CN101705217B

CN101705217B - 一种联产木聚糖酶和纤维素酶的方法

Info

Publication number: CN101705217B
Application number: CN2009102101557A
Authority: CN
Inventors: 李荣杰; 薛培俭; 尚海涛; 穆晓玲
Original assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Current assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Priority date: 2009-10-29
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2029-10-29
Also published as: CN101705217A

Abstract

本发明公开了一种联产木聚糖酶和纤维素酶的方法，利用农作物秸秆或木材加工废弃物作为培养基中的碳源，经灭菌、接种、固体发酵、提取、干燥的过程，制取木聚糖粗酶；然后利用木聚糖酶渣子作为碳源，经灭菌、接种、液体发酵生产纤维素酶；所述木聚糖酶渣子为上述制得的木聚糖酶粗酶经提取木聚糖酶后剩下的废弃物。本发明能够在生产木聚糖酶的同时，利用木聚糖酶提取后剩下的废渣子替代高价格的微晶纤维素作为诱导物，进行液体发酵生产纤维素酶，大大降低生产成本，便于该技术的大规模工业化生产的推广。

Description

一种联产木聚糖酶和纤维素酶的方法

技术领域

本发明涉及一种联产木聚糖酶和纤维素酶的方法。

背景技术

纤维素、半纤维素和木质素相互交织而构成了植物细胞壁的主要成分，其是天然纤维素原料的主要成分，其一般组成比例为4∶3∶3。木聚糖是植物半纤维素的重要组成部分，其主要成分是D-木糖，木聚糖酶(Xylanase，EC3.2.1.8)是一类重要的水解酶，主要以内切方式作用于木聚糖酶主链上的β-1，4-木糖苷键。水解产物主要为不同聚合度的低聚糖和木糖，同化木糖的酵母菌可以把木糖转化成酒精。目前国内燃料酒精的生产主要原料来自于粮食，而目前粮食短缺问题已经是国际性问题，粮食短缺问题的解决迫在眉睫。高活性、低成本的木聚糖酶生产技术目前还未得到解决。

纤维素酶是一个多酶体系，由多个组分组成。按底物特异性可将纤维素酶分成以下组分：外切β-1，4-葡聚糖酶(exo-β-1，4-glucanase)、内切-β-1，4-葡聚糖酶(vendo-β-1，4-glucanase，EG)(EC3.2.1.4)、β-1，4-葡糖糖苷酶(β-1，4-glucanase，BG)(EC3.2.1.21)。目前国内外生产纤维素酶有固体和液体两种方法，固体发酵设备投资少，但占地面积大、生产稳定性差、易染杂菌、技术难掌握。而液体发酵具有生产稳定性高、技术易掌握、便于大规模工业化生产，但是目前主要利用价格昂贵的微晶纤维素作为诱导物进行纤维素酶生产，成本较高。含天然纤维素类物质如玉米芯、麦秸直接作为原料效果不理想，这些物质用于生产木聚糖酶后，其半纤维素物质木聚糖被大量分解，其致密结构遭到破坏，纤维素部分被暴露出来，再经烘干粉碎后容易被产纤维素酶菌利用，可代替价格昂贵的微晶纤维素作为诱导物进行纤维素酶液体生产，大大降低生产成本，有利于大规模工业化生产。其研究有助于我国非粮食能源领域迅速发展，解决目前世界粮食短缺、能源危机等重大国际问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种联产木聚糖酶和纤维素酶的方法；特别是提供一种利用微生物生产出高酶活的木聚糖酶，再利用木聚糖酶发酵渣子联产纤维素酶，降低生产成本且适合工业大生产的方法。

其具体技术方案为：

一种联产木聚糖酶和纤维素酶的方法，利用农作物秸秆或木材加工废弃物作为培养基中的碳源，经灭菌、接种、固体发酵、提取、干燥的过程，制取木聚糖粗酶；然后利用木聚糖酶渣子作为碳源，经灭菌、接种、液体发酵生产纤维素酶；所述木聚糖酶渣子为上述制得的木聚糖酶粗酶经提取木聚糖酶后剩下的废弃物。

本发明以废弃物木聚糖酶渣子替代微晶纤维素作为诱导物，进行液体发酵生产纤维素酶。木聚糖酶渣子是木聚糖酶粗酶经提取木聚糖酶后剩下的废弃物，由于天然纤维素类物质如玉米芯、麦秸作为原料用于生产木聚糖酶后，其半纤维素物质木聚糖被大量分解，其致密结构遭到破坏，纤维素部分被暴露出来，再经烘干粉碎后容易被产纤维素酶菌利用，可代替价格昂贵的微晶纤维素作为诱导物进行纤维素酶液体生产，大大降低生产成本，便于大规模工业化生产。

本发明的方法，其中所述农作物秸秆为麦草、稻草、玉米秸秆、小麦秸秆或玉米芯。

本发明的方法，固体发酵制取木聚糖粗酶时，培养基中除碳源外，还包括无机盐溶液，并控制50～70重量％的含水量。

本发明的方法，发酵制取木聚糖粗酶时，采用机械搅拌接种、固体盘式发酵的方式。机械搅拌接种替代手工接种大大节省人力，既低成本又提高混合均匀度。固体盘式发酵替代固体发酵罐发酵，消毒灭菌彻底，局部染菌易处理，减小染菌带来的损失。

本发明的方法，固体发酵制取木聚糖粗酶时，木聚糖酶发酵用的种子是用PDA培养基试管斜面上的孢子接1000mL麸曲瓶扩培一次，用400mL无菌水洗下作为固体发酵的种子。麸曲瓶固体培养基与固体发酵培养基相同。纤维素酶发酵用的种子是用PDA培养基试管斜面上的孢子接500mL摇瓶培养的液体种子。

固体发酵培养基为：农作物秸秆或木材加工废弃物：20～30重量％；麸皮9～10重量％；硫酸铵1.8～2.5重量％；尿素0.9～1.2重量％；硫酸镁0.3～0.4重量％；磷酸二氢钾0.35～0.5重量％；其余为水；pH5.5。优选为农作物秸秆或木材加工废弃物：21％；麸皮9％；硫酸铵1.8％；尿素0.9％；硫酸镁0.3％；磷酸二氢钾0.35％；水67％；pH5.5。

本发明的方法，在利用农作物秸秆作为碳源时，秸秆要经过粉碎、过2～5mm孔径的筛子。

本发明的方法，其中木聚糖酶固体发酵周期为4～6天。

本发明的方法，木聚糖酶固体发酵扩大生产时将天然纤维素类物质如玉米芯、稻草、麦秸秆、玉米秸秆等用粉碎机粉碎，过2～5mm孔径筛子作为碳源，再加入麸皮或玉米粉、硫酸铵、尿素、硫酸镁等辅料，加水用混合机搅拌均匀，装入1m×1m×0.1m的大方盘装中，每盘5～10kg，分层装入灭菌柜中，121℃高压灭菌40min。灭菌后物料冷却至35℃，用麸曲瓶种子接种，接种量为5～10％，分层放入培养室的培养架上，30℃下静态培养4天。期间在培养至20小时用无菌水喷洒浇水一次，水湿透培养基为宜，在培养期间待培养基即将发热即停止加热，使其自然生长。待两天后，30℃恒温继续培养1～2天即可。将培养好的酶经过洗脱、压滤、过离子柱纯化、喷雾干燥制成酶粉。

本发明的方法，在利用木聚糖酶渣子作为碳源发酵生产纤维素酶时，摇瓶种子培养基为葡萄糖1.5％；硫酸镁0.1％；磷酸二氢钾0.5％；玉米浆0.5％；氯化钙0.1％；酵母粉1.5％；硫酸铵0.6％；pH4.5。摇瓶种子培养周期为24h，培养温度为28℃。

初始液体发酵培养基中各物质的重量百分比为：木聚糖酶渣子1.5-2.0％；葡萄糖0.2-0.3％；玉米浆1.0-1.5％；酵母粉1.0-1.5％；麸皮0.5-0.8％；氯化钙0.05-0.1％；pH4.0～6.0；发酵后期液体补料培养基中各物质的重量百分比为：木聚糖酶渣子4.0-5.0％；乳糖7-8％；酵母粉2.0-2.5％；磷酸二氢钾0.5-0.6％；硫酸镁0.1-0.2％；Tween-800.2-0.3％；硫酸铵0.2-0.3％；氯化钙0.5-1.0％；pH4.0～6.0。

本发明的方法，在利用木聚糖酶渣子作为碳源发酵生产纤维素酶时，木聚糖酶渣子要经烘干、粉碎、过200目筛子。

本发明的方法，液体发酵时，液体发酵培养基装量为50～55％，发酵温度为28℃～30℃，通气量为1∶0.5～1.0，罐压0.05MPa，发酵时间为96～144小时，DO控制在30～60，开始补料时间为48～60小时。

本发明中，固体发酵生产木聚糖酶所用的菌种是产木聚糖酶的黑曲霉工业菌株或基因工程黑曲霉菌株。液体发酵生产纤维素酶所用的菌种是产纤维素酶的里氏木霉工业菌株或基因工程里氏木霉菌株。

本发明中，木聚糖酶的测定方法是用0.2g木聚糖作为底物，加0.9mL pH4.8柠檬酸缓冲液，再加0.1mL粗酶稀释液，50℃恒温水浴摇床反应30min，用3，5-二硝基水杨酸法测定生成的还原糖，以木糖为标准糖，以每分钟生成1μmol还原糖所需的酶量定义成一个木聚糖酶酶活力单位(IU)。柠檬酸缓冲液为21g无水柠檬酸、7.8g氢氧化钠加蒸馏水定容至2L，pH为4.8。发酵好的固体酶用柠檬酸缓冲液以一定的稀释倍数稀释浸泡过夜即得粗酶液。

还原糖测定方法：采用DNS法，以木糖为标准。

固体培养基水分测定：水分测定仪测定。

纤维素酶的测定方法：用0.1g滤纸作为底物，加0.9mL pH4.8柠檬酸缓冲液，再加0.1mL粗酶离心上清液，50℃恒温水浴摇床反应30min，用3，5-二硝基水杨酸法测定生成的还原糖，以葡萄糖为标准糖，以每分钟生成1μmol还原糖所需的酶量定义成一个纤维素酶酶活力单位(IU)。液体发酵好的醪液离心取上清液即为粗酶液。柠檬酸缓冲液为21g无水柠檬酸、7.8g氢氧化钠加蒸馏水定容至2L，pH为4.8。

还原糖测定方法：采用DNS法，以葡萄糖为标准。

上述技术方案具有如下优点：

(1)本发明的生产木聚糖酶的方法是以农业废弃物秸秆如麦草、玉米芯、稻草以及木材加工废料如木屑等作为主要原料生产木聚糖酶，其生产成本低廉，工艺简单，易操作，生产的木聚糖酶活力高，有利于秸秆酶技术的工业化推广。

(2)本发明的联产纤维素酶的方法是利用上述制作的木聚糖酶提取后剩下的废渣子替代高价格的微晶纤维素作为诱导物，进行液体发酵生产纤维素酶，大大降低生产成本，便于该技术的大规模工业化生产的推广。

(3)上述固体发酵得到的木聚糖酶的酶活可达8000IU/g(折固体干基)；联产发酵得到的纤维素酶的酶活可达50-60IU/mL。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一、固体发酵生产木聚糖酶

实施例1：

种子扩大培养基在麸曲瓶中制作，种子培养基为农作物秸秆20％、麸皮20％、硫酸铵2.5％、尿素1.2％、硫酸镁0.4％、磷酸二氢钾0.5％，水55.4％，pH5.5。121℃消毒40min，黑曲霉(CGMCC3.3147)斜面种子接种，混合均匀，30℃下静态培养5～10天。

实施例2：

固体发酵培养基：玉米芯30％、麸皮10％、硫酸铵2.5％、尿素1.2％、硫酸镁0.4％、磷酸二氢钾0.5％、水55.4％、pH5.5。固体发酵培养基用1m×1m×0.1m的大方盘装料10kg，盖盖子，121℃消毒40min，晾凉后接种，接种量为5％，用混合机混合接种，分装每盘5～6kg，30℃下培养，静态4～6天。木聚糖酶活力达到7000IU/g(折固体干基)。

实施例3：

固体发酵培养基：稻草粉30％、麸皮10％、硫酸铵2.5％、尿素1.2％、硫酸镁0.4％、磷酸二氢钾0.5％、水55.4％、pH5.5。固体发酵培养基用1m×1m×0.1m的大方盘装料10kg，盖盖子，121℃消毒40min，晾凉后接种，接种量为5％，用混合机混合接种，分装每盘5～6kg，30℃下培养，静态4～6天。木聚糖酶活力达到6000IU/g(折固体干基)。

实施例4：

固体发酵培养基：木屑30％、麸皮10％、硫酸铵2.5％、尿素1.2％、硫酸镁0.4％、磷酸二氢钾0.5％、水55.4％、pH5.5。固体发酵培养基用1m×1m×0.1m的大方盘装料10kg，盖盖子，121℃消毒40min，晾凉后接种，接种量为5％，用混合机混合接种，分装每盘5～6kg，30℃下培养，静态4～6天。木聚糖酶活力达到7000IU/g(折固体干基)。

实施例5：

固体发酵培养基：玉米芯21％、麸皮9％、硫酸铵1.8％、尿素0.9％、硫酸镁0.3％、磷酸二氢钾0.35％、水66.65％、pH5.5。固体发酵培养基用1m×1m×0.1m的大方盘装料10kg，盖盖子，121℃消毒40min，晾凉后接种，接种量为5％，用混合机混合接种，分装每盘5～6kg，30℃下培养，第一天给培养基浇水保湿，此后继续静态3～4天。木聚糖酶活力达到8000IU/g(折固体干基)。

将培养好的酶经过洗脱、压滤、过离子柱纯化、喷雾干燥制成酶粉。

实施例6：

固体发酵培养基：麦草粉21％、麸皮9％、硫酸铵1.8％、尿素0.9％、硫酸镁0.3％、磷酸二氢钾0.35％、水66.65％、pH5.5。固体发酵培养基用1m×1m×0.1m的大方盘装料10kg，盖盖子，121℃消毒40min，晾凉后接种，接种量为5％，用混合机混合接种，分装每盘5～6kg，30℃下培养，第一天给培养基浇水保湿，此后继续静态3～4天。木聚糖酶活力达到8000IU/g(折固体干基)。

二、液体发酵生产纤维素酶

实施例7：

摇瓶种子培养基的配制：葡萄糖1.5％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.5％、玉米浆0.5％、氯化钙0.1％、酵母粉1.5％、硫酸铵0.6％，其余为水，pH4.5，500mL三角瓶装量150mL/瓶，121℃消毒30min。

PDA试管斜面中取里氏木霉(CICC13052)孢子接一环接入三角瓶中，放入摇床220r/min，30℃培养24h。

实施例8：

纤维素酶液体培养基：木聚糖酶渣子1.5％、葡萄糖0.2％、玉米浆1.0％、酵母粉1.0％、麸皮0.5％、氯化钙0.05％，其余为水，pH4.5。

液体补料培养基中各物质的重量百分比为：木聚糖酶渣子4.0％、乳糖8％、磷酸二氢钾0.5％、酵母粉2％、硫酸镁0.1％、Tween-800.2％、硫酸铵0.2％、氯化钙0.5％，其余为水，pH4.5。

液体深层发酵培养基装量为55％，发酵温度为28℃～30℃，通气量为1∶0.5～1.0，搅拌转速200r/min，罐压0.05MPa，发酵时间为144小时，DO控制在30～60，开始补料时间为60小时，补料量为罐子体积的15％，补料时间为80小时。纤维素酶活力达30IU/g。

实施例9：

液体补料培养基：木聚糖酶渣子4.0％、乳糖8.0％、磷酸二氢钾0.5％、酵母粉2.0％、硫酸镁0.1％、Tween-800.2％、硫酸铵0.2％、氯化钙0.5％，其余为水，pH4.5。

液体深层发酵培养基装量为50％，发酵温度为28℃～30℃，通气量为1∶0.5～1.0，搅拌转速200r/min，罐压0.05MPa，发酵时间为144小时，DO控制在30～60，开始补料时间为48小时，补料量为罐子体积的20％，补料时间为90小时。纤维素酶活力达50IU/g。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种联产木聚糖酶和纤维素酶的方法，其特征在于，利用农作物秸秆或木材加工废弃物作为培养基中的碳源，经灭菌、接种黑曲霉或基因工程黑曲霉菌株、固体发酵、提取、干燥的过程，制取木聚糖酶粗酶；然后利用木聚糖酶渣子作为碳源，经灭菌、接种里氏木霉或基因工程里氏木霉菌株、液体发酵生产纤维素酶；所述木聚糖酶渣子为上述制得的木聚糖酶粗酶经提取木聚糖酶后剩下的废弃物；

其中，固体发酵使用的培养基为：农作物秸秆或木材加工废弃物：20～30重量％；麸皮9～10重量％；硫酸铵1.8～2.5重量％；尿素0.9～1.2重量％；硫酸镁0.3～0.4重量％；磷酸二氢钾0.35～0.5重量％；其余为水；pH5.5；固体发酵周期为4～6天；

液体发酵初始使用的培养基为：木聚糖酶渣子1.5～2.0％；葡萄糖0.2～0.3％；玉米浆1.0～1.5％；酵母粉1.0～1.5％；麸皮0.5～0.8％；氯化钙0.05～0.1％；pH4.0～6.0；发酵后期液体补料培养基中各物质的重量百分比为：木聚糖酶渣子4.0～5.0％；乳糖7～8％；酵母粉2.0～2.5％；磷酸二氢钾0.5～0.6％；硫酸镁0.1～0.2％；Tween-800.2～0.3％；硫酸铵0.2～0.3％；氯化钙0.5～1.0％；pH4.0～6.0；液体发酵时，液体发酵培养基装量为50～55％，发酵温度为28℃～30℃，通气量为1∶0.5～1.0，罐压0.05MPa，发酵时间为96～144小时，DO控制在30～60，开始补料时间为48～60小时。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农作物秸秆为麦草、稻草、玉米秸秆、小麦秸秆或玉米芯。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，固体发酵制取木聚糖酶粗酶时，培养基中除碳源外，还包括无机盐溶液，并控制50～70重量％的含水量。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，固体发酵制取木聚糖酶粗酶时，采用机械搅拌接种、固体盘式发酵的方式。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在利用农作物秸秆作为碳源时，秸秆要经过粉碎、过2～5mm孔径的筛子。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在利用木聚糖酶渣子作为碳源发酵生产纤维素酶时，木聚糖酶渣子要经烘干、粉碎、过200目筛子。