CN108949581A - 一种利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法 - Google Patents

一种利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种木聚糖酶的制备方法，尤其涉及一种利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法。该方法包括以下步骤：菌种选取、菌种培养、发酵、烘干、包装。本发采用黑曲霉诱变株作为生产菌株，其产品活力高，生产效率高；本发明充分利用廉价固体原料如麸皮、玉米芯作为菌种的碳源来源，变废为宝，降低生产成本，而且生产工艺简单，操作方便，发酵周期短，产品质量稳定，酶活性较高，另外本发明的木聚糖酶具有良好的耐酸性和耐高温性能，适于推广使用。

Description

一种利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法
（一）技术领域
本发明涉及一种木聚糖酶的制备方法，尤其涉及一种利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法。
（二）背景技术
木聚糖是一类重要的半纤维素，以农作物残渣中的半纤维素、纤维素为原料培养微生物生产经济价值较高的产品研究有重要的意义，而关键在于获得大量廉价的木聚糖酶与纤维素酶。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称，它可以将木聚糖降解为寡聚木糖、木糖和少量单糖。
黑曲霉是发酵产木聚糖酶的菌种之一。黑曲霉属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科，是丝状真菌的一个常见种，广泛分布于粮食、植物产品和土壤中。人类运用黑曲霉的历史悠久，早在中国古代，人们就利用黑曲霉制作酱料、酱油、米酒等。由于黑曲霉生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素，被美国FDA认证为安全菌种（ＧＲＡＳ）。黑曲霉具有很强的外源基因表达能力及高效的蛋白表达、分泌和修饰能力，同时重组子具有很高的遗传稳定性。随着越来越多的外源蛋白在黑曲霉成功表达，且被证明具有较高的产量和活性，黑曲霉成为了一个重要的酶表达体系，也逐渐成为重要的工业酶制剂生产菌种。
我国是农业大国，每年都会生产大量农业脚料如秸秆、玉米芯、稻壳等，绝大部分因为难以利用仅作为农家燃料。半纤维素是植物细胞壁中含量第二丰富的多糖,占生物质原料干重的30%一40%。木聚糖是一种多聚五碳糖，主要成分是D一木糖,是植物半纤维素的重要组成部分。木聚糖酶是一类以内切和外切方式降解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键的酶系,是降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称，该酶系可广泛应用于造纸、食品、饲料添加剂等领域。
目前，工业上普遍采用液态发酵方法来生产木聚糖酶，这种方法存在能耗大、工艺操作复杂，设备投资多等缺点。本发明目的是提供一种利用黑曲霉固态发酵木聚糖酶的生产工艺，此方法具有操作简单、原料易得、设备简单、投资少等优点，且发酵产物除木聚糖酶以外，其他酶种类多，协同性好，复合酶使用效果更好。
（三）发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌种选取：将黑曲霉接种在斜面培养基上，在28-30℃条件下培养4-5d，从中挑选出黑曲霉菌株；
（2）菌种培养：将挑选出的黑曲霉菌株接种到固体培养基上，培养3-4d，然后转入种子罐中进行通风搅拌培养，黑曲霉菌株与种子罐培养基的重量比为（2-3）:1000，种子罐培养基的组成按重量份数为麸皮5-8 份，玉米粉3-6份，豆饼粉4-6份，葡萄糖3-5份，水800-1000份；
（3）发酵：将步骤（2）得到的菌种接入消毒的固体发酵培养基中，菌种与固体发酵培养基的重量比为1：（9-20），搅拌均匀后，移入固体发酵罐，进行通风发酵培养3-8d，制得木聚糖酶；
（4）烘干、包装：将步骤（3）制得的木聚糖酶在50-55℃条件下进行低温干燥，烘干后进行粉碎和分装。
所述步骤（1）中斜面培养基的组成按重量份数为：硝酸钠3份，氯化钾0.5份，三水磷酸氢二钾1份，七水硫酸铁0.02份，七水硫酸镁1份，蔗糖30份，琼脂20份，pH为6-7，在120℃条件下灭菌30 min。
所述步骤（2）中固体培养基的组成按重量份数为：麸皮8-10份，玉米芯5-8份，豆饼粉0.5-2份，硫酸铵0.2-0.3份，磷酸二氢钠0.03-0.05份，固体培养基在120℃条件下灭菌30min。步骤（2）种子罐中的培养温度为25-40℃，搅拌速度为200-400rpm。
所述步骤（3）中固体发酵培养基的组成按重量份数为：麸皮15-25份、粉碎后的玉米芯35-70份、豆饼粉10-20份，硫酸铵1-5份，固体发酵培养基在120℃条件下灭菌30min。步骤（3）中通风发酵培养的环境温度为25-38℃，空气相对湿度为70-85%，自然补给无菌空气。
所述步骤（4）中木聚糖酶粉碎后过80目筛网。
本发明的有益效果是：本发采用黑曲霉诱变株作为生产菌株，诱变菌株发酵后不产孢子，后期产品外观好，其产品活力高，生产效率高；本发明采用固体发酵法制备木聚糖酶，与液体发酵方法相比，存在操作简单、原料易得、设备投资少等优点；本发明充分利用廉价固体原料如麸皮、玉米芯作为菌种的碳源来源，变废为宝，降低生产成本，而且生产工艺简单，操作方便，发酵周期短，产品质量稳定，酶活性较高，还具有良好的耐酸性和耐高温性能，适于推广使用。
（四）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选取：将黑曲霉接种在斜面培养基上，斜面培养基的组成按重量份数为：硝酸钠3份，氯化钾0.5份，三水磷酸氢二钾1份，七水硫酸铁0.02份，七水硫酸镁1份，蔗糖30份，琼脂20份，pH为6-7，在120 ℃条件下灭菌30 min；黑曲霉在28℃条件下在斜面培养基上培养4d，从中挑选出黑曲霉菌株；
（2）菌种培养：将挑选出长势良好的黑曲霉菌株接种到固体培养基上，固体培养基的组成按重量份数为：麸皮8份，玉米芯5份，豆饼粉0.5份，硫酸铵0.2份，磷酸二氢钠0.03份，固体培养基在120℃条件下灭菌30min；黑曲霉菌株在固体培养基上培养4d，然后转入种子罐中，黑曲霉菌株与种子罐培养基的重量比为2:1000，进行通风搅拌培养，培养温度为30℃，搅拌速度为200-400rpm；种子罐培养基的组成按重量份数为麸皮5份，玉米粉3份，豆饼粉4份，葡萄糖3份，水800份；
（3）发酵：将步骤（2）得到的菌种接入消毒的固体发酵培养基中，其中菌种与固体发酵培养基的重量比为1：9，搅拌均匀后，移入固体发酵罐，进行通风发酵培养3d，环境温度控制在25-38℃，空气相对湿度为70-85%，制得木聚糖酶；固体发酵培养基的组成按重量份数为：麸皮15份、粉碎后的玉米芯35份、豆饼粉10份，硫酸铵1份，固体发酵培养基在120℃条件下灭菌30min；
（4）烘干、包装：将步骤（3）制得的木聚糖酶在50-55℃条件下进行低温干燥，烘干后进行粉碎，过80目筛网，然后进行分装，制得的木聚糖酶酶活为32452U/g。
实施例2
利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选取：将黑曲霉接种在斜面培养基上，在30℃条件下在斜面培养基上培养4d，从中挑选出黑曲霉菌株；
（2）菌种培养：将挑选出长势良好的黑曲霉菌株接种到固体培养基上，固体培养基的组成按重量份数为：麸皮10份，玉米芯8份，豆饼粉2份，硫酸铵0.3份，磷酸二氢钠0.05份，固体培养基在120℃条件下灭菌30min；黑曲霉菌株在固体培养基上培养3d，然后转入种子罐中，黑曲霉菌株与种子罐培养基的重量比为3:1000，进行通风搅拌培养，培养温度为25℃，搅拌速度为200-400rpm；种子罐培养基的组成按重量份数为麸皮8 份，玉米粉6份，豆饼粉6份，葡萄糖5份，水1000份；
（3）发酵：将步骤（2）得到的菌种接入消毒的固体发酵培养基中，其中菌种与固体发酵培养基的重量比为1：20，搅拌均匀后，移入固体发酵罐，进行通风发酵培养5d，环境温度控制在25-38℃，空气相对湿度为70-85%，制得木聚糖酶；固体发酵培养基的组成按重量份数为：麸皮25份、粉碎后的玉米芯68份、豆饼粉20份，硫酸铵5份，固体发酵培养基在120℃条件下灭菌30min；
（4）烘干、包装：将步骤（3）制得的木聚糖酶在50-55℃条件下，进行低温干燥，烘干后进行粉碎，过80目筛网，然后进行分装，制得的木聚糖酶酶活为33500U/g。
实施例3
利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选取：将黑曲霉接种在斜面培养基上，在30℃条件下在斜面培养基上培养5d，从中挑选出黑曲霉菌株；
（2）菌种培养：将挑选出长势良好的黑曲霉菌株接种到固体培养基上，固体培养基的组成按重量份数为：麸皮9份，玉米芯6份，豆饼粉1份，硫酸铵0.3份，磷酸二氢钠0.04份，固体培养基在120℃条件下灭菌30min；黑曲霉菌株在固体培养基上培养4d，然后转入种子罐中，黑曲霉菌株与种子罐培养基的重量比为2:1000，进行通风搅拌培养，培养温度为40℃，搅拌速度为200-400rpm；种子罐培养基的组成按重量份数为麸皮6份，玉米粉5份，豆饼粉5份，葡萄糖4份，水900份；
（3）发酵：将步骤（2）得到的菌种接入消毒的固体发酵培养基中，其中菌种与固体发酵培养基的重量比为1：15，搅拌均匀后，移入固体发酵罐，进行通风发酵培养8d，环境温度控制在25-38℃，空气相对湿度为70-85%，制得木聚糖酶；固体发酵培养基的组成按重量份数为：麸皮20份、粉碎后的玉米芯50份、豆饼粉15份，硫酸铵3份，固体发酵培养基在120℃条件下灭菌30min；
（4）烘干、包装：将步骤（3）制得的木聚糖酶在50-55℃条件下，进行低温干燥，烘干后进行粉碎，过80目筛网，然后进行分装，制得的木聚糖酶酶活为32950U/g。
下面结合实验进行进一步说明。
将本发明中制得的木聚糖酶进行耐酸和耐高温实验，实施例1-3制得的木聚糖酶分别编号为木聚糖酶Ⅰ、木聚糖酶Ⅱ、木聚糖酶Ⅲ，将以液体发酵法制备的木聚糖酶作为对照例，编号为木聚糖酶Ⅳ进行实验。液体发酵法制备木聚糖酶的方法参照申请号CN2009101533553，公开号CN102041250A，一种黑曲霉产木聚糖酶方法的专利制备。
将木聚糖酶Ⅰ、木聚糖酶Ⅱ、木聚糖酶Ⅲ和木聚糖酶Ⅳ中每一种木聚糖酶都均匀分为两组，一组分别放置于温度37℃，pH2.5的酸性环境中，4小时后测定酶活；另一组分别放置于温度80℃，pH5.5的高温环境中，10分钟后测定酶活。实验结果如下表所示。
表1不同木聚糖酶的耐酸性和耐高温活性
如表1所示，木聚糖酶Ⅰ、木聚糖酶Ⅱ、木聚糖酶Ⅲ在高温和酸性环境中，其酶活率高于液体发酵方法制备的木聚糖酶Ⅳ，具有更高的酶活性，因此本发明制备的的木聚糖酶具有良好的耐酸性和耐高温性能，适于推广使用。
以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的几种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌种选取：将黑曲霉接种在斜面培养基上，在28-30℃条件下培养4-5d，从中挑选出黑曲霉菌株；
（2）菌种培养：将挑选出的黑曲霉菌株接种到固体培养基上，培养3-4d，然后转入种子罐中进行通风搅拌培养，黑曲霉菌株与种子罐培养基的重量比为（2-3）:1000，种子罐培养基的组成按重量份数为麸皮5-8 份，玉米粉3-6份，豆饼粉4-6份，葡萄糖3-5份，水800-1000份；
（3）发酵：将步骤（2）得到的菌种接入消毒的固体发酵培养基中，菌种与固体发酵培养基的重量比为1：（9-20），搅拌均匀后，移入固体发酵罐，进行通风发酵培养3-8d，制得木聚糖酶；
（4）烘干、包装：将步骤（3）制得的木聚糖酶在50-55℃条件下进行低温干燥，烘干后进行粉碎和分装。
2.根据权利要求1所述的利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法，其特征在于：所述步骤（1）中斜面培养基的组成按重量份数为：硝酸钠3份，氯化钾0.5份，三水磷酸氢二钾1份，七水硫酸铁0.02份，七水硫酸镁1份，蔗糖30份，琼脂20份，pH为6-7，在120 ℃条件下灭菌30min。
3.根据权利要求1所述的利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法，其特征在于：所述步骤（2）中固体培养基的组成按重量份数为：麸皮8-10份，玉米芯5-8份，豆饼粉0.5-2份，硫酸铵0.2-0.3份，磷酸二氢钠0.03-0.05份，固体培养基在120℃条件下灭菌30min。
4.根据权利要求1所述的利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法，其特征在于：所述步骤（2）种子罐中的培养温度为25-40℃，搅拌速度为200-400rpm。
5.根据权利要求1所述的利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法，其特征在于：所述步骤（3）中固体发酵培养基的组成按重量份数为：麸皮15-25份、粉碎后的玉米芯35-70份、豆饼粉10-20份，硫酸铵1-5份，固体发酵培养基在120℃条件下灭菌30min。
6.根据权利要求1所述的利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法，其特征在于：所述步骤（3）中通风发酵培养的环境温度为25-38℃，空气相对湿度为70-85%，自然补给无菌空气。
7.根据权利要求1所述的利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法，其特征在于：所述步骤（4）中木聚糖酶粉碎后过80目筛网。
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