WO2019177311A1 - 해조류로부터 포도당 및 라미나리올리고당을 생산하는 신규한 베타-글루코시데이즈 - Google Patents

해조류로부터 포도당 및 라미나리올리고당을 생산하는 신규한 베타-글루코시데이즈 Download PDF

Info

Publication number
WO2019177311A1
WO2019177311A1 PCT/KR2019/002706 KR2019002706W WO2019177311A1 WO 2019177311 A1 WO2019177311 A1 WO 2019177311A1 KR 2019002706 W KR2019002706 W KR 2019002706W WO 2019177311 A1 WO2019177311 A1 WO 2019177311A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
beta
glucose
glucosidase
laminarin
oligosaccharide
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/002706
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김경헌
김동현
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to US16/979,568 priority Critical patent/US11248246B2/en
Priority to CN201980018506.6A priority patent/CN111836900A/zh
Publication of WO2019177311A1 publication Critical patent/WO2019177311A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)

Definitions

  • the present invention relates to a novel beta-glucosidase that produces glucose and laminaoligosaccharides from seaweed.
  • Woody biomass has long been regarded as a renewable biomass for producing fermentable sugars such as glucose because of its abundant resources and low cost.
  • it has a high lignin content and a very complicated structure, so that high-strength pretreatment and enzyme saccharification are essential to use it, making it difficult to use easily.
  • algae has been spotlighted as a biomass to replace woody biomass, which has a high carbohydrate content, no need for arable land, and lignin so that the structure is not complicated.
  • brown algae harvest about 70 million tons annually worldwide, its major carbohydrate components are alginic acid and glucan, and glucan is mainly laminarin.
  • Laminarin has the beta-1,3 bond as the main bond and the beta-1,6 bond aside.
  • Laminarina among brown algae, Saccharina and Fucus spp. Have a high laminarin content of 30-80% of dry weight. Since laminarin is a polysaccharide composed of glucose, it is very ideal as a biomass for producing fermentable sugars.
  • laminari oligosaccharides produced from laminarin is known to have a variety of physiological activity can be used as a functional material.
  • high-strength pretreatment In order to produce fermentable sugars using wood-based biomass, high-strength pretreatment must be accompanied, and at least three enzyme combinations such as endo-glucanase, exo-glucanase and beta-glycosidase are required.
  • endo-glucanase In order to produce fermentable sugars using wood-based biomass, high-strength pretreatment must be accompanied, and at least three enzyme combinations such as endo-glucanase, exo-glucanase and beta-glycosidase are required.
  • endo-glucanase endo-glucanase
  • exo-glucanase exo-glucanase
  • beta-glycosidase beta-glycosidase
  • the present invention provides a glucose comprising beta-glucosidase having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having exo-type glucanase and transglycosidase activity; It provides a composition for producing laminari oligosaccharides.
  • the present invention also relates to glucose or laminaoligosaccharide comprising reacting beta-glucosidase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with laminarine or laminaribiose to produce glucose or laminariooligosaccharide. It provides a production method of
  • Beta-glucosidase of the present invention not only produces glucose by exo type glucanase activity against the polysaccharide laminarin, but also shows transglycosilase activity against laminarin or laminaribio by varying reaction conditions. It has the effect of producing glucose and / or laminari oligosaccharides.
  • 1 is a gel photograph confirmed the expression of beta-glucosidase of the present invention.
  • Figure 2 is a result of confirming the optimal active pH of beta-glucosidase of the present invention.
  • Figure 3 is a result of confirming the optimum temperature of beta-glucosidase of the present invention.
  • Figure 4 is a heat safety confirmation result of beta-glucosidase of the present invention.
  • 5 is a result of TLC analysis screening the substrate specificity of beta-glucosidase using various disaccharides as a substrate, (a) is a land-based disaccharide, and (b) a marine-derived disaccharide.
  • FIG. 6a shows the yield of hydrolysis of laminarin to produce glucose as a major product
  • FIG. 6b is the result of HPLC analysis of the main product.
  • Figure 7a is the result of HPLC analysis of laminaoligosaccharides produced through transglycosylase activity for laminarin
  • Figure 7b is the result of TLC analysis of the laminaoligosaccharides.
  • the laminarine degrading activity of the Bgl1B protein which is believed to have beta-glycosidase activity.
  • the Bgl1B protein is composed of ⁇ -1,3 of laminarin, using laminarine, a polysaccharide in which glucose is linked to the main skeleton of beta-1,3-bond, and a side chain linked by beta-1,6-bond, as a substrate. It was confirmed that glucose alone was produced by having exo-type glucanase activity that cleaved ⁇ -1,6-glycosidic bonds. In addition, by adjusting the concentration of the enzyme and the reaction time was confirmed the transglycosylation activity of producing oligosaccharides having a high degree of polymerization from laminarin or laminaribiose.
  • the present invention provides a composition for producing glucose or laminari oligosaccharide, comprising beta-glucosidase having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having exo-type glucanase and transglycosidase activity. do.
  • the present invention also provides a glucose or laminari comprising the reaction of beta-glucosidase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with laminarine or laminaribiose to produce glucose or laminariooligosaccharide
  • a glucose or laminari comprising the reaction of beta-glucosidase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with laminarine or laminaribiose to produce glucose or laminariooligosaccharide
  • methods for producing oligosaccharides are methods for producing oligosaccharides.
  • the beta-glucosidase is transglycosyl for laminarin or laminaribios as well as exo-type glucanase activity that cleaves ⁇ -1,3 or ⁇ -1,6-glycosidic bonds to laminarin. It is characterized by showing a raise activity.
  • the optimal pH of the beta-glucosidase in the buffer solution may vary depending on the type of the buffer solution, but exhibits enzymatic activity of about 80% or more at about pH 5 to 7.5, specifically, the highest activity at pH 6. In addition, it exhibits high enzymatic activity of 80% or more at 10 to 40 ° C at pH6. However, since the enzyme activity is rapidly lowered at 50 ° C., the beta-glucosidase is sufficiently capable of enzymatic reaction even at room temperature, so that the process can be economically performed without energy consumption for increasing the temperature. In addition, the enzyme can be inactivated even at the heat treatment at a relatively low temperature compared to the existing enzymes.
  • Mg 2 + , Ni 2 + and Co 2 + did not significantly affect the enzyme activity, but in the case of Mn 2 + about 50% inhibits the degree of enzyme activity, strongly inhibit the Cu 2 + in the case of Fe + 2, the enzyme activity to less than about 10%.
  • the beta-glucosidase may be derived from Saccharophagus degradans 2-40 T , but is not particularly limited thereto.
  • beta-glucosidase can be transcribed and translated through DNA segments, ie coding genes, involved in producing a polypeptide that includes the intervening sequences between individual coding segments as well as regions before and after coding regions of the enzyme.
  • it may be transcribed and translated from, but not limited to, the sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO amino acids having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, and at least 99% of the amino acid sequences disclosed in Sequence.
  • the beta-glucosidase during Days saccharide is a wave having Gus Gras thiooxidans (Saccharophagus degradans) 2-40 T culture supernatant was separated from the water and can be purified, and genetic engineering using recombinant technology in Saccharomyces wave Gus de gras thiooxidans (Saccharophagus degradans ) can be produced and separated by strains other than 2-40 T or by artificial chemical synthesis.
  • recombinant technology When using recombinant technology, it is possible to use factors used for ease of expression of conventional recombinant proteins, such as antibiotic resistance genes, reporter proteins or peptides that can be used for affinity column chromatography, which techniques belong to the present invention. Those skilled in the art fall within a easily implemented range. For example, it may be obtained from a host cell or a culture thereof transformed with a recombinant vector comprising the gene encoding the beta-glucosidase, ie, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2. E. coli is used as the host cell, but is not limited thereto.
  • the beta-glucosidase may be used as a substrate, such as laminarin, laminaribio, cellobiose, genthiobio, lactose or agarose.
  • the beta-glucosidase may control the reaction conditions to produce glucose alone, or to produce glucose and laminaoligosaccharides.
  • the reaction conditions may be the concentration of beta-glucosidase and the reaction time.
  • beta-glucosidase of 0.1 to 3 U relative to the substrate laminarin (mg) may be produced by reacting at 25 to 40 ° C. for 2 to 48 hours.
  • Laminari oligosaccharide reacts with beta-glucosidase of 0.005 to 0.05 U relative to the substrate laminarin (mg) or 0.0001 to 0.005 U relative to the substrate laminaribio (mg) at 2 to 40 ° C. for 2 to 72 hours. Can be produced.
  • Laminari oligosaccharides that can be produced using the laminarin or laminaribiose may be any one of degrees of polymerizations (DP) 2 or more, more specifically, 2 to 10 laminari oligosaccharides. More specifically, the present invention may be laminaribiose (DP2), laminaritriose (DP3), laminaretetraose (DP4), laminaripentaose (DP5), laminari hexaose (DP6) and the like.
  • the degradation product of beta-glucosidase can be separated and purified by approximately 95% of high purity glucose or laminari oligosaccharide by sequentially performing silica gel chromatography as an adsorption chromatography and bio gel P2 chromatography as a gel permeation chromatography. have.
  • protein and “polypeptide” are used interchangeably herein.
  • the polypeptide has a certain proportion (eg, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99%) of sequence identity with respect to another sequence, when the two sequences are aligned. Comparison of these means that the amino acid residues in this ratio are identical.
  • the alignment and percentage homology or identity may be determined by any suitable software program known in the art, such as those described in CURRENT PROTOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (FM Ausubel et al. (Eds) 1987 Supplement 30 section 7.7.18). Can be determined using Preferred programs include the GCG Pileup program, FASTA (Pearson et al . 1988 Proc . Natl Acad .
  • BLAST BLAST Manual, Altschul et al., Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, MD, and Altschul et al. 1997 NAR 25: 3389 -3402).
  • Another preferred alignment program is ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA), preferably using basic parameters.
  • TFASTA Data Searching Program available from Sequence Software Package Version 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.).
  • the term “recombinant” means that the cell, nucleic acid, protein or vector has been modified by introduction of a heterologous nucleic acid or protein or alteration of the original nucleic acid or protein, or The cell refers to a cell derived from such a modified cell. That is, for example, a recombinant cell expresses a gene that is not found within the original (non-recombinant) form of the cell, or alternatively expresses an original gene that is abnormally expressed or not expressed at all upon expression. Expression.
  • nucleic acid encompasses single- or double-stranded DNA, RNA, and chemical variants thereof.
  • Nucleic acid and polynucleotide can be used interchangeably herein. Because the genetic code is degenerate, one or more codons can be used to encode a particular amino acid, and the invention encompasses polynucleotides encoding a particular amino acid sequence.
  • introduction of inserting a nucleic acid sequence into a cell means “transfection” or “transfection” or “transduction” and refers to the integration of the nucleic acid sequence into eukaryotic or prokaryotic cells. Mention is included, wherein the nucleic acid sequence is integrated into the cell's genome (eg, chromosome, plasmid, pigment, or mitochondrial DNA), converted to autonomic replicon, or transiently expressed.
  • the cell's genome eg, chromosome, plasmid, pigment, or mitochondrial DNA
  • Saccharophagus degradans 2-40 T (ATCC43961) genomic DNA to obtain 30 g of instant sea salt, 20 mM Tris-HCl, 2 g glucose, 1 g yeast extract and 0.5 g ammonium chloride in a minimum medium of 30 ml Incubated for 12 hours at °C.
  • Genomic DNA was extracted using a commercialized DNA isolation kit (Qiagen, Valencia, CA, USA).
  • the target gene bgl1B was amplified by PCR from genomic DNA.
  • Primers used were 5'-ATACATATGAATAGACTTACACTACCGCCTTCTTCTCGT-3 '(forward: SEQ ID NO: 3) and 5'-ATAGCGGCCGCGCTCCTACTCGAGACAAACTCAGCAAATGC-3' (reverse: SEQ ID NO: 4).
  • the PCR product and the pET21 ⁇ vector were digested with Nde I and Not I, and ligated to construct a pET21 ⁇ -Bgl1B plasmid. This plasmid was transferred to Escherichia coli. coli ) was transformed into DH5 ⁇ .
  • Escherichia coli BL21 (DE3), a host for protein expression, was transformed.
  • the cells were cultured using Luria-Bertani (LB) medium containing 50 mg / L empicillin until the 600 nm absorbance reached 0.5 at 37 ° C. 0.1 mM IPTG was added to induce the expression of the protein and the induction temperature was set to 16 ° C. to overexpress the protein in water-soluble form for 16 hours. After the incubation, the cells were recovered by centrifugation and released using 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4). After grinding by ultrasonication, the supernatant was obtained by centrifugation again.
  • LB Luria-Bertani
  • This recombinant protein was purified using HisTrap column (GE Healthcare, Piscataway, USA). Purified protein was concentrated with Amicon Ultra Centrifugal filter (30,000 molecular weight cutoff; Millipore, Billerica, MA, USA) and protein concentration was measured with bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, San Hose, CA, USA). It was.
  • BCA bicinchoninic acid
  • Figure 4 shows the safety of the temperature of the enzyme. After 1 hour of reaction at 40 ° C., the enzyme activity was maintained at 80%. After 1 hour of reaction at 50 ° C. or higher, little activity was observed.
  • Bgl1B in protein activity to determine the metal ion effect of 10 mM to 0.1% (w / v) cellobiose Mg 2 +, Ca 2 +, Mn 2 +, Ni 2 +, Cu 2 +, Fe 2 + and Co 2
  • the relative activity was compared with the case where no metal ions were added by adding + .
  • Mg + 2, Ni + 2 and Co + 2 did not have a significant effect on the enzyme activity, in the case of Mn 2+ exhibited the enzyme activity of 56.2%.
  • the enzyme activity was very low (10%) and strongly inhibited.
  • each disaccharide was reacted with 0.6 U of Bgl1B for 1 hour in a 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6) at a concentration of 0.2% (w / v).
  • Substrates used were two groups, the first being terrestrial disaccharides, cellobiose (beta-1,4 bonds), lactose (beta-1,4 bonds), genthiobioses (beta-1,6 bonds), sucrose (Alpha-1,2 bond), maltose (alpha-1,4 bond) and melibiose (alpha-1,6 bond), the second group being marine-derived substrates, laminaribios (beta-1,3 bond) ), Agarobiose (beta-1,4 bond), neoagarobiose and trisaccharides (alpha-1,4 bond), agarotriose (beta-1,6 bond and alpha-1,4 bond) It was.
  • Bgl1B was able to hydrolyze all beta-bonded disaccharides.
  • Bgl1B did not hydrolyze all alpha-binding disaccharides.
  • agarotriose could not be hydrolyzed. Therefore, Bgl1B was found to have a wide range of enzymatic activity capable of hydrolyzing disaccharides with beta-binding.
  • each substrate was reacted at pH 6 and 40 ° C at various concentrations of 0.1-0.4% (w / v).
  • Variables related to enzyme kinetics, V max , K m and k cat, were determined from the Lineweaver-Burk plot.
  • Bgl1B when combined with the variables, Bgl1B showed the highest substrate specificity for laminaribioses. This resulted in 259 times higher V max , 2.5 times lower K m and 108 times higher k cat than the commercially available Novozyme 188, resulting in 108 times higher catalytic efficiency.
  • Bgl1B has high substrate specificity in the following order: cellobiose, genthiobio, lactose and agarobiose.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • TLC Thin Layer Chromatography
  • HPLC analysis was performed using an Agilent 1100 HPLC instrument equipped with a gel permeation and ligand exchange column (KS-802; Shodex) and a differential index detector. The analytical conditions were 0.5 mL / min flow rate and 80 column temperature. C and mobile phases were used sterile water.
  • TLC analysis was performed by loading 1 ⁇ l of the reaction product into silica gel 60 plated (Merck) and using a mixed solvent of n -butanol: acetic acid: water (3: 2: 2 by volume), and 10% (v / v) sulfuric acid treatment.
  • Bgl1B can produce glucose as a main product of fermentable sugars from laminarin by using Bgl1B alone under desired conditions, and oligosaccharides, a functional material, can be obtained through transglycosylation activity from laminarin and laminaribiose. It was confirmed to be generated.
  • the present invention can be applied to the field of glucose and laminaoligosaccharide production by enzymatic reaction.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 해조류로부터 포도당 및 라미나리올리고당을 생산하는 신규한 베타-글루코시데이즈에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 베타-글루칸에 대해 엑소 타입의 글루카네이즈 활성을 보이면서, 트랜스글리코실레이즈 활성을 보이는 베타-글루코시데이즈로부터 포도당만을 생산할 뿐만 아니라, 반응조건을 달리하여 라미나린에 대해 트랜스글리코실레이즈 활성을 보여 라미나리올리고당을 생산하는 효과가 있다.

Description

해조류로부터 포도당 및 라미나리올리고당을 생산하는 신규한 베타-글루코시데이즈
본 발명은 해조류로부터 포도당 및 라미나리올리고당을 생산하는 신규한 베타-글루코시데이즈에 관한 것이다.
지구온난화에 대한 관심과 함께, 지속 가능한 발전을 위해 재생 가능한 바이오매스의 관심이 증대되고 있다. 목질계 바이오매스는 풍부한 자원과 가격이 저렴하기 때문에 포도당과 같은 발효 가능한 당을 생산하기 위한 재생 가능한 바이오매스로 오랫동안 간주되었다. 그러나 이는 리그닌 함량이 높고, 구조가 매우 복잡하여 이를 사용하기에는 고강도 전처리와 효소 당화가 필수적이어서 쉽게 이용하기가 어렵다. 최근 목질계 바이오매스를 대체할 바이오매스로 해조류가 각광받고 있는데, 이는 높은 탄수화물 함량을 가지고 있으며, 경작지가 따로 필요 없으며, 리그닌이 거의 없어서 구조가 복잡하지 않다는 장점이 있다.
해조류 중, 갈조류는 전 세계적으로 매년 약 7천만 톤을 수확하고 있으며, 이의 주요 탄수화물의 구성요소는 알긴산 및 글루칸이고, 글루칸은 주로 라미나린이다. 라미나린은 베타-1,3 결합을 주요 결합으로 가지고 있으며, 베타-1,6 결합을 곁가지로 가지고 있다. 갈조류 중 라미나리나(Laminarina), 사카리나(Saccharina) 및 푸커스 속(Fucus spp.)는 건조 중량의 30-80%의 높은 라미나린 함량을 가지고 있다. 라미나린은 포도당으로 이루어진 다당류이기 때문에 발효 가능한 당을 생산하기 위한 바이오매스로 매우 이상적이다. 또한, 라미나린으로부터 생산된 라미나리올리고당은 다양한 생리활성이 있는 것으로 알려져 있어 기능성 소재로 이용 가능하다.
목질계 바이오매스를 이용하여 발효 가능한 당을 생성하기 위해서는 고강도의 전처리가 수반되어야 하며, 엔도-글루카네이즈, 엑소-글루카네이즈 및 베타-글리코시데이즈 등 최소 3가지의 효소 조합이 필요하다. 이와 같은 전처리 공정에서는 높은 열을 이용하기 때문에 많은 에너지가 필요하며, 효소 당화공정에서 사용되는 효소의 비용은 전체 바이오공정에서 매우 큰 비율을 차지한다.
따라서, 최소한의 효소를 이용하여 생산단가를 줄이면서도 효율적으로 라미나린을 가수분해하여 발효당인 포도당과 기능성 소재인 라미나리올리고당을 생산하는 공정이 요구된다.
본 발명의 목적은 갈조류로부터 포도당과 라미나리올리고당을 생산할 수 있는 신규한 베타-글루코시데이즈의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지며 엑소-타입의 글루카네이즈 및 트랜스글리코실레이즈 활성을 갖는 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)를 포함하는 포도당 또는 라미나리올리고당 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)를 라미나린 또는 라미나리바이오스와 반응시켜 포도당 또는 라미나리올리고당을 생산하는 것을 포함하는 포도당 또는 라미나리올리고당의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 베타-글루코시데이즈는 다당류인 라미나린에 대해 엑소 타입의 글루카네이즈 활성을 보여 포도당만을 생산할 뿐만 아니라, 반응조건을 달리하여 라미나린 또는 라미나리바이오스에 대해 트랜스글리코실레이즈 활성을 보여 포도당 및/또는 라미나리올리고당을 생산하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 베타-글루코시데이즈의 발현을 확인한 젤 사진도이다.
도 2는 본 발명의 베타-글루코시데이즈의 최적 활성 pH 확인 결과이다.
도 3은 본 발명의 베타-글루코시데이즈의 최적 온도 확인 결과이다.
도 4는 본 발명의 베타-글루코시데이즈의 열 안전성 확인 결과이다.
도 5는 다양한 이당류를 기질로 하여 베타-글루코시데이즈의 기질 특이성을 스크리닝한 TLC 분석 결과로 (a)는 육상 유래 이당류이고, (b) 해양 유래 이당류이다.
도 6a는 라미나린을 가수분해하여 포도당을 주요 산물로 생성한 수율을 나타낸 것이고, 도 6b는 상기 주요 산물의 HPLC 분석 결과이다.
도 7a는 라미나린에 대해 트랜스글리코실레이즈 활성을 통해 생성된 라미나리올리고당의 HPLC 분석 결과이고, 도 7b는 상기 라미나리올리고당의 TLC 분석 결과이다.
도 8a는 라미나리바이오스에 대해 트랜스글리코실레이즈 활성을 통해 생성된 라미나리트리오스 및 포도당의 HPLC 분석 결과이고, 도 8b는 라미나리트리오스 및 포도당의 TLC 분석 결과이며, 도 8c는 Bgl1B의 염기서열(SEQ ID NO: 2)을 나타낸 것이다.
본 발명자들은 베타-글리코시데이즈 활성을 가질 것으로 추정되는 Bgl1B 단백질의 라미나린 분해 활성을 확인하였다. 그 결과, Bgl1B 단백질은 포도당이 베타-1,3-결합의 주 골격과 및 베타-1,6-결합으로 곁가지가 연결된 다당류인 라미나린을 기질로 사용하여 라미나린의 β-1,3, 또는 β-1,6-글리코시드 결합을 절단하는 엑소-타입의 글루카네이즈 활성을 가져 포도당을 단독으로 생산함을 확인하였다. 또한, 상기 효소의 농도 및 반응시간을 조절하여 라미나린 또는 라미나리바이오스로부터 높은 중합도를 갖는 올리고당을 생산하는 트랜스글리코실레이즈 활성을 확인하였다.
따라서, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지며 엑소-타입의 글루카네이즈 및 트랜스글리코실레이즈 활성을 갖는 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)를 포함하는 포도당 또는 라미나리올리고당 생산용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)를 라미나린 또는 라미나리바이오스와 반응시켜 포도당 또는 라미나리올리고당을 생산하는 것을 포함하는 포도당 또는 라미나리올리고당의 생산방법을 제공한다.
상기 베타-글루코시데이즈는 라미나린에 대해 β-1,3 또는 β-1,6-글리코시드 결합을 절단하는 엑소-타입의 글루카네이즈 활성뿐만 아니라 라미나린 또는 라미나리바이오스에 대해 트랜스글리코실레이즈 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
또한, 완충 용액 내 상기 베타-글루코시데이즈의 최적 pH는 완충용액의 종류에 따라 달라질 수는 있으나 약 pH 5 내지 7.5에서 80% 이상의 효소 활성을 나타내고, 구체적으로, pH6에서 가장 높은 활성을 나타낸다. 또한, pH6에서 10 내지 40℃에서 80% 이상의 높은 효소 활성을 나타낸다. 그러나 50℃ 이상에서는 효소 활성이 급격히 저하됨에 따라 상기 베타-글루코시데이즈는 실온에서도 충분히 효소 반응이 가능하므로 온도를 높이기 위한 에너지 소비 없이도 경제적으로 공정을 수행할 수 있는 장점이 있다. 또한, 기존 효소들에 비해 상대적으로 낮은 온도에서의 열처리에도 효소를 불활성화시킬 수 있다.
또한, 상기 베타-글루코시데이즈의 효소 활성에 대한 금속이온의 효과를 확인한 결과, Mg2 +, Ni2 + 및 Co2 +는 효소 활성에 큰 영향을 미치지 않았지만, Mn2 +의 경우 약 50% 정도 효소 활성을 저해하며, Cu2 +와 Fe2 +의 경우, 효소 활성을 약 10% 이하로 강력하게 저해한다.
상기 베타-글루코시데이즈는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40T에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 베타-글루코시데이즈는 효소의 코딩 영역 전 및 후의 영역뿐만 아니라 개별 코딩 분절 사이의 개재 서열이 포함된 폴리펩타이드를 생산하는데 연관된 DNA 분절, 즉 코딩 유전자를 통해 전사 및 번역될 수 있다. 예컨대, SEQ ID NO: 2에 기재된 서열로부터 전사 및 번역될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 효소의 하나 이상의 치환, 결손, 전위, 첨가 등의 변이 단백질로서 상기 포도당 또는 라미나리올리고당의 가수분해 활성을 가지는 단백질도 본 발명의 효소의 권리범위에 포함되며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1에 개시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.
상기 베타-글루코시데이즈는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)2-40T 배양물의 상등액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)2-40T 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다.
재조합 기술을 이용하는 경우, 통상적인 재조합 단백질 발현의 용이함을 위하여 사용되는 인자들, 예컨대 항생제 저항성 유전자, 친화성 컬럼 크로마토그래피에 사용될 수 있는 리포터 단백질 또는 펩타이드를 사용할 수 있으며, 이러한 기술은 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시 가능한 범주에 해당된다. 예컨대, 상기 베타-글루코시데이즈를 코딩하는 유전자, 즉, SEQ ID NO: 2에 기재된 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 수득될 수 있다. 상기 숙주세포로 대장균을 사용하나, 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 베타-글루코시데이즈는 라미나린, 라미나리바이오스, 셀로바이오스, 젠티오바이오스, 락토오스 또는 아가로바이오스 등을 기질로 사용할 수 있다.
상기 베타-글루코시데이즈는 반응조건을 제어하여 포도당을 단독으로 생산하거나, 포도당과 라미나리올리고당을 생산할 수 있다.
상기 반응조건은 베타-글루코시데이즈의 농도와 반응시간 등일 수 있다.
예컨대, 기질인 라미나린 (mg) 대비 0.1 내지 3 U의 베타-글루코시데이즈를 25 내지 40 ℃, 2 내지 48 시간의 조건에서 반응시켜 생산될 수 있다.
라미나리올리고당은 기질인 라미나린 (mg) 대비 0.005 내지 0.05 U 또는 기질인 라미나리바이오스 (mg) 대비 0.0001 내지 0.005 U의 베타-글루코시데이즈를 2 내지 40 ℃, 2 내지 72 시간의 조건에서 반응시켜 생산될 수 있다.
상기 라미나린 또는 라미나리바이오스를 사용하여 생산될 수 있는 라미나리올리고당은 중합도(degrees of polymerizations, DP) 2 이상, 더 구체적으로, 2 내지 10의 라미나리올리고당 중 어느 하나일 수 있다. 보다 구체적으로, 라미나리바이오스(DP2), 라미나리트리오스(DP3), 라미나리테트라오스(DP4), 라미나리펜타오스(DP5), 라미나리헥사오스(DP6) 등일 수 있다.
상기 베타-글루코시데이즈의 분해산물은 흡착 크로마토그래피인 실리카 젤 크로마토그래피 및 젤 투과 크로마토그래피인 바이오 젤 P2 크로마토그래피를 순차적으로 실시하여 대략 95%의 고순도의 포도당 또는 라미나리올리고당을 분리 정제할 수 있다.
본 명세서에서 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
본 발명에서 폴리펩타이드가 또 다른 서열에 대하여 특정 비율(예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%)의 서열 동일성을 가진다는 것은, 상기 두 서열을 정렬시킬 때, 상기 서열들의 비교시 상기 비율의 아미노산 잔기가 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 백분율 상동성 또는 동일성은, 당업계에 공지된 임의의 적당한 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[CURRENT PROTOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. M. Ausubel 등 (eds) 1987 Supplement 30 section 7.7.18)]에 기재된 것들을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직한 프로그램으로는, GCG Pileup 프로그램, FASTA(Pearson 등 1988 Proc . Natl Acad . Sci USA 85:2444-2448), 및 BLAST(BLAST Manual, Altschul 등, Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med.(NCIB NLM NIH), Bethesda, MD, 및 Altschul 등 1997 NAR 25:3389-3402)이 있다. 또 다른 바람직한 정렬 프로그램은 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, PA)로서, 바람직하게는 기본 매개변수를 사용하는 것이다. 사용 가능한 또 다른 서열 소프트웨어 프로그램은 Sequence Software Package Version 6.0(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)에서 이용 가능한 TFASTA Data Searching Program 이다.
본 발명에서 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때 용어 "재조합"은, 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 본래적 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 또는 상기 세포가 이렇게 변형된 세포로부터 유래한 것을 가리킨다. 즉, 예를 들어, 재조합 세포는 상기 세포의 본래적 (비(非)재조합) 형태 내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는, 다르게는 발현 시 비정상적으로 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 본래적 유전자를 발현한다.
본 명세서에서 "핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥의 DNA, RNA, 및 이들의 화학적 변형체를 포괄한다. "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 유전 암호가 축퇴되어 있기 때문에, 특정 아미노산을 인코딩하기 위해서 하나 이상의 코돈을 사용할 수 있으며, 본 발명은 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포괄한다.
핵산 서열을 세포 내로 삽입하는 용어 "도입"은 "트랜스펙션(transfection)", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입(transduction)"을 의미하며, 핵산 서열의 진핵 또는 원핵 세포 내로의 통합에 대한 언급이 포함되고, 이때 상기 핵산 서열은 세포의 게놈(예컨대, 염색체, 플라스미드, 색소체, 또는 미토콘드리아 DNA) 내로 통합되어, 자율 레플리콘으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현된다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> Bgl1B의 과발현 및 정제
사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40T (ATCC43961)의 게놈 DNA를 얻기 위해 2.3 g의 인스턴트 해수염, 20 mM Tris-HCl, 2 g glucose, 1 g yeast extract 및 0.5 g 암모늄 클로라이드를 1 L에 녹인 최소배지에서 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 게놈 DNA는 상용화 DNA 분리 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 추출하였다. 게놈 DNA로부터 표적 유전자인 bgl1B을 PCR에 의해 증폭되었다. 사용된 프라이머는 5'-ATACATATGAATAGACTTACACTACCGCCTTCTTCTCGT-3'(정방향: SEQ ID NO: 3) 및 5'-ATAGCGGCCGCGCTCCTACTCGAGACAAACTCAGCAAATGC-3'(역방향: SEQ ID NO: 4)이다. 친화도 크로마토그래피를 이용하여 단백질을 정제하기 위해 C-말단에 6개의 히스티딘을 코딩하고 있는 유전자의 염기서열을 추가하였다. PCR 산물과 pET21α 벡터는 NdeI과 NotI으로 각각 절단하고, 라이게이션하여 pET21α-Bgl1B 플라스미드 구축하였다. 이 플라스미드를 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) DH5α에 형질전환 하였다.
이렇게 확보한 유전자를 과발현하기 위해 단백질 발현용 숙주인 에스케리치아 콜라이 BL21(DE3)에 형질전환 하였다. 이 세포를 50 mg/L 엠피실린이 포함되어 있는 Luria-Bertani(LB) 배지를 이용하여 37℃에서 600 nm 흡광도가 0.5에 도달할 때까지 배양하였다. 단백질의 발현을 유도하기 위해 0.1 mM IPTG를 첨가하였고 유도 온도는 16℃로 설정하여 16시간 동안 수용성 형태로 단백질을 과발현하였다. 배양이 끝난 후, 원심분리하여 세포를 회수하고, 이를 20 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.4)를 이용하여 풀어준 다음. 초음파로 분쇄한 후, 다시 원심분리 하여 상층액을 획득하였다. 이 재조합 단백질을 HisTrap 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, USA)을 이용해 정제하였다. 정제된 단백질은 Amicon Ultra Centrifugal filter(30,000 분자량 컷오프; Millipore, Billerica, MA, USA)로 농축하였으며, bicinchoninic acid(BCA) protein assay kit(Thermo Fisher Scientific, San Hose, CA, USA)로 단백질 농도를 측정하였다.
발현된 Bgl1B은 8% SDS-PAGE를 이용하여 49.8 kDa으로 확인되었다(도 1).
<실시예 2> Bgl1B 단백질의 최적 pH 및 활성 온도 확인
Bgl1B 단백질의 최적 활성을 나타내는 pH를 알아보기 위해 0.1% (w/v) 셀로바이오스을 포함하는 20 mM sodium acetate(pH 4.0-6.0), 20 mM sodium phosphate(pH 6.0-7.0) 및 20 mM Tris-HCl-NaCl(pH 7.0-9.0) 버퍼에 각각 Bgl1B 단백질과 함께 40℃에서 15분 반응하였다.
도 2는 4.0-9.0 범위의 pH에서 Bgl1B의 상대적 활성을 나타낸다. pH 6에서 가장 높은 활성을 나타내었다. pH 4와 pH 8 이상의 조건에서는 활성이 30% 이하로 감소하였다.
도 3은 2-60℃ 범위의 온도에서 Bgl1B의 상대적 활성을 나타낸 것이다. pH 6에서 40℃에서 가장 높은 효소활성을 나타냈다. 그리고 20℃에서 약 83%의 효소활성을 유지하였다. 또한, 2-10℃의 매우 낮은 온도에서도 58% 이상의 효소활성을 나타냈다. 그러나 50℃ 이상에서는 급격하게 효소 활성이 감소하였다. 이는 실온에서도 충분히 효소반응이 가능함으로 온도를 올리기 위해 에너지를 가하지 않아도 되어 경제적인 공정을 이룰 수 있다. 또한, 간단한 열처리만으로도 효소를 불활성화 시킬 수 있다.
도 4는 효소의 온도에 대한 안전성을 나타낸 것이다. 40℃에서 1시간 반응한 후 효소활성은 80% 유지되었으며, 50℃ 이상에서 1시간 반응한 후에는 거의 활성을 나타내지 않았다.
<실시예 3> Bgl1B의 금속이온 효과
Bgl1B 단백질 활성에 금속이온 효과를 알아보기 위해, 0.1% (w/v) cellobiose에 10 mM의 Mg2 +, Ca2 +, Mn2 +, Ni2 +, Cu2 +, Fe2 + 및 Co2 +을 첨가하여 금속이온이 넣지 않은 경우와 상대적인 활성을 비교하였다.
표 1과 같이, Mg2 +, Ni2 + 및 Co2 +는 효소 활성에 큰 영향을 미치지 않았지만, Mn2+의 경우 56.2%의 효소활성을 나타냈다. 또한, Cu2 +와 Fe2 +의 경우, 효소 활성을 10%로 매우 낮게 나와 강력하게 저해하였다.
금속이온 상대 효소 활성(%)
대조군 100.0±2.8
Mg2 + 98.9±2.3
Ca2 + 82.0±1.5
Mn2 + 52.6±2.1
Ni2 + 90.3±2.7
Cu2 + 0.0±0.0
Fe2 + 8.2±0.3
Co2 + 95.7±1.6
<실시예 4> Bgl1B의 기질 특이성 확인
Bgl1B 단백질의 기질 특이성을 확인하기 위해, 각 이당류를 0.2% (w/v)의 농도가 되도록 하여 20 mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6)에서 0.6 U의 Bgl1B과 1시간 반응시켰다. 사용된 기질은 두 그룹으로 첫 번째 그룹은 육상유래 이당류로서, 셀로바이오스(베타-1,4 결합), 락토오스(베타-1,4 결합), 젠티오바이오스(베타-1,6 결합), 수크로오스(알파-1,2 결합), 말토오스(알파-1,4 결합) 및 멜리바이오스(알파-1,6 결합)이며, 두 번째 그룹은 해양유래 기질로서, 라미나리바이오스(베타-1,3 결합), 아가로바이오스(베타-1,4 결합), 네오아가로바이오스 및 삼당류인(알파-1,4 결합), 아가로트리오스(베타-1,6 결합 및 알파-1,4 결합)를 사용하였다.
도 5에서 나타난 것과 같이, Bgl1B는 모든 베타-결합을 가진 이당류를 가수분해할 수 있었다. 이에 반해 Bgl1B은 모든 알파-결합을 가진 이당류는 가수분해하지 못하였다. 또한, 아가로트리오스도 가수분해하지 못하였다. 따라서 Bgl1B은 베타-결합을 가진 이당류를 가수분해할 수 있는 광범위한 효소활성을 가지고 있는 것으로 확인되었다.
<실시예 5> 다양한 기질에 대한 Bgl1B의 효소 반응속도 확인
Bgl1B 단백질의 다양한 기질에 대한 효소 반응속도를 확인하기 위하여, 각 기질을 0.1-0.4% (w/v)의 다양한 농도로 하여 pH 6, 40℃에서 반응시켰다. 효소 반응속도에 관련된 변수인 Vmax, Km 및 kcat는 Lineweaver-Burk plot으로부터 결정되었다.
효소 기질 글리코시드 결합 Vmax(U/mg protein) Km(mM) kcat(s-1) kcat/Km(mM-1s-1)
Bgl1B 라미나리바이오스 β-1,3 1.1x102 9.9x10-1 9.1x101 9.2x101
셀로바이오스 β-1,4 1.6x101 2.0x101 1.3x101 6.5x10-1
젠티오바이오스 β-1,6 1.1x100 1.3x101 8.8x10-1 6.6x10-2
락토오스 β-1,4 1.0x100 2.0x101 8.3x10-1 4.1x10-2
아가로바이오스 β-1,4 3.1x10-1 6.9x101 2.6x10-1 3.7x10-3
Novozyme 188 라미나리바오스 β-1,3 4.2x10-1 2.5x100 8.5x10-1 3.4x10-1
셀로바이오스 β-1,4 3.9x100 3.4x100 7.8x100 2.3x100
표 2에 나타난 결과처럼, 변수를 종합적으로 볼 때 Bgl1B는 라미나리바이오스에 대해 가장 높은 기질특이성을 보였다. 이는 상용화 효소인 Novozyme 188 보다 259배 높은 Vmax와 2.5 배 낮은 Km 및 108배 높은 kcat을 보여, 촉매 효율이 108배 높은 것으로 나타났다. 그 다음으로 Bgl1B이 높은 기질 특이성을 갖는 것은 셀로바이오스, 젠티오바이오스, 락토오스 및 아가로바이오스 순이다.
<실시예 6> HPLC 및 TLC를 이용한 Bgl1B 단백질의 효소 반응 특성 확인
다당류인 라미나린을 기질을 이용하여 Bgl1B 단백질의 효소 반응 특성을 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)와 Thin Layer Chromatography(TLC)를 사용하여 분석하였다. HPLC 분석은 gel permeation and ligand exchange column(KS-802;Shodex)와 시차굴절 검출기(refractive index detector)를 장착한 Agilent 1100 HPLC 장비를 이용해서 분석하였으며, 분석 조건은 유속 0.5 mL/min, 컬럼온도 80℃ 및 이동상은 멸균수를 사용하였다. TLC 분석은 반응산물 1 ㎕를 silica gel 60 plated(Merck)에 로딩한 후, n-부탄올:아세트산:물(3:2:2 부피비) 혼합용매를 이용하여 전개하였으며, 시각화를 위해 10% (v/v) 황산 처리하였다.
0.2% (w/v) 라미나린에 대하여 3 U Bgl1B를 40℃에서 24시간 반응시킨 결과, 도 6(a)와 같이 라미나린에서 포도당이 생성된 수율은 75%의 매우 높은 수율이며, 도 6(b)와 같이 Bgl1B에 의해 라미나린이 분해되면서 올리고당은 생성되지 않고 오직 포도당만 생성되는 것을 HPLC 분석으로 확인할 수 있었다.
또한, 반응조건을 달리하여, 0.2% (w/v) 라미나린 기질 대비 Bgl1B의 농도를 0.03 U로 매우 낮게 반응시킨 결과, 도 7a-b와 같이 24시간까지는 라미나린으로부터 포도당이 생성되다가 그 이후로 포도당은 더는 증가하지 않고 DP2, DP3, DP4 와 같은 낮은 중합도의 올리고당이 생성되었다. 이는 라미나리바이오스의 경우에서도 확인되었다.
0.3% (w/v) 라미나리바이오스에 대하여 0.002 U Bgl1B를 반응시킨 결과, 도 8(a, b)과 같이 DP3가 생성되는 것을 확인하였다.
이 결과들은 Bgl1B을 이용하여 원하는 조건을 통해 Bgl1B 단독으로 라미나린으로부터 발효가능성 당인 포도당을 주요산물로 생성할 수 있으며, 또한 라미나린 및 라미나리바이오스로부터 트랜스글리코실레이즈 활성을 통해 기능성 소재인 올리고당이 생성됨을 확인하였다.
본 발명은 효소적 반응에 의한 포도당 및 라미나리올리고당 생산 분야에 적용할 수 있다.

Claims (10)

  1. SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지며 엑소-타입의 글루카네이즈 및 트랜스글리코실레이즈 활성을 갖는 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)를 포함하는 포도당 또는 라미나리올리고당 생산용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    베타-글루코시데이즈는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40T에서 유래한 것인, 포도당 또는 라미나리올리고당 생산용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    베타-글루코시데이즈는 상기 베타-글루코시데이즈를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 얻은 것인, 포도당 또는 라미나리올리고당 생산용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    유전자는 SEQ ID NO: 2의 염기서열을 포함하는, 포도당 또는 라미나리올리고당 생산용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    베타-글루코시데이즈는 라미나린, 라미나리바이오스, 셀로바이오스, 젠티오바이오스, 락토오스 및 아가로바이오스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 기질을 사용하는, 포도당 또는 라미나리올리고당 생산용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    라미나리올리고당은 중합도(degrees of polymerizations) 2 내지 10의 라미나리올리고당 중 어느 하나인, 포도당 또는 라미나리올리고당 생산용 조성물.
  7. SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)를 라미나린 또는 라미나리바이오스와 반응시켜 포도당 또는 라미나리올리고당을 생산하는 것을 포함하는 포도당 또는 라미나리올리고당의 생산방법.
  8. 제7항에 있어서,
    포도당은 기질인 라미나린 (mg) 대비 0.1 내지 3 U의 베타-글루코시데이즈를 25 내지 40 ℃, 2 내지 48 시간의 조건에서 반응시켜 생산되는 것인, 포도당 또는 라미나리올리고당의 생산방법.
  9. 제7항에 있어서,
    라미나리올리고당은 기질인 라미나린 (mg) 대비 0.005 내지 0.05 U 또는 기질인 라미나리바이오스 (mg) 대비 0.0001 내지 0.005 U의 베타-글루코시데이즈를 2 내지 40 ℃, 2 내지 72 시간의 조건에서 반응시켜 생산되는 것인, 포도당 또는 라미나리올리고당의 생산방법.
  10. 제7항에 있어서,
    라미나리올리고당은 중합도 2 내지 10의 라미나리올리고당 중 어느 하나인, 포도당 또는 라미나리올리고당의 생산방법.
PCT/KR2019/002706 2018-03-12 2019-03-08 해조류로부터 포도당 및 라미나리올리고당을 생산하는 신규한 베타-글루코시데이즈 WO2019177311A1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/979,568 US11248246B2 (en) 2018-03-12 2019-03-08 Beta-glucosidase for producing glucose and laminarioligosaccharide from sea weed
CN201980018506.6A CN111836900A (zh) 2018-03-12 2019-03-08 从海藻生产葡萄糖及昆布多糖寡糖的新型β-葡萄糖苷酶

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2018-0028510 2018-03-12
KR1020180028510A KR102011718B1 (ko) 2018-03-12 2018-03-12 해조류로부터 포도당 및 라미나리올리고당을 생산하는 신규한 베타―글루코시데이즈

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019177311A1 true WO2019177311A1 (ko) 2019-09-19

Family

ID=67806954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/002706 WO2019177311A1 (ko) 2018-03-12 2019-03-08 해조류로부터 포도당 및 라미나리올리고당을 생산하는 신규한 베타-글루코시데이즈

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11248246B2 (ko)
KR (1) KR102011718B1 (ko)
CN (1) CN111836900A (ko)
WO (1) WO2019177311A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102011718B1 (ko) * 2018-03-12 2019-08-19 고려대학교 산학협력단 해조류로부터 포도당 및 라미나리올리고당을 생산하는 신규한 베타―글루코시데이즈
CN111593034B (zh) * 2020-06-24 2022-07-05 江南大学 利用β-1,6-葡聚糖酶制备低聚龙胆糖的方法及其应用
CN112430614B (zh) * 2020-11-09 2022-10-25 集美大学 一种昆布多糖酶及其应用
CN113667661B (zh) * 2021-07-26 2023-11-07 青岛大学 一种β-葡萄糖苷酶及其在制备葡萄糖和昆布寡糖中的应用
CN114410611B (zh) * 2021-12-21 2023-01-17 中国海洋大学 昆布多糖降解酶OUC-BsLam26及其应用
CN114196655B (zh) * 2021-12-21 2022-11-15 中国海洋大学 耐热性昆布多糖降解酶OUC-SaLam66及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101784665B1 (ko) * 2016-07-07 2017-11-07 고려대학교 산학협력단 베타―글루칸으로부터 젠티오바이오스 또는 글루코스를 생산하는 신규한 베타―1,6―엔도글루카네이즈
KR20170124149A (ko) * 2016-04-29 2017-11-10 고려대학교 산학협력단 베타―글루칸으로부터 올리고당 또는 글루코스를 생산하는 신규한 베타－１,３－１,６－엔도글루카네이즈

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101483162B1 (ko) 2014-04-07 2015-01-22 (주) 그린솔루션 적외선 센서와 ｇｐｓ를 이용한 녹조 저감 및 부유물 제거 장치
CN104232606B (zh) * 2014-08-29 2017-12-05 山东大学 一种改造的β‑葡萄糖苷酶及其表达基因与应用
KR102011718B1 (ko) * 2018-03-12 2019-08-19 고려대학교 산학협력단 해조류로부터 포도당 및 라미나리올리고당을 생산하는 신규한 베타―글루코시데이즈

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170124149A (ko) * 2016-04-29 2017-11-10 고려대학교 산학협력단 베타―글루칸으로부터 올리고당 또는 글루코스를 생산하는 신규한 베타－１,３－１,６－엔도글루카네이즈
KR101784665B1 (ko) * 2016-07-07 2017-11-07 고려대학교 산학협력단 베타―글루칸으로부터 젠티오바이오스 또는 글루코스를 생산하는 신규한 베타―1,6―엔도글루카네이즈

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Protein 12 May 2016 (2016-05-12), "beta-glucosidase [Saccharophagus degradans]", XP055641147, retrieved from NCBI Database accession no. WP_011467876.1 *
MOTONE, K . ET AL.: "Direct ethanol fermentation of the algal storage polysaccharide laminarin with an optimized combination of engineered yeasts", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 231, 2016, pages 129 - 135, XP029660364, DOI: 10.1016/j.jbiotec.2016.06.002 *
ZHANG, W. ET AL.: "Purification, characterization and function analysis of an extracellular p-glucosidase from elongating stipe cell walls in Coprinopsis cinerea", FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 363, no. 9, 2016, pages 1 - 9, XP055641157 *

Also Published As

Publication number Publication date
US11248246B2 (en) 2022-02-15
US20210040522A1 (en) 2021-02-11
CN111836900A (zh) 2020-10-27
KR102011718B1 (ko) 2019-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019177311A1 (ko) 해조류로부터 포도당 및 라미나리올리고당을 생산하는 신규한 베타-글루코시데이즈
WO2010110599A2 (ko) 신규한 알파-네오 아가로바이오스 가수분해 효소 및 그를 이용한 단당류의 획득 방법
KR101521711B1 (ko) 신규한 아가로올리고당 분해효소 및 이를 이용한 아가로오스로부터 3,6-안하이드로-l-갈락토오스와 갈락토오스의 생산방법
CN109072270B (zh) 用于产生低聚糖或葡萄糖的组合物及其产生的方法
CN110452919B (zh) 一种截短的褐藻胶裂解酶Aly7B-CDII基因及其应用
WO2017126862A1 (ko) 내열성 한천분해효소 및 이를 이용한 단당류의 생산방법
EP2543723B1 (en) Method for producing glucosidase, enzyme composition, and biomass hydrolysis method
WO2018008900A1 (ko) 베타-글루칸으로부터 젠티오바이오스 또는 글루코스를 생산하는 신규한 베타-1,6-엔도글루카네이즈
CN114277043B (zh) 一种耐热甘露糖苷酶基因及其表达蛋白和应用
CN115747236A (zh) 一种α-葡萄糖苷酶、编码基因、载体、宿主及其应用
WO2016053025A2 (ko) 완충용액 전처리를 이용하여 한천에서 단당류의 생산 수율을 개선하는 방법
CN113832121A (zh) 一种粘细菌裂解多糖单加氧酶及其基因工程菌和应用
WO2020050659A1 (ko) 한천으로부터 당 알코올의 생물학적 신규 제조방법
Brumm et al. Identification, cloning and characterization of Dictyoglomus turgidum CelA, an endoglucanase with cellulase and mannanase activity
KR102300386B1 (ko) 알파- 및 베타-1,4-글리코시드 결합을 모두 절단하는 효소의 용도
CN109762798A (zh) 一种巴伦葛兹类芽孢杆菌壳聚糖酶的制备方法与应用
CN116179516B (zh) 一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用
CN116410960B (zh) 嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G及其应用
CN108841810B (zh) 一种多功能纤维素酶基因及其应用
CN116640744B (zh) 壳聚糖酶OUC-CsnA4-S49I及其应用和制备壳寡糖的方法
CN117286125A (zh) 一种重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、编码基因及其应用
WO2012165577A1 (ja) サーモスポロスリックス・ハザケンシスに由来する新規セルラーゼ
JP2009153516A (ja) β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ
CN111218439A (zh) 一种具有pH广泛稳定性的适冷褐藻胶裂解酶AlgL2及其应用
KR20180105623A (ko) 내열성 및 내산성을 가지는 Acidothermus 속 유래 탈분지 효소를 이용한 전분당으로부터 포도당의 생산 방법 및 그 포도당

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19766649

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19766649

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1