CN117604057A - 一种提高透明质酸生产效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种提高透明质酸生产效率的方法，将产透明质酸的兽疫链球菌种子液按照5‑20%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养；整个发酵培养过程中，控制温度38‑39℃，溶氧2.0‑3.0L/min，通过流加蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L。本发明方法简单、有效，可应用于透明质酸的工业化生产中。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体提供一种提高透明质酸生产效率的方法。
背景技术
透明质酸（简称：HA），是一种重要的医药材料和化妆品原料，具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质。随着国内外化妆品行业的迅速发展，竞争日益激烈，市场供不应求。各生产企业都在不遗余力的致力于新型化妆品的研究与开发，提高产品档次和附加值。
透明质酸的生产方法主要有动物组织提取法和微生物发酵法,不同来源的透明质酸其化学本质和分子结构都是一致的。由于动物组织提取法成本较高，受原材料的限制规模化生产较低，限制了其应用。而微生物发酵法与动物组织提取法相比，成本低，产量不受原料的限制，易于分离、纯化和形成规模化工业生产。
目前，透明质酸发酵法生产研究主要集中在发酵培养基和发酵条件的优化，透明质酸发酵属于高粘度发酵，溶氧是透明质酸发酵产量提高的关键因素，因此，如何提高透明质酸发酵过程中的溶氧浓度是目前急需解决的关键问题。利用添加携氧剂的策略提高透明质酸发酵产量的方法，目前已有少量研究，基本处于实验室阶段，尚未工程化应用研究。
专利CN111321187A公开了一种透明质酸的发酵生产工艺，包括以下步骤：将兽疫链球菌种子液接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养6h，然后往发酵罐中添加甘油和乙醛，继续发酵培养8-10h，再进行超声处理，然后继续发酵培养2h，终止发酵。本发明在发酵制备透明质酸的方法中，对多种因素进行优化和改进，提高了透明质酸的产量。
专利CN108410927A公开了公开了一种发酵法生产高分子量透明质酸的方法，其包括以下步骤：步骤1）菌株活化，步骤2）发酵，步骤3）过滤、醇沉、离心以及干燥。本发明方法简单可行，生产的透明质酸产量和分子量高，达到化妆品级产品的要求。
但是上述方法未涉及添加携氧剂的策略。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高透明质酸生产效率的方法，利用本专利方法能够有效提高透明质酸发酵效率，从而提高透明质酸的产量。
本发明是通过如下技术方案来实现的。
一种提高透明质酸生产效率的方法，包括以下步骤：
将产透明质酸的兽疫链球菌种子液按照5-20%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养；发酵培养总时间为15-20h，整个发酵过程中，控制温度38-39℃，溶氧2.0-3.0L/min，通过流加蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L。
优选地，
所述发酵培养基的组分为：蔗糖70g/L，蛋白胨2.0g/L，七水硫酸镁1.2 g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸锌100mg/L，pH 7.0。
优选地，
发酵至6h时，往发酵罐中添加正十二烷。
优选地，
发酵至9h时，往发酵罐中添加6-氨基嘌呤。
更优选地，
发酵至6h时，往发酵罐中添加占总发酵液体积1-3％的正十二烷。
更优选地，
发酵至9h时，往发酵罐中添加6-氨基嘌呤，添加6-氨基嘌呤的终浓度为5-20mg/L。
最优选地，
发酵至6h时，往发酵罐中添加占总发酵液体积3％的正十二烷。
最优选地，
发酵至9h时，往发酵罐中添加6-氨基嘌呤，添加6-氨基嘌呤的终浓度为20mg/L。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
将产透明质酸的兽疫链球菌种子液按照10%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养；发酵培养总时间为18h，整个发酵过程中，控制温度39℃，溶氧3.0L/min，通过流加500g/L的蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L。
优选地，所述兽疫链球菌种子液的制备方法为：将兽疫链球菌接种于种子培养基中培养至浓度109cfu/ml的兽疫链球菌种子液；所述种子培养基的成分为：蔗糖75g/L，蛋白胨2.5g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L。
实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种提高透明质酸生产效率的方法，包括以下步骤：
兽疫链球菌ATCC39920接种于种子培养基中培养至菌株浓度109cfu/ml的兽疫链球菌种子液；种子培养基的成分为：蔗糖75g/L，蛋白胨2.5g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L；
将兽疫链球菌种子液按照10%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养；发酵培养基的组分为：蔗糖70g/L，蛋白胨2.0g/L，七水硫酸镁1.2 g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸锌100mg/L，pH 7.0；发酵至6h，添加3％体积比的正十二烷（v/v，即正十二烷占总发酵液体积的3%）到透明质酸发酵液中，发酵至9h，往发酵罐中添加6-氨基嘌呤，添加6-氨基嘌呤的终浓度为20mg/L。发酵总时间为18h，整个发酵过程中，控制温度39℃，溶氧3.0L/min，通过流加浓度为500g/L的蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L。
对比例1
一种提高透明质酸生产效率的方法，包括以下步骤：
兽疫链球菌ATCC39920接种于种子培养基中培养至菌株浓度109cfu/ml的兽疫链球菌种子液；种子培养基的成分为：蔗糖75g/L，蛋白胨2.5g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L；
将兽疫链球菌种子液按照10%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养；发酵培养基的组分为：蔗糖70g/L，蛋白胨2.0g/L，七水硫酸镁1.2 g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，pH 7.0；发酵总时间为18h，整个发酵过程中，控制温度39℃，溶氧3.0L/min，通过流加浓度为500g/L的蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L。
实施例2
锌离子对透明质酸发酵效率的影响。
研究表明EMP途径和透明质酸合成途径存在竞争关系，但是由于微生物自身代谢网络和产物合成途径的复杂性，难以推断出某一合成代谢点在整个物质合成中的作用。我们尝试验证锌离子在兽疫链球菌合成透明质酸的影响。
在对比例1的基础上，在发酵培养基中添加不同浓度梯度的七水硫酸锌，分别为0,10,50,100,200，单位为mg/L，检测不同浓度的锌离子对发酵液中透明质酸含量的影响，如下表1所示。
表1
| 七水硫酸锌mg/L | 0 | 10 | 50 | 100 | 200 |
| 透明质酸含量g/L | 2.76 | 2.83 | 2.99 | 3.16 | 3.01 |
如上表1所示，发酵液中透明质酸含量随着锌离子浓度的增加而增加，锌离子浓度为100mg/L时透明质酸含量达到峰值，较不添加锌离子提高了14.5%，继续增加锌离子浓度反而会造成透明质酸产量下降，可能原因是，在高浓度的锌离子条件下,EMP途径中的己糖激酶和磷酸果糖激酶两种关键酶活性受到抑制，导致往透明质酸合成方向的代谢流增加，但是对于EMP途径的过度抑制会造成细胞活力下降，并不利于透明质酸的合成。
实施例3
通过实施例2确定发酵培养基中七水硫酸锌的添加量为100mg/L，验证6-氨基嘌呤对兽疫链球菌合成透明质酸的影响。首选，我们选择在不同的时间点添加添加10mg/L的6-氨基嘌呤，发现在发酵前期添加6-氨基嘌呤的效果不明显，在发酵中期添加效果最好，选择在发酵9h时添加。设置添加浓度为0,5,10,20,40,80，单位为mg/L，检测不同浓度的6-氨基嘌呤对发酵液中透明质酸发酵产量的影响，如下表2所示。
表2
| 6-氨基嘌呤mg/L | 0 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 |
| 透明质酸含量g/L | 3.16 | 3.34 | 3.57 | 3.81 | 3.70 | 3.62 |
结论，在6-氨基嘌呤浓度为0-20mg/L的范围内，发酵液中透明质酸含量与6-氨基嘌呤正相关，随着6-氨基嘌呤浓度继续增大，发酵液中透明质酸含量有所降低。在20mg/L的添加量条件下，较不添加的组，透明质酸含量提高了17.1%。发酵中期添加一定浓度的腺嘌呤后，磷酸果糖激酶和乙酸激酶的活力均有所降低，磷酸果糖激酶活力的降低有利于代谢流往透明质酸合成方向的代谢流增加，而乙酸激酶是在乙酸生成过程中的关键酶，它控制着乙酸的最终生成，发酵后期乙酸的过量积累对菌株活力会造成一定损害。
实施例4
在实施例2-3基础上，优化了了透明质酸的发酵方法，具体包括以下步骤：
兽疫链球菌ATCC39920接种于种子培养基中培养至菌株浓度109cfu/ml的兽疫链球菌种子液；种子培养基的成分为：蔗糖75g/L，蛋白胨2.5g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L；
将兽疫链球菌种子液按照10%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养；发酵培养基的组分为：蔗糖70g/L，蛋白胨2.0g/L，七水硫酸镁1.2 g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸锌100mg/L，pH 7.0；发酵至9h，往发酵罐中添加6-氨基嘌呤，添加6-氨基嘌呤的终浓度为20mg/L。发酵总时间为18h，整个发酵过程中，控制温度39℃，溶氧3.0L/min，通过流加浓度为500g/L的蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L。
实施例5
在实施例4的基础上，我们还比较了不同携氧剂对透明质酸发酵效率的影响。
携氧剂选择大豆油、正己烷、正十二烷，添加时机为发酵6h。研究发现，添加1%(v/v)大豆油、1%(v/v)正己烷、1%(v/v)正十二烷,相对于空白组分别提高11.5%、15.7%和23.9%;添加3%(v/v)大豆油、3%(v/v)正己烷、3%(v/v)正十二烷,相对于空白组分别提高26.8%、65.1%和112.6%。
以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种提高透明质酸生产效率的方法，包括以下步骤：
将产透明质酸的兽疫链球菌种子液按照5-20%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养；发酵培养总时间为15-20h，整个发酵过程中，控制温度38-39℃，溶氧2.0-3.0L/min，通过流加蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：蔗糖70g/L，蛋白胨2.0g/L，七水硫酸镁1.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸锌100mg/L，pH 7.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵至6h时，往发酵罐中添加正十二烷。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵至9h时，往发酵罐中添加6-氨基嘌呤。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵至6h时，往发酵罐中添加占总发酵液体积1-3％的正十二烷。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵至9h时，往发酵罐中添加6-氨基嘌呤，添加6-氨基嘌呤的终浓度为5-20mg/L。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵至6h时，往发酵罐中添加占总发酵液体积3％的正十二烷。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵至9h时，往发酵罐中添加6-氨基嘌呤，添加6-氨基嘌呤的终浓度为20mg/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将产透明质酸的兽疫链球菌种子液按照10%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养；发酵培养总时间为18h，整个发酵过程中，控制温度39℃，溶氧3.0L/min，通过流加500g/L的蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L。
10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于，所述兽疫链球菌种子液的制备方法为：将兽疫链球菌接种于种子培养基中培养至浓度109cfu/ml的兽疫链球菌种子液；所述种子培养基的成分为：蔗糖75g/L，蛋白胨2.5g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L。
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