KR100614412B1 - 다양한 섬유소분해효소를 생산하는 신규한 사상균트리코데르마 인하마텀 케이에스제이1 및 이를 이용한경제적인 효소생산방법 - Google Patents

다양한 섬유소분해효소를 생산하는 신규한 사상균트리코데르마 인하마텀 케이에스제이1 및 이를 이용한경제적인 효소생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다양한 섬유소분해효소를 생산하는 신규한 사상균 트리코데르마 인하마텀 KSJ1(Trichoderma inhamatum KSJ1 ; KFCC 11349P) 및 이를 이용한 경제적인 효소생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 셀룰라아제, 자일란아제, 아밀라아제, 펙틴아제 등을 동시에 생산하는 신규한 사상균인 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주(Trichoderma inhamatum KSJ1)와 이 균주를 이용한 경제적인 효소생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 의해, 상업용섬유소 및 섬유소폐기물을 탄소원으로 이용하여 셀룰라아제, 자일란아제, 아밀라아제, 펙틴아제 등 다양한 섬유소분해효소를 생산할 수 있는 신규한 사상균인 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주가 제공되며, 탄소원의 선택에 따라 원하는 특정 섬유소분해효소를 더 효과적으로 생산할 수 있는 경제적인 효소생산방법이 제공된다.
트리코데르마, 섬유소분해효소, 셀룰라아제, 자일란아제, 아밀라아제

Description

다양한 섬유소분해효소를 생산하는 신규한 사상균 트리코데르마 인하마텀 케이에스제이1 및 이를 이용한 경제적인 효소생산방법{NEW FILAMENTOUS TRICHODERMA INHAMATUM KSJ1 PRODUCING VARIOUS LIGNOCELLULOLYTIC ENZYME, AND ECONOMICAL ENZYME PRODUCING METHOD USING THAT}
도 1은 본 발명의 KSJ1 균주의 전자현미경 관찰을 통한 형태학적 사진
도 2는 본 발명의 KSJ1 균주의 계통도
도 3은 본 발명의 KSJ1 균주의 배양시간에 따른 건조균체량, 건조기질량, 씨엠씨, pH 및 생산된 섬유소분해효소의 활성변화를 나타내는 그래프
본 발명은 다양한 섬유소분해효소를 생산하는 신규한 사상균 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 및 이를 이용한 경제적인 효소생산방법에 관한 것이다.
자연계에 다량으로 존재하는 섬유소는 크게 셀룰로오스, 아밀로오스, 헤미셀룰로오스로 분류할 수 있으며, 이들을 유용화학물질, 식량 및 에너지로 재활용하기 위해 세계적으로 활발한 연구를 진행해 왔다.
그러나, 섬유소는 화학적 및 생물학적 가수분해에 매우 저항성이 큰 비수용성의 경고한 구조를 지닌 화합물이기 때문에 극히 일부만이 유효하게 이용되고 있으며, 대부분은 폐기물로서 환경오염원으로 작용한다.
바이오매스 유래의 폐섬유소를 효율적으로 이용하기 위해 해결되어야 할 기술은 먼저, 셀룰로오스나 전분계의 고분자 섬유소의 가수분해에는 다양한 효소군의 공동작용이 필요하기 때문에 다양한 효소들을 많이 균형적으로 동시생산이 가능한 균주를 확보해야 하며, 또한 섬유소의 가수분해공정에서 비용의 60 %를 차지하는 효소군의 생산단가를 낮추는 기술을 개발하여야 한다.
섬유소분해효소를 생산하는 곰팡이로서는 트리코데르마 비리드(Trichoderma viride), 트리코데르마 리세이(T. reesei), 페니실리움 푸니클로섬(Penicillium funiculosum), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 등이 있으며, 이들은 비교적 효소생산성이 높아 산업현장에서 부분적으로 이용되고 있다.
그러나, 이들 균주들은 단일효소 사용목적에 최적화된 단일 효소생산에 이용되어지고 있으며, 셀룰라아제, 자일란아제, 아밀라아제 등의 다양한 섬유소분해효소의 동시생산에 대한 최적화기술은 미약한 실정이다.
현재, 가장 문제가 되고 있는 음식물쓰레기는 복합 폐섬유소로 구성된 자원이다. 이 폐자원을 고부가화로 전환하기 위해 가수분해하기 위해서는 다양한 가수분해효소들의 효율적 동시생산이 가능해야 한다.
또한, 섬유소분해효소의 생산단가를 낮추기 위해서는 먼저 생산배지의 대체 가 필요하다.
생산배지의 탄소원을 연구분야에서 이용되고 있는 상대적으로 고가인 정제된 섬유소를 탄소원으로 이용하면 효소 생산성은 좋지만 생산단가가 높아져 비경제적인 문제가 있었다.
본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해, 셀룰라아제, 자일란아제, 아밀라아제 등의 효소를 효율적으로 동시생산할 수 있는 신규한 사상균 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주(Trichoderma inhamatum KSJ1 ; KFCC 11349P)를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상업용섬유소 및 섬유소폐기물을 탄소원으로 이용하여, 원하는 특정 섬유소분해효소를 더 효과적으로 생산할 수 있는 경제적인 효소생산방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 다양한 섬유소분해효소를 생산하는 신규한 사상균 트리코데르마 인하마텀 KSJ1(Trichoderma inhamatum KSJ1) 및 이를 이용한 경제적인 효소생산방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 셀룰라아제, 자일란아제, 아밀라아제, 펙틴아제 등을 동시에 생산하는 신규한 사상균인 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주((Trichoderma inhamatum KSJ1 ; KFCC 11349P)에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주는 상업용섬유소 및 섬유소폐기물을 탄소원으로 이용하여 셀룰라아제, 자일란아제, 아밀라아제, 펙틴아제 등 다양한 섬유소분해효소를 생산하며, 탄소원의 선택에 따라 원하는 특정 섬유소분해효소를 더 효과적으로 생산할 수 있어 경제적인 효소생산을 할 수 있다.
본 발명의 KSJ1 균주는 전자현미경을 통한 형태학적 관찰에 의하면 균사(hyphae)는 무색 투명한 격막(septum)이 존재하고, 이들 직경은 3 ~ 5 ㎛ 이다(도 1).
ITS rDNA 유전자의 염기서열은 서열목록의 서열번호 1과 같고, 염기서열의 크기는 597 bp였으며, 트리코데르마 인하마텀과의 97.97 %의 유사성이 있는 균주로 동정되었고(표 4), 계통학적 분석에서도 트리코데르마 인하마텀과 매우 근접하게 위치하였다.
따라서, 본 발명의 분리균주를 트리코데르마 인하마텀 KSJ1(Trichoderma inhamatum KSJ1)으로 명명하고, 사단법인 한국종균협회 한국미생물보존센터에 2005년 3 월 16 일자에 기탁하였다(기탁번호 : KFCC 11349P).
본 발명의 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주의 효소생산 최적온도는 25 ~ 30 ℃이고, 효소생산의 최적 pH는 6.0 ~ 7.0 이다.
또한, KSJ1 균주의 균체성장, 기질이용 및 효소생산성을 종합적으로 살펴보면, 균체성장에 따라 배양액내의 씨엠씨는 환원당으로 전환되어지고, 생성되어진 환원당을 이용하여 급격한 균체성장 및 축적이 이루어진다.
트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주의 효소생산은 첫번째 단계에서 에너지 신진대사에 의해 최대 균체성장 및 축적이 이루어지고, 그 다음 단계에서 2차 대사산물로서 효소가 유도됨을 확인하였다.
이는 분해되기 쉬운 용해성 기질인 씨엠씨의 가수분해를 통해 균체성장에 필요한 탄소원 및 에너지원을 획득하고, 균체의 유지대사를 위해 상대적으로 가수분해 되기 힘든 아비셀의 분해를 위해 보다 강력한 섬유소분해효소를 생산하는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 KSJ1 균주의 효소생산에 관한 기질특이성은 다음과 같다.
알파셀룰로오스(α-Cellulose), 아비셀, 씨엠씨, 자일란(birchwood 및 oat spelt 기원) 등의 상업용 섬유소와, 볏짚, 폐지, 톱밥 등의 섬유소폐기물을 기질로 하여 효소활성을 조사한 바, 사용되어진 모든 기질에서 균체성장은 이루어졌으나, 각각의 기질에 따라 다른 효소활성을 타나내었다.
KSJ1 균주의 섬유소분해효소 생산은 용해성(CMC) 보다는 비용해성 물질(알파셀룰로오스, 아비셀)에서, 헤미셀룰로오스 보다는 셀룰로오스 물질에서, 순수물질(상업용섬유소) 보다는 복합기질(섬유소폐기물)에서 높은 효소 활성을 보여주었다. 또한, 볏짚에서 높은 효소 활성이 나타났다.
또한, 섬유소폐기물을 이용하여 경제적인 효소를 생산하는 방법에 대해 연구한 결과, 볏짚과 폐지를 함께 혼합하여 농도를 1 ~ 2 %(w/v) 로 사용할때 효소활성이 높다는 것을 알 게 되었다.
한편, 본 발명의 KSJ1 균주를 이용하여 셀룰라아제, 자일란아제, 아밀라아 제, 펙틴아제 등 다양한 섬유소분해효소를 경제적으로 생산하기 위해 상업용섬유소(알파셀룰로오스, CMC, 아비셀, 자일란 등) 및 섬유소폐기물(볏짚, 폐지, 톱밥 등)을 이용하는데, 탄소원의 특성에 따라 다양한 효소가 유도된다.
즉, 상업용 섬유소는 셀룰라아제의 높은 효소활성을 나타내고, 섬유소폐기물은 아밀라아제의 높은 효소활성을 나타낸다는 사실을 알 수 있었다.
이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 신규한 섬유소분해효소 생산균주의 분리
본 발명의 섬유소분해효소 생산균주를 분리하기 위해 균주분리원은 제주도 천지연폭포 부근의 형태를 알 수 없을 정도로 썩은 나무를 이용하였다.
분리배지는 맨델스(Mandels)배지의 아비셀(Avicel)과 씨엠씨(CMC) 대신에 톱밥 10 g/L을 첨가하여 사용하였다.
상기의 맨델스 배지의 조성은 아래의 표 1과 같다.
시료 50 g에 멸균수 200 ㎖를 넣고 현탁시켜 30 분간 방치한 다음, 상등액을 희석하여 분리배지에 도말하였다.
위의 배지를 30 ℃에서 배양하였고, 시간경과에 따른 균주 성장형태를 관찰하면서, 계대배양을 통해 균주의 활성유지 및 순수분리를 수행하였다.
분리균주들은 YMEA/B 배지에 30 ℃에서 3 일간 성장시킨 후, 4 ℃에서 보관하였다.
상기의 YMEA/B 배지의 조성은 아래의 표 2와 같다.
이들 균주들을 YMEA/B 배지에 3 일 배양하여 성장속도를 살펴보았고, 또한 맨델스 배지에 접종하여 30 ℃, 100 rpm 으로 5 일간 배양 후 효소활성도를 분석하였다.
위의 결과를 통해 최종적으로 섬유소분해효소의 생산균주를 선별하였다.
썩은 나무에서 6 종의 곰팡이를 분리하였으며, 이 중 가장높은 효소활성을 보여주는 균주를 분류하여, 효소 생산자로 널리 알려진 트리코데르마 리세이(KCTC6952)의 효소활성을 비교한 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.
즉, 표 3에서 보는 바와 같이 본원발명에서 분리한 균주가 효소생산의 배양시간에서 매우 유리함을 알 수 있었다.
<표 1> 맨델스(Mandels) 배지의 조성
조성물질 조성액 미량원소용액 황산철(FeSO4·7H2O) 5.0 g 황산망간(MnSO4·7H2O) 1.6 g 황산아연(ZnSO4·7H2O) 1.4 g 염화코발트Ⅱ(CoCl2) 2.0 g 증류수 100 ㎖
아비셀(Avicel) 5.0 g
CMC(결정섬유소) 5.0 g
펩톤(Pepton) 1.0 g
요소(Urea) 0.3 g
염화칼슘(CaCl2) 0.3 g
인산칼륨(KH2PO4) 2.0 g
황산암모늄((NH4)2SO4) 1.4 g
황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 0.3 g
미량원소용액 1.0 ㎖
증류수 1.0 ℓ
<표 2> YMEA/B 배지의 조성
조성물질 조성액
효모추출액(Yeast extract) 4.0 g
맥아추출액(Malt extract) 10.0 g
글루코스(Glucose) 4.0 g
한천(Agar) 15.0 g
증류수 1.0 ℓ
<표 3> 본발명의 실시예 1의 균주와 트리코마 리세이의 효소생산성 비교결과
균 주 배양시간(일) 효소활성도(U/㎖)
씨엠씨아제 베타글루코시다아제 자일란아제
실시예 1의 분리균주 5 11.38 0.64 16.21
트리코데르마 리세이 (KCTC6952) 7 8.59 0.48 9.85
* 균주배양은 맨델스 배지에서 같은 방법으로 수행하였음.
<실시예 2> 신규한 섬유소분해효소 생산균주 KSJ1의 동정
본발명의 실시예 1에서 분리한 균주를 준비하였다.
분리균주의 동정을 위해 형태학적 관찰 및 아이티에스(ITS, International transcribed spacer) rDNA 유전자의 염기서열 분석을 다음과 같이 수행하였다.
준비한 균주의 서열배열을 조사하고, 타 균주와의 유사성을 비교하여 표 4에 나타내었고, 최종적으로 계통학적 거리(evolutionary distance)를 계산하여, 계통도(phylogenetic tree)를 작성하여 도 2에 나타내었다.
형태학적 관찰은 YMEA 배지에서 성장시킨 균주를 육안으로 균체의 성장속도, 집락형태, 배면의 색깔 등을 살펴보았다.
전자현미경(Scanning electron microscope ; JSM-5400, JEOL Co., Japan) 관찰을 통해서는 격벽의 존재, 균사체의 직경, 분생자 및 분생자경의 형태 등을 살펴 보았다.
본발명의 실시예 1의 분리균주는 YMEA 배지에서 30 ℃에서 3 일 동안에 90 ㎜의 배양접시를 다 덮을 만큼 신속히 성장하였고, 집락의 배지 표면은 녹색으로 낮고 넓게 형성하였다. 또한, 밝고 흐릿한 황록색 분생자(conidia)를 가진 흰색 균사체(mycelium)를 형성하였고, 집락의 배면색은 옅은 황색을 타나내었다.
전자현미경을 통한 형태학적 관찰에 의하면 균사(hyphae)는 무색 투명한 격막(septum)이 존재하였고, 이들 직경은 3 ~ 5 ㎛ 이었다(도 1).
ITS rDNA 유전자의 염기서열은 서열목록에 나타내었다(서열번호 1).
시퀀스의 크기는 597 bp였으며, 트리코데르마 인하마텀과의 97.97 %의 유사성이 있는 균주로 동정되었고(표 4), 계통분류학적 분석에서도 트리코데르마 인하마텀과 매우 근접하게 위치하였다.
본발명의 실시예 1의 분리균주를 트리코데르마 인하마텀 KSJ1(Trichoderma inhamatum KSJ1)으로 명명하고, 사단법인 한국종균협회 한국미생물보존센터에 2005년 3 월 16 일자에 기탁하였다(기탁번호 : KFCC 11349P).
<표 4> 본발명의 분리균주 KSJ1 균주의 유전정보와 타균주와의 유사성 분석결과
Strains Accession No. 유사성(%)
Trichoderma inhamatum CBS 273.78 TH27378RR 97.97
Trichoderma harzianum CBS 226-95 AF057606 97.40
Trichoderma virens AF222865 AF222865 96.76
Trichoderma longibrachiatum CBS 816.68 TLITSRR7 94.85
<실험예 1> 신규한 사상균 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주의 효소생산에 대한 특성 실험
1. 실험에 사용된 분석방법
1) 셀룰라아제
① 씨엠씨아제(CMCase) 활성도 : 2 %(w/v)의 CMC(Carboxymethyl cellulose ; 결정섬유소) 용액 0.5 ㎖에 50 mM 구연산(citric acid) 완충용액(pH 4.8)으로 희석되어진 효소액 0.5 ㎖을 혼합한 반응물을, 50 ℃에서 30 분간 반응시켜 생성된 환원당을 디엔에스(DNS) 방법으로 정량하여 측정하였다.
효소활성도는 표준반응조건에서 1 Чmol·min-1의 글루코스에 상응하는 환원당을 생성하는데 필요한 효소량을 1 U(Unit)로 정의하였다.
② 베타글루코시다아제(β-glucosidase) 활성도 : 0.1 M 아서트산나트륨(sodium acetate) 완충용액(pH 4.8) 0.8 ㎖과 5 mM ρ-니트로페닐(nitrophenyl)-β-D-글루코스 용액 1 ㎖에 위의 완충용액으로 희석되어진 효소액 0.2 ㎖을 혼합하여, 50 ℃에서 30 분간 반응시킨 후 0.4 M 글리신 완충용액(pH 10.8) 4 ㎖를 넣어 반응을 종결시키고, 효소반응에서 생성된 파라니트로페놀(ρ-nitrophenol)을 430 nm(UV spectrophotometer ; TU1800PC, Human Co., Korea)에서 정량하여 측정하였다.
1 U는 위의 반응조건에서 1 Чmol·min-1의 파라니트로페놀을 생성하는데 필요한 효소량으로 정의하였다.
③ 아비셀라아제(Avicelase) 활성도 : 1 %(w/v)의 아비셀(Avicel) 용액 1 ㎖ 와 50 mM 구연산 완충용액(pH 4.8)으로 희석되어진 효소액 1 ㎖을 혼합한 반응물을, 50 ℃에서 120 분간 반응시켜 소모기-넬슨(Somogyi-Nelson) 방법으로 환원당을 정량하여 측정하였다.
효소활성도는 표준반응조건에서 1 Чmol·min-1의 셀로바이오스(cellobiose)에 상응하는 환원당을 생성하는데 필요한 효소량을 1 U로 정의하였다.
④ 에프피아제(FPase) 활성도 : 여과지의 가수분해 능력으로 나타내었는데, 이는 셀룰라아제의 효소활성을 대표한다. 50 ㎎(1 ×6 ㎝)의 여과지(Watman no.1)를 50 mM 구연산 완충용액(pH 4.8)으로 희석되어진 배양 상등액 1.0 ㎖와 혼합하여, 50 ℃에서 60 분간 반응시켜 생성된 환원당을 다엔에스 방법으로 정량하여 측정하였다.
효소활성도는 표준 반응조건에서 1 Чmol·min-1의 글루코스에 상응하는 환원당을 생성하는데 필요한 효소량을 1 U로 정의하였다.
2) 아밀라아제
① 알파아밀라아제(α-amylase) 활성도 : 2 %(w/v)의 용해성 전분(soluble starch)용액 0.8 ㎖에 50 mM 구연산 완충용액(pH 4.8)으로 희석되어진 효소액 0.2 ㎖을 혼합한 반응물을, 50 ℃에서 30 분간 반응시켜 생성된 환원당을 디엔에스 방법으로 정량하여 측정하였다.
효소활성도는 표준반응조건에서 1 Чmol·min-1의 말토오스에 상응하는 환원당을 생성하는데 필요한 효소량을 1 U로 정의하였다.
② 베타아밀라아제(β-amylase) 활성도 : 2 %(w/v)의 용해성 전분(soluble starch)용액 0.8 ㎖에 50 mM 구연산 완충용액(pH 4.8)으로 희석되어진 효소액 0.2 ㎖을 혼합한 반응물을, 50 ℃에서 30 분간 반응시켜 생성된 글루코스를 글루코스 분석키트(glucose assay kit ; Young Dong, Korea)로 정량하여 측정하였다.
효소활성도는 표준반응조건에서 1 Чmol·min-1의 글루코스를 생성하는데 필요한 효소량을 1 U로 정의하였다.
③ 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성도 : 2 %(w/v)의 말토오스 용액 0.8 ㎖에 50 mM 구연산 완충용액(pH 4.8)으로 희석되어진 효소액 0.2 ㎖을 혼합한 반응물을, 50 ℃에서 30 분간 반응시켜 생성된 글루코스를 글루코스 분석키트로 정량하여 계산하였다.
효소활성도는 표준반응조건에서 1 Чmol·min-1의 글루코스를 생성하는데 필요한 효소량을 1 U로 정의하였다.
3) 자일란아제
① 자일란아제 활성도 : 2 %(w/v)의 자일란(oat spelt, Sigma Co., U.S.A.)용액 0.5 ㎖에 50 mM 구연산 완충용액(pH 4.8)으로 희석되어진 효소액 0.5 ㎖을 혼합한 반응물을, 50 ℃에서 30 분간 반응시켜 생성된 환원당을 디엔에스 방법으로 정량하여 측정하였다.
효소활성도는 표준반응조건에서 1 Чmol·min-1의 자일로스에 상응하는 환원당을 생성하는데 필요한 효소량을 1 U로 정의하였다.
4) 균체량, 기질랭 및 씨엠씨(CMC)량
① 균체량(dry cell weight)은 배양액내의 균체를 초음파 파쇄기(VC70, Sonics & Materials INC., U.S.A.)로 세포벽을 파쇄하여 단백질 농도를 측정하여 검량선 [균체농도(g/L) = 3.91 × 흡광도(Absorbance) + 0.06, R2:0.98]을 이용하여 결정하였다. 검량선 작성은 다음과 같다.
YMEB 배지(표 1)에서 균체를 5 일간 배양하였고, 배양액을 2 번의 원심분리(10,000 rpm, 10 min)와 증류수를 이용한 수세를 통하여 균체만을 수집하였다.
수집된 균체는 습윤량으로 정확히 측량하여 2 개씩 준비하였고, 일정량의 증류수를 넣어 재현탁시켰다. 한 개의 균체는 초음파 파쇄기로 5 분간 처리하여 원심분리 한 후, 상등액을 로우리(Lowery) 방법에 의해 단백질을 측정하였고, 다른 하나는 건조 무게(80 ℃, 24 시간)를 정량하였다.
② 배지내의 잔류 씨엠씨 농도 : 배양상등액 1.0 ㎖에 효소액(에프피아제 1.0 U/㎖, Sigma Co., U.S.A.) 0.5 ㎖와 50 mM 구연산 완충용액 (pH 4.8) 0.5 ㎖을 첨가하여 50 ℃, 30 분간 반응시키고, 이때 생성된 환원당은 디엔에스 방법으로 정량하였다.
위와 같은 조건에서 미리 작성되어진 검량선 [씨엠씨 농도(g/L) = 13.74 × 흡광도(Absorbance) + 0.27, R2:0.99]을 이용하여 정량하였다.
③ 배지내의 아베셀 + 균체량 : 배양액 일정량을 여과지에 흡인 여과하여 80 ℃에서 10 시간 건조시킨 후 실리카겔(silica gel) 데시케이터(desicator)에서 2 시간 방냉 후 여과 전후 무게차로 계산하였다. 총 기질량은 아비셀 + 균체량에 CMC량을 합하고 위에서 결정된 균체량을 감하여 정량하였다.
2. KSJ 균주의 효소생산의 환경변수의 영향에 대한 실험
균주접종물은 YMEA 배지(petre-dish, 90 ㎜)에서 3 일 30 ℃ 배양된 KSJ1 균체를 백금이를 이용하여 YMEB 배지에서 접종하였고, 3일 30 ℃에서 성장시켜 이용하였다.
효소생산은 맨델스 배지를 기본배지로 사용하였고, 500 ㎖ 베플드 플라스크(baffled flask)에 100 ㎖의 배지(초기 pH 6.0)를 넣고, 121 ℃, 15 분간 멸균한 후, 위의 접종물을 1 %(v/v)을 접종하여 30 ℃, 100 rpm으로 5 일간 배양하였다.
배양시간에 따라 배양액을 분취하여 효소활성도, 균체량 및 pH를 측정하였다.
효소활성분석을 위한 요소액은 배양액을 10,000 rpm으로 10 분간 원심분리(Centrifugal separator ; Mega21R, Hanil R&D Co., Korea)하여 상등액을 이용하였다.
본 발명의 균주 KSJ1의 효소생산에 관한 환경변수의 영향은 초기 pH, 온도 및 시간 변화 등을 조사하여 살펴보았다.
효소생산의 최적온도를 살펴보기 위해 25 ~ 40 ℃에서의 5 일간 배양한 결과, 표 5에서 보는 바와 같이 최적온도는 25 ~ 30 ℃였다.
35 ℃ 이상의 온도에서도 균주성장을 있었지만, 효소생산에는 불리한 영향을 보였다, 효소생산의 최적 pH는 6.0 ~ 7.0 이었으며, 또한 낮은 pH 4.0 ~ 5.0 에서도 효소생산은 원활하였다. 그러나, pH 8.0 이상에서는 균체성장이 미미하였고, 효소생산은 거의 이루어지지 않았다(표 5).
배양시간에 대한 효소생산성을 살펴보면, 배양이 진행됨에 따라 효소활성은 서서히 증가하여 배양 5 일째 최대 활성을 나타내었고, 그 이후부터는 점차 감소하였다(도 3).
균체성장은 배양 1 일까지는 커다란 변화를 보이지 않았지만, 그 이후부터 배양 36 시간까지 최대 성장을 보였으며, 최대 균체농도는 배양 5일째 4.6 g/L 였다.
기질이용은 배양 2일까지 씨엠씨가 전부 소비되어지고, 그 이후부터 이비셀의 분해가 시작되어져 배양 5 일째 모든 기질이 소비되었다.
배양액내의 pH는 배양동안 커다란 변화를 보이지 않았다.
균체성장, 기질이용 및 효소생산성을 종합적으로 살펴보면, 균체성장에 따라 배양액내의 씨엠씨는 환원당으로 전환되어지고, 생성되어진 환원당을 이용하여 급격한 균체성장 및 축적이 이루어진다. 효소생산은 환원당이 소비되어지는 시점에서부터 아비셀의 분해와 함께 급격히 증가하였다. 또한, 배양 5일 이후부터는 효소활성과 단백질 농도가 감소하였는데, 이는 기질제한을 통한 효소의 자가소화(autolysis)와 프로테아제의 생성때문인 것으로 추정된다.
트리코데르마 인하마텀 KSJ1 의 효소생산은 첫번째 단계에서 에너지 신진대사에 의해 최대 균체성장 및 축적이 이루어지고, 그 다음 단계에서 2 차 대사산물 로서 효소가 유도됨을 확인하였다.
이는 분해되기 쉬운 용해성 기질인 씨엠씨의 가수분해를 통해 균체성장에 필요한 탄소원 및 에너지원을 획득하고, 균체의 유지대사를 위해 상대적으로 가수분해 되기 힘든 아비셀의 분해를 위해 보다 강력한 섬유소분해효소를 생산하는 것을 알 수 있었다.
<표 5> 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주의 맨델스 배지를 이용한 효소생산에서 배양온도 및 초기 pH 변화에 따른 상대 효소활성도의 비교결과
배양인자 상대효소활성도(%)
씨엠씨아제 베타글루코시다아제 아비셀라아제 자일란아제
온도 (℃) 25 92.6 79.0 100.0 100.0
30 100.0 100.0 94.2 92.7
35 47.9 40.7 30.7 55.3
40 4.8 0.0 0.0 0.0
50 13.7 0.0 0.0 0.0
pH 3 2.1 1.0 14.7 1.0
4 67.0 62.4 92.9 29.3
5 84.0 66.5 89.0 66.6
6 94.8 84.2 96.6 100.0
7 100.0 100.0 100.0 87.3
8 0.0 0.0 0.0 0.0
3. 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주에 대한 효소생산의 기질특이성 실험
본 발명의 KSJ1 균주의 효소생산에 관한 기질특이성을 다음의 물질을 이용하 여 알아보았다.
상업용 섬유소는 알파셀룰로오스(α-Cellulose), 아비셀, 씨엠씨, 자일란(birchwood 및 oat spelt 기원)이었으며, 섬유소폐기물은 볏짚, 폐지 및 톱밥이었다.
사용되어진 모든 기질에서 균체성장은 이루어졌으나, 각각의 기질에 따라 다른 효소활성을 타나내었다.
KSJ1 균주의 섬유소분해효소 생산은 용해성 (CMC) 보다는 비용해성 물질(알파셀룰로오스, 아비셀)에서, 헤미셀룰로오스 보다는 셀룰로오스 물질에서, 순수물질(상업용섬유소) 보다는 복합기질(섬유소폐기물)에서 높은 효소 활성을 보여주었다.
또한, 볏짚에서 높은 효소 활성이 나타났는데 이는 환원당(30 ~ 50 ㎎/g) 함량에 의한 것을 알 수 있었다.
<실험예 2> 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주의 경제적인 효소생산에 대한 실험
1. 섬유소폐기물을 이용한 KSJ1 균주의 효소생산실험
경제적인 효소생산을 위해 섬유소폐기물을 혼합하여 사용하였는데, 이는 각각의 기질을 단독으로 사용할 경우에는 기질에 함유된 성분이 균체성장과 효소생산에 효과적으로 작용하지 않을 수 있으므로, 기질혼합을 통하여 상호보완하기 위해서이다.
경제적인 효소생산의 최적기질을 알아보기 위해 볏짚 + 톱밥, 볏짚 + 폐지, 톱밥 + 폐지 및 혼합기질(볏짚 + 톱밥 + 폐지)을 이용하였다.
또한, 최적의 기질농도를 살펴보기 위해 볏짚과 펄프를 각각 1 : 1로 혼합하여 1 ~ 5 %(w/v)까지 달리하여 수행하였다.
그 결과, 볏짚 + 폐지를 사용하였을 때 효소활성이 가장 높았다, 볏짚의 초기 환원당은 균체성장에 유리하게 작용하였고, 볏짚 및 폐지를 사용하여 효소생산의 최적농도를 살펴보았는데, 기질농도 2 %(w/v) 에서 가장 높은 효소활성을 보였다. 또한, 기질농도 1 ~ 2 %(w/v)에서는 기질이 잘게 분해되었으나, 3 %(w/v) 이상에서는 기질이 배양초기와 비슷한 모습으로 관찰되었다.
따라서, 기질농도가 높을수록 교반이 원활히 이루어지지 않아 효소생산을 저해하는 것을 알 수 있었다.
2. 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주의 섬유소분해효소 생산성 비교실험
상업용 섬유소와 섬유소폐기물을 이용한 효소생산에 관한 결과를 비교하여 아래의 표 6에 나타내었다.
<표 6> 상업용섬유소와 섬유소폐기물을 이용한 배양에서의 섬유소분해효소의 생산성 비교결과
상업용 섬유소 섬유소폐기물
탄소원 씨엠씨 1.25% + 아비셀 1.25% 볏짚 1% + 폐지 1%
질소원 펩톤(peptone) 0.5% 펩톤(peptone) 0.1%
영양염류 맨델스 배지 맨델스배지
에프피아제(U/㎖) 1.74 ± 0.31 1.15 ± 0.17
씨엠씨아제(U/㎖) 41.2 ± 0.31 30.8 ± 5.72
베타글루코시다아제(U/㎖) 4.49 ± 0.47 1.55 ± 0.67
아비셀라아제(U/㎖) 1.24 ± 0.31 0.48 ± 0.15
알파아밀라아제(U/㎖) 1.21 ± 0.11 6.78 ± 0.52
베타아밀라아제(U/㎖) 0.73 ± 0.05 3.37 ± 0.28
글루코아밀라아제(U/㎖) 0.44 ± 0.33 2.97 ± 0.31
자일란아제(U/㎖) 52.7 ± 10.86 45.9 ± 8.52
* 영양염류는 맨델스 배지에서 탄소원 및 질소원을 제외하고 조제된 용액이다.
표 6에서 보는 바와 같이, 상업용 섬유소는 셀룰라아제의 높은 효소활성을 보여주었고, 섬유소폐기물은 아밀라아제의 높은 효소활성을 나타내었다. 섬유소분해효소 생산은 사용되어지는 탄소원에 따라 다양하게 유도되어지는데, 본 발명의 KSJ1 균주는 상업용 섬유소 및 섬유소폐기물을 탄소원으로 이용하여 셀룰라아제, 자일란아제, 아밀라아제, 펙틴아제 등 다양한 섬유소분해효소를 생산하였다.
본 발명에 의해, 상업용섬유소 및 섬유소폐기물을 탄소원으로 이용하여 셀룰라아제, 자일란아제, 아밀라아제, 펙틴아제 등 다양한 섬유소분해효소를 생산할 수 있는 신규한 사상균인 트리코데르마 인하마텀 KSJ1(Trichoderma inhamatum KSJ1 ; KFCC 11349P)이 제공된다.
또한, 본 발명의 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주를 이용하여 섬유소분해효소를 효과적으로 생산할 수 있는 경제적인 효소생산방법이 제공된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

  1. 다양한 섬유소분해효소를 생산하는 신규한 사상균 트리코데르마 인하마텀 KSJ1(Trichoderma inhamatum KSJ1 ; KFCC 11349P).
  2. 섬유소분해효소의 생산방법에 있어서,
    제1항의 트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주를 이용하여, 상업용섬유소(알파셀룰로오스, CMC, 아비셀, 자일란) 또는 섬유소폐기물(볏짚, 폐지, 톱밥)을 탄소원으로 하여 다양한 섬유소분해효소를 생산하는 것으로 구성된,
    트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주를 이용한 섬유소분해효소의 생산방법.
  3. 제2항에 있어서,
    효소생산시 온도는 25 ~ 30 ℃, pH는 6.0 ~ 7.0 으로 하여 배양하는 것이 특징인,
    트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주를 이용한 섬유소분해효소의 생산방법.
  4. 제2항에 있어서,
    섬유소분해효소 생산시, 제1항의 KSJ1 균주를 비용해성 물질(알파셀룰로오스, 아비셀), 셀룰로오스 물질, 복합기질(섬유소폐기물)중에서 선택된 1 종 이상에서 배양하는 것이 특징인,
    트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주를 이용한 섬유소분해효소의 생산방법.
  5. 제2항에 있어서,
    제1항의 KSJ1 균주에 의해 생산되는 섬유소분해효소는 셀룰라아제, 자일란아제, 아밀라아제, 펙틴아제 중 1 종 이상인 것이 특징인,
    트리코데르마 인하마텀 KSJ1 균주를 이용한 섬유소분해효소의 생산방법.
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