CN102041250A - 一种黑曲霉产木聚糖酶方法 - Google Patents

一种黑曲霉产木聚糖酶方法 Download PDF

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Inventor
吴菁
史利斌
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Abstract

本发明提供了一种新的木聚糖酶生产方法，其步骤包括：配置营养盐液、配置液体种子培养基，将产孢子培养基上的黑曲霉按2％接种量接种于种子培养基，培养3-4天。然后配置液体发酵培养基(玉米芯2％，(NH4)2SO4 1％，KH2PO40.13％，CaCl2 0.025％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4·7H2O 0.008％，ZnSO4·7H2O 0.003％)。将种子培养基菌种按25％的接种量接种于液体发酵培养基，再加入2％的麸皮、1％的酵母膏、0.5％的吐温，调节pH为5.0，温度28℃，于150r/min放于恒温振荡培养箱中培养72h。所得发酵液4000r/min离心分离10min，过滤得上清液，即为粗酶液，经(NH4)2SO4分级沉淀纯化后，再经2次葡聚糖凝胶柱层析。最后干燥后得木聚糖酶粉末。本发明提供了一种新的木聚糖酶生产方法，利用该法生产木聚糖酶生产工艺简单，操作方便，原料易得，生产成本低，无污染，适于大规模工业化生产。

Description

一种黑曲霉产木聚糖酶方法
一、技术领域
本发明提供了一种新的木聚糖酶的制备方法，涉及微生物发酵法生产木聚糖酶。
二、技术背景
木聚糖(xylan)是一种多聚五碳糖，是半纤维素的重要组成部分，广泛存在于植物界。许多谷物饲粮中存在的木聚糖是阻碍营养物质消化的抗营养因子，随着农业生产力水平的提高，小麦产量大幅度增加，已远远超出作为食用粮的需要。从经济角度来看，就地转化用作饲料比较合算，但是包括小麦在内的谷物中都含有多种抗营养因子。有关资料表明小麦中的抗营养因子主要是木聚糖，此外还有少量的β-葡聚糖。这两类聚合物具有增加食糜粘度、降低动物采食量、抑制生长以及防碍养分消化吸收等抗营养作用，使饲料消化利用率大大降低。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称，它可以将木聚糖降解为寡聚木糖、木糖和少量单糖。在饲料中添加木聚糖酶，可显著降低阿拉伯木聚糖分子的大小，将其分解成较小聚合度的低聚木糖，从而改善饲料性能。如果在造纸时添加木聚糖酶则可以使木质素的提取变得更容易，同时保留纤维素成分，又可在随后的工艺中减少氯的浓度，降低有机卤素的水平，达到既环保又经济的目的。在食品业中，如果在饮料中添加一定量的低聚木糖，可以提高饮料的稳定性。在其他工业中，木聚糖酶也都显示出了广阔的应用前景。因此，木聚糖酶制剂的开发和研究已受到世界各国科学工作者的广泛关注。
我国是农业大国，每年都会生产大量农业脚料如秸秆、玉米芯、稻壳等，绝大部分因为难以利用仅作为农家燃料。这些物质中都含有大量的木聚糖，若利用木聚糖酶将其转化为低聚木糖，既可处理农业废料，变废为宝，保护环境，又可促进我国低聚糖工业的发展，因此对木聚糖酶制剂的研究将具有十分可观的社会效益和经济效益。
三、发明内容
1.黑曲霉产木聚糖酶，其特征包括以下几个步骤：
(1)配制营养盐液
取1000ml烧杯加入14g(NH4)2SO4，20g KH2PO4，4g CaCl2·2H2O，1.5gMgSO4搅拌均匀，放于4℃冰箱中保藏。
(2)黑曲霉菌种保藏
黑曲霉X-1接种在马铃薯、葡萄糖、琼脂的试管斜面上，在30℃恒温箱中培养7天后，于冰箱内4℃以下保藏。
(3)黑曲霉的选育及培养
将菌种保藏培养基上的黑曲霉菌接种到产孢子培养基上，于28℃下放入恒温培养箱中培养4-5d。
(4)黑曲霉种子培养基配置
取葡萄糖30g，玉米浆10g，营养盐100g，配置1000ml营养液。
(5)黑曲霉接种培养
将产孢子培养基上的菌种按2％的接种量接种于种子培养基，30℃、180r/min放于恒温振荡培养箱中培养3-4天。
(6)产酶基础培养基制备
配置液体发酵培养基：加入玉米芯2％，(NH4)2SO41％，KH2PO40.13％，CaCl20.025％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4·7H2O 0.008％，ZnSO4·7H2O 0.003％。
(7)接种发酵培养
将种子培养基菌种按25％的接种量接种于液体发酵培养基，再加入2％的麸皮、1％的酵母膏、0.5％的吐温，调节PH为5.0，温度28℃，于150r/min放于恒温振荡培养箱中培养72h。
(8)盐析分离
将发酵液4000r/min离心分离10min，过滤得上清液，即为粗酶液，粗酶液经20％饱和硫酸铵沉淀，纯化倍数为3.0倍。追加硫酸铵饱和度至60％，纯化倍数为5.9倍.在4℃静至12h后，取上清液。
(9)凝胶过滤提取木聚糖酶
经硫酸铵分级沉淀后的酶样经SephadexG-25葡聚糖凝胶柱层析，再经SephadexG-100葡聚糖凝胶柱层析，干燥后得木聚糖酶粉末。
本发明提供了一种新的木聚糖酶生产方法，利用该法生产木聚糖酶生产工艺简单，操作方便，原料易得，生产成本低，适于大规模工业化生产。

Claims (6)

1.一种黑曲霉产木聚糖酶方法，其特征包括以下几个步骤：
(1)配制营养盐液
取1000ml烧杯加入14g(NH4)SO4，20g KH2PO4，4g CaCl2·2H2O，1.5gMgSO4搅拌均匀，放于4℃冰箱中保藏。
(2)黑曲霉菌种保藏
黑曲霉X-1接种在马铃薯、葡萄糖、琼脂的试管斜面上，在30℃恒温箱中培养7天后，于冰箱内4℃以下保藏。
(3)黑曲霉的选育及培养
将菌种保藏培养基上的黑曲霉菌接种到产孢子培养基上，于28℃下放入恒温培养箱中培养4-5d。
(4)黑曲霉种子培养基配置
取葡萄糖30g，玉米浆10g，营养盐100g，配置1000ml营养液。
(5)黑曲霉接种培养
将产孢子培养基上的菌种按2％的接种量接种于种子培养基，30℃、180r/min放于恒温振荡培养箱中培养3-4天。
(6)产酶基础培养基制备
配置液体发酵培养基：加入玉米芯2％，(NH4)2SO4 1％，KH2PO4 0.13％，CaCl20.025％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4·7H2O 0.008％，ZnSO4·7H2O 0.003％。
(7)接种发酵培养
将种子培养基菌种按25％的接种量接种于液体发酵培养基，再加入2％的麸皮、1％的酵母膏、0.5％的吐温，调节PH为5.0，温度28℃，于150r/min放于恒温振荡培养箱中培养72h。
(8)盐析分离
将发酵液4000r/min离心分离10min，过滤得上清液，即为粗酶液，粗酶液经20％饱和硫酸铵沉淀，纯化倍数为3.0倍。追加硫酸铵饱和度至60％，纯化倍数为5.9倍.在4℃静至12h后，取上清液。
(9)凝胶过滤提取木聚糖酶
经硫酸铵分级沉淀后的酶样经SephadexG-25葡聚糖凝胶柱层析，再经SephadexG-100葡聚糖凝胶柱层析，干燥后得木聚糖酶粉末。
2.如权利要求(2)所诉，其特征在于所用的试管斜面培养基为PDA斜面培养基。
3.如权利要求(7)所诉，其特征在于加2％麸皮为碳源时发酵效果最好。
4.如权利要求(7)所诉，其特征在于加1％酵母膏为氮源时产酶效果最佳。
5.如权利要求(7)所诉，其特征在于添加0.5％的吐温对黑曲霉产木聚糖酶促进作用最佳。
6.如权利要求(8)所诉，其特征在于用质量分数为60％的(NH4)2SO4盐析效果最佳。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103045485A (zh) * 2011-10-14 2013-04-17 中国农业大学 米黑根毛霉菌株及其在制备β-葡聚糖酶和凝乳酶中的应用
CN103923840A (zh) * 2014-03-28 2014-07-16 中国科学院广州能源研究所 一种高产木聚糖酶的黑曲霉及其应用
CN108949581A (zh) * 2018-07-23 2018-12-07 山东五福生生态工程有限公司 一种利用黑曲霉发酵生产木聚糖酶的方法

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103045485A (zh) * 2011-10-14 2013-04-17 中国农业大学 米黑根毛霉菌株及其在制备β-葡聚糖酶和凝乳酶中的应用
CN103045485B (zh) * 2011-10-14 2015-04-22 中国农业大学 米黑根毛霉菌株及其在制备β-葡聚糖酶和凝乳酶中的应用
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PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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