CN104328099A - 一种重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,属于发酵工程技术领域。本发明以重组毕赤酵母N24菌株为发酵菌种,首先在以小麦B淀粉浆提供碳源的培养基中进行增殖培养,然后通过流加含小麦B淀粉浆的补料培养基实现酵母细胞的高密度培养,最后通过阶段性流加甲醇溶液诱导调控产木聚糖酶。该方法工艺简单,酶活力高,环保无污染,具有较高的经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域,具体地涉及一种重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法。
背景技术
β-葡聚糖酶属半纤维素酶类,广义而言,包括了一切能分解β-糖苷键连成的葡萄糖聚合物的酶系。由于作用方式的不同,可分为内切和外切β-葡聚糖酶两类,按其所作用的不同β-糖昔糖类型,又分为如内切β-1,4葡聚糖酶,外切β-1,3葡聚糖酶等酶种;而在啤酒生产中,则特指能分解大麦胶的大麦β-葡聚糖酶。微生物中,细菌、线菌和霉菌均能产生线菌和霉菌均能产生β-葡聚糖酶,但绝大多数菌株的酶系对大麦β-葡聚糖无特异性,只分解由β-1,2、β-1,3、β-1,4和β-1,6键分别构成的纤维素及昆布聚糖等,这些产酶菌广泛存在于青霉属、木霉属、曲霉属、镰刀菌属、毛霉属和纤维素诺卡氏菌属中,如娄地青霉和木素木霉等。而能特异分解大麦β-葡聚糖的酶主要来源于芽袍杆菌属和曲霉属,国内外已报道的有:枯草杆菌、地衣芽饱杆菌、短杆菌、黑曲霉、米曲霉、臭曲霉、冻土毛霉和溶黄质厄氏菌等,该产品可以有效分解麦类和谷类植物胚乳细胞壁中的β-葡聚糖,在饲料中可用于降低非淀粉多糖(NSP)及其抗营养因子的含量,改善畜禽对营养物质的吸收,提高畜禽的生长速度和饲料转化效率。在啤酒酿造上用于降低麦汁黏度,改善过滤性能,提高麦芽溶出率,防止啤酒浑浊,稳定啤酒质量;在啤酒生产糖化过程中,添加该酶对缩短麦汁的过滤时间有明显的效果。尤其是对用大麦作辅料或者当大麦、麦芽质量较差时,效果最佳。
小麦加工主要是面粉生产,并可进一步深加工成小麦淀粉和谷朊粉及相应转化产品。在小麦淀粉生产过程中,由于小麦本身化学组成、加工工艺等因素,又会产生小麦A、B两种淀粉,A淀粉是精制淀粉,含蛋白质等杂质很少,可作为成品淀粉,广泛使用于各行各业;也可进一步深加工成变性淀粉、淀粉糖等淀粉衍生物,从而提高其附加值。B淀粉是生产A淀粉时由离心脱水机刮下来的“废物”,又称尾淀粉、淤渣淀粉、刮浆淀粉或淀粉糊精,通常可达原料面粉总质量的20%左右,它主要是由小的淀粉粒、损伤的大淀粉颗粒以及少量细胞壁物质、面筋碎片、戊聚糖和色素组成。小麦B淀粉浆在现有工艺中通常是做废水处理掉,但是此废水成分复杂、浓度高,一直是水处理的难题之一;若直接排放会对水体及周边环境产生污染,治理污染的成本更高。此外,近些年来也有利用小麦B淀粉浆制高麦芽糖浆、麦芽糊精、食品添加剂、酒精及柠檬酸及α淀粉等方面的报道出现。
目前国内外主要利用微生物法生产β-葡聚糖酶,其中能特异分解β-葡聚糖的酶类主要来源于芽抱菌属和霉属(黑曲霉、木霉)的代谢产物。但是对于真核毕赤酵母产葡聚糖酶的研究仍然较少。CN 102559641 A公开了一种重组毕赤酵母液体深层发酵生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶方法,该方法利用重组毕赤酵母作为菌种,以酵母粉、蛋白胨、酵母氮源、生物素、甘油、H3PO4、CaSO4·2H2O、K2SO4、MgSO4·7H2O、KOH为原料,进行液体深层发酵生产β-葡聚糖酶,发酵滤液经板框过滤,过滤后得到滤渣及β-葡聚糖酶滤液;所得到的β-葡聚糖酶滤液在经过超滤和喷雾干燥后得到粉状β-葡聚糖酶产品;所得滤渣干燥后可以作为饲料添加剂,不产生任何废弃物,实现了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高产率发酵,使本发明可以适用于工业生产。但是本发明所采用原料均为合成原料,成本较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,针对现有技术的不足提供一种重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,该方法工艺简单,酶活力高,变废为宝,环保无污染。
为解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案是:一种重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,以重组毕赤酵母N24为发酵菌种,首先在以小麦B淀粉浆提供碳源的培养基中进行增殖培养,然后通过流加补料培养基实现酵母细胞的高密度培养,最后通过阶段性流加甲醇溶液诱导调控产木聚糖酶,包括以下步骤:
①菌种制备及扩大培养:将活化后的重组毕赤酵母N24菌株在无菌条件下取1~2环接种于500mLYPD培养基中,装液量为40%(v/v),于30℃、220r/min培养24h,制备一级种子;以10%接种量,将一级种子接种于5L的扩大培养基中,装液量为50%(v/v),于30℃、220r/min培养18h,制备二级种子;
②增值培养阶段:无菌条件下,将二级种子以10%的接种量接入已灭菌的30L增殖培养基中,调节初始pH值为5.5~6.0,培养温度30~32℃,初始通气比1:0.6,搅拌转速为200r/min,开始发酵;发酵8~16h,以120mL/h的速率流加补料培养基;16~24h,以180mL/h的速率流加补料培养基;24h~40h,以60mL/h的速率流加补料培养基;
③诱导产酶阶段:当增殖培养阶段的葡萄糖含量低于1.0g/L以下,溶氧上升至60%(v/v)以上时,开始补加甲醇溶液进行诱导产酶;所述诱导产酶分三个阶段,第一阶段:0~24小时,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.0~1.5mL/h;第二阶段:24~72h,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5~2.0mL/h;第三阶段:72~96h,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5~3.0mL/h。
进一步的,所述增殖培养基的组成为,玉米浆10~30g/L,硫酸二氢钾4~6g/L,硫酸镁1~3g/L,余量为小麦B淀粉浆。
进一步的,所述小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为30~50g/L。
进一步的,所述补料培养基含小麦B淀粉浆。
进一步的,所述小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为50~100g/L。
进一步的,所述小麦B淀粉浆含PTM1 10mL/L。
进一步的,所述PTM1的组成为:CuSO4·5H2O 6.0g/L,KI 0.088g/L,MnSO4·H2O 3.0g/L,Na2MoO4·2H2O 0.2g/L,H3BO3 0.02g/L,CoCl2·6H2O 0.5g/L。
进一步的,所述甲醇溶液含PTM1 10mL/L。
进一步的,所述PTM1的组成为:CuSO4·5H2O 6.0g/L,KI 0.088g/L,MnSO4·H2O 3.0g/L,Na2MoO4·2H2O 0.2g/L,H3BO3 0.02g/L,CoCl2·6H2O 0.5g/L。
本发明的有益效果在于:本发明一种重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,通过菌种制备及扩大培养、增值培养及诱导产酶这三个阶段,以小麦B淀粉浆为主要营养物质,配以玉米浆、硫酸二氢钾、硫酸镁等成分,通过合适的发酵工艺条件,得到了重组毕赤酵母有效利用小麦B淀粉浆发酵生产木聚糖酶的方法。此外,以小麦B淀粉浆为主要原料,不仅实现了农副产品的高附加值利用,有利于环保,具有较高的社会价值;也为小麦深加工提高了产品的附加值,为提高企业的经济效益开辟了一条新的途径。该方法工艺简单,酶活力高,环保无污染,具有较高的经济和社会效益。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步地详细说明。
实施例一
本发明重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,以重组毕赤酵母N24为发酵菌种,首先在以小麦B淀粉浆提供碳源的培养基中进行增殖培养,然后通过流加补料培养基实现酵母细胞的高密度培养,最后通过阶段性流加甲醇溶液诱导调控产木聚糖酶,可按以下步骤进行:
①菌种制备及扩大培养:将活化后的重组毕赤酵母N24菌株在无菌条件下取1~2环接种于500mLYPD培养基中,装液量为40%(v/v),于30℃、220r/min培养24h,制备一级种子;以10%接种量,将一级种子接种于5L的扩大培养基中,装液量为50%(v/v),于30℃、220r/min培养18h,制备二级种子;
②增值培养阶段:无菌条件下,将二级种子以10%的接种量接入已灭菌的30L增殖培养基中,其组成为玉米浆30g/L,硫酸二氢钾4g/L,硫酸镁3g/L,余量为小麦B淀粉浆,其中小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为50g/L,调节初始pH值为5.5,培养温度30℃,初始通气比1:0.6,搅拌转速为200r/min,开始发酵;发酵8~16h,以120mL/h的速率流加补料培养基;16~24h,以180mL/h的速率流加补料培养基;24h~40h,以60mL/h的速率流加补料培养基,其中,所述补料培养基含小麦B淀粉浆,其中小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为50g/L;此步骤中,所述小麦B淀粉浆含PTM1 10mL/L;
③诱导产酶阶段:接种后45h,葡萄糖含量为0.5g/L,消耗殆尽,溶氧开始上升,当溶氧量达70%(v/v),开始补加甲醇溶液进行诱导产酶;所述诱导产酶分三个阶段,第一阶段:0~24小时,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5mL/h;第二阶段:24~72h,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入2.0mL/h;第三阶段:72~96h,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5mL/h;所述甲醇溶液均含PTM1 10mL/L。
其中,步骤②③中,所述PTM1的组成为:CuSO4·5H2O 6.0g/L,KI 0.088g/L,MnSO4·H2O 3.0g/L,Na2MoO4·2H2O 0.2g/L,H3BO3 0.02g/L,CoCl2·6H2O 0.5g/L。
葡聚糖酶活性的测定方法统一为:采用DNS法,在pH4.8、50℃条件下,每分钟分解底物生成1.0μmoL还原糖(以葡萄糖计)所需酶量为1个活力单位。
经测定,本实施例所得木聚糖酶的CMC酶活力为1905.20U/mL,与现有工艺所得木聚糖酶的CMC酶活力相比,提高12%。
实施例二
本发明重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,以重组毕赤酵母N24为发酵菌种,首先在以小麦B淀粉浆提供碳源的培养基中进行增殖培养,然后通过流加补料培养基实现酵母细胞的高密度培养,最后通过阶段性流加甲醇溶液诱导调控产木聚糖酶,可按以下步骤进行::
①菌种制备及扩大培养:将活化后的重组毕赤酵母N24菌株在无菌条件下取1~2环接种于500mLYPD培养基中,装液量为40%(v/v),于30℃、220r/min培养24h,制备一级种子;以10%接种量,将一级种子接种于5L的扩大培养基中,装液量为50%(v/v),于30℃、220r/min培养18h,制备二级种子;
②增值培养阶段:无菌条件下,将二级种子以10%的接种量接入已灭菌的30L增殖培养基中,其组成为玉米浆20g/L,硫酸二氢钾5g/L,硫酸镁1g/L,余量为小麦B淀粉浆,其中小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为30g/L,调节初始pH值为5.8,培养温度31℃,初始通气比1:0.6,搅拌转速为200r/min,开始发酵;发酵8~16h,以120mL/h的速率流加补料培养基;16~24h,以180mL/h的速率流加补料培养基;24h~40h,以60mL/h的速率流加补料培养基;其中,所述补料培养基含小麦B淀粉浆,其中小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为80g/L;此步骤中,所述小麦B淀粉浆均含PTM1 10mL/L;
③诱导产酶阶段:接种后46h,葡萄糖含量为1g/L,消耗殆尽,溶氧开始上升,当溶氧量达65%(v/v),开始补加甲醇溶液进行诱导产酶;所述诱导产酶分三个阶段,第一阶段:0~24小时,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.2mL/h;第二阶段:24~72h,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入2.0mL/h;第三阶段:72~96h,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入2.0mL/h;所述甲醇溶液含PTM1 10mL/L。
其中,步骤②③中,所述PTM1的组成为:CuSO4·5H2O 6.0g/L,KI 0.088g/L,MnSO4·H2O 3.0g/L,Na2MoO4·2H2O 0.2g/L,H3BO3 0.02g/L,CoCl2·6H2O 0.5g/L。
经测定,本实施例所得木聚糖酶的CMC酶活力为1814.50U/mL,与现有工艺所得木聚糖酶的CMC酶活力相比,提高11.5%。
实施例三
本发明重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,以重组毕赤酵母N24为发酵菌种,采用一步发酵法,菌种首先在以小麦B淀粉浆提供碳源的培养基中进行增殖培养,然后通过流加补料培养基实现酵母细胞的高密度培养,最后通过阶段性流加甲醇溶液诱导调控产木聚糖酶,可按以下步骤进行::
①菌种制备及扩大培养:将活化后的重组毕赤酵母N24菌株在无菌条件下取1~2环接种于500mLYPD培养基中,装液量为40%(v/v),于30℃、220r/min培养24h,制备一级种子;以10%接种量,将一级种子接种于5L的扩大培养基中,装液量为50%(v/v),于30℃、220r/min培养18h,制备二级种子;
②增值培养阶段:无菌条件下,将二级种子以10%的接种量接入已灭菌的30L增殖培养基中,其组成为玉米浆10g/L,硫酸二氢钾6g/L,硫酸镁2g/L,余量为小麦B淀粉浆,其中小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为40g/L,调节初始pH值为6.0,培养温度32℃,初始通气比1:0.6,搅拌转速为200r/min,开始发酵;发酵8~16h,以120mL/h的速率流加补料培养基;16~24h,以180mL/h的速率流加补料培养基;24h~40h,以60mL/h的速率流加补料培养基;其中,所述补料培养基含小麦B淀粉浆,其中小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为100g/L;此步骤中,所述小麦B淀粉浆均含PTM1 10mL/L。
③诱导产酶阶段:接种后48h,葡萄糖含量为0.8%,消耗殆尽,溶氧开始上升,当溶氧达60%(v/v),开始补加甲醇溶液进行诱导产酶;所述诱导产酶分三个阶段,第一阶段:0~24小时,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.0mL/h;第二阶段:24~72h,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5mL/h;第三阶段:72~96h,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入3.0mL/h;所述甲醇溶液含PTM1 10mL/L。
其中,步骤②③中,所述PTM1的组成为:CuSO4·5H2O 6.0g/L,KI 0.088g/L,MnSO4·H2O 3.0g/L,Na2MoO4·2H2O 0.2g/L,H3BO3 0.02g/L,CoCl2·6H2O 0.5g/L。
经测定,本实施例所得木聚糖酶的CMC酶活力为1735.75U/mL,与现有工艺所得木聚糖酶的CMC酶活力相比,提高10%。
Claims (9)
1.一种重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,以重组毕赤酵母N24为发酵菌种,其特征在于:首先在以小麦B淀粉浆提供碳源的培养基中进行增殖培养,然后通过流加补料培养基实现酵母细胞的高密度培养,最后通过阶段性流加甲醇溶液诱导调控产木聚糖酶,包括以下步骤:
①菌种制备及扩大培养:将活化后的重组毕赤酵母N24菌株在无菌条件下取1~2环接种于500mLYPD培养基中,装液量为40%(v/v),于30℃、220r/min培养24h,制备一级种子;以10%接种量,将一级种子接种于5L的扩大培养基中,装液量为50%(v/v),于30℃、220r/min培养18h,制备二级种子;
②增值培养阶段:无菌条件下,将二级种子以10%的接种量接入已灭菌的30L增殖培养基中,调节初始pH值为5.5~6.0,培养温度30~32℃,初始通气比1:0.6,搅拌转速为200r/min,开始发酵;发酵8~16h,以120mL/h的速率流加补料培养基;16~24h,以180mL/h的速率流加补料培养基;24h~40h,以60mL/h的速率流加补料培养基;
③诱导产酶阶段:当增殖培养阶段的葡萄糖含量低于10g/L以下,溶氧上升至60%(v/v)以上时,开始补加甲醇溶液进行诱导产酶;所述诱导产酶分三个阶段,第一阶段:0~24小时,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.0~1.5mL/h;第二阶段:24~72h,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5~2.0mL/h;第三阶段:72~96h,甲醇溶液流加速率为每升培养液中加入1.5~3.0mL/h。
2.如权利要求1所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,其特征在于:所述增殖培养基的组成为,玉米浆10~30g/L,硫酸二氢钾4~6g/L,硫酸镁1~3g/L,余量为小麦B淀粉浆。
3.如权利要求2所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,其特征在于:所述小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为30~50g/L。
4.如权利要求1所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,其特征在于:所述补料培养基含小麦B淀粉浆。
5.如权利要求4所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,其特征在于:所述小麦B淀粉浆中葡萄糖的含量为50~100g/L。
6.如权利要求1~5的任一项所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,其特征在于:所述小麦B淀粉浆中含PTM1 10mL/L。
7.如权利要求6所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,其特征在于:所述PTM1的组成为:CuSO4·5H2O 6.0g/L,KI 0.088g/L,MnSO4·H2O 3.0g/L,Na2MoO4·2H2O 0.2g/L,H3BO3 0.02g/L,CoCl2·6H2O 0.5g/L。
8.如权利要求1所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,其特征在于:所述甲醇溶液中含PTM1 10mL/L。
9.如权利要求8所述的重组毕赤酵母生产β-葡聚糖酶的方法,其特征在于:所述PTM1的组成为:CuSO4·5H2O 6.0g/L,KI 0.088g/L,MnSO4·H2O 3.0g/L,Na2MoO4·2H2O 0.2g/L,H3BO3 0.02g/L,CoCl2·6H2O 0.5g/L。
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