ES2321043T3 - Glucoamilasa termoestable. - Google Patents
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Abstract
Enzima aislada con actividad glucoamilasa, donde la enzima, a) es obtenida de Talaromyces emersonii, b) muestra un grado de identidad de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 7, y c) tiene una T 1/2 (vida media) de al menos 100 minutos en 50 mM de NaOAc, 0,2 AGU/ml, pH 4,5, a 70ºC.
Description
Glucoamilasa termoestable.
La presente invención se refiere a una
glucoamilasa termoestable adecuada para, por ej., la conversión de
almidón, por ej., para producir glucosa a partir de almidón. La
presente invención también se refiere al uso de dicha glucoamilasa
termoestable en varios procesos, en particular en la fase de
sacarificación en los procesos de conversión del almidón.
Las glucoamilasas,
(1,4-\alpha-D-glucan
glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) son enzimas que catalizan la liberación
de D-glucosa a partir de los extremos no reductores
de almidón o moléculas oligo y polisacáridas relacionadas.
Las glucoamilasas son producidas por diferentes
hongos filamentosos y levaduras, incluyendo Aspergillus
niger y Aspergillus awamori.
Comercialmente, las glucoamilasas son utilizadas
para convertir almidón de cereales que ya está parcialmente
hidrolizado por una \alpha-amilasa en glucosa. La
glucosa puede además ser convertida por glucosa isomerasa en una
mezcla compuesta casi a partes iguales de glucosa y fructosa. Esta
mezcla, o la mezcla enriquecida además con fructosa, es el
comúnmente usado jarabe de cereales rico en fructosa comercializado
en todo el mundo. Este jarabe es el producto de mayor tonelaje del
mundo producido por un proceso enzimático. Las tres enzimas
implicadas en la conversión del almidón en fructosa están entre las
enzimas industriales producidas más importantes.
Uno de los problemas principales existentes con
respecto al uso comercial de la glucoamilasa en la producción de
jarabe de cereales con elevado contenido en fructosa es la
termoestabilidad relativamente baja de las glucoamilasas, tales como
la glucoamilasa comercialmente disponible de Aspergillus
niger (es decir, (vendida como AMG por Novo Nordisk A/S). La
glucoamilasa comercial de Aspergillus no es térmicamente tan
estable como la \alpha-amilasa o glucosa
isomerasa y es más activa y estable a un pH inferior que la
\alpha-amilasa o glucosa isomerasa. Por
consiguiente, debe ser usado en un recipiente separado a una
temperatura y pH inferior.
US 4,247,637 describe una glucoamilasa
termoestable que tiene un peso molecular de aproximadamente 31.000
Da derivada de Talaromyces duponti adecuada para sacarificar
una solución de almidón licuado a un jarabe. De la glucoamilasa se
ha declarado que retiene al menos aproximadamente el 90% de su
actividad de glucoamilasa inicial sometida a 70ºC durante 10
minutos a un pH de 4,5.
US 4,587,215 expone una amiloglucosidasa
termoestable derivada de las especies Talaromyces
termophilus con un peso molecular de aproximadamente 45.000 Da.
La amiloglucosidasa (o glucoamilasa) descrita pierde su actividad
enzimática en dos fases diferentes, un periodo inicial de rápida
descomposición seguido de un periodo de descomposición lenta. A
70ºC (pH=5,0) la vida media para la rápida descomposición es de
aproximadamente 18 minutos sin que se pueda medir pérdida de
actividad dentro de una hora en la segunda fase de la
descomposición.
Bunni L et al., (1989), Enzyme Microb.
Technol., Vol. 11, p. 370-375. concierne la
producción, el aislamiento y caracterización parcial de un sistema
amilolítico extracelular compuesto de al menos una forma de
\alpha-amilasa y una forma de
\alpha-glucosidasa producida por Talaromyces
emersonii CBS 814.70. Sólo la \alpha-amilasa
es aislada, purificada y caracterizada.
La presente invención está basada en el
descubrimiento de una glucoamilasa nueva termoestable adecuada para
el uso, por ej., en la fase de sacarificación en procesos de
conversión de almidón.
Los términos "glucoamilasa" y "AMG"
son usados abajo de forma intercambiable.
La termoestabilidad de la glucoamilasa de la
invención es medida como T_{1/2} (vida media) usando el método
descrito en la sección de abajo "Materiales y Métodos".
Los inventores de la presente invención han
aislado, purificado y caracterizado una glucoamilasa termoestable a
partir de una cepa de Talaromyces emersonii ahora depositada
con el Centraalbureau voor Schimmelcultures bajo el número CBS
793.97.
Aplicado a una proteína, el término
"aislado" indica que la proteína se encuentra en una condición
distinta de su entorno nativo. En una forma preferida la proteína
aislada está sustancialmente libre de otras proteínas,
particularmente otras proteínas homólogas (es decir, "impurezas
homólogas" (véase abajo)).
Se prefiere proporcionar la proteína con una
pureza superior al 40%, más preferiblemente superior al 60%.
Incluso más preferiblemente proporcionar la proteína en una forma
altamente purificada, es decir, una pureza superior al 80%, más
preferiblemente superior al 95%, e incluso más preferiblemente una
pureza superior al 99%, determinada por
SDS-PAGE.
El término "enzima aislada" puede ser
denominada de forma alternativa "enzima purificada".
El término "impurezas homólogas" significa
cualquier impureza (por ej. otro polipéptido que el polipéptido de
la invención) que se origina a partir de las células homólogas, de
donde el polipéptido de la invención es obtenido originalmente.
La glucoamilasa aislada tiene una
termoestabilidad muy alta en comparación con las glucoamilasas del
estado de la técnica, tal como la glucoamilasa de Aspergillus
Niger (disponible de Novo Nordisk A/S bajo el nombre comercial
AMG). La T_{1/2} (vida media) fue determinada como de
aproximadamente 120 minutos a 70ºC (pH 4,5) como se describe en el
Ejemplo 2 abajo. La T_{1/2} de la AMG recombinante de T.
emersonii expresada en levadura fue determinada como de
aproximadamente 110 minutos como se describe en el Ejemplo 12.
En consecuencia, en el primer aspecto la
presente invención se refiere a una enzima aislada con actividad
glucoamilasa, donde la enzima es derivada de Talaromyces
emersonii, muestra un grado de identidad de al menos el 80% con
la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 7, y tiene una
T_{1/2} (vida media) de al menos 100 minutos en 50 mM de NaOAc,
0,2 AGU/ml, pH 4,5, a 70ºC.
En el segundo aspecto la invención se refiere a
una secuencia de ADN clonada derivada de Talaromyces
emersonii y que codifica una enzima que expone actividad
glucoamilasa, comprendiendo la secuencia de ADN: (a) la parte que
codifica la glucoamilasa de la secuencia de ADN mostrada en SEC ID
NO: 33; (b) la secuencia de ADN mostrada en las posiciones
649-2724 en SEC ID NO:33 o su cadena
complementaria; (c) un análogo de la secuencia de ADN definido en
(a) o (b) que es al menos 80% homóloga a dicha secuencia de ADN;
(d) una secuencia de ADN que hibridiza con una sonda bicatenaria de
ADN que comprende la secuencia mostrada en 649-2724
en SEC ID NO: 33 a media astringencia; (e) una secuencia de ADN que,
por la degeneración del código genético, no hibridiza con las
secuencias de (b) o (c), pero codifica un polipéptido que tenga
exactamente la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido
codificado por cualquiera de estas secuencias de ADN.
El término "secuencia parcial" denota una
secuencia polipeptídica parcial que está comprendida en una
secuencia polipeptídica más larga, donde dicha secuencia
polipeptídica más larga tiene la actividad de interés.
Además, la invención también se refiere a un
proceso de conversión de almidón o almidón parcialmente hidrolizado
en un jarabe que contiene, por ej., dextrosa, incluyendo dicho
proceso la fase de sacarificación del hidrolizado de almidón en
presencia de una glucoamilasa del primer aspecto o una glucoamilasa
codificada por una secuencia de ADN clonada del segundo
aspecto.
En otro aspecto la invención también se refiere
a un método de sacarificación de una solución de almidón licuado,
comprendiendo el método una fase de sacarificación enzimática que
usa una glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones
1-3 o una glucoamilasa codificada por una secuencia
de ADN de las reivindicaciones 4 ó 5.
En además otros aspectos la invención se refiere
a usos de la glucoamilasa según el primer aspecto o una
glucoamilasa codificada por una secuencia de ADN según el segundo
aspecto en un proceso de conversión de almidón, un proceso continuo
de conversión de almidón, un proceso para producir oligosacáridos,
un proceso para producir especialmente jarabes, un proceso para
producir etanol para combustible, un proceso para producir una
bebida y/o en un proceso de fermentación para producir compuestos
orgánicos, tales como ácido cítrico, ácido ascórbico, lisina, ácido
glutámico.
Finalmente, la invención se refiere a un cultivo
aislado puro del microorganismo Talaromyces emersonii CBS
793.97 capaz de producir una glicoamilasa según el primer aspecto o
una glucoamilasa codificada por una secuencia de ADN según el
segundo aspecto.
Es un objeto de la invención proporcionar un
método de sacarificación de una solución de almidón licuado, donde
una sacarificación enzimática es realizada usando una glucoamilasa
de la invención.
Además, la invención se refiere al uso de una
glucoamilasa de la invención en un proceso de conversión de
almidón, tal como un proceso continuo de conversión de almidón. En
una forma de realización del proceso continuo de conversión de
almidón esto incluye una fase continua de sacarificación.
La glucoamilasa de la invención puede ser usada
también en procesos para producir oligosacáridos o jarabes
especializados.
Finalmente, la invención se refiere a un cultivo
aislado puro del microorganismo Talaromyces emersonii CBS
793.97 o un mutante del mismo capaz de producir una glucoamilasa de
la invención.
La Figura 1 muestra el Gel de
SDS-PAGE (coloreado con azul Coomassie) usado para
determinar el peso molecular (PM) de la glucoamilasa purificada de
Talaromyces emersonii CBS 793.97 de la presente
invención.
1: Marcador estándar,
2: Volumen de Q Sefarosa (la tirada)
3: Volumen de S Sefarosa;
La Figura 2 muestra el perfil de actividad de pH
de glucoamilasa de Talaromyces emersonii y Aspergillus
niger (AMG) en 0,5% de maltosa a 60ºC;
La Figura 3 muestra el perfil de actividad según
la temperatura de glucoamilasa de Talaromyces emersonii CBS
793.97 vs. glucoamilasa de Aspergillus niger (AMG);
La Figura 4 muestra la curva para determinar
T_{1/2} (vida media) en 50 mM NaOAc, 0,2 AGU/ml, pH 4,5, a 70ºC
de glucoamilasa de Talaromyces emersonii CBS 793.97 vs.
glucoamilasa de Aspergillus niger (AMG);
La Figura 5 muestra la secuencia de la
localización de AMG de Talaromyces emersonii. La secuencia
de aminoácidos predicha es mostrada debajo de la secuencia de
nucleótidos. Los cuatro intrones son mostrados en letras minúsculas.
Son subrayadas las secuencias de intrones de consenso. La señal
putativa y los pro-péptidos tienen subrayado doble
y subrayado punteado, respectivamente;
La Figura 6 muestra una alineación/comparación
de las secuencias de aminoácidos de AMG de A. niger
(An_amg-1.pro), AMG de A. orizae
(Ao_AMG.pro), y AMG de Talaromyces emersonii
(Tal-AMG.pro). Los residuos aminoácidos idénticos
son indicados por un *. La señal y pro-péptidos son
subrayados por una única línea y una doble, respectivamente;
La Figura 7 muestra el cassette de expresión de
Aspergillus pCaHj483 usado en el Ejemplo 5;
La Figura 8 muestra el plásmido de expresión de
Aspergillus, pJaI518, para el gen de AMG de Talaromyces
emersonii;
La Figura 9 muestra la construcción del plásmido
de ruptura de A. niger,
La Figura 10 muestra el gel de SDS PAGE de dos
transformantes, JaL228#5.77 y HowB112#8.10, que expresan la
glucoamilasa de Talaromyces emersonii de la invención.
JaL228 y HowB112 son las cepas no transformadas progenitoras. PM:
Proteína de promega molecular;
La Figura 11 muestra la termoestabilidad de la
AMG del T. emersonii producida por la cepa A. niger
HowB112 determinada en 50 mM NaOAc, pH 4,5, 70ºC, 0.2 AGU/ml
(T_{1/2} determinada a 20 minutos);
La Figura 12 compara la termoestabilidad a 68ºC
del caldo de fermentación de la AMG de T. emersonii
expresada en levadura producida en levadura y la AMG de A.
niger,
La Figura 13 muestra el resultado de la prueba
para determinar la termoestabilidad de la AMG recombinante de
Talaromyces emersonii producida en levadura a 70ºC, pH 4,5,
0,2 AGU/ml. La T_{1/2} fue determinada a aproximadamente
110ºC.
La presente invención está basada en el
descubrimiento de una glucoamilasa termoestable nueva adecuada para
el uso en, por ej., la fase de sacarificación en un proceso de
conversión de almidón.
Los inventores de la presente invención han
aislado, purificado y caracterizado una glucoamilasa a partir de
una cepa de Talaromyces emersonii CBS 793.97. La
glucoamilasa resultó tener una termoestabilidad altísima en
comparación con las glucoamilasas del estado de la técnica.
Por consiguiente, en un primer aspecto la
presente invención se refiere a una enzima aislada con actividad
glucoamilasa, donde la enzima es derivada de Talaromyces
emersonii, muestra un grado de identidad de al menos el 80% con
la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 7, y tiene una
T_{1/2} (vida media) de al menos 100 minutos en 50 mM NaOAc, 0,2
AGU/ml, pH 4,5, a 70ºC.
La T_{1/2} (vida media) de la glucoamilasa
aislada de Talaromyces emersonii CBS 793.97 fue determinada
como de 120 minutos a 70ºC como se describe en el Ejemplo 2 abajo y
como de 110 minutos para T. emersonii producidos en levadura
como se describe en el Ejemplo 12.
El peso molecular de la glucoamilasa aislada
resultó ser de aproximadamente 70 kDa determinado por
SDS-PAGE. Además, el pl de dicha enzima fue
determinada como debajo de 3,5 usando focalización
isoeléctrica.
El punto isoeléctrico, pl, es definido como el
valor de pH donde el complejo molecular enzimático (con
opcionalmente metal unido u otros iones) es neutral, es decir, la
suma de cargas electroestáticas (carga electrostática neta, NEC) en
el complejo es igual a cero. En esta suma, por supuesto, debe
tenerse en consideración la naturaleza positiva o negativa de la
carga electrostática.
Se espera que enzimas sustancialmente homólogas
que tengan las mismas propiedades ventajosas sean obtenibles a
partir de otros microorganismos, especialmente organismos fúngicos,
tales como hongos filamentosos, en particular a partir de otra cepa
de Talaromyces especialmente otras cepas de Talaromyces
emersonii.
\vskip1.000000\baselineskip
Un aislado de la cepa de hongo filamentoso,
donde la glucoamilasa de la invención ha sido aislada, ha sido
depositado en Centraalbureau voor Schimmelcultures, P.O. Box 273,
3740 Ag Baarn, Países Bajos, para los objetivos de procedimiento de
patente en la fecha indicada abajo. Siendo CBS una depositaria
internacional según el tratado de Budapest ofrece permanencia del
depósito conforme a la regla 9 de dicho tratado.
Fecha de depósito 2 de Junio 1997
Ref. del depositante.: NN049253
Designación CBS: CBS 793.97
El aislado del hongo filamentoso Talaromyces
emersonii CBS nº. 793.97 ha sido depositado bajo condiciones
que aseguran que el acceso al hongo aislado estará disponible
durante el estado provisional hasta su concesión de esta solicitud
de patente respecto a la persona determinada por el comisionado de
Patentes y marcas por tener derecho a ello bajo 37 C.F.R. § 1.14 y
35. U.S.0 § 122. El depósito representa un cultivo substancialmente
puro del hongo aislado. El depósito está disponible como requieren
las leyes de patente extranjeras en los países donde se presenten
equivalentes de la solicitud principal, o sus resultados. No
obstante, debería entenderse que la disponibilidad de un depósito
no constituye una licencia para practicar la invención objeto en
derogación de los derechos de patentes concedidos por acción
gobernativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores han secuenciado la glucoamilasa
termoestable derivada de Talaromyces emersonii CBS 793.97
como se describirá con más detalle en el Ejemplo 3 abajo. Según la
invención la AMG de Talaromyces puede tener una sustitución
de Asp145Asn (o D145N) (usando la numeración SEC ID NO: 7).
En consecuencia, la invención también se refiere
a una enzima aislada con actividad glucoamilasa que comprende una o
más de las secuencias parciales mostradas en SEC ID NOS:
1-6 o la secuencia de longitud total mostrada en SEC
ID NO: 7 o una enzima con actividad glucoamilasa que sea
sustancialmente homóloga a estas. SEC ID NO: 34 muestra la
secuencia de longitud total incluyendo la señal y pre propéptido de
aminoácido nº. 1 a 27.
\vskip1.000000\baselineskip
La homología entre dos glucoamilasas es
determinada como el grado de identidad entre las dos secuencias
proteicas que indican una derivación de la primera secuencia a
partir de la segunda. La homología puede ser determinada de manera
adecuada mediante programas informáticos conocidos en la técnica
tal como GAP proporcionado en el paquete informático GCG (Program
Manual for the Wisconsin Package, Version 8, Agosto 1994, Genetics
Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)
(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular
Biology, 48, p. 443-453). Usando GAP con los
siguientes ajustes para la comparación de secuencias
polipeptídicas: penalización de creación de GAP de 3.0 y
penalización de extensión de GAP de 0.1.
Según la invención una secuencia de aminoácidos
"sustancialmente homóloga" muestra un grado de identidad de
preferiblemente al menos el 80%, al menos el 90%, más
preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el
97%, y de la forma más preferible al menos el 99% con las
secuencias de aminoácidos parciales mostradas en SEC ID NO:
1-6 o SEC ID NO: 7.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también se refiere a una secuencia
de ADN clonada que codifica una enzima que expone actividad
glucoamilasa de la invención, comprendiendo la secuencia de
ADN:
- (a)
- la parte que codifica la glucoamilasa de la secuencia de ADN mostrada en SEC ID NO: 33;
- (b)
- la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 649-2724 en SEC ID NO:33 o su cadena complementaria;
- (c)
- un análogo de la secuencia de ADN definida en (a) o (b) que es al menos en el 80% homóloga a dicha secuencia de ADN;
- (d)
- una secuencia de ADN que hibridiza con una sonda bicatenaria de ADN que comprende la secuencia mostrada en las posiciones 649-2724 en SEC ID NO: 33 a astringencia baja;
- (e)
- una secuencia de ADN que a causa de la degeneración del código genético, no hibridiza con las secuencias de (b) o (c), sino que codifica un polipéptido que tiene exactamente la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por cualquiera de estas secuencias de ADN; o
- (g)
- una secuencia de ADN que es un fragmento de las secuencias de ADN especificadas en (a), (b), (c), (d), o (e).
La parte madura de la AMG de la invención es
codificada por la secuencia de ADN en la posición
728-2724 de SEC ID NO: 33. Al expresar la AMG de la
invención en levadura, por ej., Saccharomyces cerevisiae
YNG318, los intrones tienen que ser recortados como se describe en
el Ejemplo 7.
La homología de la secuencia de ADN referida
arriba es determinada como el grado de identidad entre dos
secuencias que indican una derivación de la primera secuencia a
partir de la segunda. La homología puede ser determinada de manera
adecuada mediante programas informáticos conocidos en la técnica,
tal como GAP proporcionado en el paquete informático GCG (Program
Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, Agosto 1994, Genetics
Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)
(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular
Biology, 48, 443-453). Usando GAP con los siguientes
ajustes para la comparación de las secuencias de ADN: penalización
de creación de GAP de 5.0 y penalización de extensión de GAP de
0.3, la región de codificación de las secuencias de ADN análogas
referidas arriba muestra un grado de identidad de preferiblemente al
menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, más
preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el
97% con la parte de la secuencia de ADN que codifica AMG mostrada
en SEC ID NO: 33 o la parte que codifica glucoamilasa con o sin
intrones.
Las condiciones de hibridación referidas arriba
para definir una secuencia de ADN análoga tal y como se define en
d) arriba que hibridiza a una sonda bicatenaria de ADN que
comprende la secuencia mostrada en las posiciones
649-2748 en SEC ID NO: 33 (es decir, las parte que
codifica AMG), bajo al menos condiciones de astringencia baja, pero
preferiblemente bajo condiciones de astringencia medias o altas son
las descritas con detalle abajo.
Las condiciones experimentales adecuadas para
determinar la hibridación con astringencia baja, media o elevada
entre una prueba nucleótida y una secuencia homóloga de ADN o ARN
implican la impregnación previa del filtro conteniendo los
fragmentos de ADN o ARN para hibridizar en 5 x SSC (Cloruro
Sódico/Citrato Sódico, Sambrook et al. 1989) durante 10 min,
y la prehibridación del filtro en una solución de 5 x SSC, 5 x
solución Denhardt (Sambrook et al. 1989), 0,5% SDS y 100
\mug/ml de ADN de esperma del salmón desnaturalizado y sometido a
un baño de ultrasonido (Sambrook et al. 1989), seguido de
hibridación en la misma solución conteniendo una concentración de
10 ng/ml de una sonda preparada aleatoriamente (Feinberg, A.P. and
Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13),
marcada con ^{32P}dCTP (actividad específica > 1 x 10^{9}
cpm/\mug) durante 12 horas a aproximadamente 45ºC. Después el
filtro es lavado dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, 0,5% SDS
a aproximadamente 55ºC (astringencia baja), más preferiblemente a
aproximadamente 60ºC (astringencia media) todavía más
preferiblemente a aproximadamente 65ºC (astringencia media/alta),
incluso más preferiblemente a aproximadamente 70ºC (astringencia
alta), e incluso más preferiblemente a aproximadamente 75ºC
(astringencia muy alta).
Las moléculas con las que hibridiza la sonda de
oligonucleótidos bajo estas condiciones son detectadas usando una
película radiográfica.
La presente invención proporciona un método de
uso de glucoamilasa termoestable de la invención para producir
glucosa y similares a partir de almidón. Generalmente, el método
incluye las fases de hidrolizado parcial de almidón precursor en
presencia de \alpha-amilasa y después hidroliza
la liberación de D-glucosa a partir de los extremos
no reductores del almidón o de moléculas oligo y polisacáridas
relacionadas en presencia de glucoamilasa por seccionamiento de
enlaces glucosídicos \alpha-(1\rightarrow4) y
\alpha-(1\rightarrow6).
La hidrólisis parcial del almidón precursor
utilizando \alpha-amilasa proporciona una
descomposición inicial de las moléculas de almidón hidrolizando los
enlaces internos \alpha-(1\rightarrow4). En aplicaciones
comerciales la hidrólisis inicial que usa
\alpha-amilasa es ejecutada a una temperatura de
aproximadamente 105ºC. Se procesa una concentración de almidón muy
alta, normalmente del 30% al 40% de sólidos. La hidrólisis inicial
es realizada normalmente durante cinco minutos a esta temperatura
elevada. El almidón hidrolizado parcialmente puede ser después
transferido a un segundo tanque e incubado durante aproximadamente
una hora a una temperatura de 85ºa 90ºC para obtener un equivalente
de dextrosa (D.E.) de 10 a 15.
La fase de hidrolizar adicionalmente la
producción de D-glucosa de los extremos no
reductores del almidón o moléculas de oligo o polisacáridos
relacionadas en presencia de glucoamilasa se realiza normalmente en
un tanque separado a una temperatura reducida de entre 30ºy 60ºC.
Preferiblemente la temperatura del líquido de sustrato es bajada a
entre 55ºy 60ºC. El pH de la solución es bajado de 6 a 6,5 a un
rango de entre 3 y 5,5. Preferiblemente, el pH de la solución es de
4 a 4,5. La glucoamilasa es añadida a la solución y la reacción es
llevada a cabo durante 24-72 horas, preferiblemente
36-48 horas.
Usando una glucoamilasa termoestable de la
invención pueden ser realizados procesos de sacarificación a una
temperatura más alta que los procesos de sacarificación
tradicionales discontinuos. Según la invención la sacarificación
puede ser realizada a temperaturas en el rango de
60-80ºC, preferiblemente 63-75ºC.
Esto se aplica tanto a procesos discontinuos (descritos
anteriormente) como a procesos de sacarificación continuos.
En realidad, los procesos de sacarificación
continuos que incluyen una o más fases de separación de membrana,
es decir, fases de filtración, deben ser realizados a temperaturas
por encima de 60ºC para ser capaces de mantener un flujo
razonablemente elevado sobre la membrana. En consecuencia, una
glucoamilasa termoestable de la invención proporciona la
posibilidad de llevar a cabo procesos de sacarificación continuos a
gran escala a un precio justo dentro de un periodo de tiempo
aceptable para procesos de sacarificación industrial. Según la
invención el tiempo de sacarificación puede ser incluso
acortado.
La actividad de una glucoamilasa de la invención
es generalmente sustancialmente más elevada a temperaturas entre
60ºC - 80ºC que a la temperatura tradicionalmente usada entre 30 -
60ºC. En consecuencia, mediante el aumento de la temperatura en la
que opera la glucoamilasa puede realizarse el proceso de
sacarificación dentro de un periodo de tiempo más corto o el proceso
puede ser realizado usando una dosificación enzimática más
baja.
Puesto que la termoestabilidad de la
glucoamilasa de la invención es altísima en comparación con, por
ej., la glucoamilasa de Aspergillus niger comercialmente
disponible (es decir, AMG) tiene que añadirse una menor cantidad de
glucoamilasa para reemplazar la glucoamilasa que es inactivada
durante el proceso de sacarificación. Se mantiene más glucoamilasa
activa durante el proceso de sacarificación según la presente
invención. Además, se reduce también el riesgo de contaminación
microbiana al realizar el proceso de sacarificación a una
temperatura por encima de 63ºC.
Usando una glucoamilasa con actividad específica
aumentada (medida como actividad hacia maltosa), puede ser
necesaria una dosificación enzimática inferior en el proceso de
sacarificación.
Ejemplos de procesos de sacarificación, ...
donde la glucoamilasa de la invención puede ser usada
ventajosamente incluyen los procesos descritos en JP
3-224493; JP 1-191693; JP
62-272987; y EP 452,238.
En otro aspecto la invención se refiere a un
método de sacarificación de una solución de almidón licuado,
comprendiendo el método una fase de sacarificación enzimática que
usa una glucoamilasa de la invención.
La glucoamilasa de la invención puede ser usada
en el presente proceso de la invención en combinación con una
enzima que hidroliza sólo enlaces glucosídicos
\alpha-(1\rightarrow6) en moléculas con al menos cuatro residuos
glucosílicos. Preferiblemente, la glucoamilasa de la invención es
usada en combinación con pululanasa o isoamilasa. El uso de
isoamilasa y pululanasa para desramificar, las propiedades
moleculares de las enzimas, y el uso potencial de las enzimas con
glucoamilasa está publicado en G.M.A. van Beynum et al.,
Starch Conversion Technology, Marcel Dekker, New York, 1985,
101-142.
En otro aspecto la invención se refiere al uso
de una glucoamilasa de la invención en un proceso de conversión de
almidón.
Además, la glucoamilasa de la invención puede
ser usada en un proceso de conversión de almidón continuo que
incluye una fase de sacarificación continua.
La glucoamilasa de la invención puede ser usada
también en forma inmovilizada. Esta es adecuada y usada
frecuentemente para producir jarabes especializados, tales como
jarabes de maltosa, y además para la corriente refinada de
oligosacáridos en relación con la producción de jarabes de
fructosa.
La glucoamilasa de la invención puede ser usada
también en un proceso para producir etanol para combustible o
bebida o puede ser usada en un proceso de fermentación para producir
compuestos orgánicos, tales como ácido cítrico, ácido ascórbico,
lisina, ácido glutámico.
La glucoamilasa derivada del hongo filamentoso
depositado Talaromyces emersonii CBS No. 793.97 ha sido
depositada en la Centraalbureau voor Schimmelcultures, P.O. caja
273, 3740 Ag Baarn, Países Bajos, para los objetivos de
procedimiento de la patente en la fecha indicada abajo. Siendo CBS
un depositario internacional según el tratado de Budapest provee
permanencia del depósito conforme a regla 9 de dicho tratado. Fecha
de depósito: 2 junio 1997
Ref. del depositante: NN049253
Designación CBS: CBS 793.97
Glucoamilasa G1 derivada de Aspergillus
niger descrita en Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5),
1097-1102 disponible de Novo Nordisk y mostrada en
SEC ID NO: 9.
\vskip1.000000\baselineskip
JaL228; la construcción de esta cepa es descrita
en WO98/12300 SMO110; la construcción de esta cepa es descrita en
el Ejemplo 6 de la Cepa de Levadura: Saccharomyces
cerevisiae YNG318: MATa leu2-D2
ura3-52 his4-539
pep4-D1 [cir+].
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de glucoamilasa de A. niger G1 es
mostrado en SEC ID NO: 8. El gen de glucoamilasa de T.
emersonii con intrones es mostrado en Fig. 5 y SEC ID NO: 33.
Los intrones son mostrados en Fig. 5.
\vskip1.000000\baselineskip
pJSO026 (plásmido de expresión de S.
cerevisiae) (J.S. Okkels, (1996) A
URA3-promoter deletion in a pYES vector increases
the expression level of a fungal lipase in Saccharomyces
cerevisiae. Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration
of Biological and Engineering Sciences, vol. 782 of the Annals of
the New York Academy of Sciences). Más específicamente, el plásmido
de expresión pJSO26 es derivado de pYES 2.0 por sustitución del
promotor GAL 1 inducible de pYES 2.0 con la TPI (triosa fosfato
isomerasa) expresada constitutivamente, promotor de Saccharomyces
cerevisiae (Albert and Karwasaki, (1982), J. Mol. Appl. Genet,
1, 419-434), y suprimiendo una parte del promotor
URA3.
pJaL497; La construcción de este plásmido está
descrita en el Ejemplo 5
pJaL507; La construcción de este plásmido está
descrita en el Ejemplo 5
pJaL510; La construcción de este plásmido está
descrita en el Ejemplo 5
pJaL511; La construcción de este plásmido está
descrita en el Ejemplo 5
pJaL518; La construcción de este plásmido está
descrita en el Ejemplo 6
pCaHj483; La construcción de este plásmido está
descrita en el Ejemplo 6
pJRoy10; La construcción de este plásmido está
descrita en el Ejemplo 6
pJRoy17; La construcción de este plásmido está
descrita en el Ejemplo 6
pSM0127; La construcción de este plásmido está
descrita en el Ejemplo 6
pCR^{TM}II; Disponible de Invitrogen
Corporation, San Diego, CA, EEUU.
\newpage
Secuenciador de ADN automático (modelo 377 de
Applied Biosystems)
Sometido a autoclave durante 20 minutos a
121ºC.
A partir de una solución madre estéril con el 5%
de Treonina son añadidos 4 ml a un volumen de 900 ml junto con 100
ml de una glucosa estéril al 20%.
Sometido a autoclave durante 20 minutos a
121ºC
100 ml de una glucosa estéril al 20% son
añadidos a 900 ml.
Una unidad de Amiloglucosidasa Novo (AGU) es
definida como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de
maltosa por minuto según las siguientes condiciones estándares:
Una descripción detallada del método analítico
(AF22) es disponible a petición.
PUN es definida como la cantidad de enzima que
hidroliza pululano (0,2% pululano, a 40ºC, pH 5,0), liberando
carbohidrato con una potencia reductora equivalente a 1
micro-mol de glucosa por minuto.
La actividad es determinada en AFAU calculada
como la reducción en concentración de almidón a pH 2,5, 40ºC, 0,17
g/l almidón y determinada por una reacción de
yodo-almidón.
La termoestabilidad de glucoamilasa (determinada
como T ½ (vida media)) es evaluada usando el siguiente método: 950
microlitros de 50 mM de tampón de acetato sódico (pH 4,5) (NaOAc)
son incubados durante 5 minutos a 70ºC. Se añaden 50 microlitros de
enzima en tampón (4 AGU/ml). Se toman muestras de 2 x 40 microlitros
a períodos fijos entre 0 y 360 minutos y se enfrían sobre hielo.
Después de enfriar las muestras se mide la actividad enzimática
residual usando el ensayo de determinación AGU (descrito
arriba).
La actividad (AGU/ml) medida antes de la
incubación (0 minutos) es usada como referencia (100%). T_{1/2}
es el periodo de tiempo hasta que la actividad relativa en
porcentaje es disminuida hasta el 50%.
Se mezclaron 1600 microlitros de un sobrenadante
y 400 microlitros de 0,5M NaAC, pH 4,5. Se incubaron 7 tubos
eppendorf conteniendo cada uno 250 microlitros de la mezcla en un
termociclador de Perkin Elmer a 68ºC ó 70ºC durante 0, 5, 10, 20,
30, 45 y 60 minutos.
Se mezclaron 100 microlitros de cada mezcla con
100 microlitros de 5 mM de CNPG3
(2-cloro-4-nitrofenil-alfa-maltotriosido
de Genzyme) en pocillos de microtitulación. Tras la incubación
durante 30 minutos a 37ºC la absorbencia es medida a 405 nm.
El sustrato de 750 microL es incubado 5 minutos
a temperaturas seleccionadas, tales como 37ºC, 60ºC o 70ºC.
Se añaden 50 microL de enzima diluida en acetato
sódico y se determina la actividad usando el método estándar AGU
descrito anteriormente. Los parámetros cinéticos: Kcat y Km son
medidos a 45ºC añadiendo 50 microL de enzima diluida en acetato
sódico al sustrato precalentado de 750 microL. Se retiran partes
alícuotas de 100 microL después de 0, 3, 6, 9 y 12 minutos y se
transfieren a 100 microL 0,4M hidróxido de sodio para detener la
reacción. Se incluye un blanco.
Se transfieren 20 microL a placas de
microtitulación y se añade una solución GOD-Perid
de 200 microL. La absorbencia es medida a 650 nm después de 30
minutos de incubación a temperatura ambiente. La Glucosa es usada
como estándar, y la actividad específica es calculada como
k_{cat} (seg.^{-1})
Se inoculan 100 ml de YPD (Sherman et
Al., (1981), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor
Laboratory) con esporas de A. oryzae y se incuban con
agitación durante aproximadamente 24 horas. Se cosecha el micelio
por filtración a través de miracloth y se lava con 200 ml de 0,6 M
de MgSO_{4}. Se suspende el micelio en 15 ml de 1,2 M de
MgSO_{4}, 10 mM de NaH_{2}PO_{4}, pH 5,8. Se enfría la
suspensión sobre hielo y se añade tampón de 1 ml conteniendo 120 mg
de Novozim^{TM} 234. Después de 5 min., se añade 1 ml de 12 mg/ml
BSA (tipo Sigma H25) y se continúa la incubación con agitación
suave durante 1,5-2,5 horas a 37ºC hasta que un gran
número de protoplastos es visible en una muestra inspeccionada bajo
el microscopio.
Se filtra la suspensión es filtrada a través de
un filtro miracloth, se transfiere el filtrado a un tubo estéril y
se cubre con 5 ml de 0,6 M de sorbitol, 100 mM
Tris-HCl, pH 7,0. Se realiza el centrifugado
durante 15 min. a 1000 g y se recogen los protoplastos desde la
parte superior del colchón de MgSO_{4}. Se añaden 2 volúmenes de
STC (1,2 M de sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10
mM de CaCl_{2}) a la suspensión de protoplasto y se centrifuga la
mezcla durante 5 min. a 1000 g. El granulado de protoplasto es
resuspendido en 3 ml de STC y regranulado. Esto se repite.
Finalmente, se vuelven a suspender los protoplastos en
0,2-1 ml de STC.
Se mezcla 100 pl de suspensión de protoplasto
con 5-25 \mug de p3SR2 (un plásmido que lleva el
gen amdS de A. nidulans descrito en Hynes et al., Mol.
and Cel. Biol., Vol. 3, nº. 8, 1430-1439, Agosto,
1983) en 10 \mul de STC. Se deja la mezcla a temperatura ambiente
durante 25 min. Se añade 0,2 ml de 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM
de CaCl_{2} y 10 mM de tris-HCl, pH 7,5 y se
mezcla cuidadosamente (dos veces) y finalmente se añade 0,85 ml de
la misma solución y se mezcla cuidadosamente. Se deja la mezcla a
temperatura ambiente durante 25 min., se centrifuga a 2.500 g
durante 15 min. y se vuelve a suspender el granulado en 2 ml de 1,2
M sorbitol. Después de una sedimentación más, se extienden los
protoplastos sobre placas mínimas (Cove, (1966), Biochem. Biophys.
Acta 113, 51-56) que contienen 1,0 M sacarosa, pH
7,0, 10 mM de acetamida como fuente de nitrógeno y 20 mM de CsCl
para inhibir el crecimiento residual. Tras la incubación durante
4-7 días a 37ºC las esporas son recogidas,
suspendidas en agua estéril y extendidas en colonias individuales.
Este procedimiento es repetido y las esporas de una colonia
individual después del segundo reaislamiento son almacenadas como
un transformante definido.
La fermentación por lote alimentado es realizada
en un medio que comprende maltodextrina como una fuente de carbono,
urea como una fuente de nitrógeno y extracto de levadura. La
fermentación por lote alimentado es realizada inoculando un cultivo
en un matraz vibrante de las células huésped fúngicas en cuestión
en un medio que comprende 3,5% de fuente de carbono y 0,5% de
fuente de nitrógeno. Después de 24 horas de cultivo a pH 5,0 y a
34ºC se inicia la alimentación continua de fuentes de nitrógeno y
carbono adicionales. La fuente de carbono es tenida como el factor
de limitación y se asegura que haya un exceso de oxígeno. El
cultivo por lote alimentado es continuado durante 4 días, después
de los cuales pueden ser recuperadas las enzimas por centrifugado,
ultrafiltración, filtración clara y filtración de germen. Además, la
purificación puede ser hecha por métodos cromatográficos de
intercambio aniónico conocidos en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos de ADN y los vectores abiertos
son mezclados y transformados en la levadura Saccharomyces
cerevisiae de YNG318 por métodos estándares.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se centrifugaron 3500 ml de caldo de cultivo
T. emersonii de fermentación tipo salvaje con 0,05 AGU/ml a
9000 r.p.m. seguido de filtración en vacío a través de papel
filtrante y finalmente una filtración en blanco. Después se usó el
procedimiento siguiente para purificar la enzima:
- \quad
- Fenil-sefarosa (250 ml): 1,3 M AMS/10 mM Tris/2 mM CaCl_{2}, pH 7; elución con 10 mM Tris/2 mM CaCl_{2}, pH 7.
- \quad
- Diálisis: 20 mM NaAc, 2 mM CaCl_{2}, pH 5.
- \quad
- Q sefarosa (100 ml): 20 mM NaAc, 2 mM CaCl_{2}, pH 5; elución con un gradiente lineal de 0-0,4 M NaCl sobre 10 volúmenes de columna. Diálisis: 20 mM NaAc, 2 mM CaCl_{2}, pH 5.
- \quad
- Eliminación del color: 0,5% carbón en 10 minutos.
- \quad
- Q sefarosa (20 ml): 20 mM NaAc, 2 mM CaCl_{2}, pH 4.5; elución con un gradiente lineal de 0-0,4 M NaCl sobre 10 volúmenes de columna.
- \quad
- Diálisis: 20 mM NaAc, 2 mM CaCl_{2}, pH 5.
- \quad
- S Sefarosa (1 ml): 5 mM ácido cítrico, pH 2.9; elución con un gradiente lineal de 0-0,3 M NaCl sobre 10 volumen de columna.
Se obtuvo una pureza de la enzima superior al
90% después de la fase de Sefarosa S.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se usó la glucoamilasa purificada Talaromyces
emersonii CBS 793.97 para la caracterización.
Peso molecular (M_{v})
El peso molecular fue determinado por
SDS-PAGE en unos 70 kDa como se muestra en la
Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó el pl por debajo de 3,5 por
focalización isoeléctrica (Amploline PAG, pH
3,5-9,5 de Pharmacia).
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la dependencia
pH-actividad de la glucoamilasa de Talaromyces
emersonii y se comparó con el perfil de glucoamilasa de
Aspergillus niger.
Se determinó el perfil
pH-actividad usando 0,5% de maltosa como sustrato en
0,1 M de acetato sódico a 60ºC. El pH fue medido en muestras dobles
comprendiendo 0,1-1 AGU/ml. El resultado de la
prueba es mostrado en
\hbox{la Figura 2.}
Se determinó la dependencia
temperatura-actividad de la glucoamilasa de
Talaromyces emersonii de la invención y se comparó con el
perfil de glucoamilasa de Aspergillus niger. Se incubaron
200 \mul de maltosa al 0,5%, pH 4,3, a 37, 50, 60, 70, 75, 80 y
90ºC y la reacción fue comenzada añadiendo 10 \mul de enzima (0,25
AGU/ml); el tiempo de reacción fue de 10 minutos. El resultado de
la prueba es mostrado en la Figura 3.
Se determinó la termoestabilidad de la
glucoamilasa de Talaromyces emersonii y se comparó con la
termoestabilidad de glucoamilasa de Aspergillus niger. El
método usado ha sido descrito anteriormente en la sección de
"Material y Métodos" como "Determinación de la
Termoestabilidad I (T ½ (vida media) de AMG".
Se determinó la T ½ de la glucoamilasa de
Talaromyces emersonii en aproximadamente 120 minutos a 70ºC.
Se determinó la T ½ de la glucoamilasa de Aspergillus niger
en 7 minutos bajo las mismas condiciones (véase Figura 4).
El coeficiente de extensión fue determinado en:
\varepsilon = 2,44 ml/mg*cm sobre la base de la absorbencia a 280
nm y concentración de proteínas. La actividad específica hacia
maltosa a 37ºC fue después calculada en 7,3 AGU/mg. La pureza de la
muestra fue aproximadamente del 90% y una actividad específica
corregida es en consecuencia de 8,0 AGU/mg. Se midieron las
siguientes actividades específicas:
Ejemplo
3
Se determinó el N-terminal de la
secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de T. emersonii
después de SDS-PAGE y de electrotransferencia sobre
una membrana PVDF. Se obtuvieron los péptidos de glucoamilasa
reducida y S-carboximetilada por seccionamiento con
una proteasa específica de lisilo. Los péptidos resultantes fueron
fraccionados y repurificados usando RP-HPLC antes de
ser sometidos a determinación de la secuencia
N-terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La longitud total de la secuencia de aminoácidos
de la glucoamilasa de T. emersonii mostrada en SEC ID NO: 7
fue identificada usando métodos estándares.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Para la clonación del gen de la AMG de
Talaromyces emersonii se designaron cebadores deteriorados
mostrados en la tabla 1 para la amplificación por PCR de parte del
gen AMG.
Se preparó el ADN genómico de Talaromyces
emersonii a partir de protoplastos hechos por procedimientos
estándares [véase por ej. Christensen et al. Biotechnology
1989 6 1419-1422] y se usó como molde en la reacción
PCR. La reacción de amplificación fue realizada en volúmenes de 100
\mul conteniendo 2,5 unidades de Taq-Polimerasa,
100 ng de ADN genómico de A. orizae, 50 mM de KCl, 10 mM de
Tris-HCl, pH 8,0, 1,5 mM de MgCl_{2}, 250 nM de
cada dNTP, y 100 pM de cada uno de los conjuntos de cebadores que
siguen: 102434/117360, 102434/117361, 102435/117360, 102434/117361,
102434/127420, y 102434/127420.
La amplificación se efectuó en un termociclador
de ADN Perkin-Elmer Cetus Termal 480, y consistió
en un ciclo de 3 minutos a 94ºC, seguido de 30 ciclos de 1 minutos
a 94ºC, 30 segundos a 40ºC, y 1 minuto a 72ºC. Sólo la reacción PCR
102434/117360 dio productos. Se detectaron cuatro bandas con los
siguientes tamaños 1400, 800, 650, y 525 bp. Las cuatro bandas
fueron purificadas y clonadas en el vector pCR®2.1 (Invitrogen®).
La secuenciación de unos pocos clones de cada banda y la
comparación de las secuencias con AMG de A. niger, reveló que
un clon de la banda 650 bp codifica la parte
N-terminal de AMG de Talaromyces emersonii.
Este clon fue designado
pJaL497.
pJaL497.
Para obtener más del gen se hizo un cebador
específico (123036:
5'-GTGAGCCCAAGTTCAATGTG-3' (SEC ID
NO: 15) a partir de la secuencia de clon pJaL497. El grupo cebador
123036/127420 fue usado para la PCR en el ADN genómico de
Talaromyces y se obtuvo un único fragmento de unos 1500 bp.
El fragmento de PCR fue clonado y secuenciado en el vector pCR®2.1.
Por secuenciación el clon fue confirmado a la parte
C-terminal codificada de la AMG de Talaromyces
emersonii. El clon fue designado pJaL507.
\vskip1.000000\baselineskip
Tomados juntos los dos clones pJaL497 y pJaL507
cubrieron aproximadamente el 95% del gen de la AMG. Para clonar la
parte que falta del gen de la AMG se construyó un mapa de
restricción genómico usando los dos fragmentos PCR como sondas a un
Southern blot de ADN genómico de Talaromyces emersonii
digerido con una única o una combinación de varias enzimas de
restricción. Esto muestra que el gen de la AMG de Talaromyces
emersonii está localizado en dos fragmentos EcoRI de
aproximadamente 5,6 kb y 6,3 kb, respectivamente.
El ADN genómico de Talaromyces emersonii
fue digerido con EcoRI y se purificaron y usaron fragmentos con el
tamaño entre 4-7 kb para la construcción de una
biblioteca parcialmente genómica en Lambda ZAP II como describen las
instrucciones del fabricante (stratagene). La librería fue
seleccionada primero usando el fragmento EcoRI de 0,7 kb de pJaL497
(que codifica la mitad N-terminal del gen de la AMG)
como sonda para tomar el inicio del gen de la AMG. Se obtuvo un
clon y se le designó pJaL511. En una segunda selección de la
biblioteca usando un fragmento EcoRV de 0,75 kb a partir de pJaL507
(que codifica la mitad C-terminal del gen de la AMG)
como sonda para obtener el extremo C-terminal del
gen de la AMG. Se obtuvo un clon y se le designó pJaL510.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo la secuencia del gen de la AMG por
secuenciación sobre los plásmidos: pJaL497; pJaL507; pJaL510, y
pJaL511 y en subclones de estos con los cebadores estándares
directos e inversos para pUC. Las proteínas adaptadoras restantes
fueron cerradas usando oligonucleótidos específicos como
cebadores.
Los intrones potenciales fueron descubiertos
comparando la secuencia con secuencias de consenso para intrones en
Aspergillus y con la secuencia de la AMG de A. niger.
La secuencia de nucleótidos de AMG de Talaromyces emersonii
tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína sobre
618 aminoácidos, interrumpida por cuatro intrones de 57 pares de
bases, 55 pares de bases, 48 pares de bases y 59 pares de bases,
respectivamente. La secuencia de nucleótidos (con intrones) y
secuencia deducida de aminoácidos son mostradas en la Fig. 5. La
secuencia de ADN (con intrones) es mostrada también en SEC ID NO:
33 y la secuencia de AMG de Talaromyces emersonii (con
secuencia de señal de 1 a 27) es mostrada en SEC ID NO: 34. La
comparación de las secuencias de aminoácidos deducida con la AMG de
A. oryzae y AMG de A. niger muestra una identidad del
60,1% y 60,5%, respectivamente. La alineación de las secuencias de
aminoácidos mostrada en la Fig. 6 muestra que la AMG de
Talaromyces tiene una conexión muy corta entre el dominio
catalítico y el dominio de unión del almidón que también se
distingue para la AMG de A. orizae.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
La construcción de pCaHj483 está representada en
la Fig. 7. Dicho plásmido es construido a partir de los siguientes
fragmentos:
- a)
- el vector pToC65 (WO 91/17243) cortado con EcoRI y XbaI.
- b)
- un fragmento XbaI 2.7 kb a partir del gen de amdS (C. M. Corrick et al., Gene 53, (1987), 63 71). El gen de amdS es usado como un marcador selectivo en transformaciones fúngicas. El gen de amdS ha sido modificado de modo que el sitio BamHI normalmente presente en el gen es destruido. Esto se ha hecho introduciendo una mutación puntual silenciosa usando el cebador: 5'-AGAAATCGGGTATCCTTTCAG-3' (SEC ID NO:16)
- c)
- un fragmento EcoRI/HamHI de 0,6 kb que lleva el promotor A. Niger NA2 fundido a un fragmento de ADN de 60 bp de la secuencia que codifica el extremo 5' no traducio del ARNm del gen tpi de A. nidulans. El promotor NA2 fue aislado del plásmido pNA2 (descrito en WO 89/01969) y fundido a la secuencia de tpi de 60 bp por PCR. El cebador que codifica la secuencia de tpi de 60 bp tenía la siguiente secuencia:
- d)
- Un fragmento XbaI de 675 bp que lleva el terminador de transcripción de glucoamilasa de A. Niger. El fragmento fue aislado del plásmido pICAMG/Término (descrito en EP 0238 023).
El sitio BamHI del fragmento c fue
conectado al sitio XbaI delante del terminador de
transcripción sobre el fragmento d por medio del enlace pIC19R
(BamHI a XbaI)
La región de codificación del gen AMG de
Talaromyces emersonii fue amplificada por PCR, usando los
dos cebadores siguientes de oligonucleótidos: el cebador 139746:
5'-GACAGATCTCCACCATGGCCCTCGTTG
3' (SEC ID NO:18);
y el cebador 139747:
5'-GACCTCGAGTCATGCCAACTACTGCC
3' (SEC ID NO:19). Las regiones subrayadas indican secuencias
presentes en el gen AMG de Talaromyces emersonii. Para
facilitar la clonación se introdujo un sitio de enzima de
restricción en el extremo 5' de cada cebador; el cebador 139746
contiene un sitio BglII y el cebador 139747 contiene un sitio XhoI.
Se usó el ADN genómico de Talaromyces emersonii como molde
en la reacción PCR. La reacción fue realizada en un volumen de 100
\mul conteniendo 2,5 unidades de Taq polimerasa, 100 ng de pSO2,
250 nM de cada dNTP, y 10 pmol de cada uno de los dos cebadores
descritos anteriormente en un tampón de reacción de 50 mM de KCl, 10
mM de Tris-HCl, pH 8,0, 1,5 mM de MgCl_{2}.
La amplificación fue realizada en un
termociclador de ADN Perkin-Elmer Cetus Termal 480,
y consistió en un ciclo de 3 minutos a 94ºC seguido de 25 ciclos de
1 minuto a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, y 1 minuto a 72ºC. La reacción
PCR produjo un único fragmento de ADN de 2099 bp de longitud. Este
fragmento fue digerido con BglII y XhoI y aislado por
electroforesis de gel, purificado, y clonado en pCaHj483 digerido
con BamHI y XhoI, dando como resultado un plásmido que fue
designado pJaL518. Así, la construcción del plásmido pJal518
resultó en un plásmido de expresión fúngica para el gen de AMG de
Talaromyces emersonii (Fig. 8).
Se creó una biblioteca de A. niger
BO-1 en EMBL4 como describen las instrucciones del
fabricante. La biblioteca fue seleccionada con oligonucleótidos
marcados con DIG (pyrG:
5'-CCCTCACCAGGGGAATGCTGCAGTTGATG-3'
(SEC ID NO: 20) que fue diseñado a partir de la secuencia publicada
de Aspergillus niger (Wilson et al. Nucleic Acids
Res. 16, (1988), 2339-2339). Un clon positivo EMBL4
que hibridizó con la sonda DIG fue aislado de la biblioteca
BO-1, y un fragmento XbaI de 3,9 kb conteniendo el
gen pyrG fue subclonado del clon EMBL4 y clonado en pUC118 para
crear pJRoy10.
Se seleccionó la biblioteca mencionada arriba de
A. niger BO-1 con un fragmento de PCR
marcado con DIG generado por amplificación sobre un ADN genómico de
A. niger con los siguientes oligonucleótidos, 950847:
5'-CGCCATTCTCGGCGACTT-3'
(SEC ID NO:21), y oligonucleótido 951216:
5'-CGCCGCGGTATTCTGCAG-3'
(SEC ID NO:22), que fue diseñado a partir de la secuencia publicada
de Aspergillus niger (Boel et al., EMBO J. 3, (1984),
1581-1585). Un clon positivo EMBL4 que hibridizó
con la sonda DIG fue aislado de la biblioteca BO-1,
y un fragmento Spel de 4,0 kb conteniendo el gen AMG fue subclonado
desde el clon EMBL4 y clon en pBluescriptSK+ generando el plásmido
pJRoyl7a.
Un fragmento de SpeI-XhoI de 2,3
kb conteniendo pyrG fue aislado con gel de pJRoy10 y los extremos
restringidos rellenados con polimerasa de Klenow. El fragmento fue
insertado en el sitio Bglll de pJRoy17 que corta dentro del gen AMG
creando el plásmido pSMO127 (Fig. 9). Entre los dos sitios Spel de
pSMO127a está contenido el gen pyrG de 2,3 kb flanqueado por AMG de
2,2 kb y 2,3 kb 5' y 3', respectivamente.
JRoyP3 de A. niger es un mutante pyrG
espontáneo de A. niger BO-1, que fue
seleccionado para el crecimiento sobre una placa conteniendo ácido
5'-fluoro-orótico
(5'-FOA). El gen pyrG codifica la orotidina
5'-fosfato carboxilasa y su mutante deficitario
puede ser caracterizado como auxótrofo de uridina. La identidad del
mutante pyrG fue confirmada por la complementación del crecimiento
en un medio mínimo con gen pyrG de A. nidulans.
Veinte microgramos del plásmido pSMO127 fueron
digeridos con Spel. El ADN fue disuelto en un gel al 0,8% de
agarosa y el 6 kb consistente en el casete de ruptura lineal fue
aislado. El ADN lineal fue transformado en la cepa JRoyP3. El ADN
genómico fue obtenido a partir de 200 transformantes que fueron
después digeridos con Spel. El ADN disuelto de nuevo en gel fue
transferido a un filtro hybond de nilón, e hibridizado con una
sonda no radioactiva DIG consistente en el marco de lectura abierta
de AMG. Una sustitución del gen del casete de ruptura en la
localización de la AMG produciría un aumento de la banda de AMG
tipo salvaje de 4 kb a 6,3 kb un aumento debido al gen pyrG
de 2,3 kb. Un transformante #110 con las características anteriores
fue seleccionado para el análisis adicional.
El transformante #110 fue cultivado en frascos
de agitación que contenían medios de YPM. Las cepas
BO-1 y la cepa progenitora JRoyP3 fueron cultivadas
como controles de producción de AMG. Después de 3 días, se pasaron
30pl de sobrenadantes por un gel al 8-16% de SDS
PAGE Novex. Ninguna banda AMG fue vista en el transformante #110,
mientras las bandas grandes de AMG fueron producidas en la cepa de
control positivo BO-1 y la cepa progenitora JRoyP3.
El transformante #110 fue denominado SMO110.
Las cepas JaL228 y SM0110 fueron transformadas
con pJaL518 como describieron Christensen et al.;
Biotechnology 1988 6 1419-1422. Normalmente, los
micelios de A. oryzae fueron cultivados en un caldo nutritivo
rico. Los micelios fueron separados del caldo por filtración. Se
añadió la preparación enzimática Novozyme® (Novo Nordisk) a los
micelios en tampón osmóticamente estabilizante tal como 1,2 M de
MgSO_{4} tamponados a un pH 5,0 con fosfato sódico. Se incubó la
suspensión durante 60 minutos a 37ºC con agitación. El protoplasto
fue filtrado por un filtro miracloth para eliminar los restos
miceliales. El protoplasto fue cosechado y lavado dos veces con STC
(1,2 m sorbitol, 10 mM de CaCl_{2}, 10 mM de
tris-HCl, pH 7,5). El protoplasto fue resuspendido
finalmente en 200-1000 \mul de STC.
Para la transformación se añadieron 5 \mug de
ADN a -100 \mul de suspensión de protoplasto y después se
añadieron 200 \mul de solución PEG (60% PEG 4000, 10 mM de
CaCl_{2}, 10 mM de tris-HCl, pH 7,5) y se incubó
la mezcla durante 20 minutos a temperatura ambiente. El protoplasto
fue cosechado y lavado dos veces con 1,2 M de sorbitol. El
protoplasto fue resuspendido finalmente 200 \mul 1,2 M de
sorbitol, depositado en placas selectivas (medio mínimo + 10 g/l
Bacto-agar (Difco), e incubado a 37ºC. Después de
3-4 días de cultivo a 37ºC, los transformantes
estables aparecen como colonias que se cultivan y esporan
enérgicamente. Los transformantes fueron separados en esporas dos
veces.
Los transformantes fueron cultivados en matraz
vibrante durante 4 días a 30ºC en un medio de 100 ml d YPM (2 g/l
de extracto de levadura, 2 g/l de peptona, y 2% de maltosa). Los
sobrenadantes fueron evaluados en cuanto a actividad de AMG como se
ha descrito y fueron analizados sobre gel SDS page (Fig. 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Para cada exón se hizo una reacción PCR con
cebadores conteniendo solapamiento con el siguiente exón. Tal 1 y
Tal 4 contienen un solapamiento con el vector de levadura
pJS0026.
Exón 1: Tal 1 fue usado como el cebador 5' y Tal
5 como el cebador 3' y la secuencia genómica que codifica AMG fue
usada como el molde. Exón 2: Tal 6 fue usado como el cebador 5' y
Tal 7 fue usado como el cebador 3' y la secuencia genómica que
codifica AMG fue usada como el molde. Exón 3: Tal 8 fue usado como
el 5' cebador y Tal 9 fue usado como el cebador 3' y la secuencia
genómica que codifica AMG fue usada como el molde. Exón 4: Tal 10
fue usado como el cebador 5' y Tal 11 fue usado como el cebador 3'
y la secuencia genómica que codifica AMG fue usada como molde. Exón
5: Tal 12 fue usado como el cebador 5' y Tal 4 fue usado como
cebador 3' y la secuencia genómica que codifica AMG fue usada como
el molde.
Se realizó una reacción PCR final para combinar
los 5 exones con una secuencia que contiene la secuencia
codificante completa. En esta reacción PCR los 5 fragmentos fueron
usados como molde a partir de las primeras reacciones de PCR y Tal 1
fue usado como el cebador 5' y Tal 4 fue usado como el cebador
3'.
Este fragmento final de PCR que contiene la
región de codificación fue usado en una recombinación in
vivo en levadura junto con pJSO026 cortado con las enzimas de
restricción SmaI (o BamHI) y XbaI (para eliminar la región de
codificación y al mismo tiempo crear un solapamiento de
aproximadamente 20 bp en cada terminal para hacer posible un evento
de recombinación).
Ejemplo
8
Para expresar AMG de Talaromyces
emersonii en la levadura Saccharomyces cerevisiae YNG318
el vector de expresión de levadura pJSO26 fue construido como se
describe en la sección de arriba "Material y Métodos".
PJSO26 que comprende la secuencia de ADN que
codifica la AMG de Talaromyces fue transformado en la
levadura por métodos estándares (véase Sambrooks et al.,
(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring
Harbor).
Las células de levadura fueron cultivadas a 30ºC
durante 3 días en medio de Sc-ura seguido de
cultivo durante 3 días en YPD. El cultivo fue después centrifugado y
el sobrenadante fue usado para el ensayo de termoestabilidad
descrito en la sección "Materiales y Métodos".
El caldo de fermentación de la AMG de
Talaromyces emersonii expresado en levadura
(Saccharomyces cerevisiae YNG318) fue usado para determinar
la termoestabilidad a 68ºC usando el método descrito anteriormente
bajo "Determinación de la Termoestabilidad II". El resultado
de la prueba es mostrado en la Figura 12.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se centrifugaron 200 ml de caldo de cultivo de
la fermentación de A. niger HowB112 conteniendo el gen de
Talaromyces emersonii a 9000 r.p.m. y se dializaron con 20
mM de NaOac, pH 5 durante toda la noche. La solución fue después
aplicada sobre una columna de S Sefarosa (200 ml) previamente
equilibrada con 20 mM de NaOac, pH 5. La glucoamilasa fue recogida
en el efluente, y aplicada sobre una columna de Q Sefarosa (50 ml)
previamente equilibrada en 20 mM de NaOac, pH 4,5. El material no
ligado fue lavado de la columna y la glucoamilasa fue eluida usando
un gradiente lineal de 0-0,3 M de NaCl en 20 mM de
NaOac sobre 10 volúmenes de columna. Se controló la pureza de la
fracción de glucoamilasa por SDS-PAGE y sólo se vio
una única banda. El peso molecular resultó ser otra vez de
aproximadamente 70 kdal como se ha visto para la glucoamilasa de
tipo salvaje. La actividad específica hacia la maltosa fue medida
encontrándose una actividad específica de 8,0 AGU/mg (37ºC) y 21,0
AGU/mg (60ºC), lo que concuerda con los datos en la enzima de tipo
salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Parámetros cinéticos para la Hidrólisis de
Maltosa e Isomaltosa por AMG de Aspergillus niger y el AMG
recombinante de Talaromyces emersonii expresado en A.
niger.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
El resultado de sacarificación de la
glucoamilasa de Talaromyces emersonii fue evaluado a
temperaturas diferentes con y sin la adición de
\alpha-amilasa y pululanasa ácida.
La sacarificación fue llevada a cabo según las
siguientes condiciones:
Sustrato: 10 DE maltodextrina, aprox. 30% DS
(p/p)
Temperaturas: 60, 65, o 70ºC
pH Inicial: 4,5
Dosificación enzimática:
Glucoamilasa recombinante de Talaromyces
emersonii producida en A. niger. 0,24 o 0,32 AGU/g
DS
\alpha-amilasa ácida obtenida
de A. niger. 0,020 AFAU/g DS
Pululanasa derivada de Bacillus: 0,03
PUN/g DS
Cuando se usa sola, se dosifica la AMG de
Talaromyces con una dosificación elevada (0,32 AGU/g DS), de
lo contrario con una dosificación baja, es decir, 0,24 AGU/g
DS.
\vskip1.000000\baselineskip
El sustrato para la sacarificación fue hecho
disolviendo maltodextrina (preparada a partir de maíz común) en
agua Milli-Q en ebullición y ajustando la sustancia
seca a aproximadamente el 30% (p/p). El pH fue ajustado a 4,5
(medido a 60ºC). Se transfirieron partes alícuotas del sustrato
correspondientes a 150 g de sólidos secos a frascos de vidrio de
500 ml con tapón azul y se colocaron al baño maría con agitación a
las temperaturas respectivas. Se añadieron enzimas y el pH fue
reajustado en caso necesario (medido a temperatura de incubación).
Las muestras fueron tomadas periódicamente y analizadas por HPLC
para determinar la composición del carbohidrato.
La glucosa producida durante la sacarificación
es dada en la tabla de abajo, donde las tres primeras columnas
representan la sacarificación con glucoamilasa y
\alpha-amilasa y pululanasa ácidas, las tres
últimas solo con glucoamilasa. Los números son % DPI en DS.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se obtuvo una producción de glucosa por encima
del 95% después de 72 horas usando una dosificación enzimática de
0,24 AGU/g DS correspondiendo a 0,03 mg/g DS. La dosificación
típica de AMG de A. niger sería de 0,18 AGU/g DS
correspondiendo a 0,09 mg/g DS para obtener una producción de
95-96% de glucosa. Una dosificación enzimática
significativamente más baja en mg de proteína enzimática de
Talaromyces. AMG es en consecuencia requerida en el proceso
de sacarificación en comparación con AMG de A. Niger debido
a la alta actividad específica de AMG de T. emersonii.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Se determinó la termoestabilidad de la
glucoamilasa recombinante de Talaromyces emersonii expresada
en levadura (purificada usando el método descrito en el Ejemplo 9)
a 70ºC, pH 4,5, 0,2 AGU/ml usando el método anteriormente descrito
en la sección "Materiales y Métodos" como "Determinación de
la Termoestabilidad (T ½ (vida media) de AMG I".
La Figura 13 muestra el resultado de la prueba.
La T_{1/2} de la glucoamilasa recombinante de Talaromyces
emersonii expresada en levadura fue determinada a
aproximadamente 110 minutos a 70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de documentos citados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea.
Aquella ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
- \bullet US 4247637 A [0006]
- \bullet EP 452238 A [0057]
- \bullet US 4587215 A [0007]
- \bullet WO 9812300 A [0066]
- \bullet JP 3224493 A [0057]
- \bullet WO 9117243 A [0110]
- \bullet JP 1191693 A [0057]
- \bullet WO 8901969 A [0110]
- \bullet JP 62272987 A [0057]
- \bullet EP 0238023 A [0110]
\bulletBUNNI L et al. Enzyme
Microb. Technol., 1989, vol. 11, 370-375
[0008]
\bulletNEEDLEMAN, S.B. WUNSCH,
C.D. Journal of Molecular Biology, 1970, vol. 48,
443-453 [0041] [0045]
\bulletFEINBERG, A. P.
VOGELSTEIN, B. Anal. Biochem., 1983, vol. 132,
6-13 [0047]
\bullet G.M.A. VAN BEYNUM et al.
Starch Conversion Technology Marcel Dekker 1985.
101-142 [0059]
\bulletBOEL et al. EMBO
J., 1984, vol. 3, no. 5. 1097-1102
[0065]
\bullet A URA3-promoter
deletion in a pYES vector increases the expression level of a fungal
lipase in Saccharomyces cerevisiae J.S. OKKELS
Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological
and Engineering Sciences Annals of the New York Academy of
Sciences 1996. vol. 782, [0068]
\bulletALBERT KARWASAKI J.
Mol. Appl Genet., 1982, vol. 1, 419-434
[0068]
\bulletSHERMAN et al.
Methods in Yeast Genetics Cold Spring Harbor Laboratory 1981. [0084]
\bulletHYNES et al. Mol. and
Cel. Biol., 1983, vol. 3, no. 8.
1430-1439 [0086]
\bulletCOVE Biochem. Biophys.
Acta, 1966, vol. 113, 51-56 [0086]
\bulletCHRISTENSEN et al.
Biotechnology, 1989, vol. 6, 1419-1422
[0103]
\bullet C. M. CORRICK et al.
Gene, 1987, vol. 53, 63-71 [0110]
\bulletWILSON et al. Nucleic
Acids Res., 1988, vol. 16, 2339-2339
[0114]
\bulletBOEL et al. EMBO
J., 1984, vol. 3, 1581-1585 [0115]
\bulletCHRISTENSEN et al.
Biotechnology, 1988, vol. 6, 1419-1422
[0120]
\bulletSAMBROOKS et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor 1989.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Novo Nordisk A/S
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Novo Alle
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Bagsvaerd
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): DK 2880
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +45 4444 8888
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +45 4449 3256
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍITULO DE LA INVENCIÓN: Glucoamilasa termoestable
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CÁLCULO: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentln Edición #1.0, versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Talaromyces emersonii CBS 793.97
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA:: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Talaromyces emersonii CBS 793.97
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Talaromyces emersonii CBS 793.97
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Talaromyces emersonii CBS 793.97
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Talaromyces emersonii CBS 793.97
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Talaromyces emersonii CBS 793.97
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 591 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Talaromyces emersonii CBS 793.97
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1605 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Aspergillus Niger
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sig_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..72
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: puede péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACÓN:73..1602
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:1..1602
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 534 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Cebador 102434)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 3,6,9,12,15
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /Nota N= A,G,C o T
\hskip7.4cmR= G o A
\hskip7.4cmY= C o T
\hskip7.4cmH= A,C o T
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTNTTRAAYA AYATHGG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Cebador 102435)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 3,6,9,12,15
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /Nota N= A,G,C o T
\hskip7.4cmY= C o T
\hskip7.4cmH= A,C o T
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTNCTNAAYA AYATHGG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Cebador 117360)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 3,6,9,12,15
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /Nota N= A,G,C o T
\hskip7.4cmR= G o A
\hskip7.4cmY= C o T
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTRGANACCC TYCTYCA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "CEBADOR 117361)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 3,6,12,15
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /Nota R= G o A
\hskip7.4cmY= C o T
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTRAAYACCC TYCTYCA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Cebador 127420)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 6,9,12,15
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /Nota N= A,G,C o T
\hskip7.4cmR= G o A
\hskip7.4cmY= C o T
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCCTYCTRC TRGGNTT
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Cebador 123036"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAGCCCAA GTTCAATGTG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Cebador 1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAAATCGGG TATCCTTTCA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 105 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "CEBADOR 2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "cebador 139746"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACAGATCTC CACCATGGCG TCCCTCGTTG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN: PARA SEC ID Nº:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Cebador 3"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACCTCGAGT CACTGCCAAC TATCGTC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "cebador 4"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCTCACCAG GGGAATGCTG CAGTTGATG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Cebador 950847"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCCATTCTC GGCGACTT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "cebador 951216"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCCGCGGTA TTCTGCAG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Tal 1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATATAAAC GACGGTACCC GGGAGATCTC CACCATGGCG TCCCTCGTTG
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc - "Tal 4"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAATTACAT CATGCGGCCC TCTAGATCAC TGCCAACTAT CGTC
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Tal 5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTTGGGTC GCTCCTGCTC G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Tal 6"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAGCAGGAG CGACCCAAAT TATTTCTACT CCTGGACACG
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Tal 7"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGAGATAG TTCGCATA CG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Tal 8"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTATGCGAA CTATCTCATC GACAACGGCG AGGCTTCGAC TGC
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Tal 9"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAAGGTGGA TGAGTTCCAG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Tal 10"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGAACTCA TCCACCTTCG ACCTCTGGGA AGAAGTAGAA GG
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Tal 11"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACAATACTC AGATATCCAT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Tal 12"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGGATATC TGAGTATTGT CGAGAAATAT ACTCCCTCAG ACG
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2748 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "ADNc"
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Talaromyces emersonii
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 618 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Talaromyces emersonii
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- NOMBRE/CLAVE: SEÑAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- UBICACIÓN: (1) ... (27)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:
Claims (19)
1. Enzima aislada con actividad glucoamilasa,
donde la enzima,
- a)
- es obtenida de Talaromyces emersonii,
- b)
- muestra un grado de identidad de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 7, y
- c)
- tiene una T_{1/2} (vida media) de al menos 100 minutos en 50 mM de NaOAc, 0,2 AGU/ml, pH 4,5, a 70ºC.
2. Enzima según la reivindicación 1, teniendo la
enzima una T_{1/2} (vida media) en el rango de
100-140 minutos.
3. Enzima según las reivindicaciones
1-2, donde el Talaromyces emersonii es
Talaromyces emersonii CBS 793.97.
4. Secuencia de ADN clonado derivada de
Talaromyces emersonii y que codifica una enzima que muestra
actividad glucoamilasa, comprendiendo la secuencia de ADN:
- (a)
- la parte que codifica la glucoamilasa de la secuencia de ADN mostrada en SEC ID NO: 33;
- (b)
- la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 649-2724 en SEC ID NO:33 o su cadena complementaria;
- (c)
- un análogo de la secuencia de ADN definida en (a) o (b) que es al menos 80% homóloga a dicha secuencia de ADN;
- (d)
- una secuencia de ADN que hibridiza con una sonda de ADN bicatenaria que comprende la secuencia mostrada en 649-2724 en SEC ID NO: 33 con astringencia media:
- (e)
- una secuencia de ADN que, a causa de la degeneración del código genético, no hibridiza con las secuencias de (b) o (c) sino que codifica un polipéptido que tiene exactamente la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por cualquiera de estas secuencias de ADN.
5. Secuencia de ADN según la reivindicación 4,
donde la secuencia de ADN es obtenida del T. emersonii CBS
793.97 depositado.
6. Proceso para la conversión de almidón o
almidón parcialmente hidrolizado en un jarabe conteniendo dextrosa,
incluyendo dicho proceso la fase de sacarificar el almidón
hidrolizado en presencia de una glucoamilasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 o una glucoamilasa codificada
por una secuencia de ADN de las reivindicaciones 4 o 5.
7. Proceso, según la reivindicación 6 donde la
dosificación de glucoamilasa está presente en el rango de 0,05 a
0,5 AGU por gramo de sólidos secos.
8. Proceso de cualquiera de las reivindicaciones
6 ó 7, que comprende la sacarificación de un hidrolizado de almidón
de al menos el 30 por ciento en peso de sólidos secos.
9. Proceso de cualquiera de reivindicaciones 6 a
8, donde la sacarificación es conducida en presencia de una enzima
desramificante seleccionada del grupo de pululanasa e isoamilasa,
preferiblemente una pululanasa derivada de Bacillus
acidopullulyticus o Bacillus deramificans o una
isoamilasa derivada de Pseudomonas amyloderamosa.
10. Proceso de cualquiera de reivindicaciones 6
a 9, donde la sacarificación es conducida a un pH de
aproximadamente 3 a 5,5 y a una temperatura de
60-80ºC.
11. Método de sacarificación de una solución de
almidón licuado, comprendiendo el método una fase de sacarificación
enzimática usando una glucoamilasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 o una glucoamilasa codificada
por una secuencia de ADN de las reivindicaciones 4 o 5.
12. Uso de una glucoamilasa según cualquiera de
las reivindicaciones 1-3 o una glucoamilasa
codificada por una secuencia de ADN de las reivindicaciones 4 ó 5 en
un proceso de conversión de almidón.
13. Uso de una glucoamilasa según cualquiera de
las reivindicaciones 1-3 o una glucoamilasa
codificada por una secuencia de ADN de las reivindicaciones 4 ó 5 en
un proceso continuo de conversión de almidón.
14. Uso de una glucoamilasa según cualquiera de
las reivindicaciones 1-3 o una glucoamilasa
codificada por una secuencia de ADN de las reivindicaciones 4 ó 5 en
un proceso para producir oligosacáridos.
\newpage
15. Uso de una glucoamilasa según cualquiera de
las reivindicaciones 1-3 o una glucoamilasa
codificada por una secuencia de ADN de las reivindicaciones 4 ó 5 en
un proceso para producir jarabes especializados.
16. Uso de una glucoamilasa según cualquiera de
las reivindicaciones 1-3 o una glucoamilasa
codificada por una secuencia de ADN de las reivindicaciones 4 o 5 en
un proceso para producir etanol para combustible.
17. Uso de una glucoamilasa según cualquiera de
las reivindicaciones 1-3 o una glucoamilasa
codificada por una secuencia de ADN de las reivindicaciones 4 o 5 en
un proceso para producir una bebida.
18. Uso de una glucoamilasa según cualquiera de
las reivindicaciones 1-3 o una glucoamilasa
codificada por una secuencia de ADN de las reivindicaciones 4 6 5 en
un proceso de fermentación para producir compuestos orgánicos,
tales como ácido cítrico, ácido ascórbico, lisina, ácido
glutámico.
19. Cultivo puro aislado del microorganismo
Talaromyces emersonii CBS 793.97 capaz de producir una
glicoamilasa tal y como se ha definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 o una glucoamilasa codificada
por una secuencia de ADN de las reivindicaciones 4 6 5.
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