CN108203710B

CN108203710B - 一种利用纯秸秆固体补料诱导里氏木霉产纤维素酶的方法及其使用的补料器

Info

Publication number: CN108203710B
Application number: CN201810076624.XA
Authority: CN
Inventors: 牛堃; 相金悦; 叶磊
Original assignee: Jiangsu Diyin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Canghai Heneng New Material Technology Co ltd
Priority date: 2018-01-26
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2038-01-26
Also published as: CN108203710A

Abstract

一种利用纯秸秆固体补料诱导里氏木霉产纤维素酶的方法，包括如下步骤：S1、平板培养；S2、种子罐培养；S3、发酵培养：在接种后的产酶培养过程中，当产酶发酵罐内达到以下两个条件之一时，进行补料，使得产酶发酵罐内溶氧饱和度在20‑30％之间：①、培养前期不控制产酶发酵罐内PH值，当产酶发酵罐内PH值降至4.5时，用氨水调控PH使其不低于4.5，当PH第二次下降后、开始回升时，通过补料器进行纯固体补料；②、当发酵罐内溶氧饱和度第一次开始回升时，通过补料器进行纯固体补料。其优点是：通过产酶发酵罐内溶氧饱和度与PH的变化，确定补料时间，并采用补料器进行自动补料，以自动控制补料开启与关闭，无需添加其它辅助溶剂，获取高酶活，降低产酶成本。

Description

一种利用纯秸秆固体补料诱导里氏木霉产纤维素酶的方法及其使用的补料器

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，具体地说是一种利用纯秸秆固体补料诱导里氏木霉产纤维素酶的方法及其使用的补料器。

背景技术

在化石能源日益枯竭，环境污染问题日益严峻的今天，寻求廉价的、清洁的可再生能源成为我国及世界各国能源领域的重要研究任务。植物中纤维素含量约35％-50％，是地球上分布最广的碳水化合物，同时又是自然界中数量最大的可再生资源，它的降解是自然界碳素循环的中心环节。利用纤维素酶的水解作用，可以使纤维素水解出葡萄糖，进而发酵可以生产出纤维素乙醇等清洁可再生能源。纤维素的利用与转化对于解决我国环境污染以及能源危机等问题具有重要的意义。但是，目前我国纤维素酶的生产仍存在产量低、成本高的问题，国内纤维素酶的自产能力远远跟不上国家的需求。因此，开发低成本、高酶活的纤维素酶生产工艺将是我国的重要研究任务。

纤维素酶属于诱导酶类。诱导产酶常用微生物是里氏木霉，里氏木霉的相关启动子cbh1、cbh2、egl1和egl2可以被纤维素底物释放出的β-二糖诱导，从而启动子控制纤维素酶基因表达，编码酶蛋白。如中国专利CN 102229920 B、CN 103602648 B、CN101182503 A、CN 103045566 A公开了利用微晶纤维素作为诱导物和碳源，通过分批补料的方式合成纤维素酶的技术；但微晶纤维素的生产成本很高，生产过程会造成大量的污染，因此不适宜用于纤维素酶的工业化生产。专利CN105420217 A、CN 101735993 B、CN 101654669 B、CN106367409 A虽然公开了以非可溶性碳源如秸秆、麸皮等作为初始碳源的技术，但其在后期发酵补料培养基中均添加有可溶性糖类如葡萄糖、槐糖等，不仅大大提高了产酶成本，还原性糖还会对产酶造成一定的抑制作用。

发明内容

为解决上述技术缺陷，本发明提供一种利用纯秸秆固体补料诱导里氏木霉产纤维素酶的方法及其使用的补料器，以降低生产成本、提高纤维素酶产量及活力。

一种利用纯秸秆固体补料诱导里氏木霉产纤维素酶的方法，包括如下步骤：

S1、平板培养：将保存于甘油管中的里氏木霉接种于凝固完全的秸秆平板培养基，并于霉菌培养箱中29℃培养7～10d，直至绿色绒状孢子布满整个平板；

优选地，步骤S1中，秸秆平板培养基制备如下：

S11、秸秆平板培养基配制，以下为每100ml培养基体系中各试剂的用量：

取4.5～5.5g经预处理后的汽爆秸秆材料，4ml产酶大量元素母盐， 40ul微量元素母盐，0.2g玉米浆粉，0.2g吐温-80，2g琼脂，加水定容至100ml，配好混匀后用2M的H₂SO₄调节PH＝4.9；

S12、将步骤S11制备的培养基于灭菌锅中121℃、0.1MPa条件下灭菌20min，再置于超净工作台上加入抗生素，倒平板冷却，备用；

优选地，步骤S1中所述里氏木霉为里氏木霉RUT-C30菌株；

进一步地，步骤S11中，所述微量元素母盐包括：14g/LFeSO₄·7H₂O、 4.37g/LMnSO₄·7H₂O、3.92g/LZnSO₄·7H₂O和5.6g/LCoCl₂；

步骤S11中，所述产酶大量元素母盐包括：70g/l KH₂PO₄，98g/l (NH₄)₂SO₄，21g/l尿素，21g/l MgSO₄·7H₂O；

步骤S11中，预处理步骤为：将粒径为1～2cm的秸秆粉末与水按 1:1的比例混合后，投入汽爆罐，加热至190～210℃，维持10～20min 瞬间释放压力，降温后取出压榨、烘干、粉碎。

S2、种子罐培养：从经步骤S1培养的孢子以10^9个/L的浓度接种于种子罐中，再在转速为180rpm、通气量为1vvm、PH4.8、温度为29℃条件下，培养20～30h，获得种子液，备用；

优选地，步骤S2中，种子罐内培养基配制，以下为每1L培养基体系中各试剂的用量：12g葡萄糖、0.7g玉米浆、1.96g KH₂PO₄、1.372g (NH₄)₂SO₄、0.294g尿素、0.294g MgSO₄·7H₂O、1ml的微量元素母盐，加水定容至1L，配好混匀后用2M的H₂SO₄调节PH为4.9；

S3、发酵培养：将步骤S2获得种子液中取样检测OD，当OD值达6-8时，将步骤S2获得种子液按照8-10％的接种量接入产酶发酵罐内，于29℃、搅拌桨转速300～400rpm、通气量1～1.2vvm条件下培养30～48h，再于27℃培养直至产酶下罐；

在接种后的产酶培养过程中，当产酶发酵罐内达到以下两个条件之一时，进行补料，且补料时长为96-120h，发酵时长为156-180h：

①、培养前期不控制产酶发酵罐内PH值(因此时产酶发酵罐内 PH值大于4.5)，当产酶发酵罐内PH降至4.5时，用氨水调控PH，使得产酶发酵罐内PH不低于4.5，当PH第二次下降后、开始回升时，设置溶氧仪溶氧饱和度范围，开启补料器进行纯固体补料；

②、当发酵罐内溶氧饱和度第一次开始回升时，开启补料器进行纯固体补料。

进一步地，步骤S3，纯固体补料方式是：当补料条件满足时，在溶氧仪上设定溶氧饱和度范围为20-30％，首次开启补料器，补料过程中，若溶氧饱和度高于设定的30％，则持续补料，当溶氧饱和度低于20％时，补料停止。

优选地，步骤S2、S3中，种子罐、产酶发酵罐内分别放置培养基后，均于121℃条件下灭菌20min，待冷却至29℃，用水浴锅或循环水箱恒定保温，备用；

优选地，步骤S3中，产酶发酵罐内培养基配制，以下为每10L 培养基体系中各试剂的用量：400-500g汽爆玉米秸秆，20g玉米浆粉， 28g KH₂PO₄，39.2g(NH₄)₂SO₄，8.4g尿素，8.4g MgSO₄·7H₂O，4ml微量元素母盐，20g吐温-80，加水定容至10L，备用；

优选地，步骤S3中，补料器，包括：螺旋电机1、螺杆2、输料筒3、进料仓4、搅拌电机5、搅拌浆6、电控柜7，所述螺旋电机1 与所述螺杆2连接，所述输料筒3套设于所述螺杆2外，且所述螺杆2远离所述螺旋电机1的一端延伸出所述输料筒3；所述输料筒3上设置有一进料仓4，所述搅拌浆6设置于所述进料仓4内，并与所述搅拌电机5相连，所述螺旋电机1、所述搅拌电机5均与所述电控柜 7电连接，通过所述电控柜7控制开、关；

其中，所述电控柜7内设置有PLC控制系统71、带电极探头的溶氧仪72、第一继电器73、第二继电器74、第一变频器75、第二变频器76，所述PLC控制系统71的三个信号输出端分别与所述溶氧仪72、所述第一变频器75、所述第二变频器76的一信号输入端连接，用于向所述溶氧仪72提供电源的同时，控制所述第一变频器75、所述第二变频器76的转速；所述溶氧仪72的两个信号输出端分别与所述第一继电器73、第二继电器74的信号输入端连接，所述第一继电器73 的信号输出端与所述第一变频器75的一信号输入端连接，所述第一变频器75的信号输出端与所述搅拌电机5连接；所述第二继电器74 的信号输出端与所述第二变频器76的一信号输入端连接，所述第二变频器76的信号输出端与所述螺旋电机1连接，电极探头(图中未画出)置于产酶发酵罐(图中未画出)内，用于检测产酶发酵罐内溶氧饱和度，当达到补料条件时，将所测信号传递于所述溶氧仪72，所述溶氧仪72将信号传递于所述第一继电器73、所述第二继电器74，继而开启所述第一变频器75、所述第二变频器76，并通过所述PLC 控制系统71控制所述第一变频器75、所述第二变频器76转速，继而使得所述搅拌电机5、所述螺旋电机1工作，以达到向产酶发酵罐内自动补料的目的。

进一步地，所述补料器还包括一用于支撑所述输料筒3的支架8，所述支架8高度与发酵罐补料口高度对应，具有支撑作用的同时，方便补料；

所述进料仓4上有与其配合设置的料仓密封盖9，用于防止杂物及灰尘进入所述进料仓4内；

所述螺杆2用于推动固体物料，使其进入产酶发酵罐；

所述搅拌浆6用于推动固体物料进入所述输料筒3，避免进料仓 4内物料堆积的同时，促使固体物料随所述螺杆2运动；

所述第一继电器73、第二继电器74用于接收所述溶氧仪72的信号后吸合通电。

本发明的创造性在于：一则，使用农作物秸秆材料作为培养里氏木霉的碳源及产酶诱导物，且在发酵过程中，通过溶氧饱和度首次开始回升时或者PH值第二次开始回升时作为首次补料时间。两个时间点当中任何一个时间点出现，均表明发酵培养基中碳源不足，此时进行固体碳源补料，不仅可以避免补料过晚菌丝过早进入衰退期，还可以避免补料过早菌丝产酶受到碳源抑制，从而有效延长菌丝生长的稳定期，使菌丝维持较长时间正常代谢及高效产酶；二则，用经过蒸汽爆破后、高温高压灭菌的纯固体秸秆作为补料材料，并通过特定结构的补料器，自动控制补料的开启与关闭，在不补充营养盐及可溶性糖的基础想实现高酶活，降低产酶成本。

本发明一种利用纯秸秆固体补料诱导里氏木霉产纤维素酶的方法及其使用的补料器，其优点是：通过产酶发酵罐内溶氧饱和度与PH的变化，确定补料时间，并采用补料器进行自动补料，以自动控制补料量，无需添加其它辅助溶剂，无需人工实时监测，即可获取高酶活，降低产酶成本。

附图说明

图1为溶氧饱和度、PH随发酵时间的变化图表；

其中，a、b分别表示PH、溶氧饱和度随发酵时间的变化曲线；

t1、t2分别表示溶氧饱和度第一次回升、PH第二次回升时的时间点；

图2为补料器结构示意图；

图3为电控柜内部元器件连接示意图；

其中：

1、螺旋电机，2、螺杆，3、输料筒，4、进料仓，5、搅拌电机， 6、搅拌浆，

7、电控柜，71、PLC控制系统，72、溶氧仪，73、第一继电器， 74、第二继电器，75、第一变频器，76、第二变频器；

8、支架，9、料仓密封盖。

具体实施方式

以下就具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例一

S1、平板培养，包括如下步骤：

S11、玉米秸秆平板培养基配制：体系100ml，取5g经预处理后的汽爆玉米秸秆，4ml产酶大量元素母盐，40ul微量元素母盐，0.2g 玉米浆粉，0.2g吐温-80，2g琼脂，加水定容至100ml，配好混匀后用2M的H₂SO₄调节PH＝4.9；

S12、将步骤S11制备的培养基于灭菌锅中121℃、20min，再置于超净工作台上加入抗生素，倒平板冷却，备用；

再将保存于60％甘油中的里氏木霉RUT-C30孢子接种于凝固完全的玉米秸秆平板培养基上，并于霉菌培养箱中29℃培养7d，直至绿色绒状孢子布满整个平板；

其中，

所述微量元素母盐包括：14g/LFeSO₄·7H₂O、4.37g/LMnSO₄·7H₂O、 3.92g/LZnSO₄·7H₂O和5.6g/LCoCl₂；

所述产酶大量元素母盐包括：70g/l KH₂PO₄，98g/l(NH₄)₂SO₄，21g/l 尿素，21g/lMgSO₄·7H₂O；

预处理步骤为：将粒径为2cm的玉米秸秆粉末与水按1:1的比例混合后，投入汽爆罐，加热至200℃，维持15min瞬间释放压力，降温后取出压榨、烘干、粉碎。

S2、种子罐培养：

先配制种子罐内培养基：体系1L，称取12g葡萄糖、0.7g玉米浆、 1.96g KH₂PO₄、1.372g(NH₄)₂SO₄、0.294g尿素、0.294g MgSO₄·7H₂O、 1ml的微量元素母盐，加水定容至1L，混匀后用2M的H₂SO₄调节PH 为4.9；

再将装有上述培养基的种子罐置入灭菌锅中121℃灭菌20min，待冷却至29℃，用水浴锅恒定保温，备用；

最后，将经步骤S1培养的孢子以10^9个/L的浓度接种于1L的种子罐中，在转速为180rpm、通气量为1vvm、PH4.8、温度为29℃条件下，培养25h，获得种子液，备用；

S3、发酵培养：

先配制产酶发酵罐内培养基：体系10L，400g汽爆玉米秸秆，20g 玉米浆粉，28gKH₂PO₄，39.2g(NH₄)₂SO₄，8.4g尿素，8.4g MgSO₄·7H₂O， 4ml微量元素母盐，20g吐温-80，加水定容至10L；

再将装有上述培养基的产酶发酵罐通高温高压水蒸汽实消灭菌，灭菌条件121℃，20min；灭菌完毕待发酵培养基冷却至29℃，用循环水箱恒定保温；对步骤S2获得种子液中取样检测OD，当OD值达为7时，将步骤S2获得种子液按照10％(V/V)比例接种到10L产酶发酵罐内，于29℃、搅拌桨转速400rpm、通气量1.vvm条件下培养 40h，再于27℃培养直至产酶下罐；

接种后，立即在尚无菌氧耗的发酵体系中校正溶氧电极，溶氧仪满氧状态显示9.0mg/l，发酵进行至38h，pH由初始接种后的5.5下降至4.5，并在氨水调控下稳定在4.5，溶氧仪显示值下降至2.7mg/l (对应溶氧饱和度为30％)时，后开始第一次回升，此时在溶氧仪上设置溶氧值范围为1.8-2.7mg/l(对应溶氧饱和度范围为20-30％)，开启补料器进行纯固体补料，补料过程中根据溶氧饱和度变化，补料器自动调控补料开闭，补料固体为蒸汽爆破后且经高温高压灭菌的玉米秸秆材料；发酵初始固体物料含量为5％，固体补料维持120h，发酵结束固体物料含量为10％。

发酵维持168h后结束，将发酵液过滤离心，获得纤维素酶活力 40IU/ml的粗酶液。

上述滤纸酶活力(FPA)按照IUPAC推荐的国际标准方法测定 (Ghose TK.Measurement of cellulase activities[J].Pure&Appl Chem，1987， 59(2)：257-268)。一个滤纸酶活力国际单位(IU)等于标准酶促反应条件下每分钟生成1.0umol葡萄糖(以还原糖计)所需的酶量，用 IU/ml表示。

实施例二

与实施例一不同之处在于：

步骤S11中，平板培养，包括如下步骤：取4.5g经预处理后的汽爆玉米秸秆，且预处理步骤中维持20min瞬间释放压力；

步骤S2中，接种完成后，培养时间为24h，获得种子液；

步骤S3中、发酵培养：产酶发酵罐内培养基汽爆玉米秸秆用量为450g；对步骤S2获得种子液中取样检测OD，当OD值达为8时，将步骤S2获得种子液按照8％(V/V)比例接种到10L产酶发酵罐内，于29℃、搅拌桨转速350rpm、通气量1.vvm条件下培养40h，再于 27℃培养直至产酶下罐；

接种后，立即在尚无菌氧耗的发酵体系中校正溶氧电极，溶氧仪满氧状态显示9.3mg/l，发酵进行至31h，溶氧仪显示值由9.3mg/l 下降至3.72mg/l(对应溶氧饱和度为40％)，pH由初始接种后的5.7 下降至4.0，且开始第二次回升时，此时设置溶氧值范围为1.9-2.8mg/l (对应溶氧饱和度范围为20-30％)，开始纯固体分批补料，补料过程中根据溶氧饱和度变化，补料器自动调控补料开闭；发酵初始固体物料含量为4％，固体补料维持96h，发酵结束固体物料含量为8％。

发酵维持168h后结束，将发酵液过滤离心，获得纤维素酶活力 36IU/ml的粗酶液。

实施例三

为验证在溶氧饱和度第一次开始回升时，补料对酶活的影响，以与实例一相同的实验条件，将补料时间点不同作为单一变量，做了三组对比实验，每组实验设置三次重复，并对每组实验的酶活结果取平均值：

三组对比实验分别在三个时间点开启补料：

A点，溶氧饱和度第一次开始回升之前一段时间；

B点，溶氧饱和度第一次开始回升时；

C点，溶氧饱和度达到第一次开始回升之后的一段时间；

试验结果如下表1所示：

表1

通过表1可知，溶氧饱和度第一次开始回升时开启补料器，进行纯固体补料，为最佳起始补料时间点，有效提高纤维素酶活力；溶氧饱和度开始回升，表明发酵体系中碳源不足，菌丝无法利用足够碳源进行正常好氧代谢，故监测到溶氧仪上的数值不再下降，而是开始回升。在此时进行固体补料补充碳源，继续供菌丝正常代谢，可延长菌丝生长的稳定期及高效产酶期。

实施例四

为验证PH值第二次开始上升时，补料对酶活的影响，以与实例二相同的实验条件，将补料时间点不同作为单一变量，做四组对比实验，每组实验设置三次重复，并对每组实验的酶活结果取平均值。

四组对比实验分别在四个不同时间点开启补料：

D点，PH第一次降至最低的时间点；

E点，PH第一次回升至最高值的时间点；

F点，PH第二次降至最低的时间点；

G点，PH第二次回升一段时间后的时间点；

试验结果如下表2所示：

表2

起始补料时间点	补料时长	固体终浓度	纤维素酶活力
				D点	72h	10％	29IU/mL
E点	72h	10％	20IU/mL
				F点	72h	10％	40IU/mL
G点	72h	10％	32IU/mL

通过表2可知，在PH值第二次开始上升时开启纯固体补料，为最佳起始补料时间点，有效提高纤维素酶活力；PH值第二次开始回升，表明发酵体系中碳源耗尽，无法进行正常的三羧酸循环代谢产酸，故而PH不再下降。此时进行固体补料补充碳源，继续供菌丝正常代谢，可延长菌丝生长的稳定期及高效产酶期。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种利用纯秸秆固体补料诱导里氏木霉产纤维素酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、平板培养：将保存于甘油管中的里氏木霉接种于凝固完全的秸秆平板培养基，并于霉菌培养箱中29℃培养7~10d，直至绿色绒状孢子布满整个平板；

S2、种子罐培养：将经步骤S1培养的孢子以10^9个/L的浓度接种于种子罐中，再在转速为180rpm、通气量为1vvm、pH 4.8、温度为29℃条件下，培养20~30h，获得种子液，备用；

S3、发酵培养：从步骤S2获得种子液中取样检测OD，当OD值达为6-8时，将步骤S2获得种子液按照8-10％的接种量接入产酶发酵罐内，于29℃、搅拌桨转速300~400rpm、通气量1~1.2vvm条件下培养30~48h，再于27℃培养直至产酶下罐；在接种后的产酶培养过程中，当产酶发酵罐内达到以下两个条件之一时，进行补料，且补料时长为96~120h，发酵时长为156~180h：

①、培养前期不控制产酶发酵罐内pH 值，当产酶发酵罐内pH 降至4.5时，用氨水调控pH ，使得产酶发酵罐内pH 不低于4.5，当pH 第二次下降后、开始回升时，设置溶氧仪溶氧饱和度范围，开启补料器进行纯固体补料；

②、当发酵罐内溶氧饱和度第一次开始回升时，开启补料器进行纯固体补料；

所述纯固体补料为蒸汽爆破后且经高温高压灭菌的玉米秸秆材料；

所述秸秆平板培养基中，每100mL含有4 .5~5 .5g经预处理后的汽爆秸秆材料，4ml产酶大量元素母盐，40ul微量元素母盐，0 .2g玉米浆粉，0 .2g吐温-80和2g琼脂；

所述微量元素母盐的成分为：14 g/L FeSO₄·7H₂O、4.37 g/L MnSO₄·7H₂O、3.92 g/LZnSO₄·7H₂O和5.6 g/L CoCl₂；

所述产酶大量元素母盐的成分为：70 g/L KH₂PO₄，98 g/L (NH₄)₂SO₄，21 g/L尿素，21g/L MgSO₄·7H₂O。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中，秸秆平板培养基制备如下：

S11、秸秆平板培养基配制，以下为每100ml培养基体系中各试剂的用量：取4 .5~5 .5g经预处理后的汽爆秸秆材料，4ml产酶大量元素母盐，40ul微量元素母盐，0 .2g玉米浆粉，0.2g吐温-80，2g琼脂，加水定容至100ml，配好混匀后用2M的H2SO4调节PH＝4.9；

S12、将步骤S11制备的培养基于灭菌锅中121℃、0 .1MPa条件下灭菌20min，再置于超净工作台上加入抗生素，倒平板冷却，备用。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中，补料器，包括：螺旋电机(1)、螺杆(2)、输料筒(3)、进料仓(4)、搅拌电机(5)、搅拌浆(6)、电控柜(7)，所述螺旋电机(1)与所述螺杆(2)连接，所述输料筒(3)套设于所述螺杆(2)外，且所述螺杆(2)远离所述螺旋电机(1)的一端延伸出所述输料筒(3)；所述输料筒(3)上设置有一进料仓(4)，所述搅拌浆(6)设置于所述进料仓(4)内，并与所述搅拌电机(5)相连，所述螺旋电机(1)、所述搅拌电机(5)均与所述电控柜(7)电连接，通过所述电控柜(7)控制开、关；

其中，所述电控柜(7)内设置有PLC控制系统(71)、带电极探头的溶氧仪(72)、第一继电器(73)、第二继电器(74)、第一变频器(75)、第二变频器(76)，所述PLC控制系统(71)的三个信号输出端分别与所述溶氧仪(72)、所述第一变频器(75)、所述第二变频器(76)的一信号输入端连接，用于向所述溶氧仪(72)提供电源的同时，控制所述第一变频器(75)、所述第二变频器(76)的转速；所述溶氧仪(72)的两个信号输出端分别与所述第一继电器(73)、第二继电器(74)的信号输入端连接，所述第一继电器(73)的信号输出端与所述第一变频器(75)的一信号输入端连接，所述第一变频器(75)的信号输出端与所述搅拌电机(5)连接；所述第二继电器(74)的信号输出端与所述第二变频器(76)的一信号输入端连接，所述第二变频器(76)的信号输出端与所述螺旋电机(1)连接，电极探头置于产酶发酵罐内，用于检测产酶发酵罐内溶氧饱和度，当达到补料条件时，将所测信号传递于所述溶氧仪(72)，所述溶氧仪(72)将信号传递于所述第一继电器(73)、所述第二继电器(74)，继而开启所述第一变频器(75)、所述第二变频器(76)，并通过所述PLC控制系统(71)控制所述第一变频器(75)、所述第二变频器(76)转速，使得所述搅拌电机(5)、所述螺旋电机(1)工作。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3，纯固体补料方式是：预先在溶氧仪中设定溶氧饱和度范围为20~30％，当补料条件满足时，首次开启补料，补料过程中，若溶氧饱和度高于设定的30％，则持续补料，当溶氧饱和度低于20％时，补料停止。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2、S3中，种子罐、产酶发酵罐内分别放置培养基后，均于121℃、0 .1MPa条件下灭菌20min，待冷却至29℃，用水浴锅或循环水箱恒定保温，备用。