TWI530562B - 一種提高纖維分解酵素活性之生產方法 - Google Patents

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Description

一種提高纖維分解酵素活性之生產方法
本發明係關於一種纖維分解酵素之生產方法，特別是關於一種利用木黴菌以及黑麴菌共培養來提高纖維分解酵素的酵素活性之生產方法。
纖維素為D-葡萄糖以β-1,4-糖苷鍵組成的大分子多醣，為植物細胞壁之主要成分。纖維素是地球上分布最豐富的天然高分子化合物，其含碳量占植物界的50%以上。植物透過光合作用利用光能固定空氣中的二氧化碳，並將能量轉化為化學能儲存於纖維素分子的鍵結中。有效的分解纖維素並將其中能量以及碳源轉換為人類得以應用的形式，可為現今所面臨的糧食、能源問題提供可行的解決方向。
目前處理纖維素的方法大致可分為化學與物理處理法及利用纖維素分解酵素處理等三種方法；其中纖維素分解酵素是多類水解酵素組合成的複合酵素，自然界中主要由真菌、細菌及放線菌所生產，可將不具溶解性的纖維素分解成單糖並用為生技製程上之碳源。纖維素分解酵素主要可分為三種類型，透過酵素的共同作用完成纖維素的降解，其中英文名稱、EC編號(Enzyme Commission number)以及功能如下：(1)內切型纖維素纖維分解酵素(EC 3.2.1.4；endo-β-1,4-glucanase)：以隨機方式截切纖維素分子內β-1,4糖苷鍵，並釋出纖維寡醣，增加還原端數目與降低黏滯度；(2)外切型纖維素纖維分解酵素(EC 3.2.1.91；exo-β-1,4-glucauase)：以纖維雙醣(cellobiose)為單位，由高度結晶型纖維素尾端進行截切；(3)β-葡萄糖苷酵素(EC 3.2.1.21；β-1,4-glucosidase)：將纖維雙醣水解為葡萄糖。
其中，外切型纖維素纖維分解酵素之活性，會受其產物纖維雙糖回饋抑制，β-葡萄糖苷酵素的存在有助於避免纖維雙糖的過度累積，能有效減緩其對於外切型纖維分解酶的回饋抑制作用。
現今商業化纖維酵素多以木黴菌屬(Trichoderma Species)或黑麴菌屬(Aspergillus Species)生產。木黴菌雖可分泌大量內切及外切型纖維素纖維分解酵素，但β-葡萄糖苷酵素活性表現量偏低，易導致纖維生質物酵素水解過程中產生纖維雙糖累積，造成回饋抑制作用而使水解效率下降，故需額外添加由黑麴菌生成之β-葡萄糖苷酵素才可改善此問題。
有鑒於此，本發明利用木黴菌以及黑麴菌兩種不同菌株進行共培養，並使用纖維素以及乳糖誘導其生產纖維分解酵素，來提高生產之酵素的活性。
本發明主要目的在於，利用共培養之真菌生產纖維分解酵素，以克服先前技術中以單一菌種生產之纖維分解酵素整體活性偏低之問題。
為達此一目的，本發明之一種提高纖維分解酵素活性之生產方法，其步驟包含：(a)第一誘導物之製備：以稀酸處理纖維素原料，製得第一誘導物；(b)前培養菌絲之製備：於二個前培養基中分別接種木黴菌以及黑麴菌之孢子，培養48小時以及24小時，製得前培養菌絲；(c)單一菌種酵素之生產：混合該第一誘導物以及培養基添加於發酵槽中，接種木黴菌前培養菌絲，持續培養24至60小時；(d)第二誘導物饋料步驟：連續於發酵槽中添加第二誘導物，其 中該第二誘導物係以乳糖為主要成分；以及(e)共培養酵素之生產：於木黴菌前培養菌絲接種24至60小時之後，於發酵槽中接種黑麴菌前培養菌絲，持續培養至總培養時間為96至192小時。
上述之方法，其中該纖維素原料可為稻稈。
上述之方法，其中步驟(a)第一誘導物之製備較佳係將稻稈以物理方式破碎後混合稀酸破壞其結構，並以溫度150至200℃之蒸氣蒸煮20-40分鐘。。
上述之方法，其中該二個前培養基可包含0.5至2重量百分比的葡萄糖。
上述之方法，其中該第二誘導物中乳糖濃度可為150至300g/L。
上述之方法，其中步驟(e)共培養酵素之生產較佳係於木黴菌前培養菌絲接種48小時之後，於發酵槽中接種黑麴菌前培養菌絲。
上述之方法，其中該第二誘導物較佳可於培養過程中第24小時開始，每隔5分鐘添加進入發酵槽中，共饋料96小時。
上述之方法，其中該第二誘導物總體積較佳可為發酵槽內容物體積的33%，每次添加之體積較佳可為第二誘導物總體積的0.0868%。
藉由本發明所提供之一種提高纖維分解酵素活性之生產方法，所得到的酵素整體活性達21.7(FPU/ml)，係為單獨培養木黴菌活性6(FPU/ml)之3.6倍，以及單獨培養黑麴菌活性3.4(FPU/ml)之6.3倍，顯示使用本發明之一種提高纖維分解酵素活性之生產方法，所產生酵素之整體活性顯著高於單一菌種生產方法。
第1圖 係根據本發明之提高纖維分解酵素活性之生產方法流程圖。
第2圖 係根據本發明實施例之纖維分解酵素整體活性分析圖。
實施例1 共培養纖維分解酵素生產方法
本發明之提高纖維分解酵素活性之生產方法其流程如第1圖所示。(a)第一誘導物之製備：係將稻稈經由裁切為2至5公分，並搭配螺旋擠壓機混合濃度3% w/w之硫酸，送入高溫環境下以150℃之蒸氣蒸煮25分鐘，破壞其結構，作為誘導纖維素分解酵素之第一誘導物。
(b)前培養菌絲之製備：首先調配前培養基，前培養基中含有1.5%的葡萄糖以及表1中之成分(其中表1之成分除葡萄糖含量外，係為習知培養基常用成份)，調整前培養基之pH值至5.0，並於121℃下高壓滅菌20分鐘。待冷卻後，於前培養基中接種Trichoderma reesei RUT-C30 BCRC32924之木黴菌孢子，其中木黴菌孢子之濃度為1×106/mL，於30℃、150rpm條件下培養48小時，製得木黴菌前培養菌絲。另於相同成分之前培養基中接種Aspergillus niger BCRC31494之黑麴菌孢子，其中黑麴菌孢子之濃度為1×106/mL，於30℃、150rpm條件下培養24小時，製得黑麴菌前培養菌絲。
(c)單一菌種酵素之生產：首先依據表1之成分配製培養基，添加第一誘導物於培養基中至混合物之固液比為4%，並調整pH值至5.0，在121℃下高壓滅菌20分鐘後，添加於5L發酵槽中。接種木黴菌前培養菌絲，添加前一步驟製得之木黴菌前培養菌絲於發酵槽中，其體積為發酵槽中培養基的十分之一，於溫度30℃、pH值5.0、溶氧量23%之條件下培養48小時。
(d)第二誘導物饋料步驟：調配以乳糖為主要成分之第二誘導物，其配方如表2(其中表2之成分除乳糖含量外，係為習知培養基常用成份，但因第二誘導物之體積為發酵槽內容物體積的33%，故第二誘導物之各成分濃度調整為較習知培養基成分高之濃度，以使添加後之濃度與習知培養基相近)所示，其中乳糖濃度為200g/L。於培養過程中第24小時開始，每隔5分鐘添加第二誘導物進 入發酵槽中，共饋料96小時。該第二誘導物總體積為發酵槽內容物體積的33%，每次添加之體積為第二誘導物初始總體積的0.0868%。
(e)共培養酵素之生產：於接種木黴菌前培養菌絲48小時之後，添加前培養菌絲之製備步驟中製得之黑麴菌前培養菌絲於發酵槽中，其體積為發酵槽中培養基的十分之一，並繼續以溫度30℃、pH值5.0、溶氧量23%之條件，持續培養144小時，進行纖維分解酵素之生產。
為了測定生產過程中，纖維分解酵素之活性變化。於接種木黴菌前培養菌絲之時，以及其後每隔24小時取發酵槽中之內容物，固液分離後得到纖維分解酵素之粗萃取液進行活性分析。
酵素粗萃液活性分析，係取纖維分解酵素生產程序所得之粗萃液，以國際純化學與應用化學聯盟(International Union of Pure and Applied Chemistry,IUPAC)所建立之方法進行活性測試。纖維分解酵素整體活性測試以濾紙(Whatman No.1 Filter Paper)為基質，經由酵素加水分解而生成之還原糖與呈色劑-3,5-二硝基柳酸(Dinitrosalicylic acid,DNS)反應，以540奈米(nm)之吸光度之增加用以定量測定。其中，該纖維分解酵素整體活性測定計算方式係以50毫克(mg)Whatman No.1濾紙為受質，於50℃條件下作用60分鐘後，產生2.0mg之還原糖，以FPU為酵素活性單位，並定義為在測試分析條件下，每分鐘釋放出來0.37微莫耳(μmol)還原糖之酵素量，為1Unit/ml。
根據實施例1之共培養纖維分解酵素生產方法，不同時間點中酵素活性之測試結果如第2圖中A曲線所示，其中X軸為自接種木黴菌前培養菌絲起算之總培養時間(小時)，Y軸為纖維分解酵素整體活性(FPU/ml)，於總培養時間第192小時，酵素整體活性達21.7(FPU/ml)。
實施例2 單一菌種纖維分解酵素生產方法之比較
為對照出實施例1之共培養纖維分解酵素生產方法與單一菌種生產方法之間的差異，另分別單獨以木黴菌或黑麴菌進行纖維分解酵素之生產，測定不同時間點之酵素整體活性與共培養生產方法進行比較。除省略第二菌株之接種外，單一菌種生產方法中各步驟之實施方式、前培養菌絲接種量、培養基與第二誘導物之成分、饋料方式以及各項參數皆控制與實施例1之共培養生產方法相同，並以相同方法每隔24小時測定纖維分解酵素整體活性。
木黴菌單一菌種生產方法之測試結果如第2圖中B曲線，黑麴菌單一菌種生產方法之測試結果如第2圖中C曲線。
如第2圖所示，共培養生產方法之酵素整體活性於總培養時間第96小時之後顯著高於單一菌種之組別，比較總培養時間第192小時之酵素整體活性，共培養生產方法為21.7(FPU/ml)，木黴菌單一菌種生產方法為6(FPU/ml)，黑麴菌單一菌種生產方法為3.4(FPU/ml)，共培養生產方法之酵素整體活性分別為單獨培養之3.6以及6.3倍。
實施例3 接種時間間隔之測試
為測試黑麴菌接種之時間點對於酵素整體活性之影響，使用與實施例1相同之生產方式，調整接種時間間隔，進行3組不同的測試，其中黑麴菌前培養菌絲分別於木黴菌前培養菌絲接種後之24、36以及60小時進行接種，持續培養至自接種木黴菌前培養菌絲起算之總培養時間為192小時。使用與實施例1中相同之酵素整體活性測試方法，測量總培養時間第192小時之酵素整體活性。與實施例1之結果整理如表3。
由表3之結果可了解到，共培養生產方法中木黴菌與黑麴菌接種時間不論間隔24至60小時，經總培養時間192小時後，所產生之酵素整體活性與實施例2中之結果比較，均顯著較木黴菌6(FPU/ml)或黑麴菌3.4(FPU/ml)單獨培養為佳，其中最佳間隔時間為48小時的21.7(FPU/ml)。
本發明在上文中已以較佳實施例揭露，然熟習本項技術者應理解的是，該實施例僅用於描繪本發明，而不應解讀為限制本發明之範圍。應注意的是，舉凡與該實施例等效之變化與置換，均應設為涵蓋於本發明之範疇內。因此，本發明之保護範圍當以申請專利範圍所界定者為準。

Claims (7)

  1. 一種提高纖維分解酵素活性之生產方法，其步驟包含：(a)第一誘導物之製備：以稀酸處理纖維素原料，製得第一誘導物；(b)前培養菌絲之製備：於二個前培養基中分別接種木黴菌以及黑麴菌之孢子，培養48小時以及24小時，製得前培養菌絲；(c)單一菌種酵素之生產：混合該第一誘導物以及培養基添加於發酵槽中，接種木黴菌前培養菌絲，持續培養24至60小時；(d)第二誘導物饋料步驟：連續於發酵槽中添加第二誘導物，其中該第二誘導物係以乳糖為主要成分；以及(e)共培養酵素之生產：於木黴菌前培養菌絲接種36至小於48小時之後，於發酵槽中接種黑麴菌前培養菌絲，持續培養至總培養時間為96至192小時。
  2. 如請求項第1項中所述之生產方法，其中該纖維素原料係為稻稈。
  3. 如請求項第2項中所述之生產方法，其中步驟(a)第一誘導物之製備係將稻稈以物理方式破碎後混合稀酸破壞其結構，並以溫度150至200℃之蒸氣蒸煮20-40分鐘。
  4. 如請求項第1項中所述之生產方法，其中該二個前培養基包含0.5至2重量百分比的葡萄糖。
  5. 如請求項第1項中所述之生產方法，其中該第二誘導物中乳糖濃度為150至300g/L。
  6. 如請求項第1項中所述之生產方法，其中該第二誘導物於培養過程中第24小時開始，每隔5分鐘添加進入發酵槽中，共饋料96小時。
  7. 如請求項第6項中所述之生產方法，其中該第二誘導物總體積為發酵槽內容物體積的33%，每次添加之體積為第二誘導物總體積的0.0868%。
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