WO2023101389A1 - 베타-글루코시다아제와 이의 보조인자를 이용한 이당류의 생산방법 및 상기 생산된 이당류를 포함하는 트리코데르마 속 균주의 효소 생산 유도용 조성물 - Google Patents

베타-글루코시다아제와 이의 보조인자를 이용한 이당류의 생산방법 및 상기 생산된 이당류를 포함하는 트리코데르마 속 균주의 효소 생산 유도용 조성물 Download PDF

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WO2023101389A1
WO2023101389A1 PCT/KR2022/019160 KR2022019160W WO2023101389A1 WO 2023101389 A1 WO2023101389 A1 WO 2023101389A1 KR 2022019160 W KR2022019160 W KR 2022019160W WO 2023101389 A1 WO2023101389 A1 WO 2023101389A1
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WO
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disaccharide
enzyme
trichoderma
glucosidase
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PCT/KR2022/019160
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이성균
김민회
박정원
홍형표
김택범
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씨제이제일제당 (주)
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    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
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    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a disaccharide using beta-glucosidase and its cofactor, and a composition for inducing enzyme production of a strain of the genus Trichoderma containing the disaccharide produced above, specifically, beta-glucosidase and its cofactor.
  • it relates to a composition for promoting enzyme production of a strain of the genus Trichoderma containing a high content of the produced disaccharide and an enzyme production method using the composition.
  • Sophorose is a disaccharide with two molecules of D-glucopyranosyl 2- ⁇ - ⁇ bonds, and is a kind of maltose-type disaccharide.
  • Gentiobiose is a disaccharide composed of two molecules of D-glucose connected by ⁇ bonds, and is also called amygdalose. It is a white crystalline solid, soluble in water or methanol, and when hydrolyzed using acid or ⁇ -glucosidase, 2 molecules of D-glucose are produced.
  • Disaccharides such as sophorose and zentiobiose are known as inducers of enzyme production of Trichoderma reesei .
  • One of the useful methods for producing the disaccharide is a method using an enzymatic reverse hydrolysis reaction.
  • a representative enzyme used in the method for oligosaccharide synthesis is beta-glucosidase.
  • Beta-glucosidase hydrolyzes the beta-1,4-glucosidic bond between two glucoses or between glucose and another substituted molecule. It is an enzyme that releases glucose and is a kind of exocellulase that has specificity for various beta D-glucoside substrates.
  • enzymatic reverse hydrolysis has a problem in that large-scale production is limited due to low conversion efficiency of monosaccharide to disaccharide because the equilibrium is biased in the direction of hydrolysis.
  • sophorose, zentiobiose or laminaribiose is known to induce cellulase synthesis in Penicillium purpurogenum P-26 strain (APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Jan. 1992, p. 106-110), and trehalose is known to induce cellulase synthesis in Clostridium papyrosolvens CFR-703 strain (Process Biochemistry 37 (2001) 241-245).
  • cellulase whose activity is also regulated by end product inhibition, is inhibited by cellobiose, and ⁇ -glucosidase in Thermonospora fusca strains and Trichoderma reesei strains is inhibited by glucose, respectively.
  • Cellulase synthesized as a result of such a complex regulatory action varies greatly in its synthesis and composition depending on the type of microorganism and culture conditions.
  • An object of the present invention is to provide a composition comprising 1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside or an isomer thereof.
  • Another object of the present invention is 1) contacting glucose (glucose) with beta-glucosidase ( ⁇ -glucosidase); and 2) contacting the reactant of step 1 with divalent metal ions; It is to provide a method for producing a composition for inducing enzyme production of microorganisms or increasing enzyme activity of microorganisms comprising a.
  • Another object of the present invention is to treat disaccharides containing disaccharides of trehalose, isomaltose, gentiobiose, cellobiose, sophorose and maltose.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing an enzyme from a Trichoderma genus strain using a composition for inducing enzyme production of a Trichoderma genus strain containing the disaccharide.
  • Another object of the present invention is a high content of disaccharides of trehalose, isomaltose, gentiobiose, cellobiose, sophorose and maltose It provides a use for inducing enzyme production of a composition to.
  • the present invention in one aspect
  • the “glucose” of step 1) may be in the form of liquid glucose or aqueous glucose solution, but is not limited thereto.
  • Glucose of the present invention may be at a concentration of 65 to 77% w/w, 67 to 75% w/w, or 69 to 73% w/w.
  • the beta-glucosidase may be derived from Trichoderma.
  • the beta-glucosidase of the present invention may be derived from Trichoderma reesei. More specifically, the beta-glucosidase of the present invention may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the microorganism means a microorganism that produces an enzyme
  • the microorganism may be a microorganism that produces cellulase, xylanase, or phytase enzyme, or may be a microorganism capable of producing all of cellulase, xylanase, and phytase enzymes, Not limited to this.
  • the microorganism may be a Trichoderma genus strain, more specifically a Trichoderma reesei strain.
  • the beta-glucosidase may be 1,300 to 2,000 U/ml, 1,400 to 1,900 U/ml, 1,500 to 1,800 U/ml, or 1,550 to 1,740 U/ml, but is not limited thereto.
  • the divalent metal ion may be at least one selected from the group consisting of manganese ion (Mn 2+ ), magnesium ion (Mg 2+ ), zinc ion (Zn 2+ ) and copper ion (Cu 2+ ), and zinc ion (Zn 2+ ) and copper ion (Cu 2+ ) It may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • step 2 may be used interchangeably with the term “settling step” or “reacting step” in this specification.
  • the “contact” of step 2) may be performed at 20 to 50 rpm, 25 to 45 rpm, or 28 to 42 rpm, but is not limited thereto.
  • the “contact” of step 2) may be performed at pH 3.0 to 7.0, pH 3.5 to 6.5, pH 4.0 to 6.0, or pH 4.5 to 5.5, but is not limited thereto.
  • the “contact” of step 2) may be performed at 50 ° C to 70 ° C, 55 ° C to 65 ° C, or 57 ° C to 63 ° C, but is not limited thereto.
  • the “contact” of step 2) may be performed for 5 days or more, may be performed for 6 days or more, may be performed for 7 days or more, may be performed for 5 to 22 days, or may be performed for 6 days It may be carried out for 21 days, but is not limited thereto.
  • the produced composition is trehalose, isomaltose, cellobiose, maltose, gentiobiose, sophorose, 1-hydroxyglucose It may contain at least one selected from the group consisting of 1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside and isomers thereof.
  • the produced composition may include gentiobiose and sophorose, but is not limited thereto.
  • the produced composition has an effect of inducing excellent enzyme production or fermentation activity of the produced enzyme of the Trichoderma genus strain.
  • the method for producing the composition of the present invention may further include a step of performing chromatography including divalent cations.
  • Chromatography of the present invention may be simulated moving bed (SMB) chromatography.
  • the divalent cation may be included in the form of a column filled with a cation exchange resin.
  • the divalent cation may be any one or more of calcium ions, barium ions, and strontium ions.
  • the simulated moving layer chromatography of the present invention may include 8 or more columns.
  • elution may be performed with water at 50°C to 70°C.
  • the elution of the present invention may be performed with water at 55 to 65°C or 58 to 62°C.
  • the present invention provides (1S)-1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside having a structure represented by Formula 1 below.
  • the present invention provides 1-epi-1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside having a structure represented by Formula 2 below.
  • the present invention provides a composition comprising 1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside or an isomer thereof.
  • the composition may induce the production of enzymes by microorganisms or increase the activity of enzymes produced by microorganisms.
  • the 1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside or an isomer thereof is (1S)-1-hydroglucitol-D-glucopyranoside or 1-epi-1-hydroglucitol -D-glucopyranoside.
  • the present invention provides a composition for inducing enzyme production containing a high disaccharide.
  • the disaccharide is trehalose, isomaltose, gentiobiose, cellobiose, sophorose, maltose, 1-hydroxyglucitol- It may be at least one selected from the group consisting of D-glucopyranoside (1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside) and isomers thereof.
  • the present invention relates to microbial enzymes including trehalose, isomaltose, gentiobiose, cellobiose, sophorose and maltose A composition for inducing production is provided.
  • enzyme production induction may mean inducing the amount of enzyme produced from microorganisms, and the “enzyme production induction” can be confirmed by measuring the fermentation activity of the produced enzyme.
  • the microorganism may be a Trichoderma genus strain, a Trichoderma reesei strain, and more specifically, a Trichoderma reesei QM6a strain, but is not limited thereto.
  • the enzyme may be an enzyme produced by a Trichoderma genus strain, an enzyme produced by a Trichoderma reesei strain, and more specifically, an enzyme produced by a Trichoderma reesei QM6a strain, but is not limited thereto. don't
  • the enzyme may be cellulase, xylanase or phytase, preferably xylanase.
  • composition for inducing enzyme production of the Trichoderma genus strain 1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside or an isomer thereof may be further included.
  • the 1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside or an isomer thereof is (1S)-1-hydroglucitol-D-glucopyranoside or 1-epi-1-hydroglucitol-D- It may be glucopyranoside.
  • the 1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside (1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside) or its isomer is prepared by 1) contacting glucose with ⁇ -glucosidase and 2) contacting the glucose or the reactant of step 1 with a divalent metal ion; It may be prepared by a method for producing a disaccharide containing.
  • the composition may have a low monosaccharide content and a high disaccharide content.
  • the composition may have a disaccharide content higher than the monosaccharide content included in the composition, and the increase in the disaccharide content may be achieved by simulated moving bed (SMB) chromatography.
  • SMB simulated moving bed
  • the monosaccharide content included in the composition is 45 wt% or less, 40 wt% or less, 35 wt% or less, 30 wt% or less, 20 wt% to 45 wt%, 25 wt% to 45 wt%, 20 wt% or less, based on the total composition weight % to 40%, 25% to 40%, 20% to 35%, 25% to 35%, 20% to 30%, or 25% to 30%.
  • the disaccharide content included in the composition is 27 wt% or more, 30 wt% or more, 33 wt% or more, 36 wt% or more, 39 wt% or more, 27 wt% to 50 wt%, 30 wt% to 50 wt%, based on the total composition weight.
  • the content of trehalose included in the composition is 2.5% by weight or more, 3% by weight or more, 4% by weight or more, 2.5% to 6% by weight, 3% to 6% by weight, based on the total weight of the composition. 4% to 6%, 2.5% to 5%, 3% to 5%, or 4% to 5%.
  • the content of isomaltose included in the composition is 4.5 wt% or more, 5 wt% or more, 4.5 wt% to 7 wt%, 5 wt% to 7 wt%, 4.5 wt% to 6 wt%, based on the total composition weight. , or 5% to 6% by weight.
  • the content of gentiobiose included in the composition is 15% by weight or more, 17% by weight or more, 19% by weight or more, 21% by weight or more, 15% by weight to 28% by weight, 17% by weight to 28 wt%, 19 wt% to 28 wt%, 21 wt% to 28 wt%, 15 wt% to 25 wt%, 17 wt% to 25 wt%, 19 wt% to 25 wt%, 21 wt% to 25 wt% %, 15% to 23%, 17% to 23%, 19% to 23%, or 21% to 23%.
  • the content of cellobiose included in the composition is 1.9 wt% or more, 2.0 wt% or more, 2.1 wt% or more, 2.2 wt% or more, 1.9 wt% to 3.0 wt%, 2.0 wt% to 3.0 wt%, based on the total composition weight. 2.1% to 3.0%, 2.2% to 3.0%, 1.9% to 2.7%, 2.0% to 2.7%, 2.1% to 2.7%, 2.2% to 2.7% , 1.9% to 2.5%, 2.0% to 2.5%, 2.1% to 2.5%, or 2.2% to 2.5%.
  • the content of sophorose included in the composition is 1.4 wt% or more, 1.5 wt% or more, 1.6 wt% or more, 1.7 wt% or more, 1.4 wt% to 3.0 wt%, 1.5 wt% to 1.5 wt% or more, based on the total composition weight.
  • the content of maltose included in the composition is 2.6 wt% or more, 3.0 wt% or more, 3.4 wt% or more, 3.7 wt% or more, 2.6 wt% to 5.0 wt%, 3.0 wt% to 5.0 wt%, based on the total composition weight. %, 3.4% to 5.0%, 3.7% to 5.0%, 2.6% to 4.6%, 3.0% to 4.6%, 3.4% to 4.6%, 3.7% to 4.6%, 2.6% to 4.2%, 3.0% to 4.2%, 3.4% to 4.2%, 3.7% to 4.2%, 2.6% to 3.9%, 3.0% to 3.9%, 3.4% % to 3.9%, or 3.7% to 3.9%.
  • the composition may further include an oligomer.
  • the oligomer content included in the composition is 29% to 35% by weight, 29% to 34% by weight, 29% to 33% by weight, 30% to 35% by weight, 30% to 34% by weight relative to the total composition content %, 30% to 33%, 31% to 35%, 31% to 34%, 32% to 35%, or 32% to 34%, but not limited thereto. .
  • composition (SMB isolate) having a low monosaccharide content and a high disaccharide content exhibited excellent enzymatic fermentation activity compared to a composition (TGS) having a high monosaccharide content and a low disaccharide content. Therefore, a composition containing high levels of trehalose, isomaltose, gentiobiose, cellobiose, sophorose and maltose can be used for enzymatic production of microorganisms. It can be used for induction purposes.
  • the present invention relates to a method for producing a disaccharide using beta-glucosidase and its cofactor, and a composition for inducing enzyme production of a strain of the genus Trichoderma containing the disaccharide produced above, specifically, beta-glucosida to a glucose substrate Disaccharide formation rate when divalent metal ions such as manganese ion (Mn 2+ ), magnesium ion (Mg 2+ ), zinc ion (Zn 2+ ) or copper ion (Cu 2+ ) are added as enzyme and its cofactors , and disaccharides can be obtained in high concentrations.
  • divalent metal ions such as manganese ion (Mn 2+ ), magnesium ion (Mg 2+ ), zinc ion (Zn 2+ ) or copper ion (Cu 2+ ) are added as enzyme and its cofactors , and disaccharides can be obtained in high concentrations.
  • composition containing a high amount of disaccharide produced by the production method of the present invention has an excellent effect of inducing enzyme production of strains of the genus Trichoderma, the enzyme of Trichoderma is applied through a fermentation process using the produced high concentration of disaccharide. productivity can be improved.
  • a glucose solution having a concentration of 71% w/w was prepared by dissolving glucose powder having a purity of 95% or more (hydrous crystalline glucose, Daejeong Chemical Gold) using steam.
  • 0.3 kg of ⁇ -glucosidase (SEQ ID NO: 1) at a concentration of 1,650 U/ml was added to the prepared glucose solution and allowed to stand at 60°C for 7 to 21 days to obtain a composition containing disaccharides (Treatated Glucose Syrup, TGS). manufactured.
  • Example 1 0.3 kg of ⁇ -glucosidase (same as in Example 1) was added to the glucose solution of Example 1 at a concentration of 1,650 U/ml, and further divalent ions [manganese ions (Mn 2+ ), magnesium ions (Mg 2+ ), zinc ions (Zn 2+ ) and copper ions (Cu 2+ ) respectively] were added with 1 mM and allowed to stand at 60°C for 7 to 21 days to obtain a disaccharide-containing composition. manufactured.
  • Mn 2+ manganese ions
  • Mg 2+ magnesium ions
  • Zn 2+ zinc ions
  • Cu 2+ copper ions
  • Example 3 Concentration of the disaccharide contained in the disaccharide composition and increase in the rate of change of the disaccharide according to the addition of divalent metal cations
  • the disaccharides trehalose, isomaltose, maltose, cellobiose, gentiobiose and sophorose in the compositions produced in Examples 1 and 2
  • the production concentration (g/L) and increase/decrease rate (%) of were measured and shown in Tables 1 and 2 below.
  • the product concentration was analyzed using a Bio-LC system (Dionex ICS-3000, Sunnyvale, CA, United States) equipped with an electrochemical detector and a CarboPac PAI column.
  • SMB chromatography is a Sequential Simulated Moving-bed System; Novasep, France) equipment was used, which consisted of eight columns (height of each column 95 cm, diameter 2.5 cm) connected in series, a feed pump, a recirculation pump, an eluent pump, a heat exchanger, and a flow rate. Includes a valve for control.
  • Table 3 The operating conditions of SMB chromatography are shown in Table 3 below, and the results of separation experiments through SMB chromatography are shown in Table 4.
  • the recovery rate measurement method the amount of disaccharide and trisaccharide in the raffinate was compared with the amount of disaccharide and trisaccharide injected into the mixture (TGS) into SMB chromatography, and the recovery rate was calculated using the following formula.
  • Acetylation was performed for NMR analysis on the composition prepared in Example 2.
  • acetic anhydride extra pure, Junsei Chemical Co.
  • zinc chloride Karlo Chemical Co.
  • the SMB separation solution obtained was the Raffinate fraction of Example 4 obtained as a result of SMB chromatography on the disaccharide composition prepared in Example 2.
  • the monosaccharide content of TGS was 45.08%, and the SMB isolate was 28.04%, confirming that the monosaccharide content of the SMB isolate was lower than that of TGS.
  • the disaccharide content TGS was 26.36%, and the SMB isolate was 39.37%, confirming that the disaccharide content of the SMB isolate was higher than that of TGS.
  • TGS or SMB isolate was added to the medium, respectively, and the Trichoderma genus strain was diluted to a cell concentration of 190 or 200 g/L. After culturing for 168 hours at 28° C. at pH 4, the acidic cellulase enzyme activity was measured and shown in Table 7 below.
  • Trichoderma reesei QM6a strain (ATCC13631) was prepared. Each strain was grown on a potato dextrose agar plate at 30°C for 5 days to form spores.
  • spores of each strain were resuspended in sterile NaCl solution (9 g/L) and 30% sterile glycerol was added. This mixture was stored at -80°C in a 1.8 ml tube.
  • Example 7-2 Fed-batch culture of enzyme-producing strains
  • the supply rate of the carbon source in the feed medium was set to 5.0 g / L per hour at the time when the DO rose using DO as an indicator. supplied regularly. Feeding of the feeding medium was performed using a peristatic pump.
  • the fermentation medium components are carbohydrates 20.0 g/L, ammonium sulfate 5.0 g/L, magnesium sulfate 1.5 g/L, calcium chloride 0.5 g/L, potassium phosphate 5.0 g/L, yeast extract 10.0 g/L, ferric sulfate 10.0 mg /L, cobalt chloride 4.0 mg/L, sodium molybdate 2.0 mg/L, boric acid 0.4 mg/L, Tween 80 1.0 g/L.
  • the feed medium was composed of 600.0 g/L of carbohydrate, 6.0 g/L of yeast extract, and 1.0 g/L of sodium chloride in a weight ratio of carbon source to yeast extract of 1:0.01.
  • Carbohydrates contained in the medium were added to TGS and SMB separation solutions in each enzyme activity experiment.
  • the fermentation conditions were maintained at a culture temperature of 28 ° C while maintaining the pH at 4.0 using ammonia water.
  • the stirring speed was adjusted to 600 rpm so that DO (dissolved oxygen content) limitation did not occur.
  • the seed culture is inoculated with 1 ml of the frozen spore mixture in 150 ml medium in a 500 ml Erlenmeyer flask, pre-cultured in a shaker at 28 ° C and 200 rpm for 72 hours, and 10% (v / v) of the culture medium Inoculated.
  • Example 7-2 The fermentation broth obtained in Example 7-2 was centrifuged to remove T. reesei cells and other solid materials. Culture supernatants were diluted appropriately for enzymatic assays. All enzyme activities were expressed as specific activity using international units (IU) per mL of supernatant. 1 IU was defined as the amount of enzyme required to release 1 ⁇ mol of D-glucose per minute under standard assay conditions (5 mg/mL CMC, pH 4.8, 50°C).
  • IU international units
  • Cellulases hydrolyze cellulose to produce monosaccharides and oligosaccharides under specific temperature and pH conditions. Oligosaccharides having reducing ends and monosaccharides having reducing groups undergo a color reaction with the DNS reagent under high temperature conditions, and the intensity of the color of the reaction solution is determined by the amount of reducing sugar produced by enzymatic hydrolysis, and the amount of reducing sugar production and proportional to the response.
  • the cellulase activity in the liquid is proportional, and the cellulase activity can be calculated by measuring the absorbance of the reaction solution by spectrophotometry.
  • TGS or SMB isolates were added to the medium, respectively, and the Trichoderma genus strain was diluted to a cell concentration of 240 or 250 g/L. After culturing at pH 4 for 168 hours at 28° C., enzymatic activities of xylanase and phytase were measured and are shown in Table 8 below.
  • Example 8-1 Neutral xylanase activity assay
  • Example 7-2 The fermentation broth obtained in Example 7-2 was centrifuged to remove T. reesei cells and other solid materials. Culture supernatants were diluted appropriately for enzymatic assays. All enzyme activities were expressed as specific activity using international units (IU) per mL of supernatant. 1 IU was defined as the amount of enzyme required to release 1 ⁇ mol of D-xylose per minute under standard assay conditions (1% xylan, pH 6.5, 50°C).
  • IU international units
  • xylanase breaks down xylan into oligosaccharides and monosaccharides.
  • An oligosaccharide having a reduced terminal and a monosaccharide having a reducing group undergo a color reaction with the DNS reagent. Since the color intensity of the reaction solution is proportional to the amount of reducing sugar produced by enzymatic hydrolysis, and the amount of reducing sugar produced is proportional to the activity of xylanase in the reaction solution, the activity of xylanase can be calculated by spectrophotometry.
  • IU international units
  • phytase completely hydrolyzes the substrate sodium phytate to produce orthophosphoric acid and inositol derivatives. In acidic solutions, it can form a yellow compound with ammonium vanadium molybdate, which can be measured colorimetrically at a wavelength of 415 nm.

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Abstract

본 발명은 베타-글루코시다아제와 이의 보조인자를 이용한 이당류의 생산방법 및 상기 생산된 이당류를 포함하는 트리코데르마 속 균주의 효소 생산 유도용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 글루코오스 기질에 베타-글루코시다아제와 이의 보조인자로 2가 금속 이온인 망간 이온(Mn2+), 마그네슘 이온(Mg2+), 아연 이온(Zn2+) 또는 구리이온(Cu2+)을 첨가하는 경우, 이당류의 생성 속도를 높아지고, 이당류를 높은 농도로 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 생산방법으로 제조된 이당류를 고함유하는 조성물은 트리코데르마 속 균주의 효소 생산을 우수하게 유도 효과가 있으므로, 생산된 고농도의 이당류를 활용한 발효공정 적용을 통해 트리코데르마의 효소 생산성 향상을 이룰 수 있다.

Description

베타-글루코시다아제와 이의 보조인자를 이용한 이당류의 생산방법 및 상기 생산된 이당류를 포함하는 트리코데르마 속 균주의 효소 생산 유도용 조성물
관련 출원(들)과의 상호 인용
본 출원은 2021년 11월 30일자 한국특허출원 제10-2021-0168329호와 2021년 11월 30일자 한국특허출원 제10-2021-0168330호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌들에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 발명은 베타-글루코시다아제와 이의 보조인자를 이용한 이당류의 생산방법 및 상기 생산된 이당류를 포함하는 트리코데르마 속 균주의 효소 생산 유도용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 베타-글루코시다아제와 이의 보조인자로 2가 금속 이온을 첨가하는 단계를 통해 글루코오스(glucose)로부터 젠티오비오스(gentiobiose) 또는 소포로오스(sophorose)의 이당류의 생성 속도를 높이고, 이를 통해 이당류를 높은 농도로 얻을 수 있는 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 생산된 이당류를 고함유하는 트리코데르마 속 균주의 효소 생산 촉진용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 효소 생산 방법에 관한 것이다.
소포로오스(sophorose)는 2분자의 D-glucopyranosyl 2-О-β 결합을 하고 있는 이당류로, 말토오스형 이당류의 일종이다.
젠티오비오스(gentiobiose)는 β결합으로 연결된 D-글루코스 2분자로 이루어진 이당류로, 아미그달로스(amygdalose)라고도 한다. 흰색의 결정성 고체로서 물이나 메탄올에 녹으며, 산 또는 β-글루코시다아제(β-glucosidase)를 이용하여 가수분해하면 2분자의 D-글루코오스가 생성된다.
상기 소포로오스와 젠티오비오스와 같은 이당류는 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei)의 효소 생산 유도제(inducer)로 알려져 있다.
상기 이당류를 생산하기 위한 유용한 방법 중 하나로 효소에 의한 역가수분해 반응을 이용하는 방법이 있다. 올리고당 합성을 위한 방법에 사용되는 대표적인 효소로 베타-글루코시다아제가 있다. 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 두 개의 글루코오스(glucose) 혹은 글루코오스와 다른 치환된 분자 사이의 베타-1,4-글루코시딕 결합(beta-1,4-glucosidic bond)을 가수분해하여 글루코오스를 방출하는 효소로 다양한 베타 D-글루코사이드(beta D-glucoside) 계열의 기질에 대한 특이성이 존재하는 일종의 엑소 셀룰라아제(exocellulase)이다. 그러나, 효소에 의한 역가수분해 반응은 평형이 가수분해 방향으로 치우쳐 있기 때문에 단당류에서 이당류의 낮은 전환 효율을 가져 대규모 생산이 제한되는 문제점이 있다.
대부분의 미생물이 생산하는 셀룰라아제는 유도성 효소로서 셀룰로오스, 셀로비오스, 락토오스 또는 소포로오스 등이 좋은 유도인자로 보고된 바 있다(Antonov et al. Microb Cell Fact (2016) 15:164).
섬유소 분해효소가 생합성되는 과정은 유도(induction) 과정 및 분해대사산물 억제(catabolite repression)에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 소포로오스, 젠티오비오스 또는 라미나리비오스는 Penicillium purpurogenum P-26 균주에서 셀룰라아제 합성을 유도함이 알려져 있으며(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Jan. 1992, p. 106-110), 트레할로오스는 Clostridium papyrosolvens CFR-703 균주에서 셀룰라아제 합성을 유도함이 알려져 있다(Process Biochemistry 37 (2001) 241-245). 이와 더불어 섬유소 분해 효소들의 활성은 최종 산물 저해(end product inhibition)에 의해서도 조절되는 셀룰라아제는 셀로비오스에 의하여, 그리고 Thermonospora fusca 균주와 Trichoderma reesei 균주의 경우에 β-glucosidase는 포도당에 의해서 각각 저해된다. 이와 같은 복잡한 조절작용의 결과 합성되는 섬유소 분해효소는 미생물의 종류와 배양조건에 따라 그 합성정도와 구성성분이 매우 다양하다.
본 발명의 목적은 1-하이드록시글루시톨-D- 글루코피라노사이드 (1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside) 또는 이의 이성질체를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 1) 글루코오스(glucose)를 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)와 접촉시키는 단계; 및 2) 상기 단계 1의 반응물에 2가 금속 이온을 접촉시키는 단계; 를 포함하는 미생물의 효소 생산 유도용 또는 미생물의 효소 활성 증가용 조성물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 트레할로오스(trehalose), 이소말토오스(isomaltose), 젠티오비오스(gentiobiose), 셀로비오스(cellobiose), 소포로오스(sophorose) 및말토오스(maltose)의 이당류를 포함하는 트리코데르마 속 균주의 효소 생산 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이당류를 포함하는 트리코데르마 속 균주의 효소 생산 유도용 조성물을 이용하여 트리코데르마 속 균주로부터 효소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 트레할로오스(trehalose), 이소말토오스(isomaltose), 젠티오비오스(gentiobiose), 셀로비오스(cellobiose), 소포로오스(sophorose) 및 말토오스(maltose)의 이당류를 고함유하는 조성물의 효소 생산 유도 용도를 제공한다.
본 발명에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명은 일 양태로
1) 글루코오스(glucose)를 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)와 접촉시키는 단계; 및 2) 상기 글루코오스 또는 상기 단계 1의 반응물에 2가 금속 이온을 접촉시키는 단계; 를 포함하는 미생물의 효소 생산 유도용 또는 미생물의 효소 활성 증가용 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 “글루코오스(glucose)”는 액상 글루코오스 또는 글루코스 수용액 형태일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 글루코오스는 65 내지 77% w/w, 67 내지 75% w/w, 또는 69 내지 73% w/w 농도일 수 있다.
상기 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 트리코데르마 속 유래일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 베타-글루코시다아제는 트리코데르마 레세이 유래일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 베타-글루코시다아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 미생물은 효소를 생산하는 미생물을 의미하며, 상기 미생물은 셀룰라아제, 자일라나아제 또는 피타아제 효소를 생산하는 미생물일 수 있고, 셀룰라아제, 자일라나아제 및 피타아제 효소를 모두 생산 가능한 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구체 예에서, 상기 미생물은 트리코데르마 속 균주일 수 있고, 더 구체적으로 트리코데르마 레세이 균주일 수 있다.
상기 베타-글루코시다아제는 1,300 내지 2,000 U/ml, 1,400 내지 1,900 U/ml, 1,500 내지 1,800 U/ml, 또는 1,550 내지 1,740 U/ml일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 2가 금속 이온은 망간 이온(Mn2+), 마그네슘 이온(Mg2+), 아연 이온(Zn2+) 및 구리이온(Cu2+)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 아연 이온(Zn2+) 및 구리이온(Cu2+)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 “접촉시키는 단계”는 본 명세서에서 용어 “정치시키는 단계”또는 “반응시키는 단계”와 혼용될 수 있다.
상기 단계 2)의 “접촉”은 20 내지 50 rpm, 25 내지 45 rpm, 또는 28 내지 42 rpm으로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 “접촉”은 pH 3.0 내지 7.0, pH 3.5 내지 6.5, pH 4.0 내지 6.0, 또는 pH 4.5 내지 5.5에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 “접촉”은 50℃ 내지 70 ℃, 55℃ 내지 65℃, 또는 57℃ 내지 63℃에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 “접촉”은 5일 이상 수행하는 것일 수 있고, 6일 이상 수행하는 것일 수 있고, 7일 이상 수행하는 것일 수 있고, 5일 내지 22일 동안 수행하는 것일 수 있고, 6일 내지 21일 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 생산된 조성물은 트레할로오스(trehalose), 이소말토오스(isomaltose), 셀로비오스(cellobiose), 말토오스(maltose), 젠티오비오스(gentiobiose), 소포로오스(sophorose), 1-하이드록시글루시톨-D- 글루코피라노사이드 (1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside) 및 이의 이성질체로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 생산된 조성물은 젠티오비오스(gentiobiose) 및소포로오스(sophorose)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 생산된 조성물은 트리코데르마 속 균주의 효소 생산 또는 생산된 효소의 발효 활성을 우수하게 유도하는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 조성물을 생산하는 방법은 2가 양이온이 포함된 크로마토그래피를 실시하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 크로마토그래피는 모사이동층(Simulated Moving Bed; SMB) 크로마토그래피일 수 있다.
본 발명의 크로마토그래피에서 상기 2가 양이온은 양이온 교환수지가 충전된 컬럼형태로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 크로마토그래피에서 상기 2가 양이온은 칼슘 이온, 바륨 이온, 스트론튬 이온 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 모사이동층 크로마토그래피는 8개 이상의 컬럼을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 모사이동층 크로마토그래피는 50℃ 내지 70℃의 물로 용리를 실시하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 용리는 55 내지 65℃ 또는 58 내지 62℃의 물로 실시할 수 있다.
본 발명은 다른 양태로 하기 화학식 1의 구조를 갖는 (1S)-1-하이드로글루시톨-D-글루코피라노사이드((1S)-1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside)를 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022019160-appb-img-000001
본 발명은 다른 양태로 하기 화학식 2의 구조를 갖는 1-에피-1-하이드로글루시톨-D-글루코피라노사이드(1-epi-1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside)를 제공한다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2022019160-appb-img-000002
본 발명은 또 다른 양태로 1-하이드록시글루시톨-D- 글루코피라노사이드 (1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside) 또는 이의 이성질체를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 미생물의 효소 생산을 유도하거나 미생물이 생산하는 효소 활성을 증가시키는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 1-하이드록시글루시톨-D- 글루코피라노사이드 또는 이의 이성질체는 (1S)-1-하이드로글루시톨-D-글루코피라노사이드 또는 1-에피-1-하이드로글루시톨-D-글루코피라노사이드일 수 있다.
본 발명은 일 양태로 이당류를 고함유하는 효소 생산 유도용 조성물을 제공한다.
상기 이당류는 트레할로오스(trehalose), 이소말토오스(isomaltose), 젠티오비오스(gentiobiose), 셀로비오스(cellobiose), 소포로오스(sophorose),말토오스(maltose), 1-하이드록시글루시톨-D- 글루코피라노사이드 (1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside) 및 이의 이성질체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 일 양태로 트레할로오스(trehalose), 이소말토오스(isomaltose), 젠티오비오스(gentiobiose), 셀로비오스(cellobiose), 소포로오스(sophorose) 및 말토오스(maltose)를 포함하는 미생물의 효소 생산 유도용 조성물을 제공한다.
본 명세서에 있어서 “효소 생산 유도”는 미생물로부터 생산되는 효소의 양을 유도하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 “효소 생산 유도”는 생산된 효소의 발효 활성을 측정하여 확인할 수 있다.
상기 미생물은 트리코데르마 속 균주일 수 있고, 트리코데르마 레세이 균주일 수 있고, 더욱 구체적으로, 트리코데르마 레세이 QM6a 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 효소는 트리코데르마 속 균주가 생산하는 효소일 수 있고, 트리코데르마 레세이 균주가 생산하는 효소일 수 있고, 더욱 구체적으로, 트리코데르마 레세이 QM6a 균주가 생산하는 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 효소는 셀룰라아제(cellulase), 자일라나아제(xylanase) 또는 피타아제(phytase)일 수 있고, 바람직하게는 자일라나아제일 수 있다.
상기 트리코데르마 속 균주의 효소 생산 유도용 조성물은 1-하이드록시글루시톨-D- 글루코피라노사이드 (1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside) 또는 이의 이성질체를 더 포함할 수 있다.
상기 1-하이드록시글루시톨-D- 글루코피라노사이드 또는 이의 이성질체는 (1S)-1-하이드로글루시톨-D-글루코피라노사이드 또는 1-에피-1-하이드로글루시톨-D-글루코피라노사이드일 수 있다.
상기 1-하이드록시글루시톨-D- 글루코피라노사이드 (1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside) 또는 이의 이성질체는 1) 글루코오스(glucose)를 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)와 접촉시키는 단계 및 2) 상기 글루코오스 또는 상기 단계 1의 반응물과 2가 금속 이온과 접촉시키는 단계; 를 포함하는 이당류를 생산하는 방법으로 제조된 것일 수 있다.
상기 조성물은 단당류 함량이 낮고, 이당류 함량이 높은 것일 수 있다.
상기 조성물은 조성물에 포함된 단당류 함량 보다 이당류 함량이 더 높은 것일 수 있으며, 상기 이당류 함량의 증가는 모사이동층(Simulated Moving Bed; SMB) 크로마토그래피에 의해 달성되는 것일 수 있다.
상기 조성물에 포함된 단당류 함량은 총 조성물 중량 대비 45 중량% 이하, 40 중량% 이하, 35 중량% 이하, 30 중량% 이하, 20 중량% 내지 45 중량%, 25 중량% 내지 45 중량%, 20 중량% 내지 40 중량%, 25 중량% 내지 40 중량%, 20 중량% 내지 35 중량%, 25 중량% 내지 35 중량%, 20 중량% 내지 30 중량%, 또는 25 중량% 내지 30 중량%일 수 있다.
상기 조성물에 포함된 이당류 함량은 총 조성물 중량 대비 27 중량% 이상, 30 중량% 이상, 33 중량% 이상, 36 중량% 이상, 39 중량% 이상, 27 중량% 내지 50 중량%, 30 중량% 내지 50 중량%, 33 중량% 내지 50 중량%, 36 중량% 내지 50 중량%, 39 중량% 내지 50 중량%, 27 중량% 내지 45 중량%, 30 중량% 내지 45 중량%, 33 중량% 내지 45 중량%, 36 중량% 내지 45 중량%, 39 중량% 내지 45 중량%, 27 중량% 내지 42 중량%, 30 중량% 내지 42 중량%, 33 중량% 내지 42 중량%, 36 중량% 내지 42 중량%, 39 중량% 내지 42 중량%, 27 중량% 내지 40 중량%, 30 중량% 내지 40 중량%, 33 중량% 내지 40 중량%, 36 중량% 내지 40 중량%, 또는 39 중량% 내지 40 중량%일 수 있다.
상기 조성물에 포함된 트레할로오스(trehalose)의 함량은 총 조성물 중량 대비 2.5 중량% 이상, 3 중량% 이상, 4 중량% 이상, 2.5 중량% 내지 6 중량%, 3 중량% 내지 6 중량%, 4 중량% 내지 6 중량%, 2.5 중량% 내지 5 중량%, 3 중량% 내지 5 중량%, 또는 4 중량% 내지 5 중량%일 수 있다.
상기 조성물에 포함된 이소말토오스(isomaltose)의 함량은 총 조성물 중량 대비 4.5 중량% 이상, 5 중량% 이상, 4.5 중량% 내지 7 중량%, 5 중량% 내지 7 중량%, 4.5 중량% 내지 6 중량%, 또는 5 중량% 내지 6 중량%일 수 있다.
상기 조성물에 포함된 젠티오비오스(gentiobiose)의 함량은 총 조성물 중량 대비 15 중량% 이상, 17 중량% 이상, 19 중량% 이상, 21 중량% 이상, 15 중량% 내지 28 중량%, 17 중량% 내지 28 중량%, 19 중량% 내지 28 중량%, 21 중량% 내지 28 중량%, 15 중량% 내지 25 중량%, 17 중량% 내지 25 중량%, 19 중량% 내지 25 중량%, 21 중량% 내지 25 중량%, 15 중량% 내지 23 중량%, 17 중량% 내지 23 중량%, 19 중량% 내지 23 중량%, 또는 21 중량% 내지 23 중량%일 수 있다.
상기 조성물에 포함된 셀로비오스(cellobiose)의 함량은 총 조성물 중량 대비 1.9 중량% 이상, 2.0 중량% 이상, 2.1 중량% 이상, 2.2 중량% 이상, 1.9 중량% 내지 3.0 중량%, 2.0 중량% 내지 3.0 중량%, 2.1 중량% 내지 3.0 중량%, 2.2 중량% 내지 3.0 중량%, 1.9 중량% 내지 2.7 중량%, 2.0 중량% 내지 2.7 중량%, 2.1 중량% 내지 2.7 중량%, 2.2 중량% 내지 2.7 중량%, 1.9 중량% 내지 2.5 중량%, 2.0 중량% 내지 2.5 중량%, 2.1 중량% 내지 2.5 중량%, 또는 2.2 중량% 내지 2.5 중량%일 수 있다.
상기 조성물에 포함된 소포로오스(sophorose)의 함량은 총 조성물 중량 대비 1.4 중량% 이상, 1.5 중량% 이상, 1.6 중량% 이상, 1.7 중량% 이상, 1.4 중량% 내지 3.0 중량%, 1.5 중량% 내지 3.0 중량%, 1.6 중량% 내지 3.0 중량%, 1.7 중량% 내지 3.0 중량%, 1.4 중량% 내지 2.5 중량%, 1.5 중량% 내지 2.5 중량%, 1.6 중량% 내지 2.5 중량%, 1.7 중량% 내지 2.5 중량%, 1.4 중량% 내지 2.0 중량%, 1.5 중량% 내지 2.0 중량%, 1.6 중량% 내지 2.0 중량%, 또는 1.7 중량% 내지 2.0 중량%일 수 있다.
상기 조성물에 포함된 말토오스(maltose)의 함량은 총 조성물 중량 대비 2.6 중량% 이상, 3.0 중량% 이상, 3.4 중량% 이상, 3.7 중량% 이상, 2.6 중량% 내지 5.0 중량%, 3.0 중량% 내지 5.0 중량%, 3.4 중량% 내지 5.0 중량%, 3.7 중량% 내지 5.0 중량%, 2.6 중량% 내지 4.6 중량%, 3.0 중량% 내지 4.6 중량%, 3.4 중량% 내지 4.6 중량%, 3.7 중량% 내지 4.6 중량%, 2.6 중량% 내지 4.2 중량%, 3.0 중량% 내지 4.2 중량%, 3.4 중량% 내지 4.2 중량%, 3.7 중량% 내지 4.2 중량%, 2.6 중량% 내지 3.9 중량%, 3.0 중량% 내지 3.9 중량%, 3.4 중량% 내지 3.9 중량%, 또는 3.7 중량% 내지 3.9 중량%일 수 있다.
상기 조성물은 올리고머(oligomer)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물에 포함된 올리고머 함량은 총 조성물 함량 대비 29 중량% 내지 35 중량%, 29 중량% 내지 34 중량%, 29 중량% 내지 33 중량%, 30 중량% 내지 35 중량%, 30 중량% 내지 34 중량%, 30 중량% 내지 33 중량%, 31 중량% 내지 35 중량%, 31 중량% 내지 34 중량%, 32 중량% 내지 35 중량%, 또는 32 중량% 내지 34 중량%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서의 일 실시예에서는 높은 단당류 함량과 낮은 이당류 함량을 갖는 조성물(TGS)에 비해 낮은 단당류 함량과 높은 이당류 함량을 갖는 조성물(SMB 분리액)이 우수한 효소 발효 활성을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 트레할로오스(trehalose), 이소말토오스(isomaltose), 젠티오비오스(gentiobiose), 셀로비오스(cellobiose), 소포로오스(sophorose) 및 말토오스(maltose)를 고함유하는 조성물은 미생물의 효소 생산 유도 용도로 활용될 수 있다.
본 발명은 베타-글루코시다아제와 이의 보조인자를 이용한 이당류의 생산방법 및 상기 생산된 이당류를 포함하는 트리코데르마 속 균주의 효소 생산 유도용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 글루코오스 기질에 베타-글루코시다아제와 이의 보조인자로 2가 금속 이온인 망간 이온(Mn2+), 마그네슘 이온(Mg2+), 아연 이온(Zn2+) 또는 구리이온(Cu2+)을 첨가하는 경우, 이당류의 생성 속도를 높아지고, 이당류를 높은 농도로 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 생산방법으로 제조된 이당류를 고함유하는 조성물은 트리코데르마 속 균주의 효소 생산을 우수하게 유도 효과가 있으므로, 생산된 고농도의 이당류를 활용한 발효공정 적용을 통해 트리코데르마의 효소 생산성 향상을 이룰 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 이당류 조성물의 제조
순도 95% 이상의 글루코오스 분말(함수결정 포도당, 대정화금)을 스팀(steam)을 이용하여 용해시켜서 71% w/w 농도의 글루코오스 용액 40kg을 제조하였다. 제조된 글루코오스 용액에 β-글루코시다아제(서열번호 1)를 1,650 U/ml농도로 0.3kg을 첨가하여 60℃, 7일 내지 21일간 정치시켜 이당류가 포함된 조성물(Treated Glucose Syrup, TGS)을 제조하였다.
실시예 2. 2가 금속 양이온 첨가를 이용한 이당류 조성물의 제조
실시예 1의 글루코오스 용액에 β-글루코시다아제(실시예 1과 동일)를 1,650 U/ml농도로 0.3 kg를 첨가하고, 추가로 2가 이온[망간 이온(Mn2+), 마그네슘 이온(Mg2+), 아연 이온(Zn2+) 및 구리 이온(Cu2+) 각각]을 1 mM를 첨가하여 60℃, 7일 내지 21일간 정치시켜 이당류가 포함된 조성물을 제조하였다.
실시예 3. 이당류 조성물에 포함된 이당류 농도 및 2가 금속 양이온 첨가에 따른 이당류 증감률 증가 확인
실시예 1 및 2에서 생성된 조성물에서 이당류인 트레할로오스(trehalose), 이소말토오스(isomaltose), 말토오스(maltose), 셀로비오스(cellobiose), 젠티오비오스(gentiobiose) 및 소포로오스(sophorose)의 생성 농도(g/L) 및 증감률(%)을 측정하여 하기의 표 1 및 표 2에 나타내었다. 상기 생성 농도는 전기화학 검출기 및 CarboPac PAI 컬럼이 장착된 Bio-LC 시스템(Dionex ICS-3000, Sunnyvale, CA, United States)을 사용하여 분석하였다.
정치기간
(일)		 첨가 이온 농도 (g/L)
Trehalose Isomaltose Maltose Cellobiose Gentiobiose Sophorose 합
7 무첨가 21.9 8 16.6 14.4 58.4 6.9 65.3
Mn2+ 21.7 8.6 16.8 14.5 69.5 11.6 81.1
Mg2+ 21.1 6.7 13.7 13.1 64.3 10.8 75.1
Zn2+ 22.2 7.3 15.8 14.8 69.9 12.6 82.5
Cu2+ 19.4 8 18.7 15.1 71.7 13.3 85
14 무첨가 11.4 9.3 12.1 13.1 70.6 12.7 83.3
Mn2+ 14.6 12.4 16.1 15.4 78 16.5 94.5
Mg2+ 15.3 10.6 14.6 15.6 69.4 17.4 86.8
Zn2+ 14.3 9.8 14.3 14.9 81 16.4 97.3
Cu2+ 12.6 10.3 15.9 15.2 82.1 17 99.1
21 무첨가 15 14.1 15.2 15.3 82.7 15.9 98.6
Mn2+ 14.1 15.7 17.1 15.5 86.5 23.6 110.2
Mg2+ 14.8 13.2 15.4 15.4 74.6 23.1 97.7
Zn2+ 14.5 12.5 15.2 15 92 23.4 115.4
Cu2+ 13 12.4 16.8 15.5 92.4 24.3 116.7
정치 기간(일)
　		 첨가 이온
　		 증감율 (%)
Gentiobiose Sophorose 합
7 무첨가 0 0 0
Mn2+ 18.9 67.8 24.1
Mg2+ 10 56.8 15
Zn2+ 19.7 82.8 26.3
Cu2+ 22.8 92.2 30.1
14 무첨가 0 0 0
Mn2+ 10.5 29.2 13.4
Mg2+ -1.6 36.5 4.2
Zn2+ 14.7 28.4 16.8
Cu2+ 16.3 33.5 18.9
21 무첨가 0 0 0
Mn2+ 4.6 48.7 11.7
Mg2+ -9.8 45.3 -0.9
Zn2+ 11.3 47.1 17
Cu2+ 11.7 53.0 18.4
실시예 4. SMB 크로마토그래피를 활용한 고순도 다당류 분리
실시예 2에서 제조한 조성물로부터 단당류를 제거하기 위하여 모사이동층(SMB: Simulated Moving Bed) 크로마토그래피를 이용하였다. 상기 SMB 크로마토그래피는 Sequential Simulated Moving-bed System; Novasep, France) 장비를 사용하였으며, 상기 장비는 연속적으로 연결된 8개의 컬럼(각 컬럼의 높이는 95 cm, 직경은 2.5 cm), 공급물(feed) 펌프, 재순환 펌프, 용리 액 펌프, 열교환기, 유량 제어를 위한 밸브를 포함한다. SMB 크로마토그래피 운전 조건은 하기 표 3에 나타내었고, SMB 크로마토그래피를 통한 분리 실험 결과를 표 4에 나타내었다. 회수율 측정 방법은 혼합물(TGS)을 SMB 크로마트그래피에 주입되는 이당류 및 삼당류의 양에서 라피네이트의 이당류 및 삼당류의 양을 비교하여 하기의 계산식을 이용하여 회수율을 계산하였다.
Recovery(%)= Raffinate (당함량)/Feed(당함량) X 100
*당함량 = 이당류 및 다당류 총량을 의미
공급물 실시예 2 제조 조성물
농도 60%(w/w)
양이온교환수지 XA2004/32Ca
컬럼 크기 및 개수 25 mm X 950 mm, 8ea
용리액 H2O
용리액 온도 60℃
Flow rate mL/min
Feed 1.2
Water 7
Extract 5.9
Raffinate 2.3
시료명 HPLC Purity (%)
이당류 및 삼당류 단당류
SMB Feed(공급물) 36.1 63.9
Raffinate 81~89 10~19
Extract 3.9 96.1
SMB 크로마토그래피를 통한 분리 실험 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 칼슘 이온을 사용한 Raffinate 분획물 내의 이당류 및 삼당류의 순도는 81~89%, 회수율은 89% 수준인 것을 확인하였다.
실시예 5. 제조된 이당류 성분에 대한 NMR 분석
실시예 2에서 제조된 조성물에 대한 NMR 분석을 위해 아세틸화(Acetylation)를 수행하였다. 시약(Reagents)은 아세트산 무수물(Acetic anhydride)(extra pure, Junsei Chemical Co.), 염화아연(Zinc chloride)(Kanto Chemical Co.)을 사용하였고, 아세틸화 시료의 분리 및 분석을 위한 설비 조건은 하기 표 5에 나타내었다.
Equipment Agilent technologies 1200 series
Column YMC C18 (10 X 250mm, 5um)
Eluent 60% methanol
Flow rate 2mL/min
RI cell temperature 35℃
그 결과, 분석 시료 내에서 기존에 알려진 당인 트레할로오스(trehalose), 이소말토오스(isomaltose), 젠티오비오스(gentiobiose), 셀로비오스(cellobiose), 말토오스(maltose), 소포로오스(sophorose) 및 말토오스(maltose)를 확인하였다. 또한, 분석 시료 내에 신규한 당인 (1S)-1-하이드로글루시톨-D-글루코피라노사이드((1S)-1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside) 또는 1-에피-1-하이드로글루시톨-D-글루코피라노사이드(1-epi-1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside)가 존재함을 확인하였다.
실시예 6. 글루코오스 용액과 글루코오스 용액에서 이당류가 농축된 SMB 분리액의 당 함량 분석
실시예 2에서 제조한 TGS와 이의 SMB 분리액의 당 함량을 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 상기 SMB 분리액은 실시예 2에서 제조한 이당류 조성물을 SMB 크로마토그래피 진행한 결과 수득한 실시예 4의 Raffinate 분획물을 수득한 것이다.
구체적으로, 단당류 및　이당류 농도는 전기화학 검출기 및 CarboPac PAI 컬럼이 장착된 Bio-LC 시스템(Dionex ICS-3000, Sunnyvale, CA, United States)을 사용하여 당 함량을 분석하여 하기 표 6에 나타내었다. 컬럼을 30℃에서 0.1M NaOH(0~5분)로 용출한 다음 아세트산나트륨(0~0.2M)의 선형 구배를 1 mL/분으로 5~35분 동안 용출하였다.
구분 　 TGS SMB 분리액
(포도당 효소 처리액) (TGS 농축)
중합도 당류 g/L % g/L %
DP1 Glucose 213.5 44.81 125 27.36
Fructose 1.3 0.27 3.1 0.68
sum 214.8 45.08 128.1 28.04
DP2 Trehalose 11.8 2.48 20.3 4.44
Isomaltose 19.2 4.03 25 5.47
Gentiobiose 67.5 14.17 99.5 21.78
Cellobiose 8.9 1.87 10.1 2.21
Sophorose 6.2 1.3 7.9 1.73
Maltose 12 2.52 17.1 3.74
sum 125.6 26.36 179.9 39.37
DP3이상 oligomer 136.1 28.56 148.9 32.59
Total 　 476.5 100 456.9 100
그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, TGS의 단당류 함량은 45.08%로 나타났고, SMB 분리액은 28.04%로, TGS에 비해 SMB 분리액의 단당류 함량이 낮은 것으로 확인되었다. 또한, 이당류 함량의 경우, TGS는 26.36%로 나타났고, SMB 분리액은 39.37%로 나타나, TGS에 비해 SMB 분리액의 이당류 함량이 높은 것을 확인하였다.
실시예 7. 조성물에 포함된 이당류 함량에 따른 효소 생산 유도 효과 확인
SMB 분리액이 트리코데르마 속 균주의 효소 생산을 유도하는 효과가 우수한지 확인하기 위하여, TGS와 SMB 분리액을 이용하여 효소의 발효 활성을 하기와 같이 측정하였다.
구체적으로, TGS 또는 SMB 분리액을 각각 배지에 첨가하고, 트리코데르마 속 균주를 균체 농도 190 또는 200 g/L가 되도록 희석하였다. pH 4에서 28℃ 조건에서 168 시간 동안 배양한 후, 산성 셀룰라아제 효소 활성을 측정하여 하기 표 7에 나타내었다.
더욱 구체적인 효소의 발효 활성 측정은 하기의 실시예 7-1 내지 7-3에 나타내었다.
실시예 7-1. 효소 생산 균주의 준비
효소 생산 균주로서 각각 acid cellulase(4-β-　D　-glucan 4-glucanohydrolase EC 3.2.1.4), xylanase(1,4-β-d-xylan xylanohydrolase, EC3.2.1.8), 및 phytase(3-phytases, EC 3.1.3.8, 6-phytases, EC 3.1.3.26, and 5-phytases, EC 3.1.3.72) 생산 가능한 트리코데르마 레세이 QM6a 균주(ATCC13631)를 준비하였다. 각 균주를 감자 덱스트로스 한천 플레이트에서 30℃, 5일간 성장시켜 포자를 형성시켰다.　포자 형성 후, 각 균주의 포자를 멸균 NaCl 용액(9 g/L)에 재현탁시키고, 30% 멸균 글리세롤을 첨가하였다.　이 혼합물을 - 80℃에서 1.8 ml 튜브에 보관하였다.
실시예 7-2. 효소 생산 균주의 유가식 배양
유가식 배양을 이용한 실시예 7-1의 각 효소를 생산하는 트리코데르마 레세이 QM6a 균주의 배양은 DO를 지표로 하여 DO가 상승하는 시점에 공급배지 내 탄소원의 공급 속도를 시간당 5.0 g/L로 일정하게 공급하였다. 공급 배지의 공급은 페리스태틱 펌프 (peristatic pump)를 이용하여 수행하였다. 이때 발효배지 성분은 탄수화물 20.0 g/L, 황산암모늄 5.0 g/L, 황상마그네슘 1.5 g/L, 염화칼슘 0.5 g/L, 제이인산칼륨 5.0 g/L, 효모추출물 10.0 g/L, 황산제이철 10.0 mg/L, 염화코발트 4.0 mg/L, 몰리브덴산소다 2.0 mg/L, 붕산 0.4 mg/L, Tween 80 1.0 g/L으로 조성되었다. 공급 배지는 탄소원과 효모추출물의 중량 비율이 1:0.01인 탄수화물 600.0 g/L, 효모 추출물 6.0 g/L, 염화나트륨 1.0 g/L으로 조성되었다. 상기 배지에 포함된 탄수화물은 각 효소의 활성 실험에서 각각 TGS와 SMB 분리액을 첨가하였다. 한편, 발효 조건은 배양온도 28℃에서 유지하면서 암모니아수를 이용하여 pH를 4.0으로 유지하였다. 교반 속도는 DO(용존산소량) 제한이 발생하지 않도록 600 rpm으로 조절하였다. 이때 종균 배양은 500 ml 삼각 플라스크에 있는 150 ml 배지에　1 ml의 동결된 포자 혼합물을 접종하여, 진탕기에서 28℃ 및　200 rpm 에서 72시간 동안 전배양하여 배양액의 10% (v/v)를 접종하였다.
실시예 7-3. 산성 셀룰라아제 활성 분석
상기 실시예 7-2에서 수득한 발효액을 원심분리하여　T. reesei　세포 및 기타 고체 물질을 제거하였다. 배양 상등액은 효소 분석을 위해 적절하게 희석하였다. 모든 효소 활성은 상등액 mL당 국제 단위(IU)를 사용하여 특정 활성으로 표시하였다. 1 IU는 표준 분석 조건(5 mg/mL CMC, pH 4.8, 50℃)에 분당 1 μmol의 D-glucose를 유리시키는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.
셀룰라아제는 셀룰로스를 가수 분해하여 특정 온도 및 pH 조건에서 단당류 및 올리고당을 생성한다. 환원 말단을 갖는 올리고당 및 환원기를 갖는 단당류는 고온의 조건 하에서 DNS 시약과의 색 반응을 겪고, 반응액의 색의 강도는 효소 가수 분해에 의해 생성된 환원당의 양, 및 설탕 생성을 감소시키는 양 및 반응에 비례한다. 액체 중의 셀룰라아제 활성은 비례적이며, 셀룰라아제 활성은 분광 광도법에 의해 반응 용액의 흡광도를 측정함으로써 계산될 수 있다.
번호 실험조건 배양시간
(hr)		 균체농도
(g/L)		 pH 온도
(℃)		 효소활성
(IU/mL)		 평균활성
(IU/mL)		 상대활성비교
(%)
1 TGS 168 190 4 28 2728 2822.5 0
2 TGS 168 200 4 28 2917
3 SMB 분리액 168 200 4 28 3973.333 3890 37.82108
4 SMB 분리액 168 190 4 28 3806.667
그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, TGS 첨가한 경우 산성 셀룰라아제의 평균 활성은 2822.5 IU/mL, SMB 분리액을 첨가한 경우 산성 셀룰라아제의 평균 활성은 3890 IU/mL이었으며, SMB 분리액을 첨가한 경우 산성 셀룰라아제의 평균 활성이 37.8% 추가적으로 증가함을 확인하였다.
실시예 8. SMB 분리액의 효소 종류 별 효소 생산 유도 효과 확인
SMB 분리액이 트리코데르마 속 균주의 효소 생산을 유도하는 효과가 효소의 종류에 따라 차이가 있는지를 확인하기 위하여, TGS와 SMB 분리액을 이용하여 자일라나아제(xylanase)와 피타아제(phytase)의 발효 활성을 하기와 같이 측정하였다.
구체적으로, TGS 또는 SMB 분리액을 각각 배지에 첨가하고, 트리코데르마 속 균주를 균체 농도 240 또는 250 g/L가 되도록 희석하였다. pH 4에서 28℃ 조건에서 168 시간 동안 배양한 후, 자일라나아제(xylanase)와 피타아제(phytase)의 효소 활성을 측정하여 하기 표 8에 나타내었다.
더욱 구체적으로, 상기 실시예 7-1 및 7-2에 기재된 균주 준비 과정과 배양 과정과 동일한 방법으로 측정하였으며, 각 효소 활성 분석은 하기의 실시예 8-1 및 8-2에 나타내었다.
실시예 8-1. 중성 자일라나아제 활성 분석
상기 실시예 7-2에서 수득한 발효액을 원심분리하여　T. reesei　세포 및 기타 고체 물질을 제거하였다. 배양 상등액은 효소 분석을 위해 적절하게 희석하였다. 모든 효소 활성은 상등액 mL당 국제 단위(IU)를 사용하여 특정 활성으로 표시하였다. 1 IU는 표준 분석 조건(1% xylan, pH 6.5, 50℃)에 분 당 1 μmol의 D-xylose를 유리시키는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.
특정 온도와 pH 조건에서 자일라나아제는 자일란을 올리고당과 단당으로 분해한다. 말단이 환원된 올리고당과 환원기를 갖는 단당류는 DNS 시약과 발색 반응을 한다. 반응 용액의 색상 강도는 효소가수분해에 의해 생성된 환원당의 양에 비례하고, 생성된 환원당의 양은 반응 용액 내 자일라나아제의 활성에 비례하므로, 분광광도법으로 자일라나아제의 활성을 계산할 수 있다.
실시예 8-2. 피타아제 활성 분석
상기 실시예 7-2에서 수득한 발효액을 원심분리하여　T. reesei　세포 및 기타 고체 물질을 제거하였다. 배양 상등액은 효소 분석을 위해 적절하게 희석하였다. 모든 효소 활성은 상등액 mL 당 국제 단위(IU)를 사용하여 특정 활성으로 표시하였다. 1 IU는 37℃, pH=5.5 조건에서 피타제 활성 단위인 분당 5.0 mmol/L의 농도로 피틴산나트륨 용액에서 분 당 1 μmol의 무기인을 유리시키는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.
특정 온도 및 pH 조건에서 피타아제는 기질인 피틴산나트륨을 완전히 가수분해하여 오르토인산 및 이노시톨 유도체를 생성한다. 산성 용액에서는 암모늄 바나듐 몰리브데이트와 노란색 화합물을 형성할 수 있으며, 이는 415 nm의 파장에서 비색으로 측정할 수 있다.
효소 실험조건 배양시간
(hr)		 균체농도
(g/L)		 pH 온도
(℃)		 효소활성
(IU/mL)		 상대활성비교
(%)
Neutral xylanase TGS 168 250 4 28 105376 0
SMB 분리액 168 240 4 28 144716 37.3
Phytase TGS 168 240 4 28 25312 0
SMB 분리액 168 240 4 28 26668 5.4
그 결과, 표 8에 나타난 바와 같이, TGS를 첨가한 경우 중성 자일라나아제의 평균 활성은 105,376 IU/mL, SMB 분리액을 첨가한 경우 중성 자일라나아제의 평균 활성은 144,716 IU/mL이었으며, SMB 분리액을 첨가한 경우 중성 자일라나아제 발효 활성이 37.3% 추가적으로 증가함을 확인하였다. 또한, TGS를 첨가한 경우 피타아제의 평균 활성은 25,312 IU/mL, SMB 분리액을 첨가한 경우 피타아제의 평균 활성은 26,668 IU/mL이었으며, SMB 분리액을 첨가한 경우 피타아제 발효 활성이 5.4% 추가적으로 증가하였음을 확인하였다.

Claims (18)

1-하이드록시글루시톨-D- 글루코피라노사이드 (1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside) 또는 이의 이성질체를 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 1-하이드록시글루시톨-D- 글루코피라노사이드 또는 이의 이성질체는 (1S)-1-하이드로글루시톨-D-글루코피라노사이드 또는 1-에피-1-하이드로글루시톨-D-글루코피라노사이드인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 트레할로오스(trehalose), 이소말토오스(isomaltose), 젠티오비오스(gentiobiose), 셀로비오스(cellobiose), 소포로오스(sophorose) 및 말토오스(maltose)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 미생물의 효소 생산을 유도하거나 미생물이 생산하는 효소 활성을 증가시키는 것인, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 미생물은 트리코데르마(Trichoderma) 속 균주인, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 미생물은 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei)인, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 효소는 산성 셀룰라아제(acid cellulase), 자일라나아제(xylanase) 또는 피타아제(phytase)인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 단당류 함량보다 이당류 함량이 높은 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물에 포함된 이당류 함량은 총 조성물 중량 대비 30 중량% 이상인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물에 포함된 단당류 함량은 총 조성물 중량 대비 30 중량% 이하인, 조성물.
1) 글루코오스(glucose)를 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)와 접촉시키는 단계; 및
2) 상기 글루코오스 또는 상기 단계 1의 반응물에 2가 금속 이온을 접촉시키는 단계; 를 포함하는 미생물의 효소 생산 유도용 또는 미생물의 효소 활성 증가용 조성물을 생산하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 베타-글루코시다아제는 트리코데르마(Trichoderma) 속 유래인, 방법.
제11항에 있어서, 상기 베타-글루코시다아제는 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 유래인, 방법.
제11항에 있어서, 상기 2가 금속 이온은 망간 이온(Mn2+), 마그네슘 이온(Mg2+), 아연 이온(Zn2+) 및 구리이온(Cu2+)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
제11항에 있어서, 상기 조성물은 트레할로오스(trehalose), 이소말토오스(isomaltose), 셀로비오스(cellobiose), 말토오스(maltose), 젠티오비오스(gentiobiose), 소포로오스(sophorose), 1-하이드록시글루시톨-D- 글루코피라노사이드 (1-hydroxyglucitol-D-glucopyranoside) 및 이의 이성질체로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
제11항에 있어서, 상기 미생물은 트리코데르마 속 균주인, 방법.
제11항에 있어서, 상기 방법은 2가 양이온이 포함된 크로마토그래피를 실시하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제17항에 있어서, 상기 크로마토그래피는 모사이동층(Simulated Moving Bed; SMB) 크로마토그래피인, 방법.
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