CN103045547B

CN103045547B - 一种固体菌剂及其制备方法和应用

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Publication number: CN103045547B
Application number: CN201310009330.2A
Authority: CN
Inventors: 阮晖; 杜姗姗; 伍星主; 何李琳; 李青青; 徐娟; 陈功; 诸文颖; 杨璐; 刘松柏; 何国庆
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-01-10
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2033-01-10
Also published as: CN103045547A

Abstract

本发明公开了一种固体菌剂及其制备方法和应用。所述固体菌剂的制备方法包括：(1)将未灭菌的玉米芯静置培养，获得培养物A；(2)在所述培养物A中接入黑曲霉(Aspergillus niger)和麦曲；混合培养，获得所述固体菌剂。本发明还提供了一种利用所述制备方法获得的固体菌剂及其在生产纤维素复合酶系中的应用。与现有技术相比，本发明利用未灭菌载体上的天然菌群对产酶微生物进行驯化，获得的固体菌剂不仅微生态稳定，而且能够对纤维基质进行糖化发酵生产纤维素复合酶系，可实现对纤维基质低成本高性价比的转化。

Description

一种固体菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纤维质废弃物利用领域，尤其涉及一种固体菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

饲料是发展畜牧业的物质基础，而大量的多纤维粗饲料又是世界上一笔取之不尽、用之不竭的饲料资源。

纤维质粗饲料资源包括农作物的秸秆、皮、壳、芯、废弃木材、锯末等，据统计，全世界每年的农作物秸秆产量约40多亿吨，我国每年约有7～8亿吨。这些资源粗纤维含量高，蛋白质少，粗灰分多，适口性差，不适于直接作饲料，长期以来大都被烧掉或者部分还田，而作为饲料利用的尚不到五分之一，资源利用率低而污染严重。

玉米芯属木质纤维素类生物质原料之一，在自然界的纤维质废弃物中占有很大比例。玉米芯结构复杂而成分单一，主要是纤维素、半纤维素和木质素，含有丰富碳源，但由于纤维素、半纤维素和木质素的紧密缠绕使其成为慢利用碳源。

多年来，许多国家致力于研究多种方法对纤维质粗饲料进行加工处理，包括化学、物理、生物学方法在内，使其转化成适口性良好、营养价值高的饲料。其中，最有前景的是微生物发酵法，该方法既不需要太复杂的设备和过多的能量消耗，又不需高温、高压、强酸、强碱等较为极端的条件。

微生物发酵法是通过微生物对纤维质粗饲料进行充分发酵利用生产纤维素酶添加剂，用于提高饲料利用率，改善饲料的营养价值，降低饲料成本，提高经济效益，具有广阔的开发前景。

目前国内普遍使用的固体菌剂有两种：纯化的单一菌剂和简单混合菌剂。纯化的单一菌剂是在自然环境中筛选优良的产酶单菌株，再通过一定的诱变手段，获得工业化大规模生产的产酶菌株，再吸附到特定载体上制成的菌剂。但自然环境中对纤维素、木质素等成分的降解是多种微生物协同完成的，微生物之间相互协调、相互制约，使产生的水解酶之间的比例处于一种最适降解状态。而纯化的单一菌剂中的菌种由于失去了自然条件下长期处于协同关系的其他菌的共存，其产酶能力大大降低，所产纤维素复合酶系往往不全，对发酵条件要求较高，且易受污染。

简单混合菌剂是将两种或两种以上的产酶菌种按一定的比例混合，吸附于适宜的载体上制成。人为地简单混合，各种菌之间是否具有协同关系，是否产生拮抗作用还有待证实。

发明内容

本发明提供了一种固体菌剂的制备方法，该方法操作简便，获得的固体菌剂微生态稳定。

一种固体菌剂的制备方法，包括：

(1)将自然选取的玉米芯静置培养，获得培养物A；

(2)在所述培养物A中接入黑曲霉(Aspergillus niger)和麦曲；混合培养，获得所述固体菌剂。

本发明利用在自然选取的玉米芯上自然生长的天然菌群对接入的产酶微生物进行驯化，获得了一种微生态稳定的固体菌剂。

为利于微生物的生长繁殖，所述玉米芯粉碎成1～2mm片段后再进行静置培养。如无特殊说明，本发明中的玉米芯均为被无菌粉碎成1～2mm的片段。

步骤(1)中，所述静置培养的温度优选为28～32℃，培养时间优选为20～30小时。合理的培养温度使玉米芯上的天然菌群能自然生长，合理的培养时间使所述天然菌群不会因生长过盛而影响产酶微生物的生长。

本发明可选用黑曲霉(Aspergillus niger)ZJU-RYD1，为浙江大学食品科学与发酵工程研究所保藏。也可选用其他可发酵生产纤维素复合酶系中的一种或多种酶的黑曲霉(Aspergillus niger)。

所述黑曲霉(Aspergillus niger)优选经活化后配制成1×108～109spores/mL的孢子悬液再进行接种；接种量为8～12mL/100g玉米芯。

所述麦曲与玉米芯的重量比优选为4～6∶100。优选地，所述麦曲为生麦曲，由安吉乌毡帽酒厂提供。与熟麦曲相比，生麦曲中微生物种类较为丰富，能够分泌更多更丰富的酶类。

步骤(2)中，所述混合培养的温度为29～31℃，培养环境湿度控制在90～100％，培养时间为45～50小时。

本发明还提供了利用所述制备方法制得的固体菌剂。所述固体菌剂微生态稳定、能对纤维基质进行糖化发酵产生纤维素复合酶系，利用这种微生态群系可以进行较为粗放的发酵，不必担心污染问题，实现对纤维基质的低成本高性价比生物转化。

本发明还提供了所述固体菌剂在生产纤维素复合酶系中的应用，包括：

将玉米芯、苹果皮、麦麸、水混合，接入所述固体菌剂，搅拌均匀，静置培养，获得所述纤维素复合酶系。

将该纤维素复合酶系与适宜的载体混合，还可制成纤维素酶制剂，用作饲料添加剂，提高饲料利用率，改善饲料品质。

玉米芯、苹果皮、麦麸、水优选以重量比0.8～1.2∶0.8～1.2∶0.4～0.6∶2.3～2.7混合。所述固体菌剂的添加量优选为8～12％。

所述静置发酵的条件优选为：发酵温度为28～31℃，发酵环境湿度控制在86～94％，发酵时间为3～6天。发酵基质的厚度控制在2～3cm，以增加透气率，促进微生物生长。

发酵完成后，将发酵物与适量的缓冲液混合，进行酶液的提取。

所述缓冲液优选为0.5M的柠檬酸酸钠溶液(pH 4.8)，与发酵物以6～8∶1(v/w)的比例混合，30℃水浴55～65min后离心，上清液即为所需酶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明利用自然选取的载体上的天然菌群对产酶微生物进行驯化，获得的固体菌剂不仅微生态稳定，而且能够对纤维基质进行糖化发酵生产纤维素复合酶系，可实现对纤维基质低成本高性价比的转化。

具体实施方式

1菌剂的制备

(1)玉米芯天然菌群的制备

将野外采集的玉米芯基质(采自浙大紫金港)无菌粉碎成片段为1-2mm的玉米芯，取100g玉米芯于30℃培养24小时，获得培养物A。

如无特殊说明，本发明中的玉米芯均指片段为1-2mm的玉米芯。

(2)黑曲霉活化

本具体实施方式选用黑曲霉(Aspergillus niger)ZJU-RYD1，为浙江大学食品科学与发酵工程研究所保藏；生麦曲由安吉乌毡帽酒厂提供。

将黑曲霉ZJU-RYD1接种到PDA培养基斜面，28℃条件下培养3～4d进行活化。获取活化后的黑曲霉ZJU-RYD1的孢子，用蒸馏水制成浓度为1×10⁸spores/mL的孢子悬液，备用。

(3)固体菌剂的制备

往步骤(1)获得的培养物A中接入10mL黑曲霉ZJU-RYD1孢子悬液、5g生麦曲，混合后于30℃培养48～60小时，即获得固体菌剂。

2固态发酵

下面以玉米芯作发酵底物为例，举例说明本发明固体菌剂在制备纤维素复合酶系中的应用。

取玉米芯，与麦麸、苹果皮、水以1∶1∶0.5∶2.5的比例混合，接种10％(w/w)的固体菌剂。发酵基质厚度控制在2cm左右，30℃培养，湿度保持在90％以上，发酵5天。

3酶液提取和酶活测定

(1)酶液提取

将发酵产物和0.5M的柠檬酸酸钠缓冲液(pH 4.8)按比例(w/v＝1∶7)混合，放入30℃水浴60min，然后在室温下3000rpm离心取上清液，即得所需酶液。

(2)酶活测定

1)纤维素酶(内切葡聚糖酶)活性测定

将一张Sigma滤纸剪成1*3cm于试管中，加0.5M的柠檬钠缓冲液(pH5.8)10mL，加酶液0.5mL，50℃保温10min。加入3mL DNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温后加蒸馏水定容至25mL，测定还原糖量。

一个酶活单位(U)定义为每分钟水解滤纸产生1μmol葡萄糖所需的酶量。

2)木聚糖酶活性测定

底物选择以0.2M的醋酸钠缓冲液(pH 5.0)溶解的浓度为1％的木聚糖溶液。取酶液0.5mL，加入1mL底物溶液，50℃保温10min。然后加入3mL DNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温后加蒸馏水定容至25mL，测定还原糖量。

一个酶活单位(U)定义为每分钟水解木聚糖产生1μmol木糖所需的酶量。

3)淀粉酶活的测定

底物选择以0.1M的柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)溶解的浓度为1％的淀粉溶液。取酶液0.5mL，加入1mL底物溶液，50℃保温10min。然后加入3mL DNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温后加蒸馏水定容至25mL，测定还原糖量。

一个酶活单位(U)定义为每分钟水解淀粉产生1μmol葡萄糖所需的酶量。

4)果胶酶活的测定

底物选择以0.1M的柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)溶解的浓度为1％的果胶溶液。取酶液0.5mL，加入1mL底物溶液，50℃保温10min。然后加入3mL DNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温后加蒸馏水定容至25mL，测定还原糖量。

一个酶活单位(U)定义为每分钟水解果胶产生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量。

重复三次，测定结果如表中所示，数据为每克菌剂所产生的酶活的平均值±标准差。

表1不同发酵时间下发酵物中四种酶的酶活力

由表1可见，利用本发明的固体菌剂进行发酵获得的玉米芯发酵物中，酶类丰富，包括纤维素酶、果胶酶、淀粉酶以及木聚糖酶，且酶活较高。发酵第3天时，果胶酶的酶活达到最高，约为24.31U/g；发酵第4天时，淀粉酶的酶活达到最高，约为132.05U/g；发酵第5天时，纤维素酶和木聚糖酶的酶活达到最高，分别约为3.73U/g和9.40U/g。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种固体菌剂的制备方法，其特征在于，包括：

（1）将自然选取的玉米芯静置培养，获得培养物A；

（2）在所述培养物A中接入黑曲霉（Aspergillus niger）和麦曲；混合培养，获得所述固体菌剂；

所述玉米芯粉碎成1～2mm片段后再进行静置培养；

步骤（1）中，所述静置培养的温度为28～32℃，时间为20～30小时。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述黑曲霉（Aspergillusniger）经活化后配制成1×10⁸～10⁹spores/mL的孢子悬液再进行接种；接种量为8～12mL/100g玉米芯。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述麦曲与玉米芯的重量比为4～6:100。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述混合培养的温度为29～31℃，培养环境湿度控制在90～100%，培养时间为45～50小时。

5.一种如权利要求1～4任一所述制备方法制得的固体菌剂。

6.如权利要求5所述的固体菌剂在生产纤维素复合酶系中的应用，包括：

将玉米芯、苹果皮、麦麸、水混合，接入所述固体菌剂，搅拌均匀，发酵培养，获得所述纤维素复合酶系。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，玉米芯、苹果皮、麦麸、水以重量比0.8～1.2:0.8～1.2:0.4～0.6:2.3～2.7混合。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述固体菌剂的添加量为8～12%。