KR20190142480A

KR20190142480A - 트리코더마 속 kmf006 균주를 이용한 셀룰레이스 생산 방법

Info

Publication number: KR20190142480A
Application number: KR1020180069390A
Authority: KR
Inventors: 김영숙; 박소현; 김영균
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2018-06-18
Filing date: 2018-06-18
Publication date: 2019-12-27
Also published as: KR102155049B1

Abstract

본 발명은 트리코더마 속 KMF006 균주를 이용한 셀룰레이스 생산 방법 및 상기 셀룰레이스를 이용한 당화 방법에 관한 것으로, 상기 트리코더마 속 KMF006 균주를 이용하면 고활성의 셀룰레이스를 생산할 수 있고, 생산된 셀룰레이스를 이용하여 바이오매스를 효과적으로 당화시킬 수 있다.

Description

트리코더마 속 KMF006 균주를 이용한 셀룰레이스 생산 방법{Method for Producing Cellulase using Trichoderma sp. KMF006 strain}

본 발명은 트리코더마 속(Trichoderma sp.) KMF006 균주를 이용한 고활성 셀룰레이스 생산 방법 및 생산된 셀룰레이스를 이용한 당화 방법에 관한 것이다.

고유가 및 자원 고갈 문제로 인하여 화석원료를 대체하는 수단으로 바이오매스(biomass)의 사용이 증가하고 있다. 그러나 바이오연료(biofuel) 및 바이오리파이너리(biorefinery)의 원료로 당질 및 전분질계 바이오매스의 사용이 급증하면서 애그플레이션(agflation)이 유발되어 식량 문제를 초래하였다. 따라서 이에 대한 대안으로 비식용인 목질계 바이오매스가 주목을 받고 있다. 목질계 바이오매스는 셀룰로스(cellulose, 40 내지 45%), 헤미셀룰로오스 (hemicellulose, 20 내지 30%) 및 페놀성 물질인 리그닌(lignin, 약 25%)으로 구성되어 있다.

목질계 바이오매스를 바이오화학연료 또는 바이오연료로 가공하기 위해서는 목질 성분을 분해하여 당을 추출하는 여러 단계의 요소 기술이 필요하며, 당을 추출하기 위해서는 목질 바이오매스로부터 추출된 셀룰로스 고분자를 가수분해하는 당화 과정이 반드시 필요하다. 일반적으로 당화 방법에는 산， 알칼리 등의 촉매를 이용하는 화학적 당화와 나무를 분해하는 곰팡이 등의 진균류 유래 셀룰레이스(cellulase)를 이용하는 효소 당화가 있다.

당화 과정에서 셀룰로스를 단당류로 분해하기 위해서는 셀룰레이스 중에서 엔도-β-1,4-글루카네이스(endo-β-1,4-glucanase; EC 3.2.1.4), 셀로바이오하이드로레이스(cellobiohydrolase; EC 3.2.1.91) 및 베타-글루코시데이스(β-glucosidase; EC 3.2.1.21)가 필요하다. 이중에서 베타-글루코시데이스는 엔도-베타-1,4-글루카네이스 및 셀로바이오하이드로레이스에 의하여 분해된 이당류를 최종 산물인 글루코스로 분해하는 역할을 하므로 효소 당화에 매우 중요한 역할을 담당한다.

현재 상업적으로 가장 많이 이용되고 있는 당화 효소는 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei)에서 생산되는 셀룰레이스이다. 이 효소는 효소 당화조건에서 안정적이고 화학적 억제인자에 대한 저항성이 큰 장점이 있으나, 베타-글루코시데이스의 활성이 낮은 단점이 있다(Brian et al, Biotechno. Bioeng. 102:1033-1044, 2009). 따라서, 셀룰로스를 글루코스로 효과적으로 분해하기 위해서는 고활성의 베타-글루코시데이스, 엔도-베타-1,4-글루카네이스 및 셀로바이오하이드로레이스를 균형 있게 생산하는 방법이 필요하다.

본 발명자들은 트리코더마 속 KMF006 균주로부터 베타-글루코시데이스, 엔도-베타-1,4-글루카네이스 및 셀로바이오하이드로레이스를 고수율로 균형 있게 생산하는 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 등록특허 제10-0614412호

본 발명의 일 목적은 트리코더마 속(Trichoderma sp.) KMF006 균주로부터 고활성 셀룰레이스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 고활성 셀룰레이스를 이용하여 바이오매스를 당화시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 배양 배지에서 트리코더마 속 KMF006 균주를 배양하는 단계; 및 수득된 배양물로부터 셀룰레이스를 회수하는 단계를 포함하는 셀룰레이스 생산 방법을 제공한다.

상기 트리코더마 속 KMF006 균주는 고활성의 셀룰레이스를 생산하는 균주이며, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2018년 3월 21일자로 기탁번호 KCTC13500BP로 기탁되었다.

본 명세서에 사용된 용어, '셀룰레이스(cellulase)'는 셀룰로스를 가수분해하는 효소의 총칭이며, '셀룰로스(cellulose)'는 글루코스가 β-1,4 글루코시드(β-1,4-glucosde) 결합으로 연결된 동종 중합체를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 셀룰레이스는 엔도-β-1,4-글루카네이스 (endo-β-1,4-glucanase), 셀로바이오하이드로레이스(cellobiohydrolase) 및 베타-글루코시데이스(β-glucosidase)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

엔도-베타-1,4-글루카네이스는 셀룰로스의 β-1,4-글루코시드 결합을 내부에서 무작위로 가수분해하는 효소이고, 일반적으로 가용성의 카르복시메틸 셀룰로스(carboxymethyl cellulose, CMC)를 기질로 사용하므로 CMC 분해효소 (CMCase)라고도 불리운다.

셀로바이오하이드로레이스는 엔도-베타-1,4-글루카네이스에 의해 가수분해된 산물의 환원 말단 및 비환원 말단을 가수분해하여 글루코스 이당체인 셀로바이오스(cellobiose)를 생성한다. 생성된 셀로바이오스는 엔도-베타-1,4-글루카네이스와 셀로바이오하이드로레이스의 활성을 억제하게 된다.

베타-글루코시데이스는 셀로바이오스를 글루코스(포도당)로 분해하므로 셀로바이오스에 의한 엔도-베타-1,4-글루카네이스와 셀로바이오하이드로레이스의 활성 억제를 제거한다. 따라서, 셀룰로스를 글루코스로 완전히 분해하기 위해서는 베타-글루코시데이스의 활성을 높이는 것이 중요하다.

본 발명의 일 구체예에서, 셀룰로스를 단당류인 글루코스로 완전히 분해하기 위해서는 상기 세 효소의 상보적 작용이 필요하다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 배양 배지는 셀룰로스, 글루코스(glucose), 락토오스(lactose), 말토오스(maltose), 셀로바이오스(cellobiose), 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨(carboxymethyl cellulose sodium salt), 자일란(xylan), 아비셀(avicel) 및 볏짚(rice straw)으로 이루어진 군에서 선택되는 탄소원; 펩톤(peptone), 효모 추출물(yeast extract), 트립톤(trypton), 효모 추출물/펩톤(1:4), 효모 추출물/트립톤(3:7), 옥수수 침지액(corn steep), 요소(urea), 질산칼륨(KN0₃), 질산나트륨(NaN0₃) 및 (NH₄)₂N0₃로 이루어진 군에서 선택되는 질소원; 및 인산이수소칼륨(KH₂PO₄), 인산수소칼륨(K₂HPO₄) 및 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)을 포함하는 배지일 수 있다. 예를 들어, 상기 배양 배지는 탄소원으로 아비셀, 질소원으로 효모 추출물 및 무기물로 인산이수소칼륨, 인산수소칼륨 및 황산마그네슘을 포함하는 배지일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 트리코더마 속 KMF006 균주를 배양하는 단계는 pH 4.5 내지 7, 온도 10℃ 내지 45℃에서 3일 내지 30일 동안 수행될 수 있다. 예를 들어 pH 5 내지 6.5의 배양 배지를 사용하여 트리코더마 속 KMF006 균주를 20℃ 내지 35℃에서 9일 내지 27일 동안 배양할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, '배양물'은 트리코더마 속 KMF006 균주를 배지에서 일정 기간 동안 배양한 결과물(배양액), 배양하여 수득한 균주 및 그의 대사물을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 배양물로부터 셀룰레이스를 회수하는 단계는 당 업계에 알려진 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 배양물을 원심분리하여 상등액을 회수하는 방법을 이용할 수 있다. 또한, 당업계에 알려진 분리기술, 예를 들어 이온 교환크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 분리, 투석, 황산 암모늄 침전, 크기 배제 크로마토그래피, 여과, 겔 전기영동 또는 구배상의 분리 또는 이들의 조합에 의하여 셀룰레이스를 회수할 수 있다. 상기 방법에 의하여 회수된 셀룰레이스는 그대로 사용되거나 또는 동결 건조 등의 방법으로 건조시켜 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 배양물로부터 회수된 셀룰레이스는 배양물에서 트리코더마 속 KMF006 균주가 제거된 배양 상층액 형태, 또는 배양물로부터 분리 정제된 셀룰레이스 형태일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 트리코더마 속 KMF006 균주 유래 셀룰레이스를 바이오매스와 접촉시키는 단계를 포함하는 바이오매스의 당화 방법을 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어, '당화(saccharification)'는 녹말, 섬유소 등과 같은 고분자량의 탄수화물을 효소 또는 산의 작용으로 가수분해하여 저분자량(단당류 또는 이당류)의 당(saccharide)으로 바꾸는 반응을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어, '바이오매스(biomass)'는 에너지원으로 사용할 수 있는 식물, 동물, 미생물 등의 모든 유기 생물체를 의미하며, 생물량, 생물체량으로 불리기도 한다. 재생 및 재활용이 가능하여 친환경적이고, 어느 곳에서나 쉽게 얻을 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 트리코더마 속 KMF006 균주 유래 셀룰레이스는 트리코더마 속 KMF006 균주의 배양물, 배양물에서 트리코더마 속 KMF006 균주가 제거된 배양 상층액, 또는 배양물로부터 분리 정제된 형태의 셀룰레이스일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 바이오매스는 초본계 바이오매스 또는 목질계 바이오매스일 수 있다.

초본계 바이오매스는 억새, 거대 억새, 수수대, 갈대, 볏짚 및 낙엽 등과 같은 초본류로부터 수득할 수 있는 바이오매스를 의미한다.

목질계 바이오매스는 지구에서 생산되는 총 바이오매스의 90% 이상을 차지하는 가장 풍부한 탄소원으로 셀룰로스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicellulose) 및 리그닌(lignin) 등의 고분자 화합물이 연속적으로 축적되어 형성된다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 접촉시키는 단계는 바이오매스 농도 1 내지 20 중량%, 셀룰레이스 농도 1 내지 70 FPU 및 당화 온도 30℃ 내지 70℃ 범위에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스 농도 2 내지 10 중량%, 셀룰레이스 농도 10 내지 70 FPU 및 당화 온도 35℃ 내지 55℃ 범위에서 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 셀룰레이스의 농도 단위인 FPU(filter paper unit)는 와트만 여과지(Whatman filter paper) 50 ㎎(1x6 ㎝)을 기질로 사용하여 셀룰레이스와 37℃에서 1시간 동안 반응(pH 5.0)시켰을 때, 와트만 여과지로부터 1분 동안 글루코스 1 μmol을 생성하는데 필요한 셀룰레이스의 양을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 트리코더마 속 KMF006 균주 유래 셀룰레이스는 엔도-베타-1,4-글루카네이스, 베타-글루코시데이스 및 셀로바이오하이드로레이스의 활성이 모두 우수하므로 바이오매스의 당화 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 트리코더마 속 KMF006 균주를 이용하면 고활성의 셀룰레이스를 생산할 수 있고, 상기 셀룰레이스를 이용하여 바이오매스를 효과적으로 당화시킬 수 있다.

도 1은 서로 다른 탄소원을 포함하는 배지에서 트리코더마 속 KMF006 균주를 배양한 후, 생산된 베타-글루코시데이스의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 서로 다른 질소원을 포함하는 배지에서 트리코더마 속 KMF006 균주를 배양한 후, 생산된 베타-글루코시데이스의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 서로 다른 온도 조건에서 트리코더마 속 KMF006 균주를 배양한 후, 생산된 베타-글루코시데이스의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 서로 다른 pH 조건에서 트리코더마 속 KMF006 균주를 배양한 후, 생산된 베타-글루코시데이스의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 셀룰레이스 생산에 영향을 미치는 주효과인자를 확인하기 위하여 탄소원, 질소원, 인산이수소칼륨(KH₂PO₄), 인산수소칼륨(K₂HPO₄) 및 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)의 농도, 배양 온도 및 배양 pH가 다른 조건에서 트리코더마 속 KMF006 균주를 배양한 후 베타-글루코시데이스 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 트리코더마 속 KMF006 균주의 셀룰레이스 생산에 가장 큰 영향을 미치는 주효과인자로 탄소원, 질소원 및 pH를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 최적 탄소원, 질소원 및 pH 조건에서 KMF006 균주를 배양한 후, 생산된 베타-글루코시데이스의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 셀룰레이스의 농도 변화에 따른 셀룰로스의 당화 정도를 측정한 결과를 나타낸다: 도 8의 A는 베타-글루코시데이스 10 FPU(filter pater unit), B는 베타-글루코시데이스 20 FPU, C는 베타-글루코시데이스 30 FPU, D는 베타-글루코시데이스 40 FPU, E는 베타-글루코시데이스 50 FPU 및 F는 베타-글루코시데이스 60 FPU에 대한 결과이다.
도 9는 당화 온도 35℃(A) 또는 50℃(B)에서 셀룰레이스 농도 변화에 따른 셀룰로스의 당화 정도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 기질의 농도 변화에 따른 당화 정도를 셀룰로스(A) 및 참나무 폭쇄재(B)에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 기질의 농도 변화에 따른 당화 정도를 소나무 폭쇄재에서 확인한 결과를 나타낸다: 도 11의 A는 폭쇄시간 13분, B는 폭쇄시간 7분 및 C는 폭쇄시간 3분인 소나무 폭쇄재의 결과이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 셀룰레이스 생산을 위한 영양원 및 배양 조건 확인

1- 1.균주 배양

트리코더마 속 KMF006 균주(이하, KMF006 균주로 기재함)를 MEA(Malt Extract Agar) 플레이트에서 5일 내지 7일 동안 배양하고, PDB(potate dextrose broth) 50 ㎖에 균사체를 접종하여 30℃에서 150 rpm으로 진탕하면서 5일 동안 전배양하였다.

본배양은 탄소원 2%, 질소원 1%와 무기물로 KH₂P0₄ 5 g/L, K₂HP0₄ 5 g/L 및 MgS0₄.7H₂0 3 g/L를 포함하는 액체배지를 사용하였다. 상기 액체배지 200 ㎖에 전배양액 5%(v/v)를 접종하고, 150 rpm으로 30℃에서 3주 내지 4주 동안 배양하면서 배양액(효소액)을 회수하였다. 이때 배양 온도는 20℃ 내지 35℃ 범위, 액체배지의 pH는 4.0 내지 7.0 범위에서 배양하였다. 회수한 배양액은 원심분리한 후, 상등액을 조효소액으로 사용하여 베타-글루코시데이스 활성을 측정하였다.

1-2. 베타- 글루코시데이스 (β- glucosidase , BGL ) 활성 측정

0.1M 아세트산 나트륨(sodium acetate, NaAC) 완충용액(pH 5.0) 0.8 ㎖에 p-니트로페닐-β-D-글리코피라노시드(p-nitrophenyl-β-D-glycopyranoside, pNPG) 0.1 ㎖과 상기 본배양액 0.1 ㎖를 첨가하여 50℃에서 15분 동안 반응시켰다. 이후 2M 탄산나트륨(Na₂CO₃) 용액 0.1 ㎖를 첨가하여 반응을 정지시키고, 405 ㎚에서 흡광도를 측정하여 생성된 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 양을 확인하였다. 효소 활성 단위인 1 unit(U)은 일정 조건에서 15분 동안 p-니트로페놀 1 μmol을 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

1-3. 탄소원에 따른 셀룰레이스 활성

배양 배지에 포함되는 탄소원에 따라 KMF006 균주가 생산하는 베타-글루코시데이스의 활성이 변하는지 확인하기 위하여 각각의 탄소원을 포함하는 배지에서 KMF006 균주를 배양하였다.

탄소원은 섬유소계 시료인 셀룰로스(cellulose; Daejung), 아비셀(Avicel; Fluka), 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨(carboxymethyl cellulose sodium salt, CMC-Na; Fluka), 셀로바이오스(cellobiose; Alfa Aesar), 글루코스(glucose; Duksan), 락토오스(lactose; Ducksan), 말토오스(maltose; Sigma) 또는 자일란(xylan; Sigma)을 사용하였다.

목질계 바이오매스는 볏짚(rice straw), 2개 수종의 목재 또는 혼합 목분을 사용하였다. 볏짚은 경상남도 거창군에서 구입하여 건조 및 분쇄한 후 사용하고, 목재는 상수리나무(Quercus acutissima)와 리기다소나무(Pinus rigida)를 사용하였다. 혼합 목분은 4종의 침엽수 공시목재(낙엽송, 리기다 소나무, 잣나무 및 소나무) 목분을 동일 비율로 혼합하여 사용하였다. 모든 목질계 바이오매스의 입자는 50 메쉬(mesh)를 통과한 시료만 사용하였다.

배지 중 탄소원에 따른 베타-글루코시데이스의 활성을 측정한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 아비셀의 경우 배양 18일차까지는 볏짚과 유사한 수준의 베타-글루코시데이스 활성을 나타내었다. 그러나 배양 21일차 이후부터 베타-글루코시데이스의 활성이 급격히 증가하여 배양 27일차에 가장 높은 효소 활성(51.34 U/㎖)을 보였다. 따라서 셀룰레이스 생산을 위한 최적 탄소원은 아비셀인 것을 확인할 수 있었다.

1-4. 질소원에 따른 셀룰레이스 활성

배양 배지에 포함되는 질소원에 따라 KMF006 균주가 생산하는 베타-글루코시데이스의 활성이 변하는지 확인하기 위하여 각각의 질소원을 포함하는 배지에서 KMF006 균주를 배양하였다.

질소원으로는 효모 추출물(yeast extract; BD), 펩톤(peptone; BD), 트립톤 (tryptone; BD), 효모 추출물/펩톤(1:4), 효모 추출물/트립톤(3:7), 옥수수 침지액(corn steep; Sigma), 요소(urea; Sigma), 질산칼륨(KN0₃; Duksan), 질산나트륨(NaN0₃; Duksan) 또는 (NH₄)₂N0₃(Junsei)을 사용하였다.

배지 중 질소원에 따른 베타-글루코시데이스 활성을 측정한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 거의 모든 질소원에서 배양 24일차까지는 베타-글루코시데이스의 활성이 증가하고, 그 이후부터 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 배양 24일차에 가장 높은 베타-글루코시데이스 활성을 보이는 질소원은 효모 추출물(81.63 U/㎖)이었으며, 다른 질소원과 비교하여 배양 15일차 이후에 베타-글루코시데이스 활성이 급격히 증가하는 것을 알 수 있었다. 따라서 셀룰레이스 생산을 위한 최적 질소원은 효모 추출물인 것을 확인할 수 있었다.

도 1 및 도 2의 결과를 비교하면, 베타-글루코시데이스의 최고 활성이 나타나는 배양 시기가 탄소원에서는 배양 27일차, 질소원에서는 배양 24일차로 나타나 서로 상이한 것을 알 수 있었다. 그러나 탄소원 종류에 따른 결과에서 배양 24일차와 27일차 사이의 효소 활성 변화폭이 작으므로 배양 기간 단축 효과가 있는 24일을 최적 배양 기간으로 선정하였다.

1-5. 배양 온도에 따른 셀룰레이스 활성

KMF006 균주의 배양 온도에 따른 베타-글루코시데이스의 활성을 측정한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 모든 온도 조건에서 배양 24일차까지 베타-글루코시데이스 활성이 증가하다가 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 배양 온도가 낮을수록 활성은 감소하였으며, 30℃에서 배양한 경우 활성이 가장 높았으므로 최적 배양 온도를 30℃로 선정하였다.

1-6. 배양 pH에 따른 셀룰레이스 활성

KMF006 균주의 배양 pH에 따른 베타-글루코시데이스의 활성을 측정한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 pH 5.5(아세트산 나트륨 완충용액)에서 156.12 U/㎖로 활성이 가장 높게 나타났다. 또한, pH 4.5 내지 5.5 범위에서 pH가 증가함에 따라 베타-글루코시데이스 활성이 급격히 증가하였고, pH 5.5 내지 6.5 범위에서는 활성이 감소하였으며, pH 6.5 이후로 활성이 급격히 감소하는 것을 알 수 있었다. 따라서 최적 pH를 유지하기 위한 완충용액으로 pH 5.5인 아세트산 나트륨 완충용액을 선정하였다.

실시예 2: 셀룰레이스 생산을 위한 주효과 인자 및 농도 확인

KMF006 균주의 배양 조건 중에서 셀룰레이스 생산에 현저한 영향을 미치는 주효과 인자를 Plackett-Burman법으로 확인하였다(Vanaja&Shobha Rani, Clin. Res. Regul. Aff. 24: 1-23, 2007). 범위에 따른 각 인자의 기울기가 클수록 KMF006 균주의 균체 생장에 많은 영향을 미치는 것을 의미한다.

2-1. 균주 배양

KMF006 균주를 MEA 플레이트에서 5일 내지 7일 동안 배양하고, PDB 50 ㎖에 균사체를 접종하여 30℃에서 150 rpm으로 진탕하면서 5일 동안 전배양하였다.

본배양은 하기 표 1에 기재된 조건으로 액체배지를 제조하여 수행하였다. 제조된 액체배지에 전배양액 5%(w/v)를 접종하고, 150 rpm으로 30℃에서 약 4주 동안 배양하였다. 배양이 진행되는 동안 매일 배양액 500 ㎕를 회수하여 셀룰레이스 활성 측정에 이용하였다.

영양원		인자 수준 (levels of factor)
영양원		-	0	+
1	아비셀 (g/L)	10	20	30
2	효모 추출물 (g/L)	5	10	15
3	K₂HP0₄ (g/L)	2.5	5	7.5
4	KH₂P0₄ (g/L)	2.5	5	7.5
5	MgS0₄ (g/L)	2	3	4
6	온도 (℃)	28	30	32
7	pH	5.0	5.5	6.0

2-2. 셀룰레이스 활성 측정

셀룰레이스 활성 측정은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 7종의 인자 중에서 아비셀, 효모 추출물 및 pH의 기울기가 다른 인자(KH₂P0₄, K₂HP0₄, MgS0₄ 및 온도)와 비교하여 현저히 가파른 것을 확인할 수 있었다.

아비셀의 경우, 농도가 10 g/L에서 30 g/L로 증가할수록 베타-글루코시데이스의 활성이 증가하였다. 반면, 효모 추출물은 농도가 5 g/L에서 15 g/L로 증가할수록 베타-글루코시데이스 활성이 감소하였으며, pH의 경우 pH 5.0에서 6.0으로 증가할수록 활성이 증가하는 경향을 나타내었다.

본 실험을 통하여 상기 세 인자가 KMF006 균주의 셀룰레이스 생산에 가장 큰 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었으며, 세 인자의 적정 농도 도출이 필요함을 알 수 있었다.

2-3. 주효과인자의 최적 농도 확인

KMF006 균주의 셀룰레이스 생산에 가장 큰 영향을 미치는 아비셀, 효모 추출물 및 pH의 적정 농도 범위를 하기와 같이 확인하였다.

실시예 2-1과 동일한 방법으로 KMF006 균주를 전배양하고, 액체배지에 전배양액 5%(w/v)를 접종하여 본배양을 수행하였다. 본배양에 사용한 액체배지는 하기 표 2에 기재된 조성으로 사용하고, 무기물은 실시예 1-1과 동일한 농도로 이용하였다. 본배양을 150 rpm으로 약 4주 동안 수행하고, 배양이 진행되는 동안 매일 배양액 500 ㎕를 회수하여 셀룰레이스 활성 측정에 이용하였다.

영양원		인자 수준 (levels of factor)
영양원		-	0	+
1	아비셀 (g/L)	10	20	30
2	효모 추출물 (g/L)	5	10	15
3	pH	5.0	5.5	6.0

베타-글루코시데이스 활성을 실시예 1-2와 동일한 방법으로 측정한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 아비셀 30 g/L, 효모 추출물 14.8971 g/L 및 pH 6.0인 조건에서 최대 효소 활성(216.0355 U/㎖)을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

곡면적 변화를 확인하기 위해서는 최종적으로 2종의 주효과 인자를 선별해야 한다. 도 6에서 pH는 그래프의 기울기가 완만하며, 이는 탄소원과 질소원이 효소 활성에 미치는 영향력이 상대적으로 크다는 것을 의미한다. 따라서, 주효과도가 상대적으로 낮은 pH를 pH 6.0으로 고정하고, 탄소원과 질소원 사이의 곡면적 변화를 분석하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 아비셀 30 g/L 및 효모 추출물 14.8971 g/L 농도인 경우 최대 효소 활성(216.0355 U/㎖)이 나타나 도 8과 동일한 결과를 확인할 수 있었다.

따라서, KMF006 균주로부터 고활성의 셀룰레이스를 생산하기 위한 최적 배양 조건은 아비셀 30 g/L, 효모 추출물 15 g/L 및 pH 6.0 조건임을 확인할 수 있었다.

2-4. 최적 배양 조건에서 생산한 셀룰레이스의 활성 측정

실시예 2-3에서 확인한 최적 배양 조건으로 KMF006 균주를 배양하고, 배양액을 회수하여 셀룰레이스 활성을 측정하였다. 베타-글루코시데이스 활성은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 측정하고, 엔도-베타-1,4-글루카네이스(endo-β-1,4-glucanase, EG)와 셀로바이오하이드로레이스(cellobiohydrolase, CBH)의 활성은 하기와 같이 측정하였다.

엔도-베타-1,4- 글루카네이스 활성

0.1M 아세트산 나트륨 완충용액(pH 5.0)에 카르복시메틸셀룰로스 나트륨을 2%(v/v) 농도로 용해시켜 효소 반응액을 제조하였다. 효소 반응액 45 ㎕에 배양액 5 ㎕를 첨가하여 50℃에서 30분 동안 반응시키고, 구리 용액 50 ㎕를 첨가한 후 100℃에서 10분 동안 가열하여 반응을 정지시켰다. 생성된 환원당의 양은 Somogyi-Nelson 방법으로 측정하였다(최신 실험 미생물학, p253, 2001). 효소 활성의 단위인 1 unit(U)은 일정 조건에서 30분 동안 글루코스(glucose) 1 μmol을 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

셀로바이오하이드로레이스 활성

0.1M 아세트산 나트륨 완충용액(pH 5.0) 0.8 ㎖에 p-니트로페닐-β-D-셀로바이오시드(p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, pNPC) 0.1 ㎖과 배양액 0.1 ㎖를 첨가하여 50℃에서 15분 동안 반응시켰다. 이후 2M 탄산나트륨 용액 0.1 ㎖를 첨가하여 반응을 정지시키고, 405 ㎚에서 흡광도를 측정하여 생성된 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 양을 확인하였다. 효소 활성 단위인 1 unit(U)은 일정 조건에서 15분 동안 p-니트로페놀 1 μmol을 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

측정 결과

셀룰레이스 활성 측정 결과를 표 3에 기재하였다. 최적 배양 조건 적용 전과 비교하여 베타-글루코시데이스의 활성은 약 62배 증가하고, 엔도- 베타-1,4-글루카네이스 활성은 약 6배 정도 증가하였다. 또한, 셀로바이오하이드로레이스의 활성은 약 7.5배 증가한 것을 알 수 있었다. 최적 조건 적용 전의 KMF006 균주는 셀룰로스 2.0%(w/v), 효모 추출물/펩톤(1:4), KH₂PO₄ 0.5%(w/v), K₂HPO₄ 0.5%(w/v), MgSO₄ㆍ7H₂O 0.3%(w/v)를 포함하는 배지(pH 5.0)를 사용하여 25℃에서 24일 동안 배양하였다.

	최적 조건	효소 활성 (U/㎖)
	최적 조건	베타-글루코시데이스	엔도-베타-1,4-글루카네이스	셀로바이오 하이드로레이스
KMF006 균주	적용 전	3.50±O.22	33.80±O.24	1.20±O.25
KMF006 균주	적용 후: 아비셀+효모 추출물	216.04±10.94	202.13±7.85	8.9±0.34

실시예 3: KMF006 균주 유래 셀룰레이스에 의한 바이오매스의 당화 확인

3-1. 셀룰레이스 농도 및 당화 온도

기질인 바이오매스는 셀룰로스(DAEJUNG, 20 내지 100 micron)를 사용하고, 기질 농도는 5%로 선정하여 최적 당화 조건을 탐색하였다. 효소는 KMF006 균주가 생산하는 베타-글루코시데이스를 10 내지 60 FPU(filter paper unit) 범위에서 10 FPU 단위로 사용하고, 당화 온도는 35℃ 내지 65℃ 범위에서 5℃ 단위로 실험하였다.

그 결과, 도 8의 그래프에 나타난 바와 같이 당화 온도 50℃까지는 전반적으로 당화율이 증가하다가 50℃ 이후로 당화율이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 당화 온도 50℃를 기준으로, 베타-글루코시데이스 농도 10 내지 60 FPU 범위에서 당화율은 각각 75.46%, 81.34%, 85.75%, 94.07%, 96.91% 및 89.18%로 나타났다. 도 8의 그래프에서 세로축에 기재된 환원당(%, g, glucan)은 당화 반응에 투입된 글루칸의 중량 대비 생성된 글루코스의 양을 중량 백분율로 표시한 것을 의미하며, 당화율을 나타낸다.

또한, 당화 온도 35℃ 및 50℃에서 효소 농도에 따른 당화율을 비교하였다. 그 결과, 도 9의 A(35℃) 및 B(50℃)에 나타난 바와 같이 당화 온도 50℃ 및 효소 투입량 50 FPU에서 당화율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

3-2. 목질계 바이오매스의 당화 확인

상기 실시예 5-1에서 확인한 당화 조건(당화 온도 50℃, 셀룰레이스 농도 50 FPU)에서 목질계 바이오매스에 대한 당화 실험을 수행하였다.

기질인 목질계 바이오매스는 참나무 폭쇄재(25kgf/㎝², 폭쇄시간 5분)와 소나무 폭쇄재(25kgf/㎝², 폭쇄시간 3, 7, 13분)를 사용하고, 비교기질은 셀룰로스(20 내지 100 micron)를 사용하였다. 셀룰레이스는 대조군으로 상용 효소인 Cellic^® CTec2(Novozyme)를 사용하고, KMF006 균주가 생산하는 셀룰레이스를 사용하였다.

기질 농도(%)에 따른 당화율을 확인한 결과, 도 10의 A(셀룰로스) 및 B(참나무 폭쇄재)에 나타난 바와 같이 대조군은 기질 농도 9%에서 가장 높은 당화율을 나타내나, KMF006 균주 유래 셀룰레이스는 기질 농도 7%에서 가장 우수한 당화율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 모든 기질 농도에서 대조군보다 KMF006 균주 유래 셀룰레이스의 당화율이 우수한 것을 알 수 있었다.

소나무 폭쇄재의 농도에 따른 당화율을 확인한 결과, 도 11의 A(폭쇄시간 13분), B(폭쇄시간 7분) 및 C(폭쇄시간 3분)에 나타난 바와 같이 모든 경우 대조군보다 KMF006 균주 유래 셀룰레이스의 당화율이 현저히 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 기질 농도가 3%로 낮은 경우 대조군은 환원당을 거의 생성하지 못하지만, KMF006 균주 유래 셀룰레이스는 당화율이 우수한 것을 알 수 있다. 소나무 폭쇄재는 리그닌 함량이 높은 것으로 알려져 있으며, KMF006 균주 유래 셀룰레이스는 소나무 폭쇄재에서 85.55%(기질 농도 7%)의 높은 당화율을 나타내므로 목질계 바이오매스의 당화에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 결과를 통하여 KMF006 균주 유래 셀룰레이스는 당화 온도 50℃, 효소 농도 50 FPU 및 기질 농도 7% 조건에서 당화율이 현저히 우수한 것을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC13500BP

20180321

Claims

⒜ 배양 배지에서 트리코더마 속(Trichoderma sp.) KMF006 균주(기탁번호 KCTC13500BP)를 배양하는 단계; 및
⒝ 수득된 배양물로부터 셀룰레이스를 회수하는 단계를 포함하는 셀룰레이스 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양 배지는 셀룰로스(cellulose), 글루코스(glucose), 락토오스(lactose), 말토오스(maltose), 셀로바이오스(cellobiose), 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨(carboxymethyl cellulose sodium salt), 자일란(xylan), 아비셀(avicel) 및 볏짚으로 이루어진 군에서 선택되는 탄소원;
펩톤(peptone), 효모 추출물(yeast extract), 트립톤(trypton), 효모 추출물/펩톤(1:4), 효모 추출물/트립톤(3:7), 옥수수 침지액(corn steep), 요소(urea), 질산칼륨(KN0₃), 질산나트륨(NaN0₃) 및 (NH₄)₂N0₃로 이루어진 군에서 선택되는 질소원; 및
인산이수소칼륨(KH₂PO₄), 인산수소칼륨(K₂HPO₄) 및 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)을 포함하는 것인 셀룰레이스 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 트리코더마 속 KMF006 균주를 배양하는 단계는 pH 4.5 내지 7 및 배양 온도 10℃ 내지 45℃에서 3일 내지 30일 동안 수행되는 것인 셀룰레이스 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 셀룰레이스는 엔도-베타-1,4-글루카네이스(endo-β-1,4-glucanase), 베타-글루코시데이스(β-glucosidase) 및 셀로바이오하이드로레이스(cellobiohydrolase)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 셀룰레이스 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 셀룰레이스는 배양물에서 트리코더마 속 KMF006 균주가 제거된 배양 상층액 또는 배양물로부터 분리 정제된 셀룰레이스 형태인 것인 셀룰레이스 생산 방법.
트리코더마 속 KMF006 균주 유래 셀룰레이스를 바이오매스와 접촉시키는 단계를 포함하는 바이오매스의 당화 방법.
제6항에 있어서, 상기 셀룰레이스는 트리코더마 속 KMF006 균주의 배양물, 배양물에서 트리코더마 속 KMF006 균주가 제거된 배양 상층액 또는 배양물로부터 분리 정제된 형태인 것인 당화 방법.
제6항에 있어서, 상기 바이오매스는 초본계 바이오매스 또는 목질계 바이오매스인 것인 당화 방법.
제6항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 바이오매스 농도 1 내지 20 중량%, 셀룰레이스 농도 1 내지 70 FPU(filter paper unit) 및 온도 30℃ 내지 70℃에서 수행되는 것인 당화 방법.