WO2017116217A1 - 내열성 및 내산성을 가지는 Acidothermus 속 유래 탈분지 효소를 이용한 전분당으로부터 포도당의 생산 방법 및 그 포도당 - Google Patents

내열성 및 내산성을 가지는 Acidothermus 속 유래 탈분지 효소를 이용한 전분당으로부터 포도당의 생산 방법 및 그 포도당 Download PDF

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glucose
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윤란영
김성보
박승원
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    • C08L3/12—Amylose; Amylopectin; Degradation products thereof

Definitions

  • the present application relates to a method for producing glucose from starch sugar by using a debranching enzyme and a glycosylating enzyme derived from Acidothermus genus.
  • Biomass can be largely divided into sugar (sugar), such as sugar cane, starch (corn), such as sweet potato (starch), and cellulose (cellulose), such as wood, silver grass, and the like.
  • sugar such as sugar cane
  • starch corn
  • sweet potato starch
  • cellulose cellulose
  • Sugar obtained easily from sugar cane can be directly ingested by microorganisms, so there is no need for a separate pretreatment or saccharification process.
  • starch like corn, is a major component, and its large molecular size makes it difficult for microbes to use directly. For this reason, it is necessary to break it into small sized glucose. Water enters this process and is called hydrolysis.
  • Starch hydrolysis is mainly done by enzymes, which are the same as what we eat and digest. When we eat rice with rice, it is broken down in the stomach by enzymes from the salivary glands and converted into glucose, which is then delivered to cells in our bodies for metabolism. The first step in converting starch to glucose is to loosen the starch structure by raising the temperature as we cook. This allows the enzyme to access the starch and break it down into glucose. The process of splitting starch into glucose by enzymes consists of complex mechanisms.
  • Enzymatic saccharification is one of the methods used for converting starch to glucose to produce glucose by reacting alpha-amylase derived from microorganisms to starch, followed by debranching enzymes and glycosylating enzymes.
  • Promozyme® Pullulanase, Novozyme Co., Ltd.
  • an enzyme isolated from Pseudomonas sp. Was used as the debranching enzyme used in the enzyme glycosylation method, but Promozyme® has a narrow side chain length [DP (Degree of Polymerization) 4) to 5], which is not suitable for hydrolysis of branched chains of various lengths (DP 3 to 30) present in starch sugar, resulting in low glucose yield.
  • the present application relates to a method for producing glucose from starch sugar using a novel debranching enzyme, specifically heat and acid resistance to a substrate solution comprising at least one starch sugar selected from the group consisting of starch, amylopectin and maltodextrin It relates to a method for producing glucose comprising the step of reacting by simultaneously adding a debranching enzyme and a saccharifying enzyme derived from Acidothermus having a.
  • isoamylase a debranching enzyme derived from Acidothermus
  • starch sugar the yield of glucose from starch sugar can be improved by hydrolyzing branched chains of various lengths.
  • Another object of the present application is to provide a method for improving the yield of glucose from starch sugar by using isoamylase and glycosylating enzyme derived from Acidothermus in a constant unit ratio.
  • the present application provides a method for producing glucose from starch sugar, comprising treating a debranching enzyme and glycosylating enzyme derived from Acidothermus genus to a substrate solution containing starch sugar .
  • the debranching enzyme derived from Acidothermus genus may include inserting a gene encoding a debranching enzyme derived from Acidothermus genus into a vector to produce an expression vector; Transforming the expression vector into a cell; And it may be prepared by a method comprising the step of culturing the transformed cells. Centrifugation and / or crushing the culture obtained after the culture may be further included. The crushing may be carried out by various methods known in the art, for example, an ultrasonic crusher may be used as the crushing method.
  • the vector may be pET-28a (+).
  • the debranching enzyme derived from Acidothermus genus may be isoamylase.
  • the debranching enzyme has a hydrolytic activity of ⁇ -1,6-linking, and in particular, shows specificity for a wide range of side chain lengths (DP; Degree of Polymerization) 3 to 30, thereby increasing glucose yield.
  • the glycosylase is an enzyme capable of catalyzing the hydrolysis of debranched starch sugar or starch sugar to glucose, and finally glucose can be produced from the starch sugar chain cleaved by the debranching enzyme by adding a glycosylating enzyme.
  • a glycosylating enzyme for example, ⁇ -amylase, ⁇ -amylase, glucoamylase and the like can be used, and specifically, glucoamylase can be used.
  • the glycosylation enzyme may be a glycosylation reaction in the range of pH 3 to pH 7, more specifically, may be performed at pH 3 to pH 6.
  • the reaction temperature of the glycosylating enzyme may be a temperature of 40 °C to 70 °C, more specifically 55 °C to 65 °C.
  • the Acidothermus sp is Acidothermus cellulolyticus strains.
  • Acidothermus The cellulolyticus strain may be Acidothermus cellulolyticus strain 11B [ATCC ® 43068 TM ].
  • the strain-derived isoamylase is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and also has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • E. coli E. coli
  • Bacillus microorganisms Bacillus microorganisms
  • yeast for example baker's yeast
  • Corynebacterium microorganisms and plants can be used.
  • the starch sugar may be at least one selected from the group consisting of starch, amylopectin and maltodextrin, and specifically, may be starch having an amylopectin structure.
  • Amylopectin and maltodextrin can be prepared by adding alpha amylase to starch.
  • the starch sugar may be, for example, starch sugar derived from any one of corn, tapioca, potato, and rice.
  • the starch sugar may be liquefied starch sugar.
  • Treatment of the debranching enzyme and saccharifying enzyme derived from Acidothermus genus to the substrate solution containing starch sugar may be performed in the range of pH 2 to pH 6, more preferably at pH 3 to pH 5 Most preferably at pH 4.3.
  • Treatment of the debranching enzyme and saccharifying enzyme derived from Acidothermus genus into a substrate solution containing starch sugar may be performed at a temperature of 40 ° C. to 70 ° C., more preferably at a temperature of 50 ° C. to 65 ° C. And most preferably at 65 ° C.
  • the unit ratio of the debranching enzyme and saccharifying enzyme derived from Acidothermus genus is 2: 1 to 60: 1, specifically 10: 1 to 60: 1, or specifically 10: 1 to 40: 1. It can be a range.
  • the debranching enzyme In order to exceed the reaction equilibrium of the glycosylating enzyme, the debranching enzyme needs help, and the higher the enzyme activity unit ratio, the higher the glucose yield, but the enzyme activity unit ratio of the glycosylating enzyme and the debranching enzyme derived from Acidothermus genus 1:60 If exceeded, the yield of glucose may decrease. In addition, since the glycosylation reaction that breaks down starch sugar into glucose plays a major role and the debranching enzyme plays a secondary role, if the enzyme activity unit ratio of debranching enzyme and saccharifying enzyme derived from Acidothermus genus is less than 2: 1 It does not play a role in breaking down starch sugar, which can reduce glucose yield.
  • Another aspect of the present application provides a method of using a debranching enzyme from the genus Acidothermus in producing glucose from starch sugar.
  • Acidacidmus having activity at 40 °C to 70 °C and pH 2 to pH 6 It provides a debranching enzyme derived from cellulolyticus .
  • the debranching enzyme has a hydrolytic activity of ⁇ -1,6-linking, and has good selectivity for chain length, particularly for DP 3 and 4, or at least 3, or at least 4, thereby increasing glucose yield. have.
  • the active temperature range of the debranching enzyme may be 40 ° C to 70 ° C, more preferably 50 ° C to 65 ° C, and most preferably 60 ° C.
  • the active pH range of the debranching enzyme may be pH 2 to pH 6, more preferably at pH 3 to pH 5, most preferably at pH 4.3.
  • debranching enzyme (Isoamylase) derived from Acidothermus genus in the production of glucose using starch sugar can improve the yield of producing glucose from starch sugar than using the conventional commercial enzyme debranching enzyme (Pullulanase). Can be.
  • the amount of side reaction (DP2) and unreacted (DP3, DP4 +) products generated during the starch sugar hydrolysis reaction is reduced, thereby reducing the amount of It can improve the yield of producing glucose.
  • the method for producing glucose from the starch sugar of the present application greatly improves the production yield of glucose because it uses a debranched enzyme that maintains activity under conditions of strong acidity and / or high temperature.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating several debranching enzymes and the resulting degradation process.
  • Example 1 Gene Acquisition and Recombinant Protein Production
  • the primer sequences used for PCR included some sequences at both ends of the debranching enzyme gene from Acidothermus cellulolyticus, which are acid / heat resistant microorganisms, and restriction enzyme reaction sequences of Nde I and Hind III , respectively.
  • the obtained DNA fragment was inserted into the pET-28a (+) vector and transformed into E. coli BL21 (DE3).
  • the DNA has the same nucleotide sequence as SEQ ID NO: 1.
  • the transformed Escherichia coli was plated in a plate medium containing kanamycin (kanamycin) to select the strain resistant to kanamycin (kanamycin) first.
  • the first selected strains were cultured in liquid, respectively, and the DNAs were purified and double-sliced into Nde I and Hind III. Finally, the strains showing 2.1 kb and 5.3 kb DNA fragments were finally selected.
  • the nucleotide sequence of the desired debranching enzyme gene sequence and the debranching enzyme obtained in this study were identical.
  • the frozen E. coli BL21 (DE3) strain was inoculated into a test tube containing 5 ml of LB medium, and the seed culture was performed at 37 ° C. until the absorbance was 2.0 at 600 nm.
  • the seed culture was added to a 2 L flask containing 500 ml of LB medium to carry out the main culture.
  • 0.1 mM IPTG isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactothiopyranoside
  • the stirring speed during the process was adjusted to maintain 180 rpm, the culture temperature was maintained at 37 °C, even after addition of IPTG was stirred at 120 rpm, the culture temperature was 20 °C.
  • the culture of the transformed strain was centrifuged at 6,000 ⁇ g at 4 ° C. for 20 minutes and washed twice with 50 mM Tris-HCl buffer, followed by Ni-NTA binding buffer (50 mM sodium phosphate, 300 mM Nacl). , 10 mM imidazole, pH 8.0) was added to disrupt the cell solution with an ultrasonic sonicator.
  • the cell lysate was again centrifuged at 13,000 ⁇ g for 20 minutes at 4 ° C. to separate only the cell supernatant as an enzyme solution. To accurately characterize the enzyme, it was purified using a Ni-NTA superflow column. The molecular weight of the purified enzyme was determined to be about 75 kDA by SDS-PAGE.
  • the debranching enzyme (isoamylase) activity from acid / heat resistant microorganisms was measured using HPLC.
  • HPLC analysis conditions for activity measurement are as follows.
  • Total analysis time is set to 20 minutes.
  • Acid / heat resistant microorganisms (Acidothermus cellulolyticus ) -derived debranched enzyme (isoamylase) activity was confirmed by the production of glucose degraded from starch by enzymatic complex reaction with glycosylated enzyme (Glucoamylase) using corn starch as a raw material. Enzyme reaction conditions are as follows.
  • Glucoamylase (Dupont Co., Ltd.) and debranching enzyme (Isoamylase, 50 mM sodium acetate buffer pH 4.3) produced in Example 1 using a total unit ratio of 1: 4 liquefied starch (DE ( Dextrose Equivalnet) 9.5) and the enzyme complex reaction was carried out for 72 hours at a temperature of 60 °C. The reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 5 minutes, followed by HPLC analysis to determine the amount of glucose produced. As a result, the yield of glucose degraded from corn starch was 96.2%. The yield of glucose degraded from starch was calculated as the area ratio of the products produced after the enzymatic reaction.
  • DE Dextrose Equivalnet
  • Example 3 Acidothermus Of origin Debranching enzyme( Isoamylase ) And commercial debranching enzymes ( Pullulanase Glucose yield comparison
  • the total unit ratio of glycosylated enzymes (Glucoamylase and Dupont) and the respective debranched enzymes (isoamylase and pullulanase) is 1: 4, which is 72 hours at liquefied starch (DE 9.5) and 60 ° C. Enzyme complex reaction was carried out. The reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 5 minutes, and then HPLC analysis was performed to determine the amount of glucose produced by the area ratio. As a result, the reaction using the debranching enzyme (isoamylase) derived from Acidothermus cellulolyticus resulted in commercial Higher glucose yields were obtained than the reaction used.
  • the change in glucose yield according to the concentration of debranching enzyme (isoamylase) from Acidothermus cellulolyticus was confirmed.
  • Enzyme reaction conditions are as follows. The total unit ratio of glycosylated enzymes (Glucoamylase, Dupont, Inc.) and debranched enzymes was 1: 2, 1:10, 1:20, 1:60, respectively. Enzyme complex reaction was carried out for 72 hours at 60 °C. The reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 5 minutes, and then HPLC analysis was performed to determine the amount of glucose produced by the area ratio. As a result, the higher the ratio of deglycolyase to isoamylase, the higher the glucose yield. .
  • Example 5 acidothermus Of origin Debranching enzyme( Isoamylase )Wow Saccharification In enzyme complex reaction Saccharification Changes in Glucose Yield with Enzyme Concentration
  • Glucose yield was changed according to glycosylated enzyme concentration in debranching enzyme (Isoamylase) and glycosylating enzyme complex reaction.
  • Enzyme reaction conditions are as follows. The total unit ratio of debranching enzyme and glycosylating enzyme (Glucoamylase, Dupont Co.) was 1: 0.05, 1: 0.04, 1: 0.03 and 1: 0.02, respectively.
  • Enzyme complex reaction was performed at 72 ° C. for 72 hours. The reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 5 minutes, and then HPLC analysis was performed to determine the yield of glucose in terms of area ratio. As a result, the lower the glycosylation ratio, the higher the glucose yield.
  • Glycoamylase which is used in starch hydrolysis, produces a side reaction product (DP2) when the hydrolysis equilibrium is reached. To solve this problem, the side reaction product is decreased by reducing the glycosylated enzyme concentration. Yield was increased effect.
  • Comparative example 1 derived from several strains Isoamylase Comparison of Amylopectin Degradation Activity (Activity Evaluation under Glycation Reaction Conditions (60 °C, pH 4.3)
  • Isoamylase derived from various strains was used to compare the degradation activity of amylopectin under glycosylation conditions. The results are shown in Table 4. Activity was confirmed only in Acidothermus cellulolyticus and Rhodothermus marinus, and the glucose yields of the two enzymes were compared.

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Abstract

본 출원은 Acidothermus 속 유래의 효소를 이용하여 전분당을 원료로 하여 생산되는 포도당의 생산 수율을 향상시킨 것에 관한 것이다. 본 출원은 가수분해의 역반응으로 쓴맛을 갖는 산 당화법을 대체할 수 있으며, 기존의 효소 당화법에 사용되는 탈분지효소에 비해 당화반응의 부반응을 감소시켜 상대적으로 높은 수율을 확보할 수 있으므로 비용을 절감할 수 있다는 장점이 있다.

Description

내열성 및 내산성을 가지는 Acidothermus 속 유래 탈분지 효소를 이용한 전분당으로부터 포도당의 생산 방법 및 그 포도당
본 출원은 Acidothermus 속 유래의 탈분지 효소 (debranching enzyme) 및 당화 효소를 이용하여 전분당으로부터 포도당을 생산하는 방법에 관한 것이다.
바이오매스는 크게 보면 사탕수수와 같이 설탕(sugar)이 주성분인 것, 옥수수, 고구마와 같이 전분(starch)이 주성분인 것, 나무, 억새 등과 같이 셀룰로오스(cellulose)가 주성분인 것으로 나눌 수 있다. 사탕수수로부터 쉽게 얻어지는 설탕은 직접 미생물이 섭취할 수 있으므로 별도의 전처리 또는 당화공정이 없어도 된다. 그러나 옥수수처럼 전분이 주성분인 경우는 분자 크기가 커서 직접 미생물이 이용할 수 없다. 그렇기 때문에 작은 크기의 포도당으로 쪼개 주어야 한다. 이 과정에 물이 들어가게 되며 이를 가수분해(hydrolysis)라고 한다.
전분의 가수분해는 주로 효소에 의해 이루어지는데, 이는 우리가 밥을 먹고 소화시키는 것과 같다. 우리가 쌀로 밥을 해서 먹으면 밥은 침샘에서 나오는 효소에 의해 위에서 분해되어 포도당으로 변환되고, 이 포도당은 우리 몸의 세포에 전달되어 대사작용에 사용된다. 전분을 포도당으로 바꾸는 첫 번째 과정은 우리가 밥을 하듯이 온도를 올려서 전분의 구조를 느슨하게 만드는 것이다. 이래야 효소가 전분에 접근해 전분을 포도당으로 쪼갤 수 있다. 효소에 의해 전분을 포도당으로 쪼개는 과정은 세부적으로 복잡한 메커니즘으로 구성되어 있다.
전분을 포도당으로 변환하기 위해 사용되는 방법 중 효소 당화법은, 미생물에서 유래한 알파아밀라아제를 전분에 작용시켜 액화시킨 후, 탈분지 효소 및 당화 효소를 반응시켜 포도당을 제조하는 것이다.
상기 효소 당화법에 이용되는 탈분지 효소로 주로 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)에서 분리한 효소인 Promozyme® (pullulanase, Novozyme社)을 사용하였으나, Promozyme®은 좁은 범위의 측쇄길이 [DP(Degree of Polymerization) 4 내지 5]에 대한 특이성을 나타내므로, 전분당에 존재하는 다양한 길이 (DP 3 내지 30)의 분지사슬의 가수분해에 부적합하여 포도당 수율이 낮은 문제점이 있었다.
본 출원은 신규한 탈분지 효소를 사용하여 전분당으로부터 포도당을 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 전분, 아밀로펙틴 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전분당을 포함하는 기질 용액에 내열성 및 내산성을 가지는 Acidothermus 속에서 유래된 탈분지 효소와 당화 효소를 동시에 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 포도당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
더욱 구체적으로, Acidothermus 속에서 유래의 탈분지 효소인 이소아밀레이즈(Isoamylase)를 전분당에 처리하면, 다양한 길이의 분지사슬을 가수분해함으로써, 전분당으로부터 포도당을 생산함에 있어 수율이 향상될 수 있다.
본 출원의 다른 목적은, Acidothermus 속에서 유래된 이소아밀레이즈 및 당화 효소를 일정한 단위비로 사용하여, 전분당으로부터 포도당을 생산하는 수율을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 출원은 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소 및 당화 효소를, 전분당을 포함하는 기질 용액에 처리하는 것을 포함하는, 전분당으로부터 포도당의 생산 방법을 제공한다.
구체적으로 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소는, Acidothermus속 유래의 탈분지 효소를 코딩하는 유전자를 벡터에 삽입하여 발현벡터를 생산하는 단계; 상기 발현 벡터를 세포에 형질 전환하는 단계; 및 상기 형질 전환된 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 배양 후 수득된 배양물을 원심분리 및/또는 파쇄하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 파쇄는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있으며, 파쇄 방법으로서 예를 들어, 초음파 파쇄기를 이용할 수 있다.
상기 벡터는 pET-28a(+)일 수 있다.
상기 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소는 아이소아밀라아제(isoamylase)일 수 있다. 상기 탈분지효소는 α-1,6-결합의 가수분해 활성을 가지며, 특히 다양한 범위의 측쇄 길이(DP; Degree of Polymerization) 3 내지 30에 대한 특이성을 나타내므로, 포도당 수율을 증가시킬 수 있다.
상기 당화 효소는, 탈분지된 전분당 또는 전분당의 포도당으로의 가수분해를 촉매할 수 있는 효소로, 당화 효소를 첨가함으로써 탈분지 효소에 의해 절단된 전분당 사슬로부터 최종적으로 포도당을 제조할 수 있다. 상기 당화 효소로는 예를 들어, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코아밀라아제 등을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코아밀라아제를 사용할 수 있다. 상기 당화 효소는 pH 3 내지 pH 7 의 범위에서 당화 반응이 진행 될 수 있고, 보다 구체적으로는 pH 3 내지 pH 6에서 진행될 수 있다. 상기 당화 효소의 반응 온도는 40 ℃ 내지 70 ℃ 의 온도, 보다 구체적으로는 55 ℃ 내지 65 ℃의 온도일 수 있다.
상기 Acidothermus속 균주는 Acidothermus cellulolyticus 균주일 수 있다. 예컨대, Acidothermus cellulolyticus 균주는 Acidothermus cellulolyticus strain 11B [ATCC ® 43068TM]일 수 있다. 상기 균주 유래 아이소아밀라아제(isoamylase)는 서열 번호 1의 염기 서열에 의해 코딩되며, 또한, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.
상기 발현벡터로 형질전환될 수 있는 세포로는, 예컨데, 대장균, 바실러스 속 미생물, 효모(예: 제빵효모), 코리네박테리움 속 미생물 및 식물체 중 어느 하나를 사용할 수 있다.
상기 전분당은 예컨데, 전분, 아밀로펙틴 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것일 수 있으며, 구체적으로는 아밀로펙틴 구조를 가지는 전분일 수 있다. 아밀로펙틴과 말토덱스트린은 전분에 알파아밀라아제를 첨가하여 제조될 수 있다.
상기 전분당은 이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨데, 옥수수, 타피오카, 감자 및 쌀 중 어느 하나에서 유래된 전분당일 수 있다.
상기 전분당은 액화 전분당일 수 있다.
상기 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소 및 당화 효소를, 전분당을 포함하는 기질 용액에 처리하는 단계가 pH 2 내지 pH 6 의 범위에서 진행될 수 있고, 보다 바람직하게는 pH 3 내지 pH 5에서 진행될 수 있고, 가장 바람직하게는 pH 4.3에서 진행될 수 있다.
상기 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소 및 당화 효소를 전분당을 포함하는 기질 용액에 처리하는 단계가 40 ℃ 내지 70 ℃의 온도에서 진행될 수 있고, 보다 바람직하게는 50 ℃ 내지 65 ℃의 온도에서 진행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 65℃에서 진행될 수 있다.
상기 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소 및 당화 효소의 효소활성 단위비(unit ratio)는 2:1 내지 60:1, 구체적으로 10:1 내지 60:1, 또는 구체적으로 10:1 내지 40:1의 범위일 수 있다.
상기 당화 효소의 반응평형을 넘어서기 위해서는 탈분지 효소의 도움이 필요하고 그 효소활성 단위비가 높을수록 포도당 수율이 증가하지만, 당화 효소 및 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소의 효소활성 단위 비가 1: 60을 초과하면 포도당의 수율이 감소할 수 있다. 또한, 전분당을 포도당으로 분해하는 당화반응은 당화효소가 주요 역할을 하는 것이고 탈분지 효소는 보조 역할을 하는 것이므로, Acidothermus속 유래의 탈분지 효소 및 당화 효소의 효소활성 단위비가 2:1 미만이면 전분당을 분해하는 역할을 하지 못해 포도당 수율이 감소할 수 있다.
본 출원의 다른 양태는, Acidothermus속 유래의 탈분지 효소를, 전분당으로부터 포도당을 생산함에 있어서 사용하는 방법을 제공한다.
본 출원의 다른 일 양태에 따르면 40 ℃ 내지 70 ℃ 및 pH 2 내지 pH 6 에서 활성을 가지는 Acidothermus cellulolyticus 유래의 탈분지 효소를 제공한다. 상기 탈분지효소는 α-1,6-결합의 가수분해 활성을 가지며, 사슬 길이에 대한 선택성, 특히 DP 3 및 4, 또는 3 이상, 또는 4 이상에 대한 선택성이 좋아, 포도당 수율을 증가시킬 수 있다.
상기 탈분지 효소의 활성 온도 범위는 40 ℃ 내지 70 ℃일 수 있으며, 보다 바람직하게는 50 ℃ 내지 65 ℃ 일수 있으며, 가장 바람직하게는 60℃ 일 수 있다.
상기 탈분지 효소의 활성 pH 범위는 pH 2 내지 pH 6 일 수 있고, 보다 바람직하게는 pH 3 내지 pH 5에서 일 수 있고, 가장 바람직하게는 pH 4.3에서 일 수 있다.
본 출원에 따르면 전분당을 이용한 포도당 생성 반응에서 Acidothermus 속 유래의 탈분지 효소(Isoamylase)를 사용한 경우, 기존 상업효소 탈분지 효소(Pullulanase)를 사용한 경우보다 전분당부터 포도당을 생산하는 수율을 향상시킬 수 있다.
또한 당화 효소와 탈분지 효소의 복합 반응에서 두 효소의 사용 비율을 조절함으로써 전분당 가수분해 반응 과정에서 생성되는 부반응(DP2) 및 미반응(DP3, DP4+) 산물의 생성 양을 감소시켜 전분당으로부터 포도당을 생산하는 수율을 향상시킬 수 있다.
특히 본 출원의 전분당으로부터 포도당을 제조하는 방법은, 강산성 및/또는 고온의 조건에서 활성을 유지하는 탈분지 효소를 사용하기 때문에 포도당의 생산 수율이 크게 향상된다.
도 1은 전분당의 여러 가수분해 효소와 그 분해 과정을 도시하는 도면이다.
도 2은 여러 탈분지 효소와 이에 따른 분해 과정을 도시하는 도면이다.
이하, 본 출원의 이해를 돕기 위해 실시 예를 들어 상세히 설명한다. 단 하기 실시 예는 본원 출원의 일 예시에 불과하며 출원의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1.: 유전자 확보 및 재조합 단백질 생산
1) 재조합 대장균의 제조
PCR에 사용된 프라이머의 서열에는 내산/내열성 미생물인 Acidothermus cellulolyticus 유래의 탈분지효소 유전자의 양쪽 말단의 일부 서열과 각각 NdeⅠ과 HindⅢ의 제한효소 반응서열을 포함하였다.
(Forward) 5'GAA-TTC-ATG-CCG-GAA -3'
(Reverse) 5'GAA-TTC-TTA-GAG-GAC -3'
이 결과로부터 2.1kb의 PCR 산물을 얻을 수 있었다. 획득한 DNA 절편을 pET-28a(+) 벡터에 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 상기 DNA 는 서열번호 1과 같은 염기 서열을 갖는다. 형질전환된 대장균은 카나마이신(kanamycin)이 포함된 평판배지에서 도말하여 카나마이신(kanamycin)에 대한 내성이 있는 균주를 1차로 선별하였다. 1차 선별된 균주들을 각기 액체 배양한 후 DNA를 정제하여 NdeⅠ과 HindⅢ로 이중 절단했을 때 2.1kb와 5.3kb의 DNA 단편이 확인된 균주를 최종 선별하였다. 자동염기서열분석기를 이용하여 염기서열을 분석한 결과, 목적하는 탈분지 효소 유전자 염기서열과 본 연구에서 얻어진 탈분지 효소의 염기서열은 동일하였다.
2) 재조합 단백질 생산
내산/내열성 미생물(Acidothermus cellulolyticus) 유래의 탈분지 효소(isoamylase)를 수득하기 위해, 다음의 실험을 수행하였다.
냉동 보관된 재조합 대장균 BL21(DE3) 균주를 LB배지 5 ㎖이 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고 600 nm에서 흡광도 2.0이 될 때까지 37 ℃의 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 종균 배양된 배양액을 LB배지 500 ㎖이 들어있는 2 L 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600 nm에서의 흡광도가 0.4가 될 때, 0.1 mM IPTG(이소프로필 β-D-1-티오갈락토티오피라노시드)를 첨가하여 탈분지 효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 180 rpm, 배양 온도는 37 ℃가 유지하도록 조절하고, IPTG를 첨가 후에도 교반 속도는 120 rpm, 배양 온도는 20 ℃로 배양하였다. 상기 형질 전환된 균주의 배양액을 6,000×g 로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리하고 50 mM 트리스-염산 완충용액으로 두 번 세척한 후, Ni-NTA binding 완충용액(50 mM sodium phosphate, 300 mM Nacl, 10 mM imidazole, pH 8.0)을 첨가하여 상기 세포 용액을 초음파 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 다시 13,000×g 로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리하여 세포 상등액만을 효소액으로서 분리하였다. 효소의 특성을 정확히 파악하기 위해서 Ni-NTA superflow 컬럼을 사용하여 정제하였다 정제한 효소의 분자량을 SDS-PAGE로 측정한 결과 약 75 kDA임을 확인하였다.
실시예 2: HPLC를 이용한 각 효소 활성 측정
1) 내산/내열성 미생물(Acidothermus cellulolyticus) 유래의 탈분지 효소(isoamylase) 활성은 HPLC를 이용하여 측정하였다. 활성측정을 위한 HPLC 분석 조건은 다음과 같다.
HPLC 분석조건
- Detector: RID　　　　　
- Flow rate: 0.6㎖ /min
- Sample injection vol.: 10㎕　　　　　
- Column: Bio-Rad HPX 87C
- Solvent: D.I Water
총 분석 소요 시간은 20분으로 설정한다.
내산/내열성 미생물(Acidothermus cellulolyticus) 유래의 탈분지 효소(isoamylase) 활성은 옥수수 전분을 원료로 하여 당화 효소(Glucoamylase)와의 효소 복합반응을 수행하여 전분으로부터 분해된 포도당 생성으로 확인하였다. 효소 반응 조건은 다음과 같다.
당화 효소(Glucoamylase, Dupont社)와 실시예 1에서 생산된 탈분지 효소(Isoamylase, 50 mM sodium acetate buffer pH 4.3)의 효소활성 단위(total unit) 비를 1:4로 사용하여 액화전분(DE(Dextrose Equivalnet) 9.5)과 온도 60 ℃에서 72시간 동안 효소 복합 반응을 수행하였다. 100 ℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 정지시킨 다음, HPLC 분석을 실시하여 포도당의 생산량을 측정하였다. 분석 결과, 옥수수 전분으로부터 분해된 포도당의 수율이 96.2%로 확인되었다. 전분으로부터 분해된 포도당의 수율은 효소 반응 후 생성된 산물들의 면적비로 계산하였다.
실시예 3: Acidothermus 속 유래의 탈분지 효소( Isoamylase ) 및 상업용 탈분지 효소( Pullulanase )의 포도당 수율 비교
Acidothermus cellulolyticus 유래의 탈분지 효소 및 상업용 탈분지 효소(pullulanase, Novozyme社)를 이용한 전분으로부터 분해된 포도당 수율을 확인해 보았다. 효소반응 조건은 다음과 같다.
당화 효소(Glucoamylase, Dupont社) 및 각각의 탈분지 효소의(isoamylase, pullulanase)의 전체 효소활성단위(total unit) 비율을 1:4로 사용하여 액화 전분(DE 9.5)과 온도 60 ℃에서 72시간 동안 효소 복합 반응을 수행하였다. 100 ℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 정지시킨 다음, HPLC 분석을 실시하여 포도당의 생산량을 면적비로 측정한 결과 Acidothermus cellulolyticus 유래의 탈분지 효소(isoamylase)를 이용한 반응이 상업용 탈분지 효소(Pullulanase)를 이용한 반응보다 더 높은 포도당 수율을 얻을 수 있었다. 또한 이당류(DP2) 이상의 전분당을 분석한 결과 Acidothermus cellulolyticus 유래의 탈분지 효소(isoamylase)를 사용한 경우 포도당으로 분해되지 않은 미반응 산물(DP3, DP4+) 생성율이 감소하여 상대적으로 포도당 수율이 증가하게 되는 것을 알 수 있었다.
당화 효소 탈분지효소 Glucose(%) DP2(%) DP3(%) DP4+(%)
Dupont社 Glucoamylase(Ratio 1) Acidothermus 유래Isoamylase(Ratio 4) 96.20 2.57 0.39 0.84
Novozym社Pullulanase(Ratio 4) 96.10 2.16 0.64 1.10
상기 표 1에 개시된 바와 같이, 대량생산에 최적화된 것으로 알려진 풀루라네이즈를 이용한 경우와 비교할 때, 본 출원의 Acidothermus cellulolyticus 유래의 이소아밀레이즈를 이용시 효소 반응이 더 높아 증가된 포도당 수율을 얻을 수 있었고, 축합도가 상대적으로 큰 미반응 산물 DP3 및 DP4의 비율이 더 낮았다. 즉, 본 출원의 이소아밀레이즈를 효소 반응에 적용하는 경우 포도당 수율이 더 증가함을 알 수 있었다.
실시예 4: Acidothermus 속 유래의 탈분지 효소( Isoamylase ) 농도에 따른 포도당 수율 변화
Acidothermus cellulolyticus 유래의 탈분지 효소(isoamylase) 농도에 따른 포도당 수율의 변화를 확인해 보았다. 효소 반응 조건은 다음과 같다. 당화 효소(Glucoamylase, Dupont社) 및 탈분지 효소의 효소활성 단위(total unit) 비를 각각, 1:2, 1:10, 1:20, 1:60로 사용하여 액화전분(DE 9.5)과 온도 60 ℃에서 72시간 동안 효소 복합 반응을 수행하였다. 100 ℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 정지시킨 다음, HPLC 분석을 실시하여 포도당의 생산량을 면적비로 측정한 결과 당화 효소 대비 탈분지 효소(isoamylase)의 비율이 높을수록 더 높은 포도당 수율을 얻을 수 있었다. 이러한 결과는 Acidothermus cellulolyticus 유래의 탈분지 효소(isoamylase)의 활성이 높을수록 전분 가수분해 반응시 당화 효소에 의해 생성되는 부반응 산물(DP2)을 감소시키고 미반응 산물(DP4)을 분해하여 포도당 수율이 증가하게 되는 것으로 보여진다.
당화 효소(Dupont社, Glucoamylase) 탈분지효소(AcidothermusIsoamylase) Glucose(%) DP2(%) DP3(%) DP4+(%)
Ratio 1 Ratio 2 95.91 2.31 0.57 1.21
Ratio 10 96.71 2.15 0.60 0.54
Ratio 20 96.94 1.99 0.63 0.43
Ratio 60 97.07 1.90 0.63 0.40
상기 표 2에 개시된 바와 같이, 본 출원의 당화 효소 대 이소아밀레이즈의 효소활성 단위비를 1:2에서 1:60으로 증가함에 따라, 더 높은 수율의 포도당을 얻을 수 있었다. 즉, 당화 효소 대비 이소아밀레이즈의 비율을 높일수록 포도당의 수율을 높일 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5: Acidothermus 속 유래의 탈분지 효소( Isoamylase )와 당화 효소 복합 반응에서 당화 효소 농도에 따른 포도당 수율 변화
탈분지 효소(Isoamylase)와 당화 효소 복합 반응에서 당화 효소 농도에 따른 포도당 수율 변화를 확인해 보았다. 효소 반응 조건은 다음과 같다. 탈분지 효소 및 당화 효소(Glucoamylase, Dupont社)의 효소활성 단위(total unit) 비를 각각 1:0.05, 1:0.04, 1:0.03 및 1:0.02로 사용하여 액화전분(DE 9.5)과 온도 60 ℃에서 72시간 동안 효소 복합 반응을 수행하였다. 100 ℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 정지시킨 다음, HPLC 분석을 실시하여 포도당의 생산량을 면적비로 측정한 결과 당화 효소의 비율이 낮을수록 더 높은 포도당 수율을 얻을 수 있었다. 전분 가수분해에서 사용되는 당화 효소(glucoamylase)는 가수분해 반응 평형에 도달하였을 때 부반응 산물(DP2)을 생성하게 되는데 이러한 문제를 해결하기 위해 당화 효소 농도를 저감함으로써 부반응 산물이 감소하게 되어 상대적으로 포도당 수율이 증가하는 효과를 얻을 수 있었다.
탈분지효소(AcidothermusIsoamylase) 당화 효소(Dupont社, Glucoamylase) Glucose(%) DP2(%) DP3(%) DP4+(%)
Ratio 1 Ratio 0.05 96.78 2.35 0.45 0.43
Ratio 0.04 96.90 2.08 0.53 0.49
Ratio 0.03 97.14 2.01 0.51 0.34
Ratio 0.02 96.25 2.05 1.22 0.48
상기 표 3에 개시된 바와 같이, 본 출원의 당화 효소의 효소활성 단위 비율이 1:0.05에서 1:0.03으로 감소함에 따라, 더 높은 수율의 포도당을 얻을 수 있었다. 즉, 이소아밀레이즈 대비 당화 효소의 비율을 낮출수록 포도당의 수율이 향상됨을 확인할 수 있었다.
비교예 1: 여러 균주 유래 이소아밀라제의 아밀로펙틴 분해 활성 비교(당화반응 조건에서의 활성 평가(60℃, pH 4.3)
No. Enzyme Strain Activity(unit)
1 Isoamylase Enterobacter cloacae subsp. Cloacae 0
2 Bifidobacterium longum subsp. Longum 0
3 Thermotoga neapolitana 0
4 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 0
5 Sinorhizobium meliloti 0
6 Acidothermus cellulolyticus 130.18
7 Novosphingobium aromaticivorans 0
8 Thermotoga thermarum 0
9 Rhodothermus marinus 105.04
여러 균주 유래 이소아밀라제를 이용하여 당화반응 조건에서의 amylopectin의 분해 활성을 비교하였고 그 결과 를 표 4에 나타내었다. Acidothermus cellulolyticus와 Rhodothermus marinus에서만 활성 확인되었고 이후 두 효소의 포도당 수율을 비교하였다.
비교예 2: Acidothermus cellulolyticus 및 Rhodothermus marinus 유래 탈분지 효소(Isoamylase) 의 포도당 수율 비교
Acidothermus cellulolyticus 및 Rhodothermus marinus 탈분지 효소를 이용한 전분으로부터 분해된 포도당 수율을 확인해 보았다. 효소반응 조건은 다음과 같다.
당화 효소(Glucoamylase, Dupont社) 및 각각의 탈분지 효소의(isoamylase, pullulanase)의 효소활성 단위(total unit) 비를 1: 2 내지 1:60으로 사용하여 액화전분(DE 9.5)과 온도 60 ℃에서 72시간 동안 효소 복합 반응을 수행하였다. 100 ℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 정지시킨 다음, HPLC 분석을 실시하여 포도당의 생산량을 면적비로 측정한 결과, Acidothermus cellulolyticus 유래의 탈분지 효소(isoamylase)를 이용한 경우(표 6 결과 참조)에서, Rhodothermus marinus 유래 탈분지 효소를 이용한 반응(표 5 결과 참조)에서 보다 더 높은 포도당 수율을 얻을 수 있었다. 또한, 이당류(DP2) 이상의 전분당을 분석한 결과 Acidothermus cellulolyticus 유래의 탈분지 효소(isoamylase)를 사용한 경우 포도당으로 분해되지 않은 미반응 산물(DP2DP4+) 생성율이 감소하여 상대적으로 포도당 수율이 증가하게 되는 것을 알 수 있었다.
당화 효소(Dupont社,Glucoamylase) 탈분지효소(Rhodothermus 유래Isoamylase) Glucose(%) DP2(%) DP3(%) DP4+(%)
Ratio 1 Ratio 2 95.88 2.48 0.35 1.29
Ratio 10 96.26 2.31 0.37 1.06
Ratio 20 96.34 2.24 0.44 0.98
Ratio 60 96.61 2.08 0.56 0.75
당화 효소(Dupont社, Glucoamylase) 탈분지효소(Acidothermus 유래Isoamylase) Glucose(%) DP2(%) DP3(%) DP4+(%)
Ratio 1 Ratio 2 95.91 2.31 0.57 1.21
Ratio 10 96.71 2.15 0.60 0.54
Ratio 20 96.94 1.99 0.63 0.43
Ratio 60 97.07 1.90 0.63 0.40
상기 표 5 및 표 6 에 개시된 바와 같이, Rhodothermus marinus 유래 탈분지 효소를 이용한 경우와 비교할 때, 본 출원의 Acidothermus cellulolyticus 유래의 이소아밀레이즈를 이용한 효소 반응이 더 높은 포도당 수율을 얻을 수 있었고, 축합도가 상대적으로 큰 미반응 산물 DP2 및 DP4의 비율이 더 낮았다. 즉, 본 출원의 이소아밀레이즈를 효소 반응에 적용하는 경우 포도당 수율이 더 증가함을 알 수 있었다.

Claims (14)

  1. 내열성 및 내산성을 가지는 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소 및 당화 효소를, 전분당을 포함하는 기질 용액에 처리하여 포도당을 제조하는 것을 포함하는, 전분당으로부터 포도당의 생산 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소는,
    Acidothermus속 유래의 탈분지 효소를 코딩하는 유전자를 벡터에 삽입하여 발현벡터를 생산하는 단계;
    상기 발현 벡터를 세포에 형질 전환하는 단계; 및
    상기 형질 전환된 세포를 대량 생산하는 단계를 포함하여 제조된 것인, 전분당으로부터 포도당의 생산 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 벡터는 pET-28a(+)인, 전분당으로부터 포도당의 생산 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소는 아이소아밀라아제(isoamylase)인, 전분당으로부터 포도당의 생산 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 Acidothermus속은 Acidothermus cellulolyticus인, 전분당으로부터 포도당의 생산 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 형질 전환된 세포는 대장균, 바실러스 속 미생물, 효모, 코리네박테리움 속 미생물 및 식물체 중 어느 하나인, 전분당으로부터 포도당의 생산 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 전분당은 아밀로펙틴 구조를 가지는 전분인, 전분당으로부터 포도당의 생산 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 전분당은 액화 전분당인, 전분당으로부터 포도당의 생산 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 전분당은 옥수수, 타피오카, 감자 및 쌀 중 어느 하나의 유래 전분인 것을 특징으로 하는, 전분당으로부터 포도당의 생산 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소 및 당화 효소를, 전분당을 포함하는 기질 용액에 처리하는 단계가 pH 2 내지 pH 6의 범위 에서 진행되는, 전분당으로부터 포도당의 생산 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소 및 당화 효소를, 전분당을 포함하는 기질 용액에 처리하는 단계가 40 ℃ 내지 70 ℃의 온도에서 진행되는, 전분당으로부터 포도당의 생산 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소 및 당화 효소의 효소 활성 단위비가 2:1 내지 60:1인, 전분당으로부터 포도당의 생산 방법.
  13. 내열성 및 내산성을 가지는 Acidothermus속 유래의 탈분지 효소를, 전분당으로부터 포도당을 제조하는 데 사용하는 방법.
  14. 온도 40 ℃ 내지 70 ℃ 및 pH 2 내지 pH 6 에서 활성을 가지는 Acidothermus cellulolyticus 유래의 탈분지 효소.
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