WO2016053025A2 - 완충용액 전처리를 이용하여 한천에서 단당류의 생산 수율을 개선하는 방법 - Google Patents

완충용액 전처리를 이용하여 한천에서 단당류의 생산 수율을 개선하는 방법 Download PDF

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WO2016053025A2
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최인걸
이찬형
윤은주
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고려대학교 산학협력단
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    • C12P19/02—Monosaccharides

Definitions

  • the present invention relates to a method for improving the yield of monosaccharides 3,6-anhydro-L-galactose and galactose using a buffer as a pretreatment solvent for the enzymatic production of monosaccharides in agar.
  • Algae have a less content of hardly soluble components such as lignin than wood-based and herbal biomass, which are currently used in many fields, and can be converted to monosaccharide, a raw material for producing bioenergy and biochemicals. There is this.
  • lignin a raw material for producing bioenergy and biochemicals.
  • it since it does not use food resources, it is also free from problems caused by the energyization of food resources. For this reason, seaweeds are becoming an important biomass for biochemical production, including alternative energy (Wi et al, Bioresour). Technol , 100 (2009), pp. 6658-6660).
  • red algae e.g. Gelidium amansii
  • agaroligosaccharides its constituents, have been reported to have excellent physiological activities such as antioxidant, anti-inflammatory, anti-cancer, anti-allergic, whitening, and moisturizing. Its use is also high in the field (Tomono et al. US Patent No. 76622291 (2009), Enoki et al. US Patent No. 691143282 (2005), Chen et al. Food Technol Biotechnol . 43 (1) pp.29- 36 (2005), Chen et al. Nut J. 5 (31) pp. 1-12 (2006).
  • Tomono et al. US Patent No. 76622291 (2009), Enoki et al. US Patent No. 691143282 (2005), Chen et al. Food Technol Biotechnol . 43 (1) pp.29- 36 (2005), Chen et al. Nut J. 5 (31) pp. 1-12 (2006).
  • neoagarobiose binds to beta-1,4, based on neoagarobiose, in which 3,6-anhydro-L-galactose and D-galactose are bound by alpha-1,3 bond.
  • the main component is agarose which is a polymer connected to each other.
  • Neoagarobiose and agarotriose (D-galactose-beta-1,4 bond-3,6-anhydro), the main reaction products by the Aga50D enzyme, an exo-type agarase that is processed after chemical pretreatment -L-galactose-alpha-1,3 bond-D-galactose).
  • the neoagarobiose is then hydrolyzed to 3,6-anhydro-L-galactose and D-galactose by Sd NABH, an alpha-neogarobiose hydrolase. .
  • pretreatment is essential for improving the reactivity of the Aga50D enzyme, but the mild chemical pretreatment method using weak acid, which is currently used, has to undergo a process such as neutralization or lyophilization for the enzymatic reaction. Incurred and the processing cost is considerable.
  • alpha-1,3 bonds between 3,6-anhydro-L-galactose and D-galactose are degraded, resulting in agarotriose when treated with exo-type beta-agarase.
  • the remaining residues which could not be finally decomposed into 3,6-anhydro-L-galactose and D-galactose, resulted in a decrease in the yield of monosaccharides.
  • agarose is an initial substrate for the production of 3,6-anhydro-L-galactose and D-galactose.Agarose is expensive because it is produced through several separate purification processes from red algae. There was a downside.
  • An object of the present invention is to use agar as a substrate to shorten the production process, reduce the production cost, and to adopt a pretreatment solvent and a hydrolase used for enzymatic hydrolysis. It is to provide a method for improving the production yield of L-galactose and galactose.
  • the present invention comprises the steps of pre-treating agar with a buffer solution of pH 6-9; And sequentially hydrolyzing the agarase, agarolytic beta-galactosidase, and alpha-neogarobiose hydrolase to the pretreatment.
  • the present invention uses agar instead of agarose as an initial substrate, a buffer solution as a pretreatment solvent, and agarase, agaroratic beta-galactosidase and alpha-neo as enzymes used for enzymatic hydrolysis.
  • agarose hydrolases sequentially to improve the yield of monosaccharides 3,6-anhydro-L-galactose and galactose, while significantly reducing the neutralization salt produced in the neutralization process of pretreatment, Using low cost agar has the effect of shortening the production cost and production process.
  • Figure 1 shows a TLC photograph of the pretreatment and the reaction of each enzyme by using agar as a substrate
  • Std is AHG (3,6- anhydro-L-galactose), DP2 (neo agarose), Gal as standard (Galactose), and DP3 (agarotrios), with lane 1 pre-treated agar, lane 2 agarase (Aga50D) reactants on pre-treated agar, lane 3 with agararomatic beta- Reactant treated with galactosidase (ABG), lane 4 treated with agararomatic beta-galactosidase reactant with alpha-neogarobiose hydrolase (NABH), and lane 5 treated with agarase Reactants treated with NABH without ABG are shown respectively.
  • Figure 2 is a result of quantitatively measuring the production yield improvement of 3,6- anhydro-L-galactose when using agararomatic beta-galactosidase (ABG) through HPLC analysis.
  • ABSG agararomatic beta-galactosidase
  • Figure 3 is a result of quantitatively measuring the production yield improvement of D-galactose when using agararomatic beta-galactosidase (ABG) through HPLC analysis.
  • ABSG agararomatic beta-galactosidase
  • pH 6-9 means a numerical range including pH 6 and pH 9.
  • the present invention comprises the steps of pre-treating agar with a buffer solution of pH 6-9; And sequentially hydrolyzing the agarase, agarolytic beta-galactosidase, and alpha-neogarobiose hydrolase to the pretreatment.
  • the method for improving the production yield of 3,6-anhydro-L-galactose and galactose of the present invention uses agar, which is less expensive than agarose as an initial substrate, and is pretreated using a buffer solution as a pretreatment solvent. , Aga50D enzyme, agarolytic beta-galactosidase and alpha-neogarobiose hydrolase, which are exo-type agarases to the pretreatment, are sequentially reacted. 3,6-anhydro-L-galactose and galactose production yield excellent enough to produce monosaccharides from agarose acid degradation products.
  • the first step is the pretreatment of agar with a buffer solution.
  • the buffer solution is to meet the optimum requirements of the enzymatic hydrolysis process of agar, the agar is difficult to enzymatic hydrolysis due to the gelling effect when pre-treatment, that is, heat treatment using water as a pre-treatment solvent. For this reason, a buffer solution is treated in agar to prevent such gelling effect.
  • neutral tris-HCl, sodium acetate, pH 6-9, more specifically pH 7-8, Sodium citrate, sodium phosphate, glycine-NaOH and the like can be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of agar in the buffer solution is preferably 0.1 to 5%.
  • agar 0.02-1 g may be added. Within this range, agar oligosaccharides can be produced effectively from agar.
  • the pretreatment conditions with the buffer solution may be carried out for 1 minute-1 hour at a temperature of 100-200 °C to produce agarose oligosaccharide in agar effectively.
  • the method for improving the production yield of 3,6-anhydro-L-galactose and galactose of the present invention may be further subjected to a neutralization process for agar that has been pretreated.
  • the neutralization process is to adjust the pH of the pretreatment to a neutral state, that is, pH 6-8, in order to meet the optimum conditions of enzymatic hydrolysis.
  • a suitable solvent NaOH, ammonium hydroxide, hydrochloric acid (HCl), etc. may be used, but is not limited thereto.
  • the second step is a process of producing monosaccharides by performing enzymatic hydrolysis on the pretreatment.
  • Enzymatic hydrolysis is characterized by sequentially reacting agarase, agarolytic beta-galactosidase and alpha-neogarobiose hydrolase to the agar pretreatment. .
  • the agar is decomposed into agaro oligosaccharides, and the disaccharides, neoagarobiose and agarotriose (D-galactose-beta-1,4 bond-3,6-anhydro) by the exo-type agarase.
  • -L-galactose-alpha-1,3-binding-D-galactose and neoagarobiose is finally synthesized by alpha-neogarobiose hydrolase and finally 3,6-anhydro-L-galactose and D It is hydrolyzed to galactose.
  • galactose may be effectively released by reacting agararotic beta-galactosidase, which acts only on the galactose moiety at the non-reducing end of the agarotriose, with the agarase reactant prior to the treatment of alpha-neogarobiose hydrolase.
  • the method of the present invention provides a method for treating 3,6-anhydro-L-galactose and D-galactose by sequentially treating agarase, agaroratic beta-galactosidase, and alpha-neogarobiose hydrolase. It will improve production yield.
  • the hydrolysis reaction can be carried out for 30 minutes-7 days at 0-200 rpm conditions in a temperature range of 20-40 °C.
  • agarases that decompose agaro-oligosaccharides to produce the disaccharides, neoagarobiose and agarotriose, are ⁇ -1,4-glyco between D-galactose of agarose and 3,6-anhydro-L-galactose.
  • An enzyme that cleaves side bonds hereinafter referred to as 'Aga50D' can be used.
  • the agarase has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, 97% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and sequence identity with the sequence At least 98% and at least 99%.
  • the agarase is Saccharophagus degradans ) may be derived from 2-40, but is not particularly limited thereto.
  • the agarase can be transcribed and translated through DNA segments, ie coding genes, involved in producing polypeptides comprising the intervening sequences between individual coding segments as well as regions before and after coding regions of enzymes.
  • DNA segments ie coding genes, involved in producing polypeptides comprising the intervening sequences between individual coding segments as well as regions before and after coding regions of enzymes.
  • it may be a sequence set forth in SEQ ID NO: 2, but is not particularly limited thereto.
  • agarolytic beta-galactosidase which acts to release galactose from agarooligosaccharides, contains not only the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, but also one or more substitutions, deletions, Proteins having the agaroligosaccharide hydrolytic activity as a transmutation protein, such as translocation, addition, etc., are also included in the scope of the enzyme of the present invention.
  • sequence identity of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 is 80% or more, Amino acid sequences of at least 85%, at least 90%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, and at least 99% (hereinafter referred to as ' Vej ABG'). .
  • the agaroratic beta-galactosidase may act only on the galactose moiety at the non-reducing end of the agaroligosaccharides such as agarotriose, and may be derived from the Vibrio sp. EJY3 strain.
  • the agaroratic beta-galactosidase can be transcribed and translated through a DNA segment, ie, a coding gene, involved in producing a polypeptide comprising an intervening sequence between individual coding segments as well as regions before and after the coding region of an enzyme.
  • a DNA segment ie, a coding gene, involved in producing a polypeptide comprising an intervening sequence between individual coding segments as well as regions before and after the coding region of an enzyme.
  • it may be a sequence set forth in SEQ ID NO: 4, but is not particularly limited thereto.
  • alpha-neogarobiose hydrolase capable of decomposing the neoagarobiose produced through the enzymatic reaction into D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose is shown in SEQ ID NO: 5
  • the alpha-neoagarobiase hydrolase may be derived from Saccharophagus degradans 2-40, but is not particularly limited thereto.
  • the alpha-neogarobiose hydrolase may be transcribed and translated through DNA segments, ie coding genes, involved in producing a polypeptide comprising an intervening sequence between individual coding segments as well as regions before and after coding regions of the enzyme.
  • DNA segments ie coding genes, involved in producing a polypeptide comprising an intervening sequence between individual coding segments as well as regions before and after coding regions of the enzyme.
  • it may be a sequence set forth in SEQ ID NO: 6, but is not particularly limited thereto.
  • the polypeptide has a certain ratio (eg, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99%) of sequence identity with respect to another sequence, when aligning the two sequences, By comparison it is meant that the amino acid residues in this ratio are identical.
  • the alignment and percent homology or identity may be determined by any suitable software program known in the art, such as those described in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (FM Ausubel et al. (Eds) 1987 Supplement 30 section 7.7.18). Can be determined using Preferred programs include the GCG Pileup program, FASTA (Pearson et al. 1988 Proc. Natl Acad .
  • BLAST BLAST Manual, Altschul et al., Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, MD, and Altschul et al. 1997 NAR25: 3389- 3402).
  • Another preferred alignment program is ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA), preferably using basic parameters.
  • TFASTA Data Searching Program available from Sequence Software Package Version 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.).
  • protein and “polypeptide” are used interchangeably herein. Conventional one or three letter codes are used herein for amino acid residues.
  • the term “recombinant” means that the cell, nucleic acid, protein or vector has been modified by introduction of a heterologous nucleic acid or protein or alteration of the original nucleic acid or protein, or The cell refers to a cell derived from such a modified cell. That is, for example, a recombinant cell expresses a gene that is not found within the original (non-recombinant) form of the cell, or alternatively expresses a native gene that is abnormally expressed or not expressed at all upon expression. Expression.
  • nucleic acid encompasses single- or double-stranded DNA, RNA, and chemical variants thereof.
  • Nucleic acid and polynucleotide can be used interchangeably herein. Because the genetic code is degenerate, one or more codons can be used to encode a particular amino acid, and the invention encompasses polynucleotides encoding a particular amino acid sequence.
  • introduction of inserting a nucleic acid sequence into a cell means “transfection”, or “transformation” or “transduction” and refers to the integration of the nucleic acid sequence into eukaryotic or prokaryotic cells. Mention is included, wherein the nucleic acid sequence is integrated into the cell's genome (eg, chromosome, plasmid, pigment, or mitochondrial DNA), converted to autonomic replicon, or transiently expressed.
  • the cell's genome eg, chromosome, plasmid, pigment, or mitochondrial DNA
  • the agarase is Saccharophagus can be isolated and purified from the culture supernatant or supernatant water in degradans), a saccharide by using a genetically engineered recombinant techniques wave Gus de gras thiooxidans (Saccharophagus degradans ) can be produced and separated by strains or artificial chemical synthesis.
  • the agarotropic beta-galactosidase is Vibrio sp.
  • Vibrio sp. can be isolated and purified from the culture supernatant or the supernatant of the water EJY3 strain, in using a genetically engineered recombinant techniques Vibrio (Vibrio sp.) Can be produced and separated by strains other than EJY3 strain or artificial chemical synthesis.
  • the alpha-neo-agarobiose hydrolase can be isolated and purified from the supernatant or supernatant of the culture of Saccharophagus degradans , Saccharopas degradans Other than Saccharophagus degradans can be produced and separated by strains or artificial chemical synthesis.
  • the hydrolysis reaction conditions of the agarase, agararomatic beta-galactosidase and alpha-neoarogabio hydrolysis are 30 minutes to 7 days under the conditions of 0 to 200 rpm in the temperature range of 20 to 40 °C, respectively Can be carried out. More specifically, it may be carried out for 10 hours to 24 hours in the temperature range of 25 to 35 °C.
  • the method for improving the production yield of 3,6-anhydro-L-galactose and galactose of the present invention is similar to that of using agarose as an initial substrate when pretreatment of agar using buffer as a pretreatment solvent. -The production yield of anhydro-L-galactose and galactose, as well as 100 times less content of the appropriate solvent (for example, NaOH) used for neutralization is suitable for mass production systems.
  • the appropriate solvent for example, NaOH
  • the culture medium was recovered by centrifugation (6000rpm, 4 °C, 15 minutes), the recovered cells were suspended in 20mM Tris buffer (Tris-HCl, 1M NaCl pH8) and crushed with an ultrasonic crusher and the suspension was centrifuged ( 16000 rpm, 4 ° C., 60 minutes), the supernatant was separated and purified by HisTrap HP column and HisTrap Q FF column (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) and confirmed by 8% SDS-PAGE.
  • Tris buffer Tris-HCl, 1M NaCl pH8
  • Two types of pretreatment were performed to compare the aglycosylation process after pretreatment of agar with 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer and agarose with 3% acetic acid.
  • Hydrolysis was carried out using microwave at 130 ° C. for 30 minutes. After neutralizing to pH 7 using 1M NaOH, the final concentration of agar and agarose was adjusted to 4.5% using distilled water.
  • Table 1 shows the results of confirming the final production yield, HMF production amount, and the amount of neutralizing solvent of 3,6-anhydro-L-galactose and D-galactose for each pretreatment condition and initial substrate.
  • Example 1 Each enzyme produced in Example 1 was reacted with 5 mL of the pretreatment of Example 2 in the order of Aga50D (19.0 U), ABG (4.6 U), and NABH (14.5 U). Each enzyme was reacted at 30 ° C. for 12 hours and inactivated for 5 minutes in water after the reaction. In order to confirm the effect of ABG on the process, only two enzymes except Aga50D and NABH except ABG were reacted under the same conditions.
  • the unit of Aga50D enzyme was defined as the amount of agarose produced from agarose for 1 minute at 30 ° C., 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7).
  • the unit of ABG and NABH enzyme was defined as the amount of D-galactose produced from agarose and neoagarobiose for 1 minute at 30 ° C. and 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7).
  • the present invention can be applied in the field of bioethanol production.

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Abstract

본 발명은 완충용액 전처리를 이용하여 한천에서 단당류의 생산 수율을 개선하는 방법에 관한 것으로, 초기 기질로 아가로스 대신에 한천을 사용하고, 전처리 용매로 완충용액을 사용하며, 효소적 가수분해에 사용되는 효소로 아가레이즈, 아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 적용하여 단당류인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스의 생산 수율을 효과적으로 개선하는 효과가 있다.

Description

완충용액 전처리를 이용하여 한천에서 단당류의 생산 수율을 개선하는 방법
본 발명은 한천에서 단당류를 효소적으로 생산하기 위한 전처리 용매로 완충용액을 사용하여 단당류인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스의 생산 수율을 개선하는 방법에 관한 것이다.
해조류는 현재 많은 분야에서 사용되고 있는 목질계, 초본계 바이오매스에 비해 리그닌 등의 난활용성 성분의 함량이 적어 훨씬 수월하게 바이오에너지 및 바이오케미컬을 생산하기 위한 원료물질인 단당으로 전환될 수 있는 장점이 있다. 또한 식량자원을 이용하지 않기 때문에 식량자원의 에너지화에 따른 문제로부터도 자유롭다. 이러한 이유로 해조류는 대체 에너지를 비롯한 바이오케미컬 생산에 있어서 중요한 바이오매스로 각광받고 있다(Wi et al, Bioresour Technol, 100 (2009), pp. 6658-6660).
특히 홍조류(예, Gelidium amansii)는 이러한 바이오에너지 및 바이오케미컬 생산의 원료뿐 아니라, 그 구성성분인 아가로올리고당이 항산화, 항염증, 항암, 항알러지, 미백, 보습 등의 생리학적 활성이 우수한 것으로 보고되고 있어 의약 및 미용분야에 있어서도 그 활용도가 높다(Tomono et al. 미국 특허 제76622291호(2009), Enoki et al. 미국 특허 제691143282호(2005), Chen et al. Food Technol Biotechnol. 43(1) pp.29-36(2005), Chen et al. Nut J. 5(31) pp.1-12(2006)). 홍조류의 경우 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스가 알파-1,3 결합에 의해 결합되어있는 네오아가로바이오스를 그 기본단위로 하여 네오아가로바이오스가 베타-1,4 결합으로 서로 연결되어 있는 중합체인 아가로스를 그 주요한 구성성분으로 한다.
본 발명자들은 네오아가로바이오스를 포함한 아가로올리고당의 생리학적 기능성이 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에서 기인한다는 사실을 실험적으로 증명하였다(Yun et al. Appll Microbiol Biotechnol. 97(7) pp.2961-70(2013)). 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산에 있어 수율이 매우 낮고 쉽게 과분해되는 문제점이 있는 화학적 처리방법(Jol et al. Anal Biochem. 268, pp.213-222(1999), Kim et al. Bull Korean Soc . 31(2) pp.511-514(2010))을 대신 할 마일드한 화학적 전처리와 효소적 당화과정을 통한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스의 생성공정 역시 보고한바 있다(대한민국 공개특허 제2013-0085017호).
화학적 전처리 이후 처리되는 엑소 타입(exo-type)의 아가레이즈인 Aga50D 효소에 의해 주된 반응산물인 네오아가로바이오스와 아가로트리오스(D-갈락토오스-베타-1,4 결합-3,6-안하이드로-L-갈락토오스-알파-1,3 결합-D-갈락토오스)로 분해된다. 이후 네오아가로바이오스는 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소인 SdNABH(대한민국 공개특허 제2010-0108241호)에 의해 최종적으로 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스로 가수분해된다. 이 과정에서 전처리는 Aga50D 효소의 반응성을 향상시키는 데 있어 필수적이나 현재 사용되고 있는 약산을 이용한 마일드한 화학전 전처리 방법은 이후 효소반응을 위해 중화 또는 동결건조 등의 공정을 거쳐야 하며 이 과정에서 다량 중화염이 발생하고 그 처리비용 또한 상당하다. 또한 화학적 전처리를 선행하게 될 경우 주로 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스 사이의 알파-1,3결합이 분해되게 되어 엑소-타입의 베타-아가레이즈를 처리하였을 때 아가로트리오스가 잔존하게 되어 최종적으로 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스로 분해되지 못하고 잔존하게 되는 점도 단당의 생산 수율을 감소시키는 원인이 되었다. 아울러, 현재까지 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스의 생산에는 아가로스를 초기 기질로 하는데, 아가로스는 홍조류로부터 수 차례의 분리정제공정을 거쳐 생산되기 때문에 그 가격이 비싸다는 단점이 있었다.
따라서, 전체 공정을 간소화하면서, 전체 공정 비용을 줄이고, 단당류의 생산 수율을 개선할 수 있는 공정 기술 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 생산 공정을 단축하고, 생산 단가를 감축하기 위해 기질로 한천을 사용하고, 전처리 용매와 효소적 가수분해에 사용하는 가수분해효소를 적절히 채택하여 단당류인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스의 생산 수율을 개선하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 pH 6 - 9의 완충용액으로 한천을 전처리하는 단계; 및 상기의 전처리물에 대해 아가레이즈, 아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 가수분해 반응시키는 단계를 포함하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스의 생산 수율을 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명은 초기 기질로 아가로스 대신에 한천을 사용하고, 전처리 용매로 완충용액을 사용하며, 효소적 가수분해에 사용되는 효소로 아가레이즈, 아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 적용하여 단당류인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스의 생산 수율을 효과적으로 개선하면서, 전처리물의 중화공정에서 생산되는 중화염을 대폭 감소시키며, 초기 기질로 저가의 한천을 사용함으로써 생산 단가와 생산 공정을 단축하는 효과가 있다.
도 1은 한천을 기질로 하여 전처리물 및 효소별 반응물에 대한 TLC 사진도를 나타낸 것으로, Std는 standard로 AHG(3,6-안하이드로-L-갈락토오스), DP2(네오아가로바이오스), Gal (갈락토오스), 그리고 DP3 (아가로트리오스)을 사용하였고, 레인 1은 전처리한 한천, 레인 2는 전처리한 한천에 대한 아가레이즈(Aga50D) 반응물, 레인 3은 아가레이즈 반응물에 아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈(ABG)를 처리한 반응물, 레인 4는 아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈 반응물에 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소(NABH)를 처리한 반응물, 및 레인 5는 아가레이즈 반응물에 ABG 없이 NABH를 처리한 반응물을 각각 나타낸다.
도 2는 HPLC 분석을 통해서 아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈(ABG)를 사용하였을 때 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산 수율 향상을 정량적으로 측정한 결과이다.
도 3은 HPLC 분석을 통해서 아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈(ABG)를 사용하였을 때 D-갈락토오스의 생산수율 향상을 정량적으로 측정한 결과이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서 수치범위를 기재함에 있어서, "-"란 표현은 각 수치범위의 임계치를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, pH 6 - 9는 pH 6과 pH 9를 포함하는 수치범위를 의미한다.
본 발명은 pH 6 - 9의 완충용액으로 한천을 전처리하는 단계; 및 상기의 전처리물에 대해 아가레이즈, 아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 가수분해 반응시키는 단계를 포함하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스의 생산 수율을 개선하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스의 생산 수율을 개선하는 방법은 초기 기질로 아가로스 대비 저가의 한천(agar)을 사용하고, 전처리 용매로 완충용액을 사용하여 전처리한 후, 상기 전처리물에 대해 엑소 타입(exo-type)의 아가레이즈인 Aga50D 효소, 아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 반응시켜 아가로스 산분해산물로부터 단당류를 생산하는 정도로 우수한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스 생산 수율을 얻을 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스의 생산 수율을 개선하는 방법을 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제1단계는 완충용액으로 한천을 전처리하는 과정이다.
상기 완충용액은 한천의 효소적 가수분해 공정의 최적 요건을 맞추기 위한 것으로, 한천은 전처리 용매로 물을 사용하여 전처리 즉 열처리할 경우 젤링 효과로 인해 효소적 가수분해가 어렵다. 이러한 이유로, 완충용액을 한천에 처리하여 이러한 젤링 효과가 나타나지 않도록 하는 것으로, 구체적으로는, pH 6 - 9, 더 구체적으로는 pH 7 - 8의 중성의 Tris-HCl, 소듐 아세테이트(sodium acetate), 소듐 시트레이트(sodium citrate), 소듐 포스페이트(sodium phosphate), glycine-NaOH 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
상기 완충용액 내 한천의 농도는 0.1 - 5%가 되게 하는 것이 좋다. 예컨대, 완충용액이 20 mL일 경우, 한천 0.02 - 1g을 부가할 수 있다. 상기 범위일 경우, 한천으로부터 효과적으로 아가로올리고당을 생산할 수 있다.
상기 완충용액에 의한 전처리 조건은 한천에서 효과적으로 아가로올리고당을 생산하기 위해 100 - 200℃의 온도에서 1분 - 1시간 동안 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스의 생산 수율을 개선하는 방법은 전처리를 거친 한천에 대해 중화과정을 추가로 실시할 수 있다.
상기 중화과정은 효소적 가수분해의 최적 조건을 맞추기 위한 것으로 전처리물의 pH를 중성의 상태, 즉, pH 6 - 8로 적정하는 것이다. 적정 용매로, NaOH, 암모늄 하이드록사이드(ammonium hydroxide), 염산 (HCl) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스의 생산 수율을 개선하는 방법에 있어서, 제2단계는 상기 전처리물에 대해 효소적 가수분해를 수행하여 단당류를 생산하는 과정이다.
효소적 가수분해는 상기의 한천 전처리물에 대해 아가레이즈, 아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 반응시키는 것을 특징으로 한다.
상기 전처리 과정을 통해 한천은 아가로올리고당으로 분해되고, 상기 엑소 타입의 아가레이즈에 의해 이당체인 네오아가로바이오스와 아가로트리오스(D-갈락토오스-베타-1,4 결합-3,6-안하이드로-L-갈락토오스-알파-1,3 결합-D-갈락토오스)로 분해되며, 네오아가로바이오스는 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소에 의해 최종적으로 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스로 가수분해 된다. 이때, 아가로트리오스의 비환원 말단에서 갈락토오스 모이어티에만 작용하는 아가로라이틱 베타-갈락토시다제를 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소 처리 전에 아가레이즈 반응물과 반응시키면 갈락토오스가 효과적으로 방출될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 아가레이즈, 아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 처리함으로써 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스의 생산 수율을 개선하게 되는 것이다.
상기 가수분해 반응은 20 - 40℃의 온도 범위에서 0 - 200 rpm 조건으로 30분 - 7일 동안 실시할 수 있다.
상기 효소들에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
우선, 아가로올리고당을 분해하여 이당체인 네오아가로바이오스와 아가로트리오스를 생산하는 아가레이즈는 아가로스의 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 β-1,4-글리코사이드 결합을 절단하는 효소(이하, 'Aga50D'라 함)를 사용할 수 있다.
상기 아가레이즈는 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열 및 상기 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 아가레이즈는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 아가레이즈는 효소의 코딩 영역 전 및 후의 영역뿐만 아니라 개별 코딩 분절 사이의 개재 서열이 포함된 폴리펩티드를 생산하는데 연관된 DNA 분절, 즉 코딩 유전자를 통해 전사 및 번역될 수 있다. 예컨대, SEQ ID NO: 2에 기재된 서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
다음으로, 아가로올리고당에서 갈락토오스를 방출하는데 작용하는 아가로라이틱 베타-갈락토시다제(agarolytic β-galactosidase)는 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 효소의 하나 이상의 치환, 결손, 전위, 첨가 등의 변이 단백질로서 상기 아가로올리고당 가수분해 활성을 가지는 단백질도 본 발명의 효소의 권리범위에 포함되며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3에 개시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다(이하, 'VejABG'라 함).
상기 아가로라이틱 베타-갈락토시다제는 아가로트리오스 같은 아가로올리고당의 비환원 말단에서 갈락토오스 모이어티에만 작용할 수 있으며, 비브리오속(Vibrio sp.) EJY3 균주에서 유래한 것일 수 있다.
상기 아가로라이틱 베타-갈락토시다제는 효소의 코딩 영역 전 및 후의 영역뿐만 아니라 개별 코딩 분절 사이의 개재 서열이 포함된 폴리펩티드를 생산하는데 연관된 DNA 분절, 즉 코딩 유전자를 통해 전사 및 번역될 수 있다. 예컨대, SEQ ID NO: 4에 기재된 서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
마지막으로, 상기 효소 반응을 통해 생산된 네오아가로바이오스를 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스로 분해할 수 있는 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소는 SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열 뿐만 아니라 상기 효소의 하나 이상의 치환, 결손, 전위, 첨가 등의 변이 단백질로서 상기 네오아가로바이오스 가수분해 활성을 가지는 단백질도 본 발명의 효소의 권리범위에 포함되며, 바람직하게는 서열번호 3에 개시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다(이하, 'sdNABH'라 함).
상기 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소는 효소의 코딩 영역 전 및 후의 영역뿐만 아니라 개별 코딩 분절 사이의 개재 서열이 포함된 폴리펩티드를 생산하는데 연관된 DNA 분절, 즉 코딩 유전자를 통해 전사 및 번역될 수 있다. 예컨대, SEQ ID NO: 6에 기재된 서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 폴리펩티드가 또 다른 서열에 대하여 특정 비율 (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%)의 서열 동일성을 가진다는 것은, 상기 두 서열을 정렬시킬 때, 상기 서열들의 비교시에 상기 비율의 아미노산 잔기가 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 백분율 상동성 또는 동일성은, 당업계에 공지된 임의의 적당한 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel 등 (eds) 1987 Supplement 30 section 7.7.18)]에 기재된 것들을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직한 프로그램으로는, GCG Pileup 프로그램, FASTA(Pearson 등 1988 Proc. Natl Acad . Sci USA 85:2444-2448), 및 BLAST (BLAST Manual, Altschul 등, Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, MD, 및 Altschul 등 1997 NAR25:3389-3402)이 있다. 또 다른 바람직한 정렬 프로그램은 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, PA)로서, 바람직하게는 기본 매개변수를 사용하는 것이다. 사용 가능한 또 다른 서열 소프트웨어 프로그램은 Sequence Software Package Version 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) 에서 이용 가능한 TFASTA Data Searching Program 이다.
본 명세서에서 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 본원에서는 아미노산 잔기에 대하여 통상의 1문자 또는 3문자 코드가 사용된다.
본 발명에서 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때 용어 "재조합"은, 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 본래적 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 또는 상기 세포가 이렇게 변형된 세포로부터 유래한 것을 가리킨다. 즉, 예를 들어, 재조합 세포는 상기 세포의 본래적(비(非)재조합) 형태 내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는, 다르게는 발현 시 비정상적으로 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 본래적 유전자를 발현한다.
본 명세서에서 "핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥의 DNA, RNA, 및 이들의 화학적 변형체를 포괄한다. "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 유전 암호가 축퇴되어 있기 때문에, 특정 아미노산을 인코딩하기 위해서 하나 이상의 코돈을 사용할 수 있으며, 본 발명은 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
핵산 서열을 세포 내로 삽입하는 용어 "도입"은 "트랜스펙션 (transfection)", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입(transduction)"을 의미하며, 핵산 서열의 진핵 또는 원핵 세포 내로의 통합에 대한 언급이 포함되고, 이때 상기 핵산 서열은 세포의 게놈 (예컨대, 염색체, 플라스미드, 색소체, 또는 미토콘드리아 DNA) 내로 통합되어, 자율 레플리콘으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현된다.
상기 아가레이즈는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)의 배양물의 상등액 또는 상청액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다.
상기 아가로라이틱 베타-갈락토시다제는 비브리오속(Vibrio sp.) EJY3 균주의 배양물의 상등액 또는 상청액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 비브리오속(Vibrio sp.) EJY3 균주 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다.
상기 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)의 배양물의 상등액 또는 상청액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다.
재조합 기술을 이용하는 경우, 통상적인 재조합 단백질 발현의 용이함을 위하여 사용되는 인자들, 예컨대 항생제 저항성 유전자, 친화성 컬럼 크로마토그래피에 사용될 수 있는 리포터 단백질 또는 펩타이드를 사용할 수 있으며, 이러한 기술은 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시 가능한 범주에 해당된다.
상기 아가레이즈, 아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해의 가수분해 반응 조건은 각각 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 7일 동안 실시할 수 있다. 보다 구체적으로 25 내지 35℃의 온도 범위에서 10시간 내지 24시간 동안 실시할 수 있다.
상기의 효소적 가수분해 반응을 수행한 후, Aminex HPX-87H 컬럼(Bio-Rad, Richmond, CA) 및 HPLC(Agilent 1100, Agilent, Waldbronn, Germany)를 순차적으로 실시하여 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 D-갈락토오스를 정량할 수 있다.
본 발명의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스의 생산 수율을 개선하는 방법은 완충용액을 전처리 용매로 사용하여 한천을 전처리할 경우 아가로스를 초기 기질로 사용하였을 때와 유사한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스의 생산 수율을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 중화에 사용된 적정용매(예를 들어, NaOH)의 함량이 100배 정도 적게 사용되므로 대량생산시스템에 적합한 효과가 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 재조합 효소 생산
E. coli BL21(DE3)을 재조합 균주의 호스트로, pET-21a를 벡터로 사용하여 Aga50D (EMBL id : ADB81904), NABH (EMBL id : ADB81917), 그리고 ABG (EMBL id : CP003241) 효소에 대해 재조합 단백질을 생산하였다. 50㎍/mL의 암피실린이 첨가된 고체배지에 도말하여 형질전환에 의해 획득한 콜로니를 다시 50㎍/mL의 암피실린이 함유된 LB(Luria broth)에 접종 후 37℃, 220rpm의 조건으로 12시간 동안 종배양(seed culture) 하였다(20mL×2). 그 이후 1L씩의 LB 브로스가 담긴 3L-삼각플라스크 2개에 접종하여 같은 조건에서 3시간(OD=0.8) 진탕배양하고 1시간 동안 얼음에서 식힌 후 0.1mM의 IPTG를 첨가하여 16℃, 120rpm 조건으로 12시간 동안 발현을 유도하였다. 배양액은 원심분리(6000rpm, 4℃, 15분)하여 균체를 회수하였고, 회수한 균체는 20mM 트리스 완충액(Tris-HCl, 1M NaCl pH8)에 현탁하여 초음파 파쇄기로 파쇄한 후 그 현탁액을 원심분리(16000rpm, 4℃, 60분)하여 상등액을 HisTrap HP column과 HisTrap Q FF column(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 효소들을 분리 정제한 후 8% SDS-PAGE에서 확인하였다.
<실시예 2> 완충용액을 이용한 한천의 전처리
20mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액을 이용한 한천의 전처리와 3% 아세트산을 이용한 아가로스의 전처리 후 당화공정을 비교하기 위해 두 종류의 전처리를 수행하였다. 20mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충용액 20mL에 1g(5%) 한천을 혼합하여 170℃에서 5, 10, 15, 그리고 20분 간, 3% 아세트산 20mL에 1.4g(7%) 아가로스를 혼합하여 130℃에서 30분 간 마이크로웨이브를 이용하여 가수분해하였다. 이후 1M NaOH를 이용하여 pH 7로 중화하였으며, 한천과 아가로스의 최종 농도는 증류수를 이용하여 4.5%로 맞춰주었다.
표 1은 전처리 조건과 초기 기질 별로 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스의 최종 생산수율, HMF 생성량, 중화용매의 사용량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
전처리 효소적 가수분해
방법 기질 기질농도(%) 온도(℃) 시간(분) 중화제(1M NaOH, mL) HMF 수율a(%) 갈락토오스 수율a(%) AHG 수율a(%)
완충용액 전처리b 한천 5 170 5 0.0±0.0 0.3±0.2 19.3±1.1 20.0±0.7
10 0.1±0.0 1.3±0.2 44.8±3.5 44.9±1.7
15 0.3±0.0 3.9±0.1 26.4±0.5 39.1±0.1
20 0.4±0.0 8.4±0.8 10.2±2.4 41.3±1.2
산 처리c 아가로스 7 130 30 10.3±0.1 0.2±0.1 47.0±0.1 54.5±0.9
a: 생성된 HMF, 갈락토오스 및 AHG는 HPLC에 의해 검출되고, 초기 기질로부터 단당류의 최대량에 근거하여 평균±표준편차로 표현됨b: 완충용액으로 20mM Tris-HCl 용액(pH7.5)이 사용됨c: 3% 아세트산이 산 전처리에 사용됨
표 1에 나타난 바와 같이, 아세트산을 이용한 아가로스의 전처리(130℃, 30분)에 비해 20mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액을 이용한 한천의 전처리(170℃, 10분)에서 6배 높은 HMF 생산량을 보였으나 중화에 사용된 1M NaOH 양이 100배 적게 사용되어 대량생산체제에 더욱 적합한 것으로 나타났다. 아울러, 이 조건에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스의 생산 수율도 유사했다.
<실시예 3> 완충용액으로 전처리한 전처리물에 대한 효소적 당화공정
실시예 1에서 생산된 각 효소들을 Aga50D(19.0 U), ABG(4.6 U), 그리고 NABH(14.5 U) 순으로 실시예 2의 전처리물 5 mL에 반응시켰다. 각 효소들을 30℃에서 12시간씩 반응시켰으며, 반응 이후 끊는 물에서 5분간 불활성화시켰다. 공정상에서의 ABG의 효과를 확인하기 위해 ABG를 제외한 Aga50D와 NABH 두 효소만은 앞에서 말한 조건과 동일한 조건에서 반응시켰다.
최종 반응산물인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스는 Aminex HPX-87H 컬럼(Bio-Rad, Richmond, CA)을 사용하여 HPLC(Agilent 1100, Agilent, Waldbronn, Germany)로 정량하였다. 이동상은 0.01M 트리풀로아세트산을 포함한 40%(v/v) 아세토나이트릴(CH3CN) 수용액을 사용하였으며, 온도는 65℃에서 유속 0.5mL/min으로 분석하였다.
Aga50D 효소의 unit은 30℃, 20mM Tris-HCl 완충용액(pH 7) 조건에서 1분 동안 아가로스로부터 생성되는 아가로바이오스의 양으로 정의하였다.
ABG와 NABH효소의 unit은 30℃, 20mM Tris-HCl 완충용액(pH 7) 조건에서 1분 동안 각각 아가로트로오스와 네오아가로바이오스로부터 생성되는 D-갈락토오스의 양으로 정의하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스 모두 10분 동안 전처리한 후 ABG를 처리하였을 때 그 생산 수율이 가장 높게 나타났다. 또한, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 ABG 사용 시 1.3배 상승하였고 D-갈락토오스는 1.8배 상승하였다(도 2 및 3 참조).
본 발명은 바이오에탄올 제조 분야에서 적용할 수 있다.

Claims (9)

  1. pH 6 - 9의 완충용액으로 한천을 전처리하는 단계; 및
    상기의 전처리물에 대해 아가레이즈, 아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 가수분해 반응시키는 단계를 포함하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 갈락토오스의 생산 수율을 개선하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    완충용액은 Tris-HCl, 소듐 아세테이트(sodium acetate), 소듐 시트레이트(sodium citrate), 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 및 glycine-NaOH으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    전처리 시 완충용액 내 한천의 농도는 0.1 - 5%이 되도록 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    전처리 조건은 100 - 200℃의 온도에서 1분 - 1시간 동안 수행하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    가수분해 반응 전에 전처리물에 대해 중화과정을 추가로 수행하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    아가레이즈는 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    아가로라이틱 베타-갈락토시데이즈(agarolytic β-galactosidase)는 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    알파-네오아가로바이오스 가수분해효소는 SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    가수분해 반응은 20 - 40℃의 온도 범위에서 0 - 200 rpm 조건으로 30분 - 7일 동안 실시하는 것인 방법.
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