CN103620043A - 来自酶处理蔗渣的沼气 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种处理源自蔗渣的材料的方法，所述处理增加木素纤维素纤维的可降解性。特别地，本发明涉及从酶处理的源自蔗渣的材料产生甲烷，其中利用本发明的酶处理来相比于未处理的蔗渣增加甲烷产生。

Description

来自酶处理蔗渣的沼气
技术领域
本发明涉及一种处理源自蔗渣的材料的方法，所述处理增加木素纤维素纤维的可降解性。特别地，本发明涉及从酶处理的源自蔗渣的材料产生甲烷，其中利用本发明的酶处理来相比于未处理的蔗渣增加甲烷产生。
发明背景
大多数天然的基于植物的材料包含可观量的木素纤维素纤维，木素纤维素纤维在许多生物系统中不可消化或者仅可被缓慢消化。其结果是对于许多转化基于植物的材料的生物过程而言，有相当大一部分被处理的材料在整个过程中不被消化或者消化程度低。
蔗渣(bagasse)是甘蔗(sugarcan)或高粱(sorghum)茎秆被粉碎提取其汁液后剩余的纤维物质。当前它被用作生物燃料以及在纸浆与纸产品和建筑材料的制造中作为可再生资源。每粉碎10吨甘蔗，糖厂产生近3吨湿蔗渣。由于蔗渣是蔗糖工业的副产物，因此每个国家的产量与甘蔗的生产量一致。蔗渣的水分含量典型地为40-50%，固形物内容由大约45-50%的纤维素、20-25%的半纤维素、18-24%的木质素和1-4%的灰分组成(基于洗涤并干燥后的内容)。
发明内容
本发明涉及一种基于源自蔗渣的材料的沼气生产方法，其中该方法包括消化罐(digester tank)中的厌氧产沼气发酵之前对材料的至少一个酶预处理，或者在沼气消化罐中在厌氧发酵之前或之中的至少一个酶处理步骤。
因此，在第一个方面，本发明涉及一种沼气生产方法，包括下述步骤：提供包含源自蔗渣的材料与水的浆液，以及：
(a)进行包括添加一种或多种酶到所述浆液的预处理以在合适的温度和pH降解所述源自蔗渣的材料，然后将经过酶降解的材料以合适的速度和比例加入沼气消化罐以在该消化罐中有效地将所述材料转化为沼气；或
(b)添加一种或多种酶到所述浆液，再将所述浆液加入沼气消化罐；
(c)将所述浆液加入消化罐后添加一种或多种酶到该消化罐，以在该消化罐中将所述源自蔗渣的材料在合适的温度和pH下降解并有效地将该材料转化为沼气。
本发明的方法提供几种好处，包括但不限于：
沼气消化罐中的转化速率更高。
消化罐中每体积单位的生产率更高。
在罐容量方面的投资更低。
单位罐容积的产气更高。
源自蔗渣的材料的转化效率更高且干物质浓度更高。
清洗液(purge)中未转化材料的量减少。
未转化的固形物中的干物质含量更高。
不需要后转化罐(post-converter)或贮存罐。
未转化材料的脱水更容易。
气相的清洁更容易。
定义
沼气：
根据本发明，术语“沼气”意思是在常规厌氧发酵罐中获得的气体。沼气的主要成分是甲烷，而且本申请和权利要求中术语“沼气”和“甲烷”可以互换使用。
术语“主消化罐”在本申请和权利要求中意思是在其中发生第一次厌氧发酵的容器。
术语“次消化罐”在本申请和权利要求中意思是在其中发生第二次厌氧发酵的容器。取决于沼气设施的具体构造，主消化罐也可以充当次消化罐。
源自蔗渣的材料：
术语“源自蔗渣的材料”在本申请和权利要求中意思是任何这样的材料，其包含任何形式、任何量或任何比例的蔗渣或来源于蔗渣的材料。源自蔗渣的材料可包含其他源自植物的组分。蔗渣的固形物部分典型地由约45-50%纤维素、20-25%半纤维素、18-24%木质素和1-4%灰分组成。典型的源自植物的组分为淀粉、葡聚糖、阿拉伯聚糖、半乳聚糖、果胶、甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半纤维素诸如木聚糖。源自蔗渣的材料可以是任何经处理或未经处理的源自蔗渣的材料，以及包含这样的材料的任何组合物。
预处理：
术语“预处理”意在包括在实际的沼气生产步骤之前对材料进行的任何合适的处理。源自蔗渣的材料，其可以就是来自甘蔗的蔗渣，可以通过任何合适的方式被预处理。预处理在酶水解之前或者同时进行。预处理的目的是减小粒度、分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素，由此增加水解速率。湿氧化和碱预处理等预处理过程以木质素为目标，而稀酸及自水解则以半纤维素为目标。蒸汽爆破是以木质素为目标的预处理的一个例子。
预处理步骤可以是使用本领域公知技术，如磨制(milling)或湿磨(wetmilling)的常规预处理步骤。在一个优选的实施方案中，预处理在源自蔗渣的材料与水所成的浆液中发生。在预处理过程中源自蔗渣的材料可以以10-80wt.%之间、优选20-70wt.-%之间、尤其是30-60wt.-%之间，如50wt-%左右的量存在。
化学、机械和/或生物预处理
根据本发明，可以对源自蔗渣的材料进行化学的、机械的和/或生物的预处理，然后依照本发明的方法进行水解。机械预处理(常称为“物理”预处理)可以单独进行，或者可以与其他预处理组合进行。
优选地，化学、物理和/或生物预处理在水解之前进行。或者，化学、机械和/或生物预处理在水解同时进行，例如与一种或多种水解酶和/或其他酶活性的添加同时进行，以释放可发酵的糖，例如葡萄糖和/或麦芽糖。
化学预处理
术语“化学预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学预处理。合适的化学预处理的例子包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳处理。此外，湿氧化和控pH热水解(hydrothermolysis)也视为化学预处理。
根据本发明亦涵盖其它预处理技术。已经显示纤维素溶剂处理将约90%的纤维素转化为葡萄糖。还显示了当木素纤维素结构被破坏时，可极大增强酶水解。碱、H2O2、臭氧、有机溶剂(使用含水醇中的路易斯酸，FeCl3，(Al)2SO4)、甘油、二
Figure BDA0000448082900000031
烷，苯酚或乙二醇属于已知可破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等，Bioresource Technology96(2005):p.673-686)。
使用碱，例如NaOH，Na2CO3、NaHCO3、Ca(OH)2、熟石灰、氨和/或KOH等的碱化学预处理也在本发明的范围内。使用氨的预处理方法描述于例如WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900、WO 2006/110901，将它们通过提述并入本文。也可使用如例如在Sven A.Rydholm的“PulpProcesses”583-648页，ISBN0-89874-856-9(1985)中所述的Kraft制浆方法(Kraftpulping process)。在酶处理之前，收集并洗涤固体纸浆(基于干刨花重量为约50%)。
湿氧化技术涉及使用氧化剂，如，基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的实例包括用DMSO(二甲亚砜)等的处理。化学预处理通常进行1到60分钟，如5到30分钟，但取决于待进行预处理的材料可进行更短或更长的时间。
其它合适的预处理方法的实例描述于Schell等，2003,Appl.Biochem andBiotechn.Vol.105-108:p.69-85和Mosier等Bioresource Technology96(2005)673-686，以及美国公开号2002/0164730，这些参考文件均通过提述并入本文。
机械预处理
术语“机械预处理”指任何促进自含源自蔗渣的材料分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素的机械性(或物理性)预处理。举例而言，机械预处理包括多种类型的磨制、辐射、汽蒸/蒸汽爆破(steam explosion)，以及水热解。
机械预处理包括粉碎(机械减小尺度)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨(vibratory ball milling)。机械预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆破)。在本发明的一个实施方案中，高压意指在300到600psi，优选400到500psi，例如约450psi的范围内的压力。在本发明的一个实施方案中，高温意指在约100到300℃，优选约140到235℃的范围内的温度。在一个优选实施方案中，机械预处理作为分批过程在使用如上定义的高压和高温的蒸汽枪水解器系统中进行。也可为此使用Sunds Hydrolyzer(可由Sunds Defibrator AB(Sweden)得到)。
在一个优选实施方案中，对源自蔗渣的材料进行辐射预处理(irradiationpre-treatment)。术语“辐射预处理”指任何借助微波的预处理，例如，如Zhu等“Production of ethanol from microwave-assisted alkali pre-treated wheat straw”在Process Biochemistry41(2006)869-873中所述的，或超声预处理，例如，如Li等“A kinetic study on enzymatic hydrolysis of a variety of pulps for itsenhancement with continuous ultrasonic irradiation”,在Biochemical EngineeringJournal19(2004)155-164中所述的。优选地，步骤(a)或(b)之前所述源自蔗渣的材料已经接受微波和/或超声辐射处理。
在另一个优选的实施方案中，在步骤(a)之前或之中，或者在步骤(b)之前，将所述源自蔗渣的材料或所述浆液均质化，优选通过磨制(milling)、湿磨(wet-milling)、研磨(grinding)、或湿法研磨(wet grinding)均质化。
组合的化学和机械预处理
在一个优选实施方案中，对源自蔗渣的材料既进行化学预处理又进行机械预处理。例如，所述预处理步骤可涉及稀酸或弱酸处理以及高温和/或高压处理。所述化学预处理和机械预处理可根据需要顺序或同时进行。
在一个优选实施方案中，所述预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆破步骤进行。在另一个优选实施方案中，预处理作为氨纤维爆破(fiber explosion)步骤(或AFEX预处理步骤)进行。
在另一个优选的实施方案中，在所述源自蔗渣的材料或浆液被均质化之前或正在被均质化时向其添加碱，优选地，所述碱是NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Ca(OH)2、熟石灰、氨和/或KOH。
生物预处理
术语“生物预处理”指可促进自源自蔗渣的材料分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素的任何生物预处理。已知的生物预处理技术涉及施加可溶化木质素的微生物(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass,于Handbookon Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E.编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh,P.和Singh,A.,1993,Physicochemical andbiological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosicbiomass:a review,于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.和Overend,R.P.编,ACS Symposium Series 566,American Chemical Society,Washington,DC,第15章;Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,于Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-Verlag BerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;Olsson,L.和Hahn-Hagerdal,B.,1996,Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production,Enz.Microb.Tech.18:312-331;以及Vallander,L.和Eriksson,K.-E.L.,1990,Production ofethanol from lignocellulosic materials:State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
在优选的实施方案中，在步骤(a)或(b)之前，源自蔗渣的材料已经被化学、机械和/或生物处理过。
发明详述
在第一个方面，本发明提供一种沼气生产方法，其包括下述步骤：提供包含源自蔗渣的材料与水的浆液，以及：
(a)进行预处理，该预处理包括添加一种或多种酶到所述浆液以在合适的温度和pH降解所述源自蔗渣的材料，然后将该经过酶降解的材料以合适的速度和比例加入沼气消化罐，以在该消化罐中有效地将所述材料转化为沼气；或
(b)添加一种或多种酶到所述浆液，再将所述浆液加入沼气消化罐；或者将所述浆液加入消化罐后添加一种或多种酶到该消化罐，以在该消化罐中在合适的温度和pH下降解该源自蔗渣的材料有效地将所述材料转化为沼气。
酶水解
将发酵源自蔗渣的材料之前或同时将其水解以降解特别是半纤维素和/或纤维素成为可发酵的糖。在酶促液化的过程中，多糖如淀粉、半纤维素、甘露聚糖和纤维素被溶解并转化为主要是寡糖，任何蛋白均水解为主要是肽，而纤维素被转化为糊精。这可以在酶预处理中完成。
在预处理之前或之中，可以将生物质磨制，优选湿法研磨，且任选通过添加依照本发明的酶来帮助磨制。调整温度和pH以允许酶发挥功能。要水解的源自蔗渣的材料典型地占浆液的高于2.5%wt-%DS(干固形物)，优选高于5%wt-%DS，优选高于10%wt-%DS，优选高于15wt-%DS，优选高于20wt.-%DS，更优选高于25wt-%DS。
优选地，在步骤(a)或(b)的过程中通过连续地或逐步地向浆液添加材料来调整源自蔗渣的材料在浆液中的含量。
在一个优选的实施方案中，在步骤(a)中在源自蔗渣的材料被降解之后，但在将它添加到消化罐之前，进行固形物分离步骤，以清洗未被溶解的固形物并任选地将它们回补到方法的步骤(a)中。
可以进一步使源自蔗渣的材料接受选自下组的一种或几种或所有的酶的作用：淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶、氧还酶和植物细胞壁降解酶。
在一个优选的实施方案中，一种或多种酶选自下组：氨肽酶,α-淀粉酶,淀粉葡糖苷酶,阿拉伯呋喃糖苷酶,阿拉伯木聚糖酶,β-葡糖苷酶，糖酶,羧肽酶,过氧化氢酶,纤维二糖水解酶,纤维素酶,几丁质酶，角质酶，环糊精糖基转移酶，阿魏酸酯酶，脱氧核糖核酸酶，内切纤维素酶，内切葡聚糖酶，内切木聚糖酶，酯酶，半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖氧化酶，葡糖苷酶，卤素过氧化物酶，半纤维素酶，转化酶，异构酶，漆酶，连接酶，脂肪酶，裂合酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，氧化酶，果胶酸裂合酶，果胶裂合酶，果胶反式消去酶，果胶乙酯酶，果胶甲酯酶，果胶分解酶，过氧化物酶，蛋白酶，肌醇六磷酸酶，酚氧化酶，聚半乳糖醛酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶，鼠李葡聚糖酶，鼠李半乳糖醛酸酶，核糖核酸酶，SPS酶，转移酶，转谷氨酰胺酶，木聚糖酶和木葡聚糖酶。
在另一个优选的实施方案中，所述一种或多种酶是蛋白酶，果胶酸裂合酶、阿魏酸酯酶和/或甘露聚糖酶。
从预处理罐将经过酶液化的材料以与转化为气体的速率相适合的速率和比例补入沼气消化罐。在液化系统中，pH保持为与消化罐中的pH相同。
值得一提的是，经预处理的生物质材料当被添加到沼气消化罐时优选应具有中性到碱性pH值，认为添加酸性生物质可能由于抑制普通产甲烷微生物而导致沼气转化过程中止。
在第一个方面的方法的一个优选的实施方案中，pH为7-10，例如7.6-10；优选8-10，或8-9，优选大约pH8.5。可以利用NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Ca(OH)2、熟石灰、氨和/或KOH调整pH。温度可以为20-70℃之间，优选30-60℃之间，更优选40-55℃之间，例如大约50℃。在水解步骤中，细胞壁被降解，使得纤维素纤维可被触及以供进一步水解。水解步骤可以作为补料分批过程进行，其中将经预处理的源自蔗渣的材料连续/逐渐补充，或逐步补充到含有水解酶的溶液中。
在一个实施方案中，在预处理的第二个水解步骤中存在果胶酸裂合酶、阿魏酸酯酶和甘露聚糖酶。在一个实施方案中，存在果胶酸裂合酶、阿魏酸酯酶、甘露聚糖酶和纤维素酶。在一个实施方案中，存在果胶酸裂合酶、阿魏酸酯酶、甘露聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶。
任选地，可以分离纤维素原纤维(cellulose fibrils)并在中性到碱性pH条件下用碱性内切葡聚糖酶处理。在该步骤中，干固形物(DS)优选为高于10wt.-%DS，优选高于15wt-%DS，优选高于20wt.-%DS，更优选高于25wt-%DS。
pH应为7-10，诸如8-9，更优选大约8.5。在步骤(a)或(b)之前可以利用NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Ca(OH)2、熟石灰、氨和/或KOH调整pH。温度可以在20-70℃，优选30-60℃，更优选40-50℃的范围。
纤维素原纤维可以在中性到酸性的pH条件下用含有纤维素水解活性的纤维素酶组合物处理。优选地，pH为4-7，优选5-7，如大约5.5。pH优选用磷酸、琥珀酸、盐酸和/或硫酸加以调整。优选在20-70℃、优选30-60℃、更优选40-50℃范围内的温度。
酶
即使在本发明的一种或多种方法的语境中没有特别指出，也应当理解酶及其它化合物是以“有效量”使用的。
蛋白酶
可使用适于在碱性条件下使用的任何蛋白酶。合适的蛋白酶包括那些动物、植物或微生物来源的蛋白酶。优选微生物来源。包括化学或遗传修饰的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶-样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶(substilisin)，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和WO 89/06270中所述的镰孢属蛋白酶。
优选的商业上可得到的蛋白酶包括Novozymes A/S(Denmark)的以商品名EverlaseTM、KannaseTM、AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DurazymTM和EsperaseTM销售的那些，Genencor International的以商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect和Purafect OXP销售的那些，和Solvay Enzymes的以商品名Opticlean和Optimase销售的那些。
半纤维素分解酶
可使用适用于水解半纤维素的任何半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括果胶酸裂合酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶，和它们两种或更多种的组合。优选地，用于本发明的半纤维素酶是内作用的半纤维素酶，且更优选地，所述半纤维素酶是具有在高于pH7，优选pH7-10的碱性条件下水解半纤维素的能力的内作用的半纤维素酶。
在一个实施方案中，所述半纤维素酶是木聚糖酶。在一个实施方案中，所述木聚糖酶可为微生物来源的，如真菌来源的(例如，木霉属(Trichoderma)，多孔菌属(Meripilus)，腐质霉属(Humicola)，曲霉属(Aspergillus)，镰孢属(Fusarium))或来自细菌(例如，芽孢杆菌属(Bacillus))。在一个优选实施方案中，所述木聚糖酶源自丝状真菌，优选源自曲霉属的菌株，如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的菌株；或腐质霉属的菌株，优选疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)的菌株。所述木聚糖酶可优选为内切-1,4-β-木聚糖酶，更优选GH10或GH11的内切-1,4-β-木聚糖酶。商业木聚糖酶的实例包括SHEARZYME
Figure BDA0000448082900000091
200L、SHEARZYME
Figure BDA0000448082900000092
500L、BIOFEED WHEAT
Figure BDA0000448082900000093
和PULPZYMETMHC(来自Novozymes)和GC880，SPEZYMECP(来自Genencor Int)。
所述半纤维素酶可以以有效水解半纤维素的量添加，如以约0.001-0.5wt.-%总干固形物(TS)，更优选以约0.05-0.5wt.-%的TS的量添加。
木聚糖酶可以以1.0-1000FXU/kg干固形物，优选5-500FXU/kg干固形物，优选5-100FXU/kg干固形物且最优选10-100FXU/kg干固形物的量添加。
或者，木聚糖酶可以以0.001-1.0g/kg DS底物，优选以0.005-0.5g/kg DS底物，且最优选以0.05-0.10g/kg DS底物的量添加。
果胶分解酶(或果胶酶)
可降解植物细胞壁果胶组合物的任何果胶分解酶可用于实施本发明。合适的果胶酶包括但不仅限于真菌或细菌来源的那些。还涵盖了经化学或遗传修饰的果胶酶。优选地，用于本发明的果胶酶是重组产生的，且为单组分酶。
果胶酶可根据其优选的底物(高度甲基酯化的果胶或低甲基酯化的果胶以及聚半乳糖醛酸(果胶酸))，及其反应机理(β-消去或水解)来分类。果胶酶可为主要是内作用的，在链内随机位置切割聚合物以得到寡聚物混合物，或其可为外作用的，从聚合物的一端进攻并产生单体或二聚体。几种作用于果胶平滑区域的果胶酶活性包括在Enzyme Nomenclature(1992)提供的酶分类中，例如，果胶酸裂合酶(EC 4.2.2.2)，果胶裂合酶(EC 4.2.2.10)，聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)，外切聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)，外切聚半乳糖醛酸裂合酶(EC 4.2.2.9)和外切聚α-半乳糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.82)。
在实施方案中，果胶酶是果胶酸裂合酶。本文中使用的果胶酸裂合酶酶活性指在果胶酸(亦称为聚半乳糖醛酸)中通过反式消去(transelimination)催化随机剪切α-1,4-糖苷键。果胶酸裂合酶亦称为聚半乳糖醛酸裂合酶和聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸)裂合酶。
果胶酸裂合酶(EC 4.2.2.2)是在果胶酸(亦称为聚半乳糖醛酸)中通过反式消去催化随机剪切α-1,4-糖苷键的酶。果胶酸裂合酶亦包括聚半乳糖醛酸裂合酶和聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸)裂合酶。
优选的果胶酸裂合酶的实例为那些从不同的细菌菌属，如欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和芽孢杆菌属克隆的那些，特别是从地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(美国专利申请6,124,127)以及从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Nasser等,(1993)FEBS Letts.335:319-326)和芽孢杆菌属菌种YA-14(Kim等，(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58:947-949)克隆的那些。还描述了由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(Dave和Vaughn(1971)J.Bacteriol.108:166-174)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)(Nagel和Vaughn(1961)Arch.Biochem.Biophys.93:344-352)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(Karbassi和Vaughn(1980)Can.J.Microbiol.26:377-384)、芽孢杆菌属菌种(Hasegawa和Nagel(1966)J.Food Sci.31:838-845)和芽孢杆菌属菌种RK9(Kelly和Fogarty(1978)Can.J.Microbiol.24:1164-1172)产生的在pH范围8-10具有最大活性的果胶酸裂合酶的纯化。
优选的果胶酸裂合酶可从地衣芽孢杆菌获得，如美国专利申请6,124,127所述。
其它的果胶酸裂合酶可为包含Heffron等,(1995)Mol.Plant-MicrobeInteract.8:331-334和Henrissat等,(1995)Plant Physiol.107:963-976中所述的果胶酸裂合酶的氨基酸序列的那些。
可使用单一的酶或果胶酸裂合酶的组合。适于本发明的优选的商业果胶酸裂合酶制备物是BioPrep
Figure BDA0000448082900000101
3000L，可自Novozymes A/S获得。
甘露聚糖酶
在本发明的上下文中，甘露聚糖酶是β-甘露聚糖酶，且定义为属于EC3.2.1.78的酶。
在几种芽孢杆菌属生物中鉴定了甘露聚糖酶。举例而言，Talbot等,Appl.Environ.Microbiol.,Vol.56,No.11,pp.3505-3510(1990)描述了源自嗜热脂肪芽孢杆菌、具有5.5-7.5的最适pH的β-甘露聚糖酶。Mendoza等,World J.Microbiol.Biotech.,Vol.10,No.5,pp.551-555(1994)描述了源自枯草芽孢杆菌、在pH5.0和55℃具有最佳活性的β-甘露聚糖酶。JP-03047076公开了一种源自芽孢杆菌属菌种、具有8-10的最适pH的β-甘露聚糖酶。JP-63056289描述了一种碱性、热稳定的β-甘露聚糖酶的产生。JP-08051975公开了来自嗜碱的芽孢杆菌属菌种AM-001的碱性β-甘露聚糖酶。WO 97/11164中公开了一种来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的纯化的甘露聚糖酶。WO 94/25576公开了来自棘孢曲霉CBS 101.43的酶，其显示甘露聚糖酶活性，而WO 93/24622公开了自里氏木霉分离的甘露聚糖酶。
所述甘露聚糖酶可来源于芽孢杆菌属的菌株，如具有以GENESEQP登录号AAY54122保藏的序列，或与该氨基酸序列同源的氨基酸序列。合适的商业甘露聚糖酶制备物是由Novozymes A/S产生的Mannaway
Figure BDA0000448082900000111
阿魏酸酯酶
在本发明的上下文中阿魏酸酯酶定义为属于EC 3.1.1.73的酶。
合适的阿魏酸酯酶制备物可从Malabrancea，例如，从P.cinnamomea获得，例如，包含具有欧洲专利申请号07121322.7中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与该氨基酸序列同源的氨基酸序列的阿魏酸酯酶的制备物。
另一种合适的阿魏酸酯酶制备物可自青霉属(Penicillium)，例如，从桔灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)获得，例如，包含具有欧洲专利申请号0815469.7中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与该氨基酸序列同源的氨基酸序列的阿魏酸酯酶的制备物。合适的商业性阿魏酸酯酶制备物是由Novozymes A/S生产的
Figure BDA0000448082900000112
342L。
碱性内切葡聚糖酶
术语“内切葡聚糖酶”意为内-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1,4-β-D-糖苷键，混合型β-1,3-葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖，以及其它含有纤维素组分的植物材料中β-1,4-键的内水解。碱性内切葡聚糖酶是在碱性条件下具有活性的内切葡聚糖酶。
在一个优选实施方案中，内切葡聚糖酶可源自木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属的菌株，优选Chrysosporium lucknowense的菌株。
在一个优选实施方案中，内切葡聚糖酶可源自秋叶氏芽孢杆菌(Bacillusakibai)的菌株。
在一个实施方案中，碱性内切葡聚糖酶组合物是商业上可得到的产品CAREZYME
Figure BDA0000448082900000121
ENDOLASE和CELLUCLEAN
Figure BDA0000448082900000123
(Novozymes A/S,Denmark)之一。所述酶可以1-100g/kg纤维素的剂量施用。
酸性纤维素分解活性
本文中使用的术语“酸性纤维素分解酶活性”应理解为包括具有纤维二糖水解酶活性(EC 3.2.1.91)，例如，纤维二糖水解酶I和/或纤维二糖水解酶II以及内切葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)和/或β-葡糖苷酶活性(EC 3.2.1.21)，在pH6以下时具有活性的酶。
在一个优选实施方案中，纤维素分解活性可为真菌来源的酶的制备物的形式，如来自木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌株；或腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属的菌株，优选Chrysosporium lucknowense的菌株。
在一个优选实施方案中，所述纤维素分解酶制备物包含一种或多种下述活性：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I和II和β-葡糖苷酶活性。
在一个优选实施方案中，所述纤维素分解酶制备物是WO2008/151079中公开的组合物，其通过提述并入本文。在一个优选实施方案中，所述纤维素分解酶制备物包含具有纤维素分解增强活性的多肽，优选为家族GH61A多肽，优选WO 2005/074656(Novozymes)中公开的那些。所述纤维素分解酶制备物还可包含β-葡糖苷酶，如源自木霉属、曲霉属或青霉属的菌株的β-葡糖苷酶，包括公开于WO 2008/057637(Novozymes)中的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白。在一个优选实施方案中，所述纤维素分解酶制备物还可包含CBHII酶，优选土生梭孢霉(Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶II(CEL6A)。在另一个优选实施方案中，所述纤维素分解酶制备物还可包含纤维素酶制备物，优选源自里氏木霉或特异腐质霉的那些。
所述纤维素分解酶组合物还可包含WO 2005/074656中公开的具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)，和源自里氏木霉的纤维素分解酶。
所述纤维素分解酶组合物还可包含棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)GH10木聚糖酶(WO 94/021785)和包含烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499)和橘橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物。
所述纤维素分解酶组合物还可以包含棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO94/021785)和/或里氏木霉纤维素酶制备物。
在另一个优选实施方案中，所述纤维素分解组合物包含WO 2005/074656中公开的具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)，土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)，和来源于里氏木霉的纤维素分解酶。
在一个实施方案中，所述纤维素分解酶组合物是商业上可得到的产品CELLUCLAST1.5L，CELLUZYMETM,CellicTM CTec,CellicTM CTec2,CellicTM HTec,CellicTM HTec2(均为Novozymes A/S,Denmark)或ACCELLARASETM1000(来自Genencor Inc.USA)。
纤维素分解活性可在0.1-100FPU每克总固形物(TS)，优选0.5-50FPU每克TS，特别是1-20FPU每克TS的范围内定量添加。
使用滤纸分析法(FPU分析法)测定纤维素酶活性
本方法公开于Adney,B.和Baker,J.1996.Laboratory Analytical Procedure,LAP-006,National Renewable Energy Laboratory(NREL)的题为“Measurementof Cellulase Activities”的文件。其基于供测定纤维素酶活性的IUPAC方法(Ghose,T.K.,Measurement of Cellulse Activities,Pure&Appl.Chem.59,pp.257-268,1987)。
该方法如Adney和Baker,1996,见上文所述进行，只是使用96孔板来读取显色后的吸光度值，如下文所述。
酶测定管：
●将一条卷曲的滤纸条(#1Whatman;1X6cm;50mg)加到一根试管(13X100mm)的底部。
●向管中添加1.0mL0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH4.80)。
●将含有滤纸和缓冲液的管在循环水浴中在50℃(±0.1℃)温育5分钟。
●温育后，向管中添加0.5mL柠檬酸盐缓冲液中的酶稀释液。酶稀释液设计成产生略高于和略低于目标值2.0mg葡萄糖的值。
●通过温和涡旋震荡3秒将管内容物混合。
●涡旋震荡后，将管在循环水浴中在50℃(±0.1℃)温育60分钟。
●在60分钟温育后立即将管从水浴中取出，并向每个管中添加3.0mLDNS试剂以终止反应。将管涡旋震荡3秒钟以混合。
空白和对照：
●向一根试管中添加1.5mL柠檬酸盐缓冲液来制备试剂空白。
●将一条卷曲的滤纸条置于一根试管的底部并添加1.5mL柠檬酸盐缓冲液来制备底物对照。
●通过将1.0mL柠檬酸盐缓冲液与0.5mL适宜的酶稀释液混合来制备每种酶稀释液的酶对照。
●以与酶测定管相同的方式测定试剂空白、底物对照和酶对照，而且与酶测定管一起进行。
葡萄糖标准品：
●制备100mL葡萄糖储液(10.0mg/mL)，并冷冻5mL等分试样。在使用前，将等分试样解冻并涡旋震荡以混合。
●如下在柠檬酸盐缓冲液中制备储液的稀释液：
G1=1.0mL储液+0.5mL缓冲液=6.7mg/mL=3.3mg/0.5mL
G2=0.75mL储液+0.75mL缓冲液=5.0mg/mL=2.5mg/0.5mL
G3=0.5mL储液+1.0mL缓冲液=3.3mg/mL=1.7mg/0.5mL
G4=0.2mL储液+0.8mL缓冲液=2.0mg/mL=1.0mg/0.5mL
●通过向1.0mL柠檬酸盐缓冲液中添加0.5mL每种稀释液来制备葡萄糖标准品管。
●以与酶测定管相同的方式测定葡萄糖标准品管，而且与酶测定管一起进行。
显色：
●在60分钟温育并添加DNS后，将所有管一起在水浴中煮沸5分钟。
●煮沸后，立即将它们在冰/水浴中冷却。
●当冷却后，将管短暂地涡旋震荡，并让纸浆沉降。然后通过将来自每个管的50微升添加至96孔板中的200微升ddH2O来稀释每个管。将每个孔混合，并在540nm读取吸光度。
计算(例子在NREL文件中给出)
●通过将四种标准品(G1-G4)的葡萄糖浓度(mg/0.5mL)对A540绘图来绘制葡萄糖标准曲线。这是使用线性回归(Prism Software)来拟合的，并使用该线的方程来确定每个酶测定管所生成的葡萄糖。
●绘制所生成的葡萄糖(mg/0.5mL)对总酶稀释度的曲线，其中Y轴(酶稀释度)为对数刻度。
●在生成刚刚高于2.0mg葡萄糖的酶稀释度与生成刚刚低于该值的稀释度之间画一条线。根据此线确定会精确生成2.0mg葡萄糖的酶稀释度。
●2.6.4如下计算滤纸单位/mL(FPU/mL)：
FPU/mL=0.37/生成2.0mg葡萄糖的酶稀释度
纤维素分解增强活性
术语“纤维素分解增强活性”在本文中定义为使具有纤维素分解活性的蛋白质对源自蔗渣的材料的水解增强的生物活性。就本发明而言，通过测量与具有相等总蛋白加载量但没有纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS(经预处理的玉米秸)中的纤维素)的对照水解相比，在如下条件下由于纤维素分解蛋白对源自蔗渣的材料(例如经预处理的源自蔗渣的材料)的水解而发生的还原糖的增加或纤维二糖和葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白质/g PCS中的纤维素，其中总蛋白质的组成为(comprised of)80-99.5%w/w纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素和0.5-20%w/w纤维素分解增强活性蛋白，在50℃进行1-7天。
具有纤维素分解增强活性的多肽通过降低达到相同程度水解所要求的纤维素分解酶量来增强具有纤维素分解活性的蛋白质所催化的对源自蔗渣的材料的水解，所述纤维素分解酶量的降低优选至少0.1倍、更优选至少0.2倍、更优选至少0.3倍、更优选至少0.4倍、更优选至少0.5倍、更优选至少1倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至少5倍、更优选至少10倍、更优选至少20倍、更优选至少30倍、最优选至少50倍、且甚至最优选至少100倍。
在一个优选的实施方案中，水解和/或发酵是在存在与具有纤维素分解增强活性的多肽组合的纤维素分解酶的情况中进行的。在一个优选的实施方案中，具有纤维素分解增强活性的多肽是家族GH61A多肽。WO 2005/074647披露了来自土生梭孢霉的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。WO 2005/074656披露了来自橘橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。美国公开申请系列号2007/0077630披露了来自里氏木霉的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。
α-淀粉酶
根据本发明可使用任何α-淀粉酶，如真菌、细菌和植物来源的。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，例如，酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其以有效量添加时，在3到7，优选3.5到6，或更优选4-5的范围内的pH具有最佳活性。
细菌α-淀粉酶
根据本发明，所述细菌α-淀粉酶优选源自芽孢杆菌属。
在一个优选实施方案中，所述芽孢杆菌属α-淀粉酶源自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的菌株，但也可源自其它芽孢杆菌属菌种。涵盖的α-淀粉酶的具体实例包括WO99/19467中SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/19467中SEQ ID NO:5所示的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，和WO 99/19467中SEQ IDNO:3所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在一个实施方案中，所述α-淀粉酶可为WO 99/19467中分别示于SEQ ID NOS:1、2或3中的任何序列具有至少60%，优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，例如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的酶。
所述芽孢杆菌属α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，特别是WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355(所有文件通过提述并入本文)任一中描述的变体和/或杂合体。特别涵盖的α-淀粉酶变体公开于美国专利号6,093,562、6,297,038或美国专利号6,187,576(通过提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选WO 1996/023873中公开的双缺失-参见，例如，第20页第1-10行(通过提述并入本文)，优选与WO 99/19467中公开的SEQ ID NO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的编号方式缺失氨基酸R179和G180(所述文献通过提述并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO 99/19467中公开的SEQ IDNO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于Δ(181-182)的双缺失，且还包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
在一个实施方案中，所述细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每g DS，优选0.001-1KNU每g DS，如约0.050KNU每g DS的量剂量添加。
真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属菌株的α-淀粉酶，如米曲霉(Aspergillusoryzae)，黑曲霉(Aspergillus niger)和川地曲霉(Aspergillis kawachii)α-淀粉酶。
优选的酸性真菌α-淀粉酶为Fungamyl样α-淀粉酶，其源自米曲霉的菌株。根据本发明，术语“Fungamyl样α-淀粉酶”指下述的α-淀粉酶，其与WO96/23874的SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，即，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。
另一个优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一个优选实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶来自黑曲霉，作为“AMYA_ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO 89/01969(实施例3，通过提述并入本文)。源自黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由Novozymes A/S,Denmark得到)。
其它涵盖的野生型α-淀粉酶包括源自根毛霉属(Rhizomucor)和多孔菌属(Meripilus)的菌株，优选微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(WO 2004/055178通过提述并入本文)或巨多孔菌(Meripilus giganteus)菌株的那些α-淀粉酶。
在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶源自川地曲霉，并由Kaneko等，J.Ferment.Bioeng.81:292-298(1996)“Molecular-cloning and determination ofthe nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable α-amylase fromAspergillus kawachii”公开，并进一步作为EMBL:#AB008370公开。
所述真菌α-淀粉酶也可为包括淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非杂合体)，或其变体。在一个实施方案中，所述野生型α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。
酸性α-淀粉酶可根据本发明以0.001到10AFAU/g DS，优选0.01到5AFAU/g DS，特别为0.3到2AFAU/g DS或0.001到1FAU-F/g DS，优选0.01到1FAU-F/g DS的量添加。
商业α-淀粉酶产品
优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括来自DSM(Gist Brocades)的MYCOLASETM，BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM X、LIQUOZYMETM SC和SANTM SUPER、SANTM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETM FRED、SPEZYMETM AA和SPEZYMETM DELTA AA(Genencor Int.)，以及以商品名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可由Novozymes A/S,Denmark得到)。
糖源生成酶
术语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(其为葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(其为麦芽糖生成者)以及支链淀粉酶和α-葡糖苷酶。糖源生成酶能够产生碳水化合物，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于本发明的方法以供产生发酵产物，例如乙醇时。所产生的碳水化合物可直接或间接转化为期望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可使用糖源生成酶的混合物。特别涵盖的混合物为至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶的混合物。酸性真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)和葡糖淀粉酶活性(AGU)间的比例(即，FAU-F每AGU)在本发明的一个实施方案中可为0.1-100，特别是2-50，如10-40的范围内。
葡糖淀粉酶
根据本发明使用的葡糖淀粉酶可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等,1984,EMBO J.3(5):1097-1102)，或其变体，如WO 92/00381,WO 00/04136和WO 01/04273(来自Novozymes,Denmark)中公开的那些；WO 84/02921中公开的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.,1991,55(4):941-949)，或它们的变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等,1996,Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等,1995,Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等,1994,Biochem.J.301:275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等,1996,Biochemistry,35:8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等,1997,Protein Eng.10:1199-1204)。
其它的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(之前表示为罗耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和(Nagasaka Y.等，1998,“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii,Appl Microbiol Biotechnol.50:323-330))，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32,153)、杜邦踝节菌(Talaromycesduponti)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利号4,587,215)。
涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)以及瓣环栓菌(Trametes cingulata)、纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)，以及大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)的葡糖淀粉酶，其均公开于WO 2006/069289；或PCT/US2007/066618中公开的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)，或其混合物。根据本发明涵盖的还有杂合体葡糖淀粉酶。所述杂合体葡糖淀粉酶的实例公开于WO 2005/045018。具体的实例包括实施例1的表1和4中公开的杂合葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述并入本文)。
涵盖的还有与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高同一性，即，与上面提及的成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%同一性的葡糖淀粉酶。
商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG200L、AMG300L、SANTM SUPER、SANTM EXTRA L、SPIRIZYMETM PLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETM B4U和AMGTM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM300(来自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900、G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
在一个实施方案中，葡糖淀粉酶可以0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，特别是0.01-5AGU/g DS，如0.1-2AGU/g DS的量添加。
生物处理
用于其他生物处理或预处理的微生物可选自细菌、酵母或真菌，或其混合物。微生物或两种以上微生物的混合物可为提高沼气生产方法的厌氧发酵步骤的甲烷生产提供条件。依照本发明的微生物的优选例子包括下列属的菌株：芽孢杆菌属(Bacillus),假单胞菌属(Pseudomonas),肠杆菌属(Enterobacter),红球菌属(Rhodococcus),不动杆菌属(Acinetobacter),和曲霉属(Aspergillus)，诸如地衣芽孢杆菌、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),溶解肠杆菌(Enterobacter dissolvens),荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans),鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii),解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida),产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoacaligenes),南极假单胞菌(Pseudomonas antarctica),蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii),门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina),枯草芽孢杆菌,黑曲霉和米曲霉，以及其中任何两种以上的组合。
特别优选的菌株包括：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136),蒙氏假单胞菌(NRRL B-50256),溶解肠杆菌(NRRL B-50257),蒙氏假单胞菌(NRRLB-50258),变形假单胞菌(ATCC 31483),恶臭假单胞菌(NRRL B-50247),变形假单胞菌(NRRL B-50248),嗜吡啶红球菌(NRRL50249),恶臭假单胞菌(ATCC 49451),门多萨假单胞菌(ATCC 53757),鲍氏不动杆菌(NRRLB-50254),短小芽孢杆菌(NRRL B-50255),地衣芽孢杆菌(NRRL B-50141),解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50151),解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50019),门多萨假单胞菌(ATCC 53757),蒙氏假单胞菌(NRRL B-50250),蒙氏假单胞菌(NRRLB-50251),蒙氏假单胞菌(NRRL B-50252),蒙氏假单胞菌(NRRL B-50253),南极假单胞菌(NRRL B-50259),解淀粉芽孢杆菌(ATCC 55405),黑曲霉(NRRL50245),和米曲霉(NRRL 50246)。
本领域技术人员会理解如何利用公知的技术来确定这些优选菌株在依照本发明的用途中的合适的量。在优选的实施方案中，这些菌株以1.0x106至5.0x109CFU/g的范围的量添加。
作为优选的微生物或两种以上微生物的混合物，可以列举：
-含有下述的混合物：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136;1.1x109CFU/g),蒙氏假单胞菌(NRRL B-50256;0.6x109CFU/g),溶解肠杆菌(NRRL B-50257;0.6x109CFU/g),蒙氏假单胞菌(NRRL B-50258;0.8x109CFU/g),荧光假单胞菌(ATCC31483;0.8x109CFU/g),恶臭假单胞菌(NRRL B-50247;0.4x109CFU/g),变形假单胞菌(NRRLB-50248;0.4x109CFU/g),嗜吡啶红球菌(NRRL 50249;0.8x109CFU/g),恶臭假单胞菌(ATCC 49451,0.4x109CFU/g),门多萨假单胞菌(ATCC 53757;0.8x109CFU/g),和鲍氏不动杆菌(NRRL B-50254;0.2x109CFU/g;
-含有下述的混合物：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136;1.6x109CFU/g),短小芽孢杆菌(NRRL B-50255;0.2x109CFU/g),解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50141;0.2x109CFU/g),解淀粉芽孢杆菌(NRRLB-50151;0.2x109CFU/g),解淀粉芽孢杆菌(NRRL B-50019;0.2x109CFU/g),蒙氏假单胞菌(NRRL B-50256;0.2x109CFU/g),溶解肠杆菌(NRRL B-50257;0.3x109CFU/g),蒙氏假单胞菌(NRRL B-50258;0.8x109CFU/g),变形假单胞菌(ATCC 31483;0.7x109CFU/g),恶臭假单胞菌(NRRL B-50247;0.2x109CFU/g),变形假单胞菌(NRRLB-50248;0.2x109CFU/g),嗜吡啶红球菌(NRRL 50249;0.3x109CFU/g),恶臭假单胞菌(ATCC 49451;0.2x109),门多萨假单胞菌(ATCC 53757;0.3x109CFU/g),蒙氏假单胞菌(NRRL B-50250;0.1x109CFU/g),蒙氏假单胞菌(NRRL B-50251;0.1x109CFU/g),蒙氏假单胞菌(NRRL B-50252;0.1x109CFU/g),蒙氏假单胞菌(NRRLB-50253;0.1x109CFU/g)和南极假单胞菌(NRRL B-50259;0.2x109CFU/g);和
-含有下述的混合物：枯草芽孢杆菌(NRRL B-50136;3.5x109CFU/g),解淀粉芽孢杆菌(ATCC 55405;1.0x109CFU/g),南极假单胞菌(NRRL B-50259;0.2x109CFU/g),黑曲霉(NRRL 50245;0.8x109CFU/g)和米曲霉(NRRL50246;0.8x109CFU/g)。
此外，Novozymes Biological Inc.以商品名BI-CHEM ABR-Hydrocarbon,BI-CHEM DC 1008CB和Manure Degrader销售的微生物或者两种以上微生物的混合物也是适用的。
需氧条件下的培育可以以分批过程、补料分批过程或连续过程进行。在分批过程中，装入容器，加入微生物的适当接种物并进行所需时间的所述过程。在补料分批过程中，向容器中加入初始体积的源自蔗渣的材料，通常为容器总操作容积的25-75%，加入微生物的适当接种物并进行过程直至达到一定的转化率/细胞密度，此时以适当速率加入包含木质纤维素纤维的材料形式的额外补料，并继续进行过程直至容器已满并任选地，在不加入额外补料的情况下继续进行一段时间。在连续过程中，通过向容器中加入材料而开始所述过程，并加入微生物的适当接种物，当达到所需的细胞密度时，移出容器中的组合物的一个物流，并同时向容器中加入一个材料物流，使容积保持基本恒定，并且该过程持续进行，理论上可进行随意长度。甚至可能使用这些技术的组合。这些技术是本领域已知的，技术人员知道如何根据容器的具体尺寸和性质为具体过程找到合适的参数。
通气的手段在本领域中是公知的，并且技术人员能够为本发明选择合适的通气手段。通气通常是藉由向吹送空气通过组合物来进行，通常通过位于容器下部的一个或多个管路或管道进行，所述一个或多个管路或管道上设有规则间隔的洞，以提供空气在组合物中均匀分布。根据本发明也可以使用其它通气手段。
选择需氧发酵步骤中的通气速率，为微生物提供便利的生长速率。可以以体积空气每体积发酵每分钟(v/v/m)测量通气速率，并且通常在0.01v/v/m至10v/v/m范围中的通气是适当的，优选0.05v/v/m至5v/v/m，更优选0.1v/v/m至2v/v/m，更优选0.15v/v/m至1.5v/v/m并且最优选0.2v/v/m至1v/v/m。
在考虑下述情况时可决定这个步骤的持续时间：在一方面，需氧条件下的培育应该持续足够长的时间，从而使合意部分的木质纤维素溶解，可以进行后续的微生物或生物过程；在另一方面，需氧步骤不应进行太长时间而消耗(combust)了大部分纤维级分。通常地，需氧步骤持续5至30天，优选7至25天，更优选10至20天，并且最优选约15天。已经发现，使用这样的培育时间可将适当高部分的木质纤维素纤维转化成可在后续微生物或生物过程中转化的形式。
应在考虑根据本发明实验的微生物或两种或多种微生物的混合物的具体要求的情况下选择这个步骤中的温度。通常地，在10℃至60℃的范围内，优选在15℃至50℃的范围内，更优选在20℃至45℃的范围内，甚至更优选在25℃至40℃的范围内选择所述温度，并且最优选约35℃。
根据本发明的方法可增加源自蔗渣的材料的可降解能力，使其更容易接受后续的微生物或生物过程，如沼气生产过程，导致比未使用本发明的方法时可能获得的更高的得率。
需氧条件下的培育持续至木质纤维素纤维的可降解能力已经增加到令人满意的程度，以至于相当大部分的木质纤维素纤维已经变得易于接受后续的微生物或生物过程。
当已根据本发明使得木质纤维素纤维容易接受处理后，容易接受处理的纤维或其部分将可用于后续的微生物或生物过程，这意味着容易接受处理的纤维或其部分能够在后续的微生物或生物过程中得到转化。因此，可以通过对根据本发明处理过的材料进行后续的微生物或生物过程，并比较该后续微生物或生物过程的得率与使用相同的包含木质纤维素纤维的材料但未使用本发明方法而得到的相应后续微生物或生物过程的得率，来确定木质纤维素的可接受处理能力(accessibility)是否通过本发明的方法得到增加。
包含木质纤维素纤维的材料可以使用本发明的方法处理，然后进行通常的厌氧沼气形成过程，确定根据本发明处理的包含木质纤维素纤维的材料的沼气得率，并与相同的沼气形成过程但未使用本发明方法的得率相比较。如果使用本发明的方法时沼气得率较高，根据本发明，则木质纤维素纤维的可接受处理能力提高。技术人员会了解，根据本发明可接受处理能力的增加可以按照其他方式，使用不同的后续微生物或生物方法来加以确定。
在一个实施方案中，本发明的方法涉及甲烷的生产。在这个实施方案中，甲烷的生产可以作为二步过程进行，所述过程包括微生物厌氧步骤和/或预处理，之后进行沼气生产过程，在沼气生产过程之前或之中同时进行酶处理。理论上，本领域中已知的任何用于形成沼气的过程均可以用于这里。
在另一个实施方案中，甲烷的生产可以作为这样的过程来进行，该过程包括第一个用于形成甲烷的过程，然后进行微生物厌氧步骤和/或酶处理，再进行第二个用于形成甲烷的过程。
实施例
实施例1.对生甘蔗和蒸汽爆破过的甘蔗的底物表征
对甘蔗渣进行测试，甘蔗渣是一种难以生物降解的富含木素纤维素的底物。蔗渣样品来源于一家巴西糖厂，在工业规模蒸汽爆破过程(STEX)中经过了处理。
获取并表征了两种不同的蔗渣样品，一种是原样的生蔗渣，另一种是经过蒸汽爆破处理的蔗渣。后者是将生蔗渣投入封闭的反应器中，施以高温高压及170℃饱和蒸汽历时15分钟，然后在处理结束时快速释放压力。该过程称为蒸汽爆破，被应用来增加用作牛饲料的蔗渣的可消化性。为了分析底物，具备mm尺寸的均一的样品是重要的。因此，将蔗渣样品切碎以进一步降低颗粒大小。这利用厨用搅拌器实现。
表1：生蔗渣样品及经过蒸汽爆破后的蔗渣样品的表征
Figure BDA0000448082900000241
如现有技术中描述的那样进行标准分析。简而言之，总固形物(TS)是通过在105摄氏度加热直到没有进一步的重量变化发生来测定。灰分则通过在马弗炉中将样品在坩埚中加热到600摄氏度直到没有进一步的重量变化发生来测定。挥发性固形物(VS)通过用总固形物减去灰分含量来计算。总挥发性脂肪酸通过按照本领域的标准方法(Standard Methods for the Examination ofWater and Wastewater,Eaton et al.,Amer Public Health Assn;21,October15,2005)进行蒸馏然后pH滴定来测定。
化学需氧量(COD)通过如Greenberg等人在Standard Methods for theexamination of water and wastewater.18th Edition,1992,p.5–7中描述的重铬酸钾法来测量。pH测量是通过将1g湿重材料添加到100ml蒸馏水中并搅拌24小时，然后用经校准的pH电极进行pH测量。
实施例2.对种子污泥(seeding sludge)的表征
所有发酵测试都用同一类嗜热性种子污泥来起始。对每个测试系列采集一份新鲜样品。后者来源于不同的嗜热型全规模沼气生产厂，处理肥料(treating manure)，屠宰场废物和/或来自食品加工工业的副产品。
在实验开始时，对种子污泥的下述方面进行表征：生物质浓度，以总悬浮固形物（TSS）和可挥发悬浮固形物（VSS）计；残余可溶化合物（可溶COD和VFA），和比产甲烷活性（specific methanogenic activity，SMA）。
将种子污泥的样品在1750g离心10min。弃去上清液，将离心沉淀用去离子水洗涤以除去可溶性盐。将样品用1750g再次离心10min。将所得的离心沉淀转移到一个坩埚中，在105℃干燥至恒重。将样品在干燥器中冷却，根据质量测定TSS。TSS测定后，将坩埚转移到马弗炉中加热到600℃2小时。在干燥器中冷却之后，测定残余灰分的质量。用TSS减去残余灰分来测定VSS。在表2中提供了一种典型的种子污泥的主要特征的概览。
根据标准程序测量比产甲烷活性：在一个1.0L的三角瓶中，将800ml污泥与一种合成的易生物降解加料(feed)混合，该加料由1.5ml乙醇和4g乙酸钠组成，相当于大约5g的COD。该反应器与沼气柱(biogas column)连接，并且被置于53℃的热水浴中。监视产沼气的体积和速率随时间的变化。在污泥活性测试结束时，分析产生的沼气的甲烷浓度，比产甲烷活性（SMA）以g CH4（作为COD计算）每g VSS每日(COD/g VSS.d)来表示，基于1g COD转化为0.35L CH4的理论假设。接种物的污泥活性测试的结果总结于表2。
表2.种子污泥的主要特征的概览
Figure BDA0000448082900000251
对于嗜热型种子污泥，认为VSS浓度是测量活性厌氧生物质浓度的最佳手段。不过需要指出的是，对于这种测量，存在来自先前补加到该生物质的底物的残余未降解有机颗粒物的干扰。此外，需要通过离心来将生物质与液相分离。
污泥活性测试的结果表明，用于厌氧实验的嗜热型种子污泥的比产甲烷活性令人满意。嗜热型污泥是高度pH缓冲的。
实施例3蒸汽爆破蔗渣和生蔗渣的分批厌氧消化
为了评价蔗渣的蒸汽爆破处理在沼气过程中的效果，实施了下面的实验：
用200ml从处理肥料和工业废物的全规模沼气厂获得的嗜热型厌氧污泥接种500ml瓶子。将生蔗渣或蒸汽爆破蔗渣形式的底物加入瓶子中，然后用氮气冲洗瓶子，并用丁基橡胶塞密封以保证厌氧条件和气密性的封闭。
将瓶子在53℃温育，直至观察不到更多的甲烷产生。在实验过程中定期将瓶子排气以避免瓶中积累压力。在排气之前，测定每个烧瓶中的甲烷的确切量，以便于准确地定量整个实验过程中产生的甲烷。
为了分析甲烷的形成，用Hamilton气体注射器提取瓶子顶部空间的样品，在装有PoraPLOT Q(10μm)25m x0.32mm熔融石英分离柱的Varian3900气象色谱仪(Varian,Agilent Technologies,USA)上进行气相色谱分析。所有的气体样品所用的样品瓶都是Supelco,Precleaned2cm3Clear Screw Cap Vials(Supelco,Bellafonte,PA,USA)。通过与用甲烷气标准品(Mikrolab,Aarhus,Denmark)获得的标准曲线进行比较来对气体样品定量。
进行了三种不同的厌氧消化：
1)仅有厌氧污泥
2)厌氧污泥和1.67g(干重)生蔗渣
3)厌氧污泥和1.67g(干重)蒸汽爆破蔗渣
对每种处理设置三个独立的生物学重复，对于所有的甲烷测量和标准品设置两个重复。这三种消化的最终结果示于表3。
表3：对蔗渣的分批实验得到的最终甲烷得率。甲烷数据是在标准状态（20℃、1atm）给出的。已经减去了来自种子污泥的背景甲烷产量。
Figure BDA0000448082900000271
基于所得的数据明显可见，对蔗渣的蒸汽爆破导致厌氧可消化性显著增加，就初始转化速率和最大可获得的转化而言都是如此。在减去污泥基线甲烷产量之后本实施例中观察到的效果是来自蒸汽爆破蔗渣的甲烷产量相比于生蔗渣增加了20.5%。
实施例4.对经酶预处理的蒸汽爆破蔗渣的分批消化
在第二个系列的厌氧消化测试中，使用蒸汽爆破蔗渣样品作为底物。目的是研究借助蒸汽爆破的物理预处理是否将蔗渣的细胞壁结构破坏到如此程度，以至于使得木素纤维素材料更容易被酶触及。该系列测试的目标是考察酶添加，或是在发酵之前定量添加或是直接定量添加到发酵罐中，对蒸汽爆破蔗渣消化的效果。
为了评估酶添加对木素纤维素材料的厌氧生物可降解性的效果，在实验室规模进行了几个系列的嗜热型（53℃）短期分批测试。
每套反应器组件的构成为一个1.0L三角瓶，其置于恒温热水浴中（调温于53℃）并与一根沼气柱连接，用于收集和测量产生的沼气。
在每个测试系列开始时，用相同量的新鲜嗜热型厌氧污泥接种反应器。手动分批向种子污泥中补加一定量的不同木素纤维素底物。补料并测量了混合液料的pH之后，将每个反应器与柱子连接以监视沼气产生。在消化期（每个补料循环约1周或更长）结束时，取样通过气象色谱分析产生的沼气的甲烷浓度。对于每个处理，用相同的底物进行3至4次连续补料。
进行酶处理，作为厌氧消化之前的酶预处理，或者通过直接向反应器加入酶来进行。在两种情况下，酶都是两种酶产品A和B的混合物。
酶A是一种里氏木霉纤维素酶制备物，含有米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)和橘橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)。酶B是一种棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/021785)。
酶预处理在密闭容器中以5%TS的蒸汽爆破蔗渣(或110g湿重的预处理蔗渣+1L自来水)进行。将每个容器置于磁力搅拌器上，在整个酶水解处理过程中持续搅拌。总酶水解时间设定为48小时，在整段时间内温度调制在50℃。酶的添加量为：酶A=59mg产品/g TS(或8.9mg酶蛋白/g TS)，酶B=2.5mg产品/g TS(或0.1mg酶蛋白/g TS)。进行了下面的测试：
●背景测试：未添加底物的种子污泥
●对照测试：种子污泥+蒸汽爆破蔗渣(以5%TS流入)
●测试1:种子污泥+经酶预处理的蒸汽爆破蔗渣
●测试2:种子污泥+蒸汽爆破蔗渣+酶预混物。
对于所有有蔗渣底物的测试，包括对照测试，将含大约5%TS（110g湿重的预处理蔗渣+1L自来水）浓度蔗渣的自来水作为补料加入。在开始时，4个反应器接种相同量（即800ml）的嗜热型污泥，相当于大约17g VSS的生物质浓度。加入蒸汽爆破蔗渣作为底物。对照反应器和两个测试反应器中输入的蔗渣在每个补料循环中达到大约5g总固形物。相应的每个补料循环的总COD输入在6.2g COD左右。
测试了相同蔗渣输入量的四次连续补料（补料循环）。在每次补料之后，考虑了(take into account)一段7-8日的消化期。在每个补料循环结束时，测量了产生沼气的甲烷浓度以及残余可溶COD和VFA浓度。4个补料循环的总累计结果总结在表4中。
表4：以蒸汽爆破蔗渣作为底物的消化测试的总结；上半部分总结了5gTS、6.2g COD的蒸汽爆破蔗渣的结果；下半部分总结了20g TS、24.8g COD的蒸汽爆破蔗渣的结果
Figure BDA0000448082900000281
Figure BDA0000448082900000291
*)32摄氏度、1atm下减去背景测试的沼气体积后的沼气体积
**)净沼气体积，考虑酶COD的总转化。
基于表4中给出的数据显然可见，酶预混物的添加，不管是在消化过程中或者在先前的另一个预处理中定量添加，都显著改善了总沼气产量和甲烷产量，提高了30%(测试1)至36%(测试2)。该实验中任何基于这些酶的添加时间的差异(在另外的预处理中或者是直接加入厌氧反应器中)都不那么突出。然而，基于用预处理蔗渣作为底物进行的实验室规模的测试，发现了这些酶的一种重要的积极净效果。
实施例5.用酶预处理或者直接添加酶的蒸汽爆破蔗渣长期半连续厌氧消化
为了在更长时间内评估酶添加对蒸汽爆破蔗渣的连续厌氧嗜热消化的积极效果，并且为了实验测定酶添加对容积装载速率（volumetric loading rate）、去除效率（removal efficiencies）、沼气和甲烷产量、以及厌氧反应器的处理蒸汽爆破蔗渣的总体性能的影响，启动了3个（半）连续反应器并运行了4个月。
这些半连续CSTR(完全搅拌式罐式反应器)测试中每一个的实验设置构成为：一个活动反应器容积为1.8L的厌氧反应器，置于52℃恒温热水浴中，并与沼气柱连接用于监测沼气产生。利用搅拌装置连续地混合每个反应器的液料以增加底物与生物质的接触，并防止固形物在反应器中沉降和积累。由于蒸汽爆破蔗渣底物的性质，补料是手工进行的，但频度达一周三次。在补料之前，从每个反应器手工抽出相同量的经消化的材料（混合液料）。以8%TS的形式定量添加蒸汽爆破蔗渣。用来接种该3个连续反应器的污泥对作为补料底物的经预处理的蔗渣适应良好，该污泥是从一个已经处理蔗渣数个月的厌氧反应器中获取的。
此实验中使用的酶预混物是棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/021785)与含烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499)和橘橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制备物的掺混物。添加量为55mg酶掺混物/g TS(或7.8mg酶蛋白/g TS)。
为了考察酶对蒸汽爆破蔗渣的厌氧转化的效果，并确定该酶的定量添加点(直接加入厌氧反应器或在特定的预处理过程中)的效果，将3个相似的CSTR反应器在111天期间（在起始周之后）同时运行。
第一反应器充当对照反应器，仅补加底物本身，第二反应器和第三反应器作为测试反应器运行，进行了相同的酶添加。在这两个测试反应器中，在整个测试期间加入了相同剂量的酶。在第一个测试反应器中，酶总是在每个分批补料之后直接加入反应器中。第二个测试反应器的补料物流先前已进行预处理：蔗渣含在自来水中流入（大约8%TS），加入相同剂量的酶，将pH调整到大约5，在2天时间内将流入容器置于50℃的培养箱中在磁力搅拌器上连续搅拌。
为了能够推断酶添加对厌氧消化的净效果，对另两批流入流也进行了同样的预处理，只是没有酶添加。
预处理和酶添加的测试进行历时4个月。在最先两个月中，三个反应器在稳定的条件下以相同的相对低的容积装载速率运行。三个CSTR反应器以大约2.3g TS/L反应器每日的容积装载速率起始，对应于35日的水力和污泥停留时间（hydraulic and sludge retention time）。
在接下来的几周中，通过增大STEX(蒸汽爆破的)蔗渣和自来水的量来逐步增加反应器的容积装载速率。由于STEX蔗渣总是以8%TS的形式添加的，蔗渣补料的增加伴随着反应器中水力和污泥停留时间的减少。三个反应器的装载速率之间从未有任何差异。
为了监测反应器性能，每周收集每个反应器的流出流。在每个测试期结束时测定主要性质（TSS,VSS,可溶COD,TAN,电导率和可挥发脂肪酸)。
对反应器补充氮(NH4Cl)和磷(KH2PO4)，这是因为蒸汽爆破蔗渣底物的N和P含量低。除了氮和磷补充之外，还向反应器加入痕量元素的混合物以保证没有微量营养物会构成限制因素。
将总测试期间基于容积装载速率细分为5个子期间。表5中全面概览了实验的每个子期间中三个连续反应器的过程参数和所得的沼气产量。
表5.测试期间3个CSTR反应器的补料和沼气产量的概览
Figure BDA0000448082900000311
Figure BDA0000448082900000321
表6.测试期间自3个CSTR反应器的流出物组成的概览；所有测量值均为mg/l。
Figure BDA0000448082900000322
表7.3个连续CSTR测试的补料和沼气产量的积累结果；总测试期从第8日至第119日
Figure BDA0000448082900000323
表8.3个连续CSTR测试的补料和沼气产量的累积结果；具有较高装载速率的测试期从第64日至第119日
Figure BDA0000448082900000332
在一个长期实验室规模测试中研究了酶对于CSTR反应器中STEX蔗渣的嗜热型消化的影响。三个类似的反应器（1.8L的活动反应器容积）在逐渐增加的装载速率下运行，从2.25g TS/L反应器每日开始逐步增大到5.56g TS/l反应器每日。它涉及一个没有酶添加的对照反应器，一个直接酶添加到厌氧反应器中的测试反应器，和一个在特定预处理（50℃，pH约5，搅拌2日）中添加酶的测试反应器。通过一方面测量沼气和甲烷产量，并且表征厌氧流出物，来监测这些反应器的性能。
当考虑111日的全测试期的结果时，反应器中直接添加酶的测试反应器1的沼气生产总体积获得了13%的总体增加。另一个酶在预处理中添加的反应器所获得的对沼气总产量的效果较小，但仍然明显：增加了8%(表7)。
当CSTR反应器在更高的容积装载速率下运行时，酶添加实现了更高的积极效果。因此，对于自第64日至第199日、容积装载速率在3.08-5.56g TS/L反应器日的测试期也计算了总沼气产量和平均沼气产量。总沼气产量相比于对照测试的增加在测试反应器1中达到16%，在测试反应器2中达10%。此外，需要指出的是在测试期3-5的过程中测试反应器1中甲烷得率(l/g TS)保持在0.30至0.31的恒定水平，而在对照反应器中甲烷得率从测试期3中的0.3减少到测试期5中的0.23。由此可见，当酶直接添加到厌氧反应器中时，获得了最好、最稳定的酶的积极效果（表8）。
从不同的子期间的结果可以推知，装载速率越高，酶添加的影响越突出。在高装载速率的测试期中测试反应器与对照反应器的沼气产量之间的相互差异主要是由于对照测试中STEX蔗渣的不完全转化(过装载)所致。后者导致对照测试中添加的每g TS STEX蔗渣的沼气产量逐渐减少。然而，在酶直接添加到反应器的测试反应器中，每g添加的TS的沼气产量基本保持恒定(约0.3L沼气/g添加的TS)。在预处理中添加酶导致波动性更大的结果。总的来说，该测试(即，在预处理过程中添加酶)的酶对沼气产量的影响与当直接添加酶时相比要小，但与对照反应器相比仍然是显著提高的。
直接添加酶的测试反应器的更好的性能，尤其是在测试的较高装载速率下的更好的性能，得到了更低的流出VFA和可溶COD浓度的验证。这些参数的最低和最稳定的结果也是在酶直接添加到反应器的测试反应器中达到的(表6)。
总的来说，本项长期实验室规模测试的结论是：当酶直接添加到厌氧反应器中时，保证了嗜热型厌氧CSTR反应器处理蒸汽爆破蔗渣(8%TS)的更稳定和高效的性能。尤其是在高装载速率的时间内，在测试中实现了显著更高的沼气和甲烷产量，以及更低的残余可溶化合物，表明酶添加对蒸汽爆破蔗渣的厌氧转化的积极影响。

Claims (14)

1.一种沼气生产方法，包括下述步骤：提供包含源自蔗渣的材料与水的浆液，以及：
(a)进行包括添加一种或多种酶到所述浆液的预处理以在合适的温度和pH降解所述源自蔗渣的材料，然后将该经过酶降解的材料以合适的速度和比例添加到沼气消化罐，以在该消化罐中有效地将所述材料转化为沼气；或
(b)添加一种或多种酶到所述浆液，再将所述浆液加入沼气消化罐；或
(c)在将所述浆液加入消化罐后添加一种或多种酶到该消化罐，以在该消化罐中在合适的温度和pH降解所述源自蔗渣的材料并有效地将所述材料转化为沼气。
2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种酶选自下组：淀粉分解酶，脂肪分解酶，蛋白水解酶，纤维素分解酶，氧还酶，和细胞壁降解酶。
3.权利要求2的方法，其中所述一种或多种酶选自下组：氨肽酶,α-淀粉酶,淀粉葡糖苷酶,阿拉伯呋喃糖苷酶,阿拉伯木聚糖酶,β-葡糖苷酶，糖酶,羧肽酶,过氧化氢酶,纤维二糖水解酶,纤维素酶,几丁质酶，角质酶，环糊精糖基转移酶，阿魏酸酯酶，脱氧核糖核酸酶，内切纤维素酶，内切葡聚糖酶，内切木聚糖酶，酯酶，半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖氧化酶，葡糖苷酶，卤素过氧化物酶，半纤维素酶，转化酶，异构酶，漆酶，连接酶，脂肪酶，裂合酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，氧化酶，果胶酸裂合酶，果胶裂合酶，果胶反式消去酶，果胶乙酯酶，果胶甲酯酶，果胶分解酶，过氧化物酶，蛋白酶，肌醇六磷酸酶，酚氧化酶，聚半乳糖醛酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶，鼠李葡聚糖酶，鼠李半乳糖醛酸酶，核糖核酸酶，SPS酶，转移酶，转谷氨酰胺酶，木聚糖酶和木葡聚糖酶。
4.权利要求2的方法，其中所述一种或多种酶是蛋白酶，果胶酸裂合酶、阿魏酸酯酶和/或甘露聚糖酶。
5.权利要求1的方法，其中所述一种或多种酶选自：含有米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶融合蛋白和橘橙嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)GH61A多肽的里氏木霉(Trichoderma reseei)纤维素酶制备物，和/或棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)GH10木聚糖酶。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中在步骤(a)之前或之中、或者在步骤(b)之前将所述源自蔗渣的材料或浆液均质化，优选通过磨制、湿磨、研磨、或湿法研磨均质化。
7.权利要求6的方法，其中在所述源自蔗渣的材料或浆液均质化之前或正在均质化时向其添加碱，优选所述碱是NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Ca(OH)2、熟石灰、氨和/或KOH。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中在步骤(a)或(b)中通过连续或分步添加材料至所述浆液来调节该浆液中源自蔗渣的材料的含量。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述含木素纤维素的材料占浆液的高于2.5%wt-%DS，优选高于5%wt-%DS，优选高于10%wt-%DS，优选高于15wt-%DS，优选高于20wt.-%DS，更优选高于25wt-%DS。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述源自蔗渣的材料在7-10的范围内的pH，优选8-9的范围内的pH，最优选8.5左右的pH被降解。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述源自蔗渣的材料在20°-70℃的范围内的温度，优选30°-60℃范围内的温度，最优选40°-50℃范围内的温度被降解。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中在步骤(a)中在源自蔗渣的材料被降解之后，但在将它添加到消化罐之前，进行固形物分离步骤，以清洗未被溶解的固形物并任选地将它们回补到方法的步骤(a)中。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中在步骤(a)或(b)之前所述源自蔗渣的材料已经接受微波和/或超声辐射处理。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中在步骤(a)或(b)之前所述源自蔗渣的材料已经被化学、机械和/或生物处理。
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