JP6169077B2 - 低い酸素移動容量係数KLaを有する、発酵槽に適した糸状菌を用いるセルラーゼの生産方法 - Google Patents
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Description
・ 「バッチ」様式での生育工程:トリコデルマ・リーゼイの生育のために急速に吸収され得る炭素の源を供給することが必要である;ついで、
・ 「流加(fed batch)」生産工程:これは、セルラーゼの発現および培養培地への分泌を可能とする誘導基質、例えば、ラクトースを用いる;このような可溶性の炭素質基質を連続的に供給することにより、培養物中の残留濃度を制限し、これにより糖の量を最適化させることは、高い酵素生産性を得ることができることを意味する;引用特許で適用された炭素質源の最適な流れは、35〜45mg(糖)・g(細胞乾燥重量)−1・h−1の範囲である
この手順は、微生物の酸素要求量を満たすために高いエネルギー出力を必要とするという不利な点を抱えている。生育段階の終わりに、酸素要求量は非常に高い。実際、基質の全てが過剰に利用可能である場合、生育は、その菌株の最大生育速度に近い生育速度で起こる。生物学的酸素要求量(バイオマスの生育速度および濃度の関数である)は増加するだろう。培養物は、溶存酸素の濃度を一定の値に制御するので、酸素移動速度(oxygen transfer rate:OTR)は、酸素消費速度(rate of oxygen consumption:ROC)(あるいは生物学的酸素要求量)と等しくなければならない。
(式中:
O2 *:飽和酸素濃度
O2L:液相中の酸素濃度
μ:微生物の生育の速度(h−1)
RX/O2:消費された酸素に対する細胞バイオマスの収率
X=細胞バイオマス(乾燥重量)の濃度
従って、このタイプの方法は、この要求量を満たすために非常に高いkLaを必要とする。これは、一般的に、撹拌(または通気)を増加させることにより達成されるが、これにより電気エネルギーが消費される。
本発明は、酵素生産性性能を維持するために用いられ得る糸状菌によるセルラーゼの生産であって、低い酸素移動容量係数(volumetric oxygen transfer coefficient)kLaを有するバイオリアクターを用いることによる生産に関する。
本発明は、通気撹拌型バイオリアクター内において糸状菌株を用いてセルラーゼを生産する方法であって、少なくとも以下の2つの工程:
・ バッチ相における、少なくとも1種の炭素質生育基質の存在下での生育の第1の工程であって、炭素質生育基質の濃度が10〜80g/Lの範囲である、工程;
・ 流加相における、少なくとも1種の誘導炭素質基質(inducer carbonaceous substrate)の存在下での生育および生産の第2の工程であって、毎時の細胞の重量(g)当たり50〜140mgの範囲の炭素源の制限的な流れの存在下での工程
を含む、方法に関する。
KLa=0.026*(P/V)0.4*VG 0.5
(式中:
P/V:散逸電力(W/m3)
VG:気体の表面速度(m/s)
である。)
従って、この相関によると、100h−1のKLaについての消散電力(P/V)は、KLaが250h−1である場合に必要な消散電力より約10倍小さい。
以下の実施例において、実施例1は、250h−1のkLaを有するバイオリアクターによる特許FR 2 881 753の基準条件を用いる培養を提示する。実施例2は、実施例1と同じ条件下で行われるが、100h−1のkLaを有する発酵槽を用いる実験を提示する。この実施例は、炭素質基質の蓄積で終了し、バイオマス生産は高く、酵素生産は低かった。実施例3は、本発明の方法を実施したものであった。それは、100h−1のkLaを有するバイオリアクターを用いて、実施例1の生産性に近い生産性を得るために用いられた。
セルロースの生産が、機械的に撹拌された発酵槽内で行われた。無機培地は、以下の組成を有していた:KOH 1.66g/L、85%H3PO4 2mL/L、(NH4)2SO4 2.8g/L、MgSO4・7H2O 0.6g/L、CaCl2 0.6g/L、MnSO4 3.2mg/L、ZnSO4・7H2O 2.8mg/L、CoCl2 104.0mg/L、FeSO4・7H2O 10mg/L、コーンスティープ(Corn Steep) 1.2g/L、消泡剤 0.5mL/L。
・ グルコース炭素質基質(初期濃度=30g/L)による生育の段階;温度27℃およびpH4.8(5.5Mアンモニア性溶液を用いて設定される)で行われる;通気は、0.5vvmにされ、攪拌は、O2圧(溶存酸素の圧力)に応じて200〜800rpmの間に増大させられ、O2圧力は、30%に設定された;
・ 酵素生成段階;30時間後に、250g/Lのラクトース溶液が、250時間にわたり、毎時の細胞の重量(g)当たり35mgの流量で連続的に注入された;温度は、25℃に降下させられ、pHは4にされて、培養は終了した;pHは、5.5Mのアンモニア性溶液を加えることによって設定され、これは、排出されるタンパク質の合成に必要な窒素を提供した;溶存酸素の量は、攪拌作用によって30%超に維持された。
− ろ紙活性またはFP(これは、FPU(filter paper units)で表される);これは、エンドグルカナーゼおよびエンドグルカナーゼの酵素的プールの全体的な活性をアッセイするために用いられ得た;
− 特定の活性についてのβ−グルコシダーゼおよびキシラナーゼの活性;
は以下の通りであった。
細胞バイオマス(g/L)=15.5
タンパク質(g/L)=50.1
生産性=0.20g/L/h
FPU=29.1IU/mL
キシラナーゼの比活性(Specific xylanase)=8.2IU/mg
β−グルコシダーゼの比活性=1.0IU/mg
図2は、バイオマス、タンパク質の濃度およびKLaにおける経時変化を表している。細胞バイオマスが実験の最初の50時間の間に15g/Lまで増大したことおよびKLaが240h−1であったことが理解され得るだろう。タンパク質の濃度は、最初の50時間の間にわずかに増加し、次いで、バイオマスの濃度が安定した時点から大幅に増加した。それは、培養が完了した時に50g/Lに達した。
実施例2は、実施例1と同一の条件下に実施されたが、用いられた発酵槽の最大KLaは100h−1であり、その初期容積は750mLであった。発酵により、細胞バイオマスの高い生産(45g/L)および低いタンパク質生産(19g/L)がもたらされた(図3参照)。
OTR=KLa(O2 *−O2L)
(式中、
O2 *:飽和酸素濃度
O2L:液相中の酸素濃度
である)。
細胞バイオマス(g/L)=45
タンパク質(g/L)=19
FPU=10.1IU/mL
キシラナーゼの比活性=8.5IU/mg
β−グルコシダーゼの比活性=1.2IU/mg
(実施例3:本発明に合致する)
100h−1のkLaを有するバイオリアクターが用いられたが、生産方法は、本発明に合致するように改変された。
細胞バイオマス(g/L)=18.9
タンパク質(g/L)=51.7
生産性=0.21g/L/h
FPU=30.1IU/mL
キシラナーゼの比活性=9.5IU/mg
β−グルコシダーゼの比活性=1.12IU/mg
Claims (13)
- 通気撹拌型バイオリアクター内において糸状菌に属する菌株を用いてセルラーゼを生産する方法であって、少なくとも以下の2つの工程:
・ バッチ相における少なくとも1種の炭素質生育基質の存在下での第1の生育工程であって、10〜60g/Lの範囲の炭素質生育基質の濃度で行われる、工程;
・ 流加相における少なくとも1種の誘導炭素質基質の存在下での生育および酵素生産のための第2の工程であって、毎時の細胞バイオマスの乾燥重量(グラム)当たり50〜140mgの範囲の炭素源の制限的な流れの存在下での工程
を含み、
バイオリアクターの酸素移動容量係数kLaは、40〜180h−1の範囲である、方法。 - 炭素質生育基質の濃度は、10〜20g/Lの範囲である、請求項1に記載の方法。
- 炭素質生育基質の濃度は、12〜17g/Lの範囲である、請求項2に記載の方法。
- 炭素源の流れは、毎時の細胞バイオマスの乾燥重量(グラム)当たり70〜100mgの範囲である、請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
- 炭素源の流れは、毎時の細胞バイオマスの乾燥重量(グラム)当たり80〜90mgの範囲である、請求項4に記載の方法。
- バイオリアクターの酸素移動容量係数kLaは、40〜150h−1の範囲である、請
求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 炭素質生育基質は、ラクトース、グルコース、キシロース、セルロース系バイオマスの酵素加水分解物の単量体糖のエタノール発酵後に得られる残渣および/またはセルロース系バイオマスの前処理に由来する水溶性ペントースの粗抽出物から選択される、請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法。
- 誘導炭素質基質は、ラクトース、セロビオース、ソホロース、セルロース系バイオマスの酵素加水分解物の単量体糖のエタノール発酵後に得られる残渣および/またはセルロース系バイオマスの前処理に由来する水溶性ペントースの粗抽出物である、請求項1〜7のいずれか1つに記載の方法。
- バイオマスを生産するために選択された炭素質生育基質は、滅菌の前に発酵槽に導入される、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
- バイオマスを生産するために選択された炭素質生育基質は、別個に滅菌され、滅菌後のバイオリアクターに導入される、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
- 流加段階の間に導入される誘導炭素質基質は、個別に滅菌された後に、前記リアクターに導入される、請求項1〜10のいずれか1つに記載の方法。
- 用いられる菌株は、トリコデルマ・リーゼイの菌株である、請求項1〜11のいずれか
1つに記載の方法。 - 用いられる菌株は、遺伝子の突然変異、選択または組み換えによって改変されたトリコデルマ・リーゼイの菌株である、請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
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