CN111304183A - 一种纤维素酶的发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纤维素酶的发酵方法。所述方法是以真菌纤维素酶产生菌为菌种，经菌种制备后进行固体或液体发酵生产纤维素酶，在进行固体或液体发酵生产纤维素酶时添加铵盐。本发明提供了一种新的纤维素酶的发酵方法，是秸秆资源化、无害化利用的环保型技术。

Description

一种纤维素酶的发酵方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种纤维素酶的发酵方法。

背景技术

纤维素(cellulose)是葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而形成的葡聚糖，通常含数千个葡萄糖单位，是地球上最丰富的有机物质，也是植物细胞壁的主要成分；纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，植物界中碳素的一半以上存在于纤维素中；植物通过光合作用，生产地球上最丰富、最廉价的纤维素资源，全世界每年植物体生成量高达1,500－2,000亿吨干物质，其中纤维素及半纤维素的总量为850亿吨，占植物界碳含量的50％以上。

纤维素酶(cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系；包括：葡聚糖内切酶(1,4-β-D-glucan glucanohydrolase)，这类酶一般作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；葡聚糖外切酶(1,4-β-D-glucancellobiohydrolase)，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)；β-葡聚糖苷酶(β-glucosidase)，这类酶一般将纤维二糖水解成葡萄糖分子。

纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能产生纤维素酶；但对纤维素作用较强的菌株多是木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、Pellienlalia属和枝顶孢霉属(Acremonium)的菌株，特别是绿色木霉(T.virde)及其近缘的菌株。

纤维素酶是一组诱导酶，受环境中诱导物，菌体自身的基因、启动子、阻遏子多因素调控。

碳信号研究表明乳糖、纤维二糖等诱导里氏木霉表达纤维素酶，能够正调控纤维素酶基因表达；以纤维素为碳源只能够增强里氏木霉的纤维素酶表达，但以乳糖为碳源时，光却能够抑制纤维素酶表达；BLR1和BLR2是里氏木霉中蓝光受体蛋白；在光照条件下，BLR1和BLR2对纤维素酶基因转录起正调控作用。

很多蛋白能够结合到纤维素酶和半纤维素酶基因的启动子区，激活或者抑制相关基因表达；Xyrl、Ace2、Hap2/3/5、Acel和Crel是较早发现的能够调控纤维素酶表达的转录因子。Ace2在调控xyn2基因中起作用：抑制xyn2早期诱导；增强xyn2后期持续表达。

真核生物G蛋白组成物Gα部分参与纤维素酶基因表达，gna1和gna3双缺失菌株中纤维素酶转录在一定的情况下受抑制；在槐糖诱导时，在培养基中添加cAMP，葡聚糖内切酶分泌量提高近一倍，cAMP对里氏木霉纤维素酶基因表达调控是通过碳源依赖性的方式实现。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种纤维素酶的发酵方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述纤维素酶的发酵方法是以真菌纤维素酶产生菌为菌种，经菌种制备后进行固体或液体发酵生产纤维素酶，在进行固体或液体发酵生产纤维素酶时添加铵盐。实验结果表明，纤维素酶发酵水平提高200％以上。

优选地，所述铵盐为无机铵盐。

优选地，所述无机铵盐包括硫酸铵、硫酸氢铵、氯化铵、硝酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵中的至少一种。

优选地，当进行固体发酵时，铵盐的添加量为固体培养基重量的2.5％-3.5％；当进行液体发酵时，铵盐的添加量为液体培养基重量的1％-3％。

优选地，所述方法的具体步骤为：

(1)固体种子制备：将麸皮与水按质量比(50％-55％)：(50％-55％)搅拌均匀，于121-124℃灭菌30-40min，得固体发酵麸皮种子培养基，冷却后在固体发酵麸皮种子培养基接种真菌纤维素酶产生菌的新鲜试管斜面菌种，抖松麸曲，于28-32℃条件下静置培养2-4d，待有白色菌丝长满麸曲表面时，即可作为固体发酵种子；

(2)配制固体发酵培养基：将纤维秸秆、麸皮、水和铵盐按质量比(20％-35％):(10％-25％):(50％-65％):(2.5％-3.5％)配制(纤维秸秆、麸皮、水和铵盐加起来的质量百分比为100％)，于121-124℃灭菌30-40min，备用；

(3)纤维素酶的发酵生产：将固体发酵种子接种至固体发酵培养基，所述按固体发酵种子与固体发酵基本调控培养基的质量比为1:(50-60)，进行开放式发酵，发酵温度为22-32℃，发酵时间3-5d，期间翻曲若干次，待发酵培养基麸曲长出白色菌丝后，麸曲开始转色、并初步形成孢子时，终止发酵，用水浸提、压榨过滤，得到纤维素酶粗酶液，并测定、比较粗酶液的纤维素酶活力；

(4)纤维素酶的纯化、浓缩：将步骤(3)制得的纤维素酶粗酶液经硅藻土预涂，2级板框过滤，再经截留分子量10000Da的超滤膜浓缩，制成内切纤维素酶活力≥1000IU/mL的纤维素酶浓缩液；

(5)纤维素酶的精滤、防腐、包装：将步骤(4)制得的纤维素酶浓缩液经膨润土预涂，添加苯甲酸钠、山梨酸钾、稳定剂，再经2级板框精滤，制成内切纤维素酶活力≥1000IU/mL的工业级纤维素酶，经包装为成品；所述苯甲酸钠与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.25％-0.35％，优选3％，所述山梨酸钾与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.15％-0.25％，优选2％，所述稳定剂与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.05％-0.15％，优选1％。

优选地，步骤(2)中所述纤维秸秆为水稻秸秆、甘蔗渣、玉米秸秆、棉花秸秆中的至少一种粉碎成10-40目。

优选地，所述方法的具体步骤为：

(1)摇瓶液体种子制备：将麸皮、淀粉、水按质量比(3.5％-4.5％)：(1％-2％)：(94％-95.5％)配制(麸皮、淀粉、水加起来的质量百分比为100％)，优选为4％：1.5％：94.5％，于121℃灭菌20-25min，得液体发酵麸皮种子培养基，冷却后在液体发酵麸皮种子培养基接种真菌纤维素酶产生菌新鲜试管斜面菌种，在28-32℃，转速150-180转/min的摇床中震荡培养2.5-3.5d，即可作为液体发酵摇瓶种子；

(2)液体发酵罐一级种子制备：将麸皮、淀粉、水按质量比(3.5％-4.5％)：(1％-2％)：(94％-95.5％)配制(麸皮、淀粉、水加起来的质量百分比为100％)，优选为4％：1.5％：94.5％，于121℃灭菌25-30min，得一级发酵罐种子培养基，冷却后在一级发酵罐种子培养基接种液体发酵摇瓶种子，在28-32℃，转速130-150转/min的发酵罐中搅拌培养2.5-3.5d，即可作为液体发酵罐一级种子；

(3)液体发酵罐二级种子制备：将麸皮、淀粉、水按质量比(3.5％-4.5％)：(1％-2％)：(94％-95.5％)配制(麸皮、淀粉、水加起来的质量百分比为100％)，优选为4％：1.5％：94.5％，于121℃灭菌25-30min，得二级发酵罐种子培养基，冷却后在发酵罐种子培养基接种液体发酵罐一级种子，在28-32℃，转速130-150转/min的发酵罐中搅拌培养2.5-3.5d，即可作为液体发酵罐二级种子；

(4)液体纤维素酶调控发酵生产：将麸皮、秸秆粉、水、铵盐按质量比(2.5％-4.5％)：(0.5％-1.5％)：(94％-95.5％)：(1％-3％)配制(麸皮、秸秆粉、水、铵盐加起来的质量百分比为100％)，优选为4％：1％：94.5％：(1％-2％)，于121℃灭菌25-30min，得纤维素酶调控发酵培养基，冷却后在纤维素酶调控发酵培养基，接种液体发酵罐二级种子，在28-32℃，通气量0.5m³/min，转速100-150转/min的发酵罐中搅拌培养4.5-5.5d，检测内切纤维素酶活力，获得纤维素酶粗酶液；

(5)纤维素酶的纯化、浓缩：将步骤(4)制得的纤维素酶粗酶液经硅藻土预涂，2级板框过滤，再经截留分子量10000Da的超滤膜浓缩，制成内切纤维素酶活力≥1000IU/mL的纤维素酶浓缩液；

(6)纤维素酶的精滤、防腐、包装：将步骤(5)制得的纤维素酶浓缩液经膨润土预涂，添加苯甲酸钠、山梨酸钾、稳定剂，再经2级板框精滤，制成内切纤维素酶活力≥1000IU/mL的工业级纤维素酶，经包装为成品；所述苯甲酸钠与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.25％-0.35％，所述山梨酸钾与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.15％-0.25％，所述稳定剂与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.05％-0.15％。

本发明所述真菌纤维素酶产生菌为康氏木霉、绿色木霉、青霉或棘孢曲霉等。

下面结合原理对本发明作进一步说明：

所述铵盐调控纤维素酶发酵的原理归纳如下：

(1)起调控作用的功能基团是铵根离子(阳离子)，不是阴离子(硫酸根、碳酸根、硝酸根或氯离子等)；

(2)铵离子在发酵调控时不起氮源的营养作用，不能促进纤维素酶产生菌的生物量增加，相反，铵离子在发挥调控作用的浓度下，菌体生物量有所减少，但纤维素酶蛋白总量显著增加，纤维素酶活性显著提高；与未使用铵盐调控的工艺相比，纤维素酶活性差异显著，提高2-6倍；

(3)铵离子的调控是基因水平的调控，通过显著提高纤维素酶转录因子、启动子的活性，提高纤维素酶基因的转录水平，从而提高纤维素酶的翻译水平，实现纤维素酶总量提高；

(4)铵离子的调控作用依赖于碳源(纤维素粉等)的存在而发挥的，培养基中需要一定的碳源；具有类似纤维素对纤维素酶诱导的特性，但铵离子对纤维素酶的“诱导”作用远远高于纤维素本身。

本发明在利用野生菌株发酵纤维素酶时就可以达到显著正调控的效果，与现有基因工程菌株调控苛刻、培养基复杂、成本高相比，具有显著优势和技术进步：

(1)培养基简单，成本低，基本发酵培养基主要以麸皮、秸秆粉等农业副产物或废弃物，可以有效减缓环境污染压力；调控剂为无机铵盐，分子量小、结构清楚、无害、易得、级别要求低，可以是肥料水平或工业级的铵盐，相比乳糖、纤维二糖，价格极为便宜；

(2)铵盐可以调控绿色木霉、绿色木霉、棘孢曲霉、黑曲霉、青霉等丝状真菌产纤维素酶，与基因工程菌诱导剂只适应单一工程菌相比，适应调控的菌株对象广泛；

(3)铵盐作为结构明确的小分子，便于体内跟踪，可以用于纤维素酶基因表达、转录、翻译等分子机制的理论研究；也可以用于生产实际，简化生产工艺，生产出高活性的纤维素酶；

总之，本发明提供了一种新的纤维素酶的发酵方法，是秸秆资源化、无害化利用的环保型技术。

具体实施方式

实施例1

铵盐调控康氏木霉AS3.2774固体发酵纤维素酶的作用，通过如下步骤实现：

配制固体发酵基本培养基(对照)：将20目水稻秸秆粉8g，麸皮4g，水23mL搅拌混匀于250mL三角瓶中，121℃灭菌30min，冷却后接种康氏木霉AS3.2774斜面菌种，抖松麸曲，28℃条件下静置培养4.5d，期间抖动麸曲通风1次，经检测，滤纸纤维素酶活性的发酵水平为0.2IU/(g干曲)。

配制固体发酵调控培养基(处理)：将20目水稻秸秆粉8.0g，麸皮4.0g，硫酸铵1.0g，自来水23mL，搅拌混匀于250mL三角瓶中，121℃灭菌30min，冷却后接种康氏木霉AS3.2774斜面菌种，抖松麸曲，28℃条件下静置培养4.5d，期间抖动麸曲通风1次，经检测，滤纸纤维素酶活性的发酵水平为1.11IU/(g干曲)；铵盐对康氏木霉AS3.2774固体发酵纤维素酶的促进作用，与对照相比提高5.55倍。

实施例2

铵盐调控绿色木霉AS3.5455液体发酵纤维素酶的作用，通过如下步骤实现：

配制液体发酵基本培养基(对照)：将40目水稻秸秆粉1.0g，麸皮4.0g，水100mL于250mL三角瓶中，121℃灭菌25min，冷却后接种绿色木霉AS3.5455斜面菌种，在28℃，摇床转速130转/min条件下培养4d，经检测，内切纤维素酶活性的发酵水平为2.3IU/mL。

配制液体发酵调控培养基(处理)：将40目水稻秸秆粉1.0g，麸皮4.0g，氯化铵1.5g水100mL于250mL三角瓶中，121℃灭菌25min，冷却后接种绿色木霉AS3.5455斜面菌种，在28℃，摇床转速130转/min条件下培养4d，经检测，内切纤维素酶活性的发酵水平为8.1IU/mL；铵盐对绿色木霉AS3.5455液体发酵纤维素酶的促进作用，与对照相比提高3.52倍。

实施例3

铵盐调控产黄青霉AS3.3871液体发酵纤维素酶的作用，通过如下步骤实现：

将20目水稻秸秆粉8g，麸皮4g，水150mL煮沸20min后过滤，滤液定容至100mL，121℃灭菌30min，冷却后接种产黄青霉AS3.3871斜面菌种，在28℃，摇床转速150转/min的条件下培养4d，经检测，产黄青霉AS3.3871生物量为0.72g/L(干重)，滤纸纤维素酶活性的发酵水平为0.12IU/mL。

同法将20目水稻秸秆粉8g，麸皮4g，水150mL煮沸20min后过滤，滤液定容至100mL，再添加硝酸铵2g，121℃灭菌30min，冷却后接种产黄青霉AS3.3871斜面菌种，在28℃，摇床转速150转/min的条件下培养4d，经检测，产黄青霉AS3.3871生物量为0.67g/L，滤纸纤维素酶活性的发酵水平为0.29IU/mL；可见铵盐不仅不能有效促进青霉的菌体重量的增加，反而有一定的抑制作用；但铵盐明显提高产黄青霉AS3.3871纤维素酶的发酵水平，与对照相比提高2.16倍。

实施例4

铵盐调控棘孢曲霉CGMCC No.3876液体发酵纤维素酶的作用，通过如下步骤实现：

配制液体发酵基本培养基(对照)：将羧甲基纤维素钠1.0g，麸皮6.0g，自来水100mL于250mL三角瓶中，121℃灭菌25min，冷却后接种棘孢曲霉CGMCC No.3876斜面菌种，28℃，摇床转速150转/min条件下培养4天，经检测，内切纤维素酶活性的发酵水平为6.5IU/mL。

配制液体发酵调控培养基(处理)：将羧甲基纤维素钠1.0g，麸皮6.0g，氯化铵2.0g，自来水100mL于250mL三角瓶中，121℃灭菌25min，冷却后接种棘孢曲霉CGMCCNo.3876斜面菌种，在28℃，摇床转速150转/min条件下培养4d，经检测，内切纤维素酶活性的发酵水平为21.4IU/mL；铵盐对棘孢曲霉CGMCC No.3876液体发酵纤维素酶具有促进作用，与对照相比提高3.29倍。

实施例5

铵盐调控康氏木霉AS3.2774固体发酵纤维素酶的生产工艺，通过如下步骤实现：

(1)固体种子制备：将麸皮与水按质量比55％：55％搅拌均匀，于121-124℃灭菌30-40min，得固体发酵麸皮种子培养基，冷却后在固体发酵麸皮种子培养基接种康氏木霉AS3.2774斜面菌种，抖松麸曲，于28℃条件下静置培养3d，待有白色菌丝长满麸曲表面时，即可作为固体发酵种子；

(2)配制固体发酵培养基：将纤维秸秆(粉碎至10目)、麸皮、水和铵盐按质量比25％:10％:61.5％:3.5％配制，于121-124℃灭菌30-40min，备用；

(3)纤维素酶的发酵生产：将固体发酵种子接种至固体发酵培养基，所述按固体发酵种子与固体发酵基本调控培养基的质量比为1:50，进行开放式发酵，发酵温度为22-32℃，发酵时间5d，期间翻曲1次，待发酵培养基麸曲长出白色菌丝后，麸曲开始转色、并初步形成孢子时，终止发酵，用水浸提、压榨过滤，得到纤维素酶粗酶液，并测定、比较粗酶液的纤维素酶活力,内切纤维素酶活力为45.23IU/mL；

(4)纤维素酶的纯化、浓缩：将步骤(3)制得的纤维素酶粗酶液经硅藻土预涂，2级板框过滤，再经截留分子量10000Da的超滤膜浓缩，制成内切纤维素酶活力1038IU/mL的纤维素酶浓缩液；

(5)纤维素酶的精滤、防腐、包装：将步骤(4)制得的纤维素酶浓缩液经膨润土预涂，添加苯甲酸钠、山梨酸钾、稳定剂，再经2级板框精滤，制成内切纤维素酶活力1031IU/mL的工业级纤维素酶，经包装为成品；所述苯甲酸钠与纤维素酶浓缩液的质量百分比为3％，所述山梨酸钾与纤维素酶浓缩液的质量百分比为2％，所述稳定剂与纤维素酶浓缩液的质量百分比为1％。

实施例6

铵盐调控棘孢曲霉CGMCC No.3876液体发酵纤维素酶的生产工艺，通过如下步骤实现：

(1)摇瓶液体种子制备：将麸皮、淀粉、水按质量比4％：1.5％：94.5％，于121℃灭菌20min，得液体发酵麸皮种子培养基，冷却后在液体发酵麸皮种子培养基接种棘孢曲霉CGMCC No.3876斜面菌种，在32℃，转速180转/min的摇床中震荡培养2.5d，即可作为液体发酵摇瓶种子；

(2)液体发酵罐一级种子制备：将麸皮、淀粉、水按质量比4％：1.5％：94.5％配制，于121℃灭菌25min，得一级发酵罐种子培养基，冷却后在一级发酵罐种子培养基接种液体发酵摇瓶种子，在32℃，转速130转/min的发酵罐中搅拌培养2.5d，即可作为液体发酵罐一级种子；

(3)液体发酵罐二级种子制备：将麸皮、淀粉、水按质量比4％：1.5％：94.5％配制，于121℃灭菌30min，得二级发酵罐种子培养基，冷却后在发酵罐种子培养基接种液体发酵罐一级种子，在32℃，转速150转/min的发酵罐中搅拌培养2.5，即可作为液体发酵罐二级种子；

(4)液体纤维素酶调控发酵生产：将麸皮、秸秆粉、水、硫酸铵按质量比4％：1％：94.5％：2％，于121℃灭菌30min，得纤维素酶调控发酵培养基，冷却后在纤维素酶调控发酵培养基，接种液体发酵罐二级种子，在32℃，通气量0.5m³/min，转速100转/min的发酵罐中搅拌培养4.5d，检测内切纤维素酶活力32.44IU/mL，获得纤维素酶粗酶液；

(5)纤维素酶的纯化、浓缩：将步骤(4)制得的纤维素酶粗酶液经硅藻土预涂，2级板框过滤，再经截留分子量10000Da的超滤膜浓缩，制成内切纤维素酶活力1182IU/mL的纤维素酶浓缩液；

(6)纤维素酶的精滤、防腐、包装：将步骤(5)制得的纤维素酶浓缩液经膨润土预涂，添加苯甲酸钠、山梨酸钾、稳定剂，再经2级板框精滤，制成内切纤维素酶活力1123IU/mL的工业级纤维素酶，经包装为成品；所述苯甲酸钠与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.3％，所述山梨酸钾与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.2％，所述稳定剂与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.1％。

Claims (8)

1.一种纤维素酶的发酵方法，其特征在于，所述方法是以真菌纤维素酶产生菌为菌种，经菌种制备后进行固体或液体发酵生产纤维素酶，在进行固体或液体发酵生产纤维素酶时添加铵盐。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铵盐为无机铵盐。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述无机铵盐包括硫酸铵、硫酸氢铵、氯化铵、硝酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵中的至少一种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当进行固体发酵时，铵盐的添加量为固体培养基重量的2.5％-3.5％；当进行液体发酵时，铵盐的添加量为液体培养基重量的1％-3％。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：

(1)固体种子制备：将麸皮与水按质量比(50％-55％)：(50％-55％)搅拌均匀，于121-124℃灭菌30-40min，得固体发酵麸皮种子培养基，冷却后在固体发酵麸皮种子培养基接种真菌纤维素酶产生菌的新鲜试管斜面菌种，抖松麸曲，于28-32℃条件下静置培养2-4d，待有白色菌丝长满麸曲表面时，即可作为固体发酵种子；

(2)配制固体发酵培养基：将纤维秸秆、麸皮、水和铵盐按质量比(20％-35％):(10％-25％):(50％-65％):(2.5％-3.5％)配制，于121-124℃灭菌30-40min，备用；

(3)纤维素酶的发酵生产：将固体发酵种子接种至固体发酵培养基，所述按固体发酵种子与固体发酵基本调控培养基的质量比为1:(50-60)，进行开放式发酵，发酵温度为22-32℃，发酵时间3-5d，期间翻曲若干次，待发酵培养基麸曲长出白色菌丝后，麸曲开始转色、并初步形成孢子时，终止发酵，用水浸提、压榨过滤，得到纤维素酶粗酶液，并测定、比较粗酶液的纤维素酶活力；

(4)纤维素酶的纯化、浓缩：将步骤(3)制得的纤维素酶粗酶液经硅藻土预涂，2级板框过滤，再经截留分子量10000Da的超滤膜浓缩，制成内切纤维素酶活力≥1000IU/mL的纤维素酶浓缩液；

(5)纤维素酶的精滤、防腐、包装：将步骤(4)制得的纤维素酶浓缩液经膨润土预涂，添加苯甲酸钠、山梨酸钾、稳定剂，再经2级板框精滤，制成内切纤维素酶活力≥1000IU/mL的工业级纤维素酶，经包装为成品；所述苯甲酸钠与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.25％-0.35％，所述山梨酸钾与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.15％-0.25％，所述稳定剂与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.05％-0.15％。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述纤维秸秆为水稻秸秆、甘蔗渣、玉米秸秆、棉花秸秆中的至少一种粉碎成10-40目。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：

(1)摇瓶液体种子制备：将麸皮、淀粉、水按质量比(3.5％-4.5％)：(1％-2％)：(94％-95.5％)配制，于121℃灭菌20-25min，得液体发酵麸皮种子培养基，冷却后在液体发酵麸皮种子培养基接种真菌纤维素酶产生菌新鲜试管斜面菌种，在28-32℃，转速150-180转/min的摇床中震荡培养2.5-3.5d，即可作为液体发酵摇瓶种子；

(2)液体发酵罐一级种子制备：将麸皮、淀粉、水按质量比(3.5％-4.5％)：(1％-2％)：(94％-95.5％)配制，于121℃灭菌25-30min，得一级发酵罐种子培养基，冷却后在一级发酵罐种子培养基接种液体发酵摇瓶种子，在28-32℃，转速130-150转/min的发酵罐中搅拌培养2.5-3.5d，即可作为液体发酵罐一级种子；

(3)液体发酵罐二级种子制备：将麸皮、淀粉、水按质量比(3.5％-4.5％)：(1％-2％)：(94％-95.5％)配制，于121℃灭菌25-30min，得二级发酵罐种子培养基，冷却后在发酵罐种子培养基接种液体发酵罐一级种子，在28-32℃，转速130-150转/min的发酵罐中搅拌培养2.5-3.5d，即可作为液体发酵罐二级种子；

(4)液体纤维素酶调控发酵生产：将麸皮、秸秆粉、水、铵盐按质量比(2.5％-4.5％)：(0.5％-1.5％)：(94％-95.5％)：(1％-3％)配制，于121℃灭菌25-30min，得纤维素酶调控发酵培养基，冷却后在纤维素酶调控发酵培养基，接种液体发酵罐二级种子，在28-32℃，通气量0.5m³/min，转速100-150转/min的发酵罐中搅拌培养4.5-5.5d，检测内切纤维素酶活力，获得纤维素酶粗酶液；

(5)纤维素酶的纯化、浓缩：将步骤(4)制得的纤维素酶粗酶液经硅藻土预涂，2级板框过滤，再经截留分子量10000Da的超滤膜浓缩，制成内切纤维素酶活力≥1000IU/mL的纤维素酶浓缩液；

(6)纤维素酶的精滤、防腐、包装：将步骤(5)制得的纤维素酶浓缩液经膨润土预涂，添加苯甲酸钠、山梨酸钾、稳定剂，再经2级板框精滤，制成内切纤维素酶活力≥1000IU/mL的工业级纤维素酶，经包装为成品；所述苯甲酸钠与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.25％-0.35％，所述山梨酸钾与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.15％-0.25％，所述稳定剂与纤维素酶浓缩液的质量百分比为0.05％-0.15％。

8.如权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于，真菌纤维素酶产生菌为康氏木霉、绿色木霉、青霉或棘孢曲霉。