CN114934034A - 一种纤维素酶加工工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种纤维素酶加工工艺。所述纤维素酶加工工艺包括：S1.原料：菌种和培养基；S2.所述菌种为青霉；S3.所述培养基由麸皮、药媒、微晶纤维素、硫酸铵、硫酸镁和氯化钙加水混合搅拌成液体培养基，然后蒸气加热进行灭菌工作，之后进行冷却降温工作；S4.将菌种接入到S3中降温好的液体培养基中，然后边搅拌边通入无菌空气，之后对其进行保温培养工作；S5.将步骤S4中培养好的发酵液取10mL放置到称重离心管中，4000Xg离心15min，弃上清液，然后再加入10mL去离子水洗涤沉淀两次。本发明提供的纤维素酶加工工艺可以大幅度提高纤维素酶的纯度的优点。
Description
技术领域
本发明属于纤维素酶技术领域，尤其涉及一种纤维素酶加工工艺。
背景技术
将丰富的、可再生的纤维素资源转化为燃料和其它工业产品，对于社会的可持续发展意义巨大。纤维素可以转化成葡萄糖或者其他可发酵糖，进而转化成生物燃料或其他产品。纤维素可以在酶的催化作用下被分解，其中参与催化的水解酶可以被称作纤维素酶。纤维素酶是纤维素转化过程中的关键因素之一，而纤维素的彻底转化需要多种纤维素酶的参与，常常是复合物体系，又被称为纤维素酶系。纤维素酶属于糖苷水解酶，可以水解β-1,4-葡萄糖苷键，即纤维素分子中连接葡萄糖单位的化学键。纤维素酶的作用底物主要是纤维素、纤维素衍生物、纤维素糊精、纤维寡糖等，但一些纤维素酶也可以水解其他一些化合物，例如水解一些半纤维素成分；另外，有其他酶类(以糖苷水解酶为主)，例如一些木聚糖酶(xylanase)也可以部分水解纤维素。其中，嗜热纤维素酶在高温环境下有着独特的稳定性和高活力，因而具有无以比拟的优势。纤维素酶存在广泛，主要来源有细菌、真菌和原生动物。微生物产生的纤维素酶对纤维素的降解，促进了植物等生物体的分解转化，是自然界中碳循环的主要组成部分。大多数动物自身不能产生纤维素酶，不能消化纤维素，但一些动物的消化道内存在的共生微生物可以产生纤维素酶，例如反刍动物(牛、羊、骆驼等等)，有一个瘤胃结构，瘤胃中的微生物可以分泌纤维素酶，帮助反刍动物消化纤维素类的食物。植物可以产生纤维素酶，对自身的纤维素进行适当的加工，在发育的不同阶段和不同部位产生纤维素酶，起到调节作用，相关技术中，公开了一种来源于产胡萝素微杆菌(Microbacteriumkitamiense)的纤维素酶及其突变体，所述纤维素酶突变体能够在85℃的环境中高效降解纤维素底物，具有广阔的应用前景。
但是，上述结构中还存在不足之处，酶的提取与分离纯化是酶的生产中最早采用并一直沿用至今的生产方法，它是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶产品的技术过程，绝大多数酶都来源于真微生物的发酵，发酵结束时发酵液中除了含有我们希望获得的酶,还掺杂着不同程度的杂蛋白和其它代谢产物，这对酶活力的表达十分不利。
因此，有必要提供一种新的纤维素酶加工工艺解决上述技术问题。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种可以大幅度提高纤维素酶的纯度的纤维素酶加工工艺。
为解决上述技术问题，本发明提供的纤维素酶加工工艺包括：
S1.原料：菌种和培养基；
S2.所述菌种为青霉；
S3.所述培养基由麸皮、药媒、微晶纤维素、硫酸铵、硫酸镁和氯化钙加水混合搅拌成液体培养基，然后蒸气加热进行灭菌工作，之后进行冷却降温工作；
S4.将菌种接入到S3中降温好的液体培养基中，然后边搅拌边通入无菌空气，之后对其进行保温培养工作；
S5.将步骤S4中培养好的发酵液取10mL放置到称重离心管中，4000Xg离心15min，弃上清液，然后再加入10mL去离子水洗涤沉淀两次，之后离心弃上清后将下层沉淀放在85℃的烘箱内进行烘至恒重，最后再减去离心管的重量即为菌体干重。
作为本发明的进一步方案，所述步骤S3中麸皮位2.955％、药媒为3.25％、微晶纤维素为3.75％、硫酸铵为1.5％、硫酸镁为0.03％和氯化钙为0.03％。
作为本发明的进一步方案，所述S3中加热灭菌工作的时间为1h，所述S3中冷却降温至28℃。
作为本发明的进一步方案，所述S4中搅拌速度为220r/min，所述S4中保温温度为30℃，所述S4中保温时间为4～5天。
作为本发明的进一步方案，所述纯化包括如下：
第一步骤：对上述步骤S4中处理好的发酵液进行抽滤处理，且抽滤处理时在滤纸上置一薄层硅藻土，然后除去菌丝体，致使得到粗酶液；
第二步骤：将第一步骤得到到粗酶液使用芳香聚酰胺膜(截留分子量为10000Da)进行膜分离，然后用磷酸缓冲液洗膜，合并洗液与超滤浓缩液，在4C下保存；
第三步骤：采用饱和度为50％～60％的硫酸铵来对第二步骤得到到浓缩液进行沉淀，致使得到酶液；
第四步骤：将第三步骤得到的酶液放入到冷冻干燥机中进行冷冻干燥工作，时间为48h，完成后就可以得到纤维素酶。
与相关技术相比较，本发明提供的纤维素酶加工工艺具有如下有益效果：
1、本发明通过对酶的纯化，使得比活力达到5.848x104U/g，可以将纯度提高2.23倍，使回收率达到88.1％，从而可以大幅度提高了纤维素酶的纯度。
附图说明
为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明纯化的结构示意图；
图2为本发明硫酸铵饱和度的结构示意图。
具体实施方式
实施例1：
请结合参阅图1，纤维素酶加工工艺包括：工序和纯化；
S1.原料：菌种和培养基；
S2.所述菌种为青霉；
S3.所述培养基由麸皮、药媒、微晶纤维素、硫酸铵、硫酸镁和氯化钙加水混合搅拌成液体培养基，然后蒸气加热进行灭菌工作，之后进行冷却降温工作；
S4.将菌种接入到S3中降温好的液体培养基中，然后边搅拌边通入无菌空气，之后对其进行保温培养工作；
S5.将步骤S4中培养好的发酵液取10mL放置到称重离心管中，4000Xg离心15min，弃上清液，然后再加入10mL去离子水洗涤沉淀两次，之后离心弃上清后将下层沉淀放在85℃的烘箱内进行烘至恒重，最后再减去离心管的重量即为菌体干重。
所述步骤S3中麸皮位2.955％、药媒为3.25％、微晶纤维素为3.75％、硫酸铵为1.5％、硫酸镁为0.03％和氯化钙为0.03％。
所述S3中加热灭菌工作的时间为1h，所述S3中冷却降温至28℃。
所述S4中搅拌速度为220r/min，所述S4中保温温度为30℃，所述S4中保温时间为4～5天。
所述纯化包括如下：
第一步骤：对上述步骤S4中处理好的发酵液进行抽滤处理，且抽滤处理时在滤纸上置一薄层硅藻土，然后除去菌丝体，致使得到粗酶液；
第二步骤：将第一步骤得到到粗酶液使用芳香聚酰胺膜(截留分子量为10000Da)进行膜分离，然后用磷酸缓冲液洗膜，合并洗液与超滤浓缩液，在4C下保存；
第三步骤：采用饱和度为50％～60％的硫酸铵来对第二步骤得到到浓缩液进行沉淀，致使得到酶液；
第四步骤：将第三步骤得到的酶液放入到冷冻干燥机中进行冷冻干燥工作，时间为48h，完成后就可以得到纤维素酶。
由图1可知，在纯化过程中，随着纯化倍数的提高，纤维素酶比活力逐渐升高，但酶的回收率却是逐渐下降的，而在发酵液经过整个纯化过程，比活力达到5.848x104U/g，纯度提高了2.23倍，回收率为88.1％，从而说明可以大幅度提高了纤维素酶的纯度。
实施例2
一种纤维素酶加工工艺包括如下：
第一步骤：对步骤S4中处理好的发酵液进行抽滤处理，且抽滤处理时在滤纸上置一薄层硅藻土，然后除去菌丝体，致使得到粗酶液；
第二步骤：将第一步骤得到到粗酶液使用芳香聚酰胺膜(截留分子量为10000Da)进行膜分离，然后用磷酸缓冲液洗膜，合并洗液与超滤浓缩液，在4C下保存；
第三步骤：分别采用饱和度为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的硫酸铵对浓缩液沉淀，确定适当的沉淀范围；
所需要的硫酸铵饱和度应在每升溶液中加入的硫酸铵的质量可以通过如下公式计算：
M(g)＝533x(S2-S1)/(100-0.3S2)
上述式中：S1：溶液起始的硫酸铵饱和度，％；
S2：溶液达到的硫酸铵饱和度，％。
第四步骤：将第三步骤得到的酶液放入到冷冻干燥机中进行冷冻干燥工作，时间为48h，完成后就可以得到纤维素酶；
从图2所示可以看见，饱和度50％和60％硫酸铵沉淀纤维素酶蛋白比较好(图2中的相对酶活是以膜分离后的酶液为参照)。
Claims (5)
1.一种纤维素酶加工工艺，其特征在于，包括以下步骤：
工序和纯化；
S1.原料：菌种和培养基；
S2.所述菌种为青霉；
S3.所述培养基由麸皮、药媒、微晶纤维素、硫酸铵、硫酸镁和氯化钙加水混合搅拌成液体培养基，然后蒸气加热进行灭菌工作，之后进行冷却降温工作；
S4.将菌种接入到S3中降温好的液体培养基中，然后边搅拌边通入无菌空气，之后对其进行保温培养工作；
S5.将步骤S4中培养好的发酵液取10mL放置到称重离心管中，4000Xg离心15min，弃上清液，然后再加入10mL去离子水洗涤沉淀两次，之后离心弃上清后将下层沉淀放在85℃的烘箱内进行烘至恒重，最后再减去离心管的重量即为菌体干重。
2.根据权利要求1所述的纤维素酶加工工艺，其特征在于：所述步骤S3中麸皮位2.955％、药媒为3.25％、微晶纤维素为3.75％、硫酸铵为1.5％、硫酸镁为0.03％和氯化钙为0.03％。
3.根据权利要求1所述的纤维素酶加工工艺，其特征在于：所述S3中加热灭菌工作的时间为1h，所述S3中冷却降温至28℃。
4.根据权利要求2所述的纤维素酶加工工艺，其特征在于：所述S4中搅拌速度为220r/min，所述S4中保温温度为30℃，所述S4中保温时间为4～5天。
5.根据权利要求2所述的纤维素酶加工工艺，其特征在于：所述纯化包括如下：
第一步骤：对上述步骤S4中处理好的发酵液进行抽滤处理，且抽滤处理时在滤纸上置一薄层硅藻土，然后除去菌丝体，致使得到粗酶液；
第二步骤：将第一步骤得到到粗酶液使用芳香聚酰胺膜(截留分子量为10000Da)进行膜分离，然后用磷酸缓冲液洗膜，合并洗液与超滤浓缩液，在4C下保存；
第三步骤：采用饱和度为50％～60％的硫酸铵来对第二步骤得到到浓缩液进行沉淀，致使得到酶液；
第四步骤：将第三步骤得到的酶液放入到冷冻干燥机中进行冷冻干燥工作，时间为48h，完成后就可以得到纤维素酶。
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2022
- 2022-06-06 CN CN202210633741.8A patent/CN114934034A/zh active Pending
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