CN115125152A - 一种降解木质纤维素的混合菌、混合酶和降解方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降解木质纤维素的混合菌、混合酶和降解方法；所述用于降解木质纤维素的混合菌是从天然来源如变质水果废物中分离和鉴定的真菌联合体，分别利用低抗性底物柚子果皮和高抗性底物工业大麻残留物进行固态发酵，生产能够降解木质纤维素成分的混合酶；本发明还采用了一锅预处理和糖化，将高度难降解的木质纤维素材料，如工业大麻残留物，降解为可发酵的糖和其他原料；本发明的方法简单、绿色、高效、具有成本效益，具有工业应用潜力。

Description

一种降解木质纤维素的混合菌、混合酶和降解方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种降解木质纤维素的混合菌、混合酶和降解方法。
背景技术
根据中国统计局的数据，2017年迄今为止工业大麻产量为12.47万吨，是2010年产量的近12.5倍。该植物的不同部分被用于某些应用，包括食品、油、膳食、化妆品、药品、纤维、植物修复等。但是，利用大麻应用于这类应用会产生大量的废物残留物，因此，工业大麻残留物的降解有助于充分利用生物质和循环生物经济。
2019年，全球柚产量(Citrus grandis L.Osbeck)产量达到929万吨，与其他柑橘类水果相比，柚子的果皮最厚，占新鲜果实总重量的49％。此外，食用柚子可从果实总重量中产生高达63％的浪费，废物管理问题是水果加工业的最大负担。此外，不当处理这些废物可能会对环境造成不利影响。
酶的成本，如纤维素酶，占总成本的40％，被认为是从生物质资源生产的整个生物燃料链中最昂贵的部分。据报道，已经多次尝试从廉价的碳源生产木质纤维素降解酶。在以前的研究中，众所周知的丝状真菌被单独用于固态发酵，或分离单一和混合糖化，或用于木质纤维素生物质后续水解的共培养。第一种情况可能面临的挑战是无法产生广泛的能够降解坚硬植物细胞壁的酶。在后两种情况下，真菌菌株的单独维护需要额外的资源和时间。而且，为不同类型微生物的混合物找到最佳的固态发酵和糖化条件是具有挑战性的。此外，这些真菌已在各种研究中被广泛用于固态发酵，但在工业应用方面没有任何进展。因此，开发创新策略和发现能够大规模生产酶的替代新型真菌菌株至关重要。开发一种新的策略也至关重要，以进一步降低与生物质预处理和通过固态发酵生产酶的商业营养补充相关的加工成本也至关重要。
发明内容
本发明提供一种降解木质纤维素的混合菌、混合酶和降解方法，解决现有的纤维素酶生产技术有限、生产成本高，维护难，以及工业大麻残留物、柚子皮等废弃物的再处理麻烦、环境不友好等问题。
为解决上述技术问题，提供一种降解木质纤维素的混合菌、混合酶和降解方法。通过固态发酵生产了能够降解工业大麻渣和柚皮的混合酶，该混合酶可包括但不限于：纤维素酶、淀粉酶、酯酶、蛋白酶、聚半乳糖醛酸酶、木聚糖酶、脂肪酶等；
一种降解木质纤维素的混合菌，包含三种菌：青霉菌Penicillium solitum含量为60％-61％，镰刀菌Fusarium oxysporum含量为21％-23％，季也蒙毕赤酵母Meyerozymaguilliermondii含量为16％-18％。
进一步的，所述三种菌是通过将变质的柚子皮切片放在含有马铃薯葡萄糖琼脂和链霉素的无菌培养皿中，孵育，分离，传代培养和鉴定获得。
一种降解木质纤维素的混合酶，是用上述三种菌进行发酵得到的。
进一步的，所述发酵是在培养皿中加入处理过的工业大麻残留物、柚子皮中的一种或两种，加入蒸馏水，消毒，加入三种菌的孢子悬浮液，进行固态发酵。
进一步的，所述发酵是在培养皿中加入等量的处理过的工业大麻残留物和柚子皮的混合物进行的发酵。
进一步的，所述工业大麻残留物是指大麻的不同部分被用于某些应用，包括食品、油、膳食、化妆品、药品、纤维、植物修复等，大麻应用于这类应用后会产生大量的废物残留物，这些废物残留物统称工业大麻残留物。
进一步的，所述柚子皮和工业大麻残留物的处理方法：将新鲜的柚子皮切成碎片，在 50-60℃的烤箱中干燥一段时间，工业大麻残留物和柚子皮分别进行研磨，将柚子皮粉碎成细粉末，研磨后的工业大麻残留物使用0.5mm丝网筛筛选工业大麻残留物。
进一步的，所述加入蒸馏水是调整培养基使其水分含量为70％。
进一步的，所述固态发酵进行了5天。
一种木质纤维素的降解方法，包括以下步骤：
(1)预处理：工业大麻残留物加入草酸，工业大麻残留物和草酸的重量比为10:1-5，加热，进行热化学预处理；
(2)糖化：在上述的预处理物中加入上述的混合酶，进行糖化；
(3)离心、过滤，得到水解物，进行还原糖分析。
进一步的，所述糖化是加入等量的处理过的工业大麻残留物和柚子皮的混合物进行发酵得到的混合酶，加入草酸，进行一锅预处理和糖化。
进一步的，所述预处理是加入2％(w/v)的草酸，加热，进行热化学预处理，加入等量的工业大麻残留物和柚子皮的混合物进行固态发酵得到的混合酶，进行一锅预处理和糖化。
进一步的，所述糖化条件150-250rpm和40℃-60℃的摇床中进行一段时间。
进一步的，所述离心、过滤，得到水解物是在10000rpm离心20min，用Whatman 1号过滤纸过滤，得到水解物以供进一步分析。
本发明的有益效果是：
本发明使用从变质水果废弃物中分离出来的新型真菌联合体，柚子皮，用于固态发酵，从廉价和可持续的资源中生产混合酶，而不补充额外的营养素。这些酶混合物进一步用于降解木质纤维素生物质，工业大麻残留物，以产生可发酵的原料。与以往的工作相比，具有以下优点：
(1)从固态发酵的天然底物中分离出并鉴定出天然的混合菌，这可以为木质纤维素的降解和生物加工提供一个新的视角。
(2)设计固态发酵使用廉价的可持续低和高抗性基质，无需预先预处理，不需要额外的营养补充，可以降低工业应用工艺的总体成本。
(3)利用废物生物质而不是原始材料，这就避免了对食品与能源的资源竞争，为生物质残留物增加了经济价值，提供了有效的废物管理战略，并可以降低生物加工成本。
(4)利用绿色和可持续的固体酸(草酸)，可以由生物资源合成，在工艺中回收，在酶糖化前进行木质纤维素预处理，可以降低工艺成本。
(5)实施“一锅”预处理和糖化过程，可尽量减少时间、设备、能源消耗、资源损失等。并最终降低了加工成本。
(6)所有方法(固态发酵、预处理和一锅工艺)均为简单、绿色、高效、具有成本效益，具有工业应用潜力。
使用工业废渣和柚皮混合物的相对优势：
(1)使用高顽拗生物量(例如大麻)的固态发酵需要预处理和/或营养补充。这将增加生产成本并使工艺复杂化。在本申请中，固态发酵单独使用(不添加任何其他营养素，也不预处理生物量)高和低顽拗性工业大麻残渣和柚皮的混合物；
(2)在固态发酵中仅使用柚子皮一般是不被选择的，其原因有：1)由于湿润的柚子皮粉末的果冻/果酱状纹理，真菌仅在表面生长，没有深度渗透。这也可能导致柚子皮的发酵固体附着在固态发酵设备上，并影响进一步的加工步骤；2)由于柚子中的木质纤维素含量相对较低，木质纤维素酶的生产也将受到限制。
本申请开发了一种创新策略，分别混合低和高顽拗性柚子皮，柚皮和工业大麻渣底物，通过固态发酵在一定的条件下生产能降解木质纤维素的混合酶。其优点有：1)柚子皮与相对多孔的工业大麻残渣混合，能够很好的微调柚子皮质地所存在的问题，这可以促进真菌菌丝体的入侵、渗透和解体，从而降解木质纤维素生物量；2)柚子皮是天然栖息地，含糖量高，木质纤维素成分低，使真菌能够在较少的压力下快速生长，以适应并在混合固态发酵培养基中分泌木质纤维素降解酶；3)真菌木质纤维素降解酶的分泌依赖于特定诱导物对转录调节因子的激活。这些诱导剂通常是生物质聚合物释放的单糖或双糖。有趣的是，柚子皮中糖的可用性将启动真菌转录调节器，以产生用于降解工业大麻残渣中木质纤维素成分的酶混合物，这有助于避免额外的商业营养素。
(3)以前的研究将大麻植物(原始生物量)的全部或部分用于生物燃料或化学品生产。然而，本申请使用了工业大麻残渣，即大麻用于其他初级产品后产生的废物。
附图说明
图1是不同发酵底物进行固态发酵后的真菌生长结果。
图2是不同预处理和糖化条件下还原糖的测定曲线。
图3是对比例1的实验结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书和较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
新鲜的柚子果实采集自湖南科技学院附近的水果店。水果的每一部分都被手工分离并称重。因此，整个果实重1.0-1.25kg，其中浪费量占新鲜果实总重量的63％，柚子皮占总浪费的78％。原始工业大麻残留物来自湖南农业大学。
一部分柚子皮用刀切成碎片，在55℃的烤箱中干燥24小时。柚子皮和工业大麻残留物使用不锈钢迷你实验室研磨机分别进行研磨后，得到柚子皮粉末，研磨后的工业大麻残留物再使用实验室0.5mm丝网筛筛选工业大麻残留物。
另部分柚子皮样品在室温下保存几天，直到果皮表面出现可见的孢子，见图1的(a)；用无菌手术刀从变质的柚子皮中切出约3─5cm的组织片段，放置在含有马铃薯葡萄糖琼脂平板和链霉素的无菌培养皿上，并在室温下孵育5天；对该真菌分离物进行了进一步的传代培养，得到图1中的(b)图，以进行真菌种类的鉴定。所述真菌的鉴定结果为青霉菌Penicillium solitum含量为61.18％，镰刀菌Fusarium oxysporum含量为21.96％，季也蒙毕赤酵母 Meyerozyma guilliermondii含量为16.85％。
实际发酵降解时，上述三种菌均从上海保藏生物技术中心购买。
对单个柚子皮、工业大麻残留物、等量工业大麻残留物和柚子皮的混合物分别进行固态发酵分析，加入蒸馏水，调整固态发酵培养基，使其水分含量为70％，并在121℃下消毒30min。加入的真菌团孢子悬液(2×107孢子/mL)均匀分布在固态发酵培养基表面，室温培养。固态发酵监测5天，得到发酵结果，分别为图1中的(c),(d),(e)图。
结果显示，含有柚子皮(低抗性)和工业大麻残留物(高抗性)混合物的平板(图1的(e)图)显示出突出的真菌生长。该固体被用于在单锅过程中进一步降解工业大麻残留物。
实施例2
原始工业大麻残留物来自湖南农业大学。工业大麻残留物使用不锈钢小型实验室研磨机接地，使用实验室0.5mm丝网筛进行筛选。准备三个含有重量体积比为10％的工业大麻残留物和蒸馏水的烧瓶，一个进行自水解，一个进行热水解(121℃预处理30min)，另一个进行热化学水解(121℃预处理30min，加入2％的草酸溶液)。
与热水解和自水解(对照)相比，热化学预处理可以产生最高的糖。自水解(对照)、热水解和热化学水解(2％草酸溶液)后生成的还原糖分别为2.03±0.42、5.20±0.81和16.44±1.75g/L。
采用三组一罐预处理和糖化，将柚子皮(低抗性)和工业大麻残留物(高抗性)的混合物添加到同一锅中进行固体发酵，使工业大麻残留物通过自水解、热水解和热化学水解(2％草酸溶液)进一步将工业大麻残留物降解为单糖和其他可发酵原料。采用2％草酸溶液处理的工业大麻残留物和未接种的柚子皮和工业大麻残留物混合处理固态发酵进行对照单锅预处理和糖化实验。在糖化中200rpm和50℃的摇床中进行24小时。定期取样品，10000rpm离心 20min，用Whatman1号过滤纸过滤，得到水解物以供进一步分析。
还原糖的测定：采用Miller的二硝基水杨酸(DNS)法测定水解物的还原糖浓度。将计算出的样品比例和预制备的二硝基水杨酸溶液加入到试管中，在水浴中加热10min。让混合物冷却，用所需比例的水稀释。用分光光度计在540nm处测定吸光度。
图2显示了用工业大麻残留物预处理自水解、热水解、热化学水解(重量体积百分比为 2％草酸溶液)和等量的柚子皮和工业大麻残留物预处理和糖化、工业大麻残留物用2％草酸和工业大麻残留物预处理和未接种的混合固态发酵。用2％草酸处理的工业大麻残留物一锅预处理糖化，用柚子皮和工业大麻残留物混合物固态发酵生成的混合酶进一步糖化，含糖量最高39.49g/L。在0～16h糖化时间范围内，该值增加1.29倍，分别是对照、自水解和热水解工业大麻残留物一锅预处理和糖化的6.79、6.14和2.22倍。
实验例1
选择由青霉菌Penicillium solitum含量为61.18％，镰刀菌Fusarium oxysporum含量为 21.96％，季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondii含量为16.85％组成的真菌联合体，著名的工业真菌黑曲霉Aspergillus niger，热带假丝酵母Candida tropicalis这三种微生物进行木质纤维素降解效率试验。
柚子皮用刀切成碎片，在55℃的烤箱中干燥24小时，使用不锈钢迷你实验室研磨机进行研磨后，得到柚子皮粉末；工业大麻残留物使用不锈钢小型实验室研磨机研磨，使用实验室0.5mm丝网筛进行筛选，备用。
将三份等量的质量比为1:1的工业大麻残留物和柚子皮的混合物加入到三个培养基中，加入蒸馏水，调整固态发酵培养基，使其水分含量为70％，并在121℃下消毒30min。分别加入工业真菌黑曲霉Aspergillus niger，热带假丝酵母Candida tropicalis和上述真菌联合体的真菌团孢子悬液(2×107孢子/mL)，均匀分布在固态发酵培养基表面，室温培养。固态发酵监测5 天，得到发酵结果，分别为图3的(a)和(b)。
其结果是：真菌联合体表现最好，其次是黑曲霉和热带假丝酵母。其详细结果见图3，图3(a)是菌生长图，图3(b)是菌丝径向生长图。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种降解木质纤维素的混合菌，其特征在于，包含三种菌：青霉菌Penicilliumsolitum含量为60％-61％，镰刀菌Fusarium oxysporum含量为21％-23％，季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondii含量为16％-18％。
2.如权利要求1所述的降解木质纤维素的混合菌，其特征是，所述三种菌是通过将柚子皮放在无菌培养皿中，孵育，分离，传代培养获得。
3.一种降解木质纤维素的混合酶，其特征是，用权利要求1或2所述的混合菌发酵得到。
4.如权利要求3所述的降解木质纤维素的混合酶，其特征是，所述发酵是在培养皿中加入工业大麻残留物、柚子皮中的一种或两种，加入蒸馏水，消毒，加入混合菌的孢子悬浮液，进行固态发酵，得到混合酶。
5.如权利要求4所述的降解木质纤维素的混合酶，其特征是，所述发酵是在培养皿中加入等量的工业大麻残留物和柚子皮的混合物进行。
6.如权利要求4所述的降解木质纤维素的混合酶，其特征是，所述柚子皮和工业大麻残留物的处理方法是，将柚子皮切成碎片，在50-60℃的烤箱中干燥一段时间，将工业大麻残留物和干燥后的柚子皮分别进行研磨得到。
7.如权利要求4所述的降解木质纤维素的混合酶，其特征是，所述加入蒸馏水是调整培养基使其水分含量为70％。
8.一种木质纤维素的降解方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)预处理：工业大麻残留物加入草酸溶液，工业大麻残留物和草酸溶液的重量比为10:1-5，加热，进行热化学预处理，得到预处理物；
(2)糖化：在上述的预处理物中加入如权利要求3-6任一所述的混合酶，进行糖化；
(3)离心、过滤，得到水解物。
9.如权利要求8所述的木质纤维素的降解方法，其特征是，所述草酸溶液的重量体积百分比为2％。
10.如权利要求8-9任一所述的木质纤维素的降解方法，其特征是，所述糖化是在150-250rpm和40℃-60℃的摇床中进行一段时间。
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