅拌转速控制为330rpm，通风比控制为1.4vvm，罐内压力为0.1MPa，继续发酵至40h-42h，即为发酵中期；
发酵至40h-42h后，将搅拌速度为280rpm，溶氧参数为28%，通风比控制为1.8vvm，继续发酵至120h即可得到木菌糖酶，酶活提高70%。
实施例3：3000L 全自动发酵罐中进行木聚糖酶的液态发酵
本发明所有实施例中的所有培养基原料均可在市场上买到，步骤1）、2）及相关配方同例1。
仅步骤3）中，再将培养瓶菌种按种子培养基重量的10%接种到预制有种子培养基的种子罐中，当罐内液体达到饱和时的溶氧为100ppm，为最大饱和浓度。发酵前期，控制搅拌速度为200rpm，当进入发酵4h-5h后，控制发酵罐内的温度为28℃，溶氧参数为18%，搅拌速度为280rpm，通风比控制为1.6vvm，罐内压力为0.1MPa；
保持罐内溶氧参数始终维持在最大饱和浓度的18%，发酵至28h，28h-34h内，增加溶氧参数至43%，搅拌转速控制为350rpm，通风比控制为1.4vvm，罐内压力为0.1MPa，即为发酵中期；
发酵至40h-42h后，将搅拌速度为250rpm，溶氧参数为32%，通风比控制为1.6vvm，继续发酵至120h即可得到木菌糖酶，酶活提高90%。
在木聚糖酶的发酵过程中恒定通风比，控制搅拌转数以满足细胞生长和产物合成对氧的需求。由图1，2可知，前期，搅拌转速300rpm的生物量最大，200rpm的其次，400rpm下的生物量最小。后期，400rpm下的酶活最高，其次为300rpm，200rpm下的酶活最低。在发酵的不同阶段，菌体代谢对氧的需求不同，搅拌转数控制溶氧容易造成溶氧不足或过剩，200rpm的转速导致对数生长期时溶氧跌零时间过长，影响菌体生长从而影响酶的积，所以酶活低。400rpm的转速下虽然溶氧跌零时间短，但高速搅拌形成的剪切力使得菌丝断裂，不利于菌体的生长。
发酵0~4.5h，转速200rpm下的菌体生长速率快，4.5h~20h，转速300rpm下的菌体生长快，20h~36h，转速400rpm下的菌体生长速率快，36h后200rpm下的菌体生长速率快。发酵24~62h，搅拌转速400rpm下的酶积累速度最快，62h后，200rpm下的酶积累速度最快。木聚糖酶的发酵是好氧发酵，溶氧浓度是微生物发酵产木聚糖酶的一个重要参数，溶氧过高会导致后期酶活力降低，过低会影响前期菌体的生长。因此在发酵初期，应控制较低的搅拌转速，避免搅拌产生的剪切力使得接入的种子液中的菌丝断裂。在菌体生长到一定数量后，分时段逐渐加大搅拌转速，避免低转速下溶氧不足致使菌体呼吸受到抑制，但到达菌体生长的对数期过后应逐渐降低搅拌转速，同样是为了避免菌丝受剪切力的伤害。
搅拌转数恒定，改变通风比控制罐内溶氧。由图3可知，通风比1.0vvm的条件下生物量最大，1.5vvm的生物量其次，2.0vvm最小。由于1.5vvm和2.0vvm的通风比条件下，发酵初期产生了大量泡沫，使部分菌体随泡沫附着在罐壁上，造成生物量的损失。由图4可知，通风比2.0vvm条件下的酶活最小，通风比1.0vvm条件下的酶活最大但与通风比1.5vvm相差无几。因此发酵初期的泡沫不仅影响菌体生长，造成发酵液中的生物量损失，同时还影响木聚糖酶的积累。
溶氧的控制使得菌体能在对数生长期摄取到足够的氧，保证了菌体的大量生长和活性，避免了因为菌体大量生长造成溶氧跌零致使菌体的呼吸受到抑制。实际上，溶氧分段控制时，初期的低搅拌速度也避免了大量泡沫的产生，避免了大量菌体粘附于罐壁而造成菌体和产物的损失。后期溶氧控制在30%时的酶活是后期溶氧控制在15%时的酶活的1.6倍，然而，继续加大后期溶氧至45%时，酶活仅增加了3%。所以，菌体进行酶的合成时并非溶氧越高越好，在培养过程中并不是维持溶氧越高越好。因此，在实际生产中应控制合适的溶氧水平是十分重要的。
Claims (3)
1.一种液态发酵生产木聚糖酶的方法，采用溶氧和搅拌联动控制法制得，其特征在于，具体步骤如下：
1）将里氏木霉在斜面试管内，28℃下培养3-5天得到里氏木霉菌种，将里氏木霉菌种用无菌生理盐水冲洗，稀释配制成108cfu/mL的孢子悬乳液；
2）将该孢子悬乳液以发酵培养基重量的10%的接种量接入装有发酵培养基的摇瓶内，在28～32℃条件下，培养1～2天得到培养瓶菌种；
3）再将培养瓶菌种按种子培养基重量的10%接种到有种子培养基的种子罐中，在28-34℃下，调节pH值为5.0，在转速为200rpm-400rpm、通风比为1.0vvm-2.0vvm、溶氧参数为15%-45%的条件下发酵120h-150h即可得到木聚糖酶，其中，该发酵过程包括发酵前期、发酵中期、发酵后期；
所述的发酵前期，将培养瓶菌种接种到有种子培养基的种子罐的0-4h，控制搅拌速度为200rpm，当进入发酵4h-5h后，控制发酵罐内的温度为28℃，溶氧参数为15%-20%，搅拌速度为200-300rpm，通风比控制为1-2vvm，罐内压力为0.1MPa；
所述的发酵中期，发酵至28h，28h-34h内，增加溶氧参数至30%-45%，搅拌转速控制为300-400rpm，通风比控制为1-1.5vvm，罐内压力为0.1MPa；
所述的发酵后期，发酵至40h-42h后，将搅拌速度控制为350-400rpm，溶氧参数控制为25%-35%，通风比控制为1-1.5vvm下，继续发酵至120h-150h即可得到木聚糖酶。
2.根据权利要求1所述的液态发酵生产木聚糖酶的方法，其特征在于溶氧参数为15%-45%是根据发酵罐最大转速和通风量调到最大后，发酵罐内所能溶解的最大氧的浓度定为100g/L，作为溶氧参数的百分比的确定依据。
3.根据权利要求1所述的液态发酵生产木聚糖酶的方法，其特征在于，所述的步骤1）中斜面试管内设置有斜面培养基，所述的斜面培养基为PDA培养基，是将新鲜去皮土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂粉20g/L混合后制得；
所述的种子培养基是将木糖20g/L，酵母膏20g/L，（NH4)2SO4 0.5g/L，NaNO3 0.5g/L混合后制得；
所述的发酵培养基是将乳糖45.13 g/L，玉米浆15.94 g/L，（NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 2.73g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，无水CaCl2 0.6g/L，吐温-80 1mL/L，混合调pH至4.0后灭菌制得。
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