CN116783007A - 包括处理水再循环、用于废料酶促和/或微生物处理的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于连续或分批处理废料(诸如固体废料)的方法，在生物反应器中经受酶促和/或微生物降解，产生生物液体和固体部分，该方法包括再循环从该生物液体和/或固体部分的下游处理获得的处理水。除了处理水的再循环之外，还可将来自外部来源的水添加到反应器。

Description

包括处理水再循环、用于废料酶促和/或微生物处理的方法
技术领域
本发明涉及在生物反应器中连续或分批处理废料生成生物液体的方法，该方法包括再循环从所述生物液体的下游处理中获得的处理水。废料可以例如是在连续或分批生物反应器中经受酶促和/或微生物降解的分类或未分类的城市固体废料(MSW)。处理水可以例如是生物液体、从厌氧消化(AD)处理、从蒸发消解物或洗涤水以及其任意组合中获得的废水。除了再循环任意处理水之外，也可将来自外部来源的水添加到反应器。
背景技术
人们对采用将储存在包括有机材料的废料中的能量被充分利用的方法产生了极大的兴趣。农业材料/废料、家庭废料和城市废料是含有高含量干物质和一定含量有机材料的来源的示例，其中，利用有机材料中储存的能量而不是仅仅处理废料具有很高的兴趣。人们对开发高效且环保的固体废料处理方法产生了相当大的兴趣，以最大限度地回收其固有的能源潜力，并且也回收可回收材料。“废料变能源”处理的一个重大挑战是废料(诸如MSW)的异质性。
加工和后续处置废料(诸如家庭、农业或城市废料)的常用方法包含焚烧、填埋、燃烧、倾倒和堆肥，其中，选择的方法常常取决于例如有机物含量与非有机物含量的比较。然而，这些方法不直接地提供对存储在有机材料中的能量的最佳利用。
消费者或废料站有时可提供预分类，这样可减少由例如焚烧和简化有机废料降解为有价值的最终产物释放的污染。然而，预分类可能无法有效地将所有不可生物降解材料(诸如金属和玻璃)从有机废料中分开。
在诸如下面所述的一个方法中，其中，废料的有机含量被液化，同时将非有机成分维持在其固相中，然后分开固相和液相，预分类可简化处理，但不是必须的。
环境友好的废料处理方法是基于生物学的方法，诸如Renescience目前应用的方法，其中，将包括有机物的废料(诸如普通未分类或分类/部分分类的家庭废料)与水、酶和任选的微生物混合，以便溶解所有有机废料，诸如食物废料、纸板、纸张、标签等，并将其转化为可用于经由厌氧消化处理生产例如沼气的生物液体。其中废料经受酶促和/或微生物加工的液化处理需要水，以便提供可作为能源用于进一步处理的生物液体。此外，生物液体和/或固体部分的后续处理步骤也可需要添加水，这取决于具体过程的特征。
根据本发明的方法基于Renescience当前应用的方法并且适用于其中包括有机物的废料已经经受酶促降解和/或微生物发酵产生生物液体和各固体部分的处理。这样的废料加工处理的示例在WO2006056838、WO2007036795、WO2011032557、WO2013185778、WO2014198274、WO2016030480、WO2016030472、WO2016050893、WO2017/174093中公开，其全部内容明确地通过引用并入本文。
对于可降解有机成分的液化，酶加工供应超过“高压灭菌(autoclave)”方法的独特优势。使用酶促液化(enzymatic liquefaction)，可使用相对便宜的设备和在相对较低的温度下运行的非加压反应，以连续的方式传导(conducted)废料，诸如MSW。在本发明的上下文中，液化包含“形成流体”和“溶解到水中”。
酶促液化有时可需要在120℃或更高的相对高温下进行热预加工，部分是为了影响废料(诸如未分类的MSW)的“灭菌(sterilization)”，并且还可软化可降解的有机成分并将纸制品“制浆(pulped)”。然而，高温预加工可能是活性有害的，因为这会杀死在废料中繁殖的环境微生物。因此，在优选的实施方式中，废料不在高温即高于90℃下预加工。在一个优选的实施方式中，废料与预加热的水混合到60℃至75℃范围内的温度，优选地70℃或优选地约70℃。此水优选地完全由再循环处理水供应，诸如来自消解物脱水的水，即废水。可替代地，或附加地，再循环的处理水是干净的冷凝水。
除了改进来自酶加工的“有机捕获(organic capture)”之外，使用乳酸菌或产醋酸、乙醇、甲酸、丁酸、乳酸、戊酸或己酸的微生物的任意组合同时进行微生物发酵，“预条件(pre-conditions)”生物液体，从而使其更有效地用作进一步处理的底物，诸如生物甲烷生产。相对于单独由酶促液化产生的生物液体，与悬浮固体相比较，微生物发酵产生的生物液体具有一般增加的溶解百分比。由于微生物“预条件(pre-conditioning)”，较高链的多糖一般被更彻底地降解。同时进行的微生物发酵和酶促加工将生物聚合物降解为易于使用的底物，并且进一步实现初级底物代谢转化为短链羧酸，诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乳酸盐、乙酸盐和/或乙醇。根据本发明的方法，废料中有机物的转化常常至少包含产乳酸菌。所得生物液体包括高百分比的糖和其他可溶性降解产物，提供生物甲烷底物，该底物适用于厌氧消化用以产生沼气。包括更多量酸的生物液体将有助于更快的厌氧降解处理。
厌氧消化是系列生物处理，其中，微生物在没有氧气的情况下分解可生物降解的材料。最终产物中的一个是沼气，其可被燃以生成电力和热量，或者可处理成可再生的天然气和运输燃料。现有技术中存在各种用于转化废料，诸如城市固体废料、城市废水固体、食物废料、高强度工业废水和残留物、脂肪、油和油脂(FOG)以及各种其他有机废料流成沼气的厌氧消化技术。许多不同的厌氧消解器系统是可商购的，并且技术人员将熟悉如何应用和优化厌氧消化处理。参与厌氧消化的微生物群落的代谢动力学是复杂的。在用于生产甲烷沼气的典型厌氧消化(AD)中，由微生物介导的生物处理实现了四个主要步骤-将生物大分子水解成组成单体或其他代谢物；酸生成，由此产生短链烃酸和醇；乙酸生成，由此将可用营养物质分解代谢为乙酸、氢气和二氧化碳；以及甲烷生成，由此乙酸和氢被特定的古细菌分解代谢为甲烷和二氧化碳。除了产生有价值的产出之外，AD还产生消解物，有时称为“原始流出物(raw effluent)”或“AD流出物(AD effluent)”。这些术语可互换地使用，并且指代从厌氧消化产生的废料。消解物包括固体和液体两者，并且这些部分可用于各种目的。在一优选的实施方式中，液体消解物可卫生化，例如通过加热到60至75℃，优选地65℃至70℃或高于70℃达60–80分钟，优选地60–70分钟，优选地约60分钟，例如以防止病原微生物从AD消化穿过。固液分开可例如通过倾析、离心和/或沉降来进行。在一优选的实施方式中，可如上所述的卫生化的液体消解物被脱水，例如通过倾析式离心机，其产生废水，该废水被再循环到根据本发明的处理中。在液体消解物卫生化的情况下，来自消解物的固液分开的废水将约为70℃，并且可用于如上所述的废料预加工。常常，液体消解物具有碱性pH，并且主要包含水，但也包含干燥的悬浮固体和溶解物质，诸如盐。“处理水”被定义为在废料的酶促和/或微生物加工下游处理中一个或多个固液分开后获得的液体部分，诸如来自AD处理的消解物脱水的水，这也被定义为“废水”。因此，处理水包括废水。处理水可包括各种盐、溶解物质和活微生物。优选地，处理水是从厌氧消化(AD)处理、从蒸发消解物或洗涤水中获得的废水。
废料加工处理中处理水的再循环如此已应用于各加工处理中。
EP3415472B1公开了有机物的厌氧消化，其中，来自消解器的消化流出物被分开成纤维部分和液体部分，并且其中，每个部分可再循环到消解器中。
WO2020/03194A1公开了消化流的再循环，其中，通过算法控制pH和电导率，以便将消解器中的pH维持在5.2–5.7。
US10118851B2公开了生物废料物质的厌氧消化。在第一步，将废料与液体混合并经受AD。在第二步中，消解物通过按压脱水，然后进行另一分开步骤，并最后将分开出的液体流出物再循环到第一AD步骤中。
WO2015/004146公开了厌氧消化处理，其中，流出物可再循环。
上述文件涉及来自AD处理的水的再循环。没有文献描述了处理水的再循环方法，其中，处理水是源自酶促废料加工处理的水，诸如从厌氧消化获得的废水，涉及将处理水再循环回前一步骤，其中，前一步骤是在生物反应器中使废料(诸如MSW)经受酶促和/或微生物加工。
本发明涉及一方法，其中，将来自废料的酶促和/或微生物液化处理，随后进行生物液体的后续下游处理的处理水再循环到生物反应器中。处理水可选地可在没有任何卫生化的情况下再循环到生物反应器中。在本方法中，可减少在包括有机物的废料的液化处理中需要的来自外部水源，诸如自来水和来自天然来源，的水量，这意味着节省的自来水可用于自然界和社会中的其他目的。
发明内容
本发明是用于在生物反应器中连续或分批处理废料的方法，其中，将来自一个或多个下游处理的处理水再循环到生物反应器中。再循环水的优点包含但不限于将酶分配到MSW中、将有机物机械地冲洗到生物液体中、将干燥到表面上的有机物溶解、盐稀释和/或将有机物和盐从生物反应器中正在加工的废料中转移出来。
处理水从一个或多个下游处理步骤中获得。例如，处理水可以是直接地从酶促和/或微生物液化处理收集的生物液体，或者处理水可从其他下游处理获得，诸如从厌氧消化(AD)处理、固体废料或处理水的洗涤步骤，其通过来自各种下游处理的蒸发获得。下游处理可利用在所述生物反应器中产生的生物液体用以生产沼气或用于其他能量衍生产物。在一个实施方式中，处理水是从厌氧消化(AD)处理、蒸发消解物或洗涤水获得的废水。除了任何处理水的再循环之外，还可将来自外部来源的水添加到反应器中。
本发明的方法是连续或分批处理废料的方法，包括：
a)在生物反应器中使废料经受酶促和/或微生物加工
b)使来自步骤a)的经加工的废料经受一个或多个分开步骤，由此提供生物液体和固体部分；
c)使所述生物液体和/或固体部分经受下游处理，其提供处理水；
d)将从步骤c)获得的处理水和可选地来自外部水源的水添加到步骤a)中的生物反应器。
对于在满足最佳酶促和微生物条件的pH下连续运行的液化过程，生物反应器中的pH一般在pH 2–6.5之间。此处已发现从步骤c)获得的处理水或其一部分的再循环一般满足这些需求，但如果再循环到反应器中的处理水的pH为相似的pH，优选地pH在3.5到6之间，则似乎满足最佳条件。处理水的pH将取决于其来自的处理。因此，在一些实施方式中，优选地在将处理水再循环到生物反应器中之前将pH调节到在3.5和6之间。例如，如果处理水是从厌氧消化处理中获得的废水，其pH将大致约为8到9。如果来自AD处理的基本废水要再循环到生物反应器中，则优选地在再循环之前将废水的pH调节到在3.5到6.0之间，以确保生物反应器中液化处理的pH保持在低于6.5优选地低于5.5的最佳水平。可替代地，优选在建立稳态条件之后在生物反应器中重复调整pH，或者如果在将处理水(例如废水)添加到生物反应器中之前不进行pH调整，则可分批或连续添加处理水到生物反应器中。在本发明的一个实施方式中，处理水分批加入步骤a)，使得反应器中的pH在pH 3.5–6之间。
在一些实施方式中，处理水可必须在70℃下进行60分钟的卫生化。添加到本发明的处理中的处理水然后将是60–70℃并且可直接地用于如上所述的预加工废料。
废料可以是包括至少一些有机物的任何种类的废料，并且可分类或未分类。诸如城市固体废料的废料特别有用，因为其包括有机物和活微生物两者，其可有助于酶促和微生物的联合降解。除了处理水之外，可选地可将来自外部来源的水添加到生物反应器中。来自外部来源的水可以是从以下中获得的水：诸如河流、湖泊和池塘的天然来源；水库；自来水；及其任何组合。可添加进一步刺激废料的酶促和微生物降解的方式。这样的方式包含酶组合物；用于诸如碳水化合物的微生物的养料；添加诸如产乳酸菌的微生物；温度规定；混合或旋转装置。
根据本发明的方法可在单个废料处理厂内执行，该废料处理厂包括一个或多个生物反应器和/或一个或多个下游处理反应器，诸如作为同一废料加工回路的部分的AD消解器；或者处理水可从一个或多个不同的和可能独立的酶促和/或微生物废料处理和/或沼气生产场所获得。
本文示出处理水可从下游处理再循环到生物反应器中，同时将生物反应器中的生物液体生产处理保持在稳定状态，其中，酶促和微生物处理都是活跃的并且保留时间和相应的成本被优化。优选地，处理水在再循环到生物反应器中时具有在3.5和6之间的pH以避免对生物反应器中的酶促和/或微生物液化处理的延迟影响。本文公开的示例示出，当添加处理水(诸如废水)到生物反应器中时，产生作为AD沼气生产的养料所需的生物液体中有价值的有机酸的酶促活性和微生物活性可以连续的速率保持在生物反应器中。虽然添加到废料中的酶组合物的最佳pH是事先已知的，但从废料的天然微生物菌群获得的酶的最佳pH是未知的。此外，虽然添加到废料中的微生物混合物的最佳pH是事先已知的，但废料的微生物菌群中天然存在的微生物的特性以及这些生物的最佳pH是未知的，并且将取决于正在处理的废料的天然微生物菌群而变化。
附图说明
图1：1a是根据本发明的包括步骤a)、b)、c)和d)的废料加工处理和处理水再循环的步骤的示意图。1b是下游处理示例的示意图。
图2：示出pH作为发酵时间的函数的图表。
图3：示出pH作为发酵时间的函数的图表，添加有或没有pH调节的废水。
图4：示出pH作为发酵时间的函数的图表，从发酵器中持续地移除材料，然后添加废水。
图5：示出pH作为发酵时间的函数的图表，添加废水。
图6：条形图示出在添加废水的发酵期间产乳酸菌占细菌总量的比例。
图7a至7d：饼图示出在添加废水的发酵期间最主要的产乳酸菌占细菌总量的比例。
图8a至8d：饼图示出在添加废水的发酵期间特定种类的产乳酸菌的比例。
图9：条形图示出在添加废水的发酵期间中古细菌占细菌总量的比例。
图10：甲烷产量作为时间的函数。
图11：添加有NH4HCO3和氨的发酵器中MSW模型底物发酵的pH曲线。
图12：在添加有废水和葡萄糖的旋转卧式反应器中，在MSW模型底物发酵过程中乳酸菌和其他细菌物种的分布。
定义
如本文所用，以下术语具有以下含义：
本文所用的“大约(About)”常常指代数量或范围，相对于所指代的数量或范围而言，可指代+/–1、2、5或甚至10％。在本发明的上下文中，术语“大约(about)”、“左右(around)”、“近似(approximately)”或符号“～”可互换地使用并且意在包括本领域普遍接受的变体，例如包括分析错误等。
术语“包括(comprising)”应解释为指定存在陈述的部分、步骤、特征、部件等，但不排除存在一个或多个附加部分、步骤、特征、部件等。例如，包括化合物的组合物因此可包括附加的化合物。
它可在一个或多个原子、官能团或子结构上有所不同，其被其他原子、基团或子结构取代。至少在理论上，可想象由另外的化合物形成结构类似物。
“分批(Batch)”指代从特定地理区域运送到废料厂的任何规定数量的废料。“分批”中的废料量和地理区域的大小随厂到厂而变化，并取决于具体的翻新收集系统和厂的具体大小，诸如大型厂。每一分批可在本方法的步骤a)、b)和c)的每一步中单独地处理，或者数分批可连续地加工或至少在一个或多个步骤中具有重叠的保留时间。一般，一分批将指由单个卡车装载到废料厂中的废料量，其常常包括每装载在15–20m3的废料处置量。来自卡车的数分批可被收集、储存并作为一个大的分批进入加工厂。在这种情况下，该分批将常常包括在40–6000m3的废料。
“分批处理(Batch process)”加工可作为分批处理或系列分批处理来进行。加工可作为补给式分批(fed batch)或连续处理，或系列补给式分批或连续处理来进行，其中，将城市固体废料材料逐渐地补给到例如含有酶组合物的加工溶液中。处理可以是“连续处理”，其中，在整个加工中以不同的时间间隔添加MSW材料和酶组合物，并且在整个加工中以不同的时间间隔移除水解物。水解物的移除可在添加纤维素材料和纤维素分解酶组合物之前、同时或之后进行。
“生物反应器(Bioreactor)”指代支持生物活性环境的任何制造或工程装置或系统。生物反应器可以是其中进行化学处理的器，该处理涉及有机体或源自这样的有机体的生物化学活性物质。此处理可以是有氧的也可以是厌氧的。这些生物反应器可能是圆柱形或非圆柱形，大小范围从升到立方米，且常常由不锈钢制成。为了本发明的目的，“生物反应器(Bioreactor)”包括提供执行本发明的适当条件的任何设施、容器或环境。
“生物液体(Bioliquid)”是通过对包括有机物的废料进行酶促加工而获得的液化和/或糖化可降解组分。生物液体还指一旦从不可发酵的固体分开，通过对包括有机物的废料进行酶促和/或微生物加工而获得的液体部分。生物液体包括水和有机底物，诸如蛋白质、脂肪、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乳酸盐、乙酸盐、乙醇和/或其他成分，这取决于废料的成分(诸如蛋白质和脂肪的成分可以是以可溶和/或不溶形式)。生物液体还包括纤维、灰分和惰性杂质。所得生物液体包括高百分比的可溶，提供用于气体产生的底物，适合于厌氧消化例如用于产生沼气的底物。
“纤维素分解背景组合物(CBC)或纤维素分解酶组合物(Cellulolyticbackground composition(CBC)or Cellulolytic Enzyme Blend)”是指包括两种或更多种纤维素分解酶的组合物的酶组合物。CBC可包括选自以下的两种或更多种纤维素分解酶：i)Aspergillus fumigatus纤维素水解酶I；(ii)Aspergillus fumigatus纤维素水解酶II；(iii)Aspergillus fumigatus beta–葡糖苷酶或其变体；以及(iv)具有纤维素分解增强活性的Penicillium sp.GH61多肽；或其同系物(homologs)。CBC还可包括一种或多种选自以下的酶：(a)Aspergillus fumigatus木聚糖酶或其同系物，(b)Aspergillus fumigatusbeta–木糖苷酶或其同系物；或(c)(a)和(b)的组合(如WO2013/028928中进一步详细描述的)。CBC的主要活性可包括：endo-1,4-beta-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)；endo-1,4-beta-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)；endo-1,4-beta-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)、beta-甘露糖苷酶(E.C.3.2.1.25)，而其他酶活性也可存在于CBC中，诸如来自葡聚糖酶、葡糖苷酶、纤维二糖水解酶I纤维二糖水解酶II的活性；beta-葡萄糖苷酶；beta-木糖苷酶；beta-L-阿拉伯呋喃糖苷酶；淀粉葡萄糖苷酶；alpha-淀粉酶；乙酰木聚糖酯酶。CBC可以是WO2013/028928(其内容通过引用并入本文)中描述的任何CBC。CBC可来自T.reesei。CBC可来自Myceliophtorathermophilae。CBC可以是CTec3，其可从Novozymes A/S(Bagsvaerd,Denmark)获得。纤维素分解酶活性可通过测量在以下条件下通过纤维素分解酶水解纤维素材料期间糖的产生/释放，与未添加纤维素分解酶蛋白质的控制加工相比较的增加来确定：1-50mg纤维素分解酶蛋白质/g纤维素在预加工的玉米秸秆(PCS)(或其他预加工的纤维素材料)中，在合适的温度，诸如40℃–80℃，例如40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃，以及合适的pH，诸如4–9，例如4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0，持续3–7天。
“用以生物质转化优化的可商购的纤维素酶制剂(Commercially availablecellulase preparation optimized for biomass conversion)”是指足以提供对生物质诸如木质纤维素生物质的酶促加工的酶活性的可商购组合物，并且其常常包括内切纤维素酶(内切葡聚糖酶)、外切纤维素酶(外切葡聚糖酶)、内切木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、木糖苷酶和/或beta-葡萄糖苷酶活性。术语“用以生物质转化优化(optimized for biomassconversion)”是指产物开发处理，其中，已选择和/或修改酶组合物以用于提高产量和/或减少生物质加工成可发酵糖中的酶消耗的特定目的。可使用用以生物质转化优化的可商购的纤维素酶制剂，例如由GENENCORTM(现为DuPont)、DSM或NOVOZYMESTM提供的一个。常常，这样的组合物包括纤维素酶和/或半纤维素酶，诸如外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、内切木聚糖酶、木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和beta-葡糖苷酶、包含其的任何组合中的一种或多种。这样的酶可例如从转基因的Trichoderma reesei的发酵中孤立(isolated)出来，诸如例如，来自Dupont(和/或GENENCOR)的以商标ACCELLERASE TRIOTM出售的商业纤维素酶制剂。可使用的用以生物质转化优化的可商购的纤维素酶制剂由NOVOZYMESTM提供并且包括外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、内切木聚糖酶、木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和beta-葡糖苷酶，诸如例如，以以下任一商标出售的商业纤维素酶制剂：来自NOVOZYMESTM的商标CTec2或CTec3。
术语“纤维素酶(Cellulase(s))”意在包括一种或多种能够降解纤维素和/或相关组合物的酶。纤维素酶是一般由真菌、细菌和原生动物产生的几种酶中的任何一种，其催化纤维素分解、纤维素和/或相关多糖的分解。纤维素酶也可用于各种此类酶的任何混合物或复合物，其系列或协同作用以分解纤维素材料。纤维素酶将纤维素分子分解成单糖(“简单糖”)，诸如beta-葡萄糖，和/或更短的多糖和寡糖。具体反应可包括水解纤维素、半纤维素、地衣多糖和谷物beta-D-葡聚糖中的1,4-beta-D-糖苷键。数种不同种类的纤维素酶是已知的，其在结构和机理上不同。与名称“纤维素酶”相关联的同义词、衍生物和/或特定酶包括endo-1,4-beta-D-葡聚糖酶(beta-1,4-葡聚糖酶、beta-1,4-内切葡聚糖水解酶、内切葡聚糖酶D、1,4-(1,3,1,4)-beta-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶)、羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、纤维糊精酶、纤维素酶A、纤维素酶AP、碱性纤维素酶、纤维素酶A3、9.5纤维素酶和胰蛋白酶SS。
纤维素酶也可基于催化的反应类型进行归类，其中，内切纤维素酶(EC3.2.1.4)在无定形位点随机地裂解内部键，其创造新的链端，外切纤维素酶或纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)从由内切纤维素酶产生的暴露链的端裂解两个到四个单元，得到四糖、三糖或二糖，诸如纤维二糖酶。外切纤维素酶进一步归类为I型–从纤维素链的还原端持续发挥作用，以及II型–从非还原端持续发挥作用。纤维二糖酶(EC3.2.1.21)或beta-葡糖苷酶将外切纤维素酶产物水解成单个单糖。氧化纤维素酶通过自由基反应解聚纤维素，例如纤维二糖脱氢酶(受体)。纤维素磷酸化酶使用磷酸盐而不是水来解聚纤维素。
化学需氧量(COD)是测量的溶液中可由反应消耗的氧气量的指示性测量。它一般以溶液体积消耗的氧气质量表示，其SI单位为毫克每升(mg/L)。COD测试可用于轻松地量化水中有机物的量。COD最常见的应用是量化地表水(例如湖泊和河流)或废水中发现的可氧化污染物的数量。COD在水质方面很有用，其提供了一度量来确定流出物将对接收体的影响，就像生化需氧量(BOD)一样。
术语“半纤维素酶(Hemicellulase(s))”意在包括一种或多种能够和/或有助于分解半纤维素(植物细胞壁的主要成分中的一个)的酶。构成半纤维素的主要多糖中的一些被认为是木聚糖、阿拉伯木聚糖、木葡聚糖、葡糖醛酸木聚糖和葡甘露聚糖。在本发明的上下文中，术语“半纤维素酶(hemicellulase(s))”意在包括：木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、木葡聚糖酶、葡糖醛酸木聚糖酶、葡甘露聚糖酶和/或酯酶、包含其的任何组合。
术语“木聚糖酶(Xylanase(s))”意在包括一种或多种能够降解木聚糖和/或相关合物(compounds)的酶。木聚糖酶是例如由微生物(诸如酵母)产生的催化木聚糖和/或相关多糖分解的数种酶中的任何一种。木聚糖酶也可用于系列或协同作用以分解木聚糖物质的各种此类酶的任何混合物或复合物。与名称“木聚糖酶”相关联的同义词、衍生物和特定酶可包括EC 3.2.1.8、endo-(1->4)-beta-木聚糖4-木聚糖水解酶、endo-1,4-木聚糖酶、endo-1,4-beta-木聚糖酶、beta-1,4-木聚糖酶、endo-1,4-beta-D-木聚糖酶、1,4-beta-木聚糖木聚糖水解酶、beta-木聚糖酶、beta-1,4-木聚糖木聚糖水解酶、beta-D-木聚糖酶和/或木糖苷酶，其能够将木聚糖诸如beta-1,4-木聚糖降解为木糖，从而有助于分解(植物细胞壁的主要成分中的一个的)半纤维素。
本文所用的“木糖苷酶”旨在包括木聚糖1,4-beta-木糖苷酶(E.C.3.2.1.37)，其也被命名为木糖苷酶、beta-木糖苷酶、exo–1,4-beta-D-木糖苷酶或4-beta-D-木聚糖木糖水解酶。此酶催化(1-4)-beta-D-木聚糖的水解，从底物的非还原末端移除连续的D-木糖残基，例如半纤维素和双糖木二糖。一个单元的beta-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下，1mM对硝基苯基-beta-D-木糖苷在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中每分钟产生1.0μmole的对硝基苯酚阴离子。
术语“阿拉伯木聚糖酶(Arabinoxylanase(s))”意在包括一种或多种能够降解阿拉伯木聚糖和/或相关合物的酶，包括例如葡糖醛酸阿拉伯木聚糖endo-1,4-beta-木聚糖酶(EC 3.2.1.136)、feraxan木聚糖内切酶、feraxanase、内切阿拉伯木聚糖酶、葡糖醛酸木聚糖木聚糖水解酶、葡糖醛酸木聚糖酶、葡糖醛酸木聚糖木聚糖水解酶、葡糖醛酸阿拉伯木聚糖1,4-beta-D-木聚糖水解酶)和葡糖醛酸阿拉伯木聚糖4-beta-D-木聚糖水解酶。葡萄糖醛酸阿拉伯木聚糖4-beta-D-木糖水解酶被认为可内水解在一些葡萄糖醛酸阿拉伯木聚糖中的(1–>4)-beta-D-木糖基链(links)。还认为此酶针对阿魏酰化阿拉伯木聚糖具有高活性。(Nishitani,K.；Nevins,D.J.(1988)."Enzymic analysis of feruloylatedarabinoxylans(Feraxan)derived from Zea mays cell walls.I.Purification ofnovel enzymes capable of dissociating Feraxan fragments from Zea mayscoleoptile cell wall".Plant Physiol.87:883–890.)
术语“木葡聚糖酶(Xyloglucanase(s))”意在包括一种或多种能够降解木葡聚糖和/或相关合物的酶，包括例如木葡聚糖特异性endo-beta-1,4–葡聚糖酶(EC 3.2.1.151)，这是被认为可催化化学反应的酶：
木葡聚糖+H2O→木葡聚糖低聚糖。此酶属于水解酶家族，特别是那些水解O-和S-糖基合物的糖苷酶。此酶的系统名称是[(1–>6)-alpha-D-xylo]-(1–>4)-beta-D-葡聚糖葡聚糖水解酶。其他常用名称可包含XEG、木葡聚糖endo-beta-1,4-葡聚糖酶、木葡聚糖酶、木葡聚糖内切水解酶、XH和1,4-beta-D-葡聚糖水解酶。
术语“葡糖醛酸木聚糖酶(Glucuronoxylanase(s))”意在包括一种或多种能够降解葡糖醛酸木聚糖和/或相关合物的酶。
术语“葡甘露聚糖酶(Glucomannanase(s))”意在包括一种或多种能够降解葡甘露聚糖酶和/或相关化合物的酶。
术语“酯酶(Esterase(s))”意在包括一种或多种能够在酸和醇中分裂(splitting)酯的酶。酯酶的示例包括乙酰酯酶和亚铁酰酯酶。
术语“乙酰酯酶(Acetylesterase(s))”意在包括能够分裂掉乙酰基的酶。乙酰酯酶(EC 3.1.1.6)是催化化学反应的酶：
醋酸酯+H2O→酶+醋酸酯。此酶属于水解酶家族，特别是那些作用于羧酸酯键(bonds)的酶。此类酶的系统名称是乙酸酯乙酰水解酶。其他常用名称包含C-酯酶(在动物组织中)、乙酸酯水解酶、氯酯酶、对硝基苯乙酸酯酶和柑橘乙酰酯酶。
术语“阿魏酰酯酶(Feroyl esterase(s))”和“阿魏酰酯酶(Feruloyl esterase(s))”可互换地使用，并且意在包括一种催化化学反应阿魏酰-(多-、寡-或单-)多糖的酶+H2O→阿魏酸+(多-、寡-或单-)糖。阿魏酰酯酶属于水解酶家族，特别是那些作用于羧酸酯键的酶。此类酶的系统名称是阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)；其他名称可包含阿魏酸酯酶(FAE)、羟基肉桂酸酯酶、半纤维素酶辅助酶和肉桂酸酯水解酶(cinnAE)。
可使用本领域已知的方法在合适的主体中表达合适的酶，诸如纤维素酶、包含木聚糖酶的半纤维素酶，和/或酯酶。此类酶也可以纯形式或以酶混合物(enzyme cocktails)的形式商购。可再次使用本领域已知的方法从市售的酶混合物中纯化特定的酶活性-参见例如等人(2005)“Efficiencies of designed enzyme combinations inreleasing arabinose and xylose from wheat arabinoxylan in an industrialfermentation residue”(Enzyme and Microbial Technology 36(2005)773-784)，其中，从Celluclast(Finizym)中纯化了Trichoderma reesei beta-木糖苷酶,并公开了进一步的商业酶制剂。
除非另有说明，“在…处(at)”干物质水平下进行加工/处理是指在所述加工开始时原料(feedstock)的干物质含量。同样，除非另有说明，“在…处(at)”pH下进行加工/处理是指在所述加工开始时生物质的含水含量的pH。
在本发明的上下文中，术语“pH和/或温度调节(pH-and/or temperature-adjusted)”意在包括pH和/或温度调节以便允许酶促加工和/或发酵在合适的pH和/或温度条件下发生。
“干物质”也显示为“DM”，是指可溶性和不可溶性的总固体，并且实际上是指“非水含量”。干物质含量通过在40至120℃之间，最好在50至105℃之间干燥，直到达到恒重来测量。
“预处理(Pre-treatment)”一般是指使用水(作为热液体、蒸汽或包括高温液体或蒸汽或两者的加压蒸汽)在120℃或更高的温度下添加或不添加酸或其他化学品。在本发明的上下文中，“水热预处理(hydrothermal pre-treatment)”意在包括与通过使用温度和水以及常常还有压力来软化木质纤维素生物质有关的方法、单元操作和/或处理，旨在提供适用于酶促消化的预处理生物质。在本发明上下文中的预处理可以是在以酶和/或微生物液化废料之前(或者随后或同时)将废料与约70℃的水(优选地再循环)混合的步骤。
“固/液分开(Solid/liquid separation)”是指主动机械地处理和/或单元操作，由此通过例如通过按压、离心、沉降、倾析等施加一些力将液体从固体分开。一般，固/液(s/l)分开提供液体和固体部分。
在本发明的上下文中，除非另有说明，否则“％”表示％重量/重量(w/w)。
一种或多种孤立的酶制剂的“有效量”是一量，在所述量中所用的酶制剂共同实现废料的充分增溶以提供包括高百分比的糖和其他可溶性降解产物的溶液，适合厌氧消化的底物，例如用于生产沼气。有效量可通过使用本文所述的增溶测试来确定。
“增溶测试(Solubilization test)”是以便查明应将多少给定的酶促组合物添加到废料中以进行充分的酶促加工而应用的测试。所选定的酶组合物在MSW模型底物上的增溶测试可用于明确最佳酶促增溶处理。可通过应用以下测试方法确定废料(诸如城市固体废料)的增溶：
增溶实验室测试I
由41％的混合植物组织的食物废料、13％的动物组织的混合食物废料和46％的混合纤维素废料组成的模型基质被切碎、混合和研磨多次直到均匀，穿通过3mm筛网，分成更小的部分并在≤–18℃下冷冻储存。
一组预先称重的50mL离心管，每个含有在50mM醋酸钠缓冲液pH 4.50±0.05中的上述模型底物的1.500±0.010g TS(60℃时的总固体)，被添加不同量的待测试的酶(一般为5–60mg EP/g TS的模型底物)用以每个管中20.000±0.025g的最终总重量。
以紧贴合的盖封闭试管，并将反应混合物在50±1℃下孵育24小时±10分钟，同时通过以每分钟10.0±0.5转的速度转置试管(上下颠倒)进行搅拌。
孵育完成后立即将管以2100±10G离心10分钟，并且离心后立即(在不到5分钟内)将上清液倒入另一组预先称重的管中。第一组管(包含盖)带有残留的未溶解模型底物，且第二组管带有含有增溶模型底物的倾析上清液，被在4位小数分析天平上称重，然后在通风良好的干燥盒中以60±1℃放置6天。
在干燥管(包括盖)之后再次称重，确定团粒(pellet)和上清液中的TS量，并且质量平衡计算如下：
质量平衡％＝((TS团粒+TS上清液–TS酶)/TS模型底物)*100％
基于TS模型底物(1.500±0.010g)的质量平衡，以确保没有材料损失和适当干燥，将一般在95–105％的区间内。
基于倾析上清液的总量和TS量，倾析上清液中的TS％计算如下：
TS％＝(TS倾析上清液/总倾析上清液)*100％
最后，增溶计算如下：
增溶％＝(((TS％*残留水/(1–TS％))–TS酶)/TS模型底物)*100％
通过基于倾析上清液的TS％和残留水量(倾析上清液和残留湿团粒的重量减去空管和模型底物的TS的重量)计算增溶，截留在离心团粒中的液相也将被计入。
增溶与酶剂量的图表将示出酶功效(在高酶剂量下的最大增溶)和酶效力(获得一定水平的增溶所需的剂量)的特征。
–酶功效一般可能是35–70％的增溶，这取决于模型底物组合物和待测试的酶组合物。使用的剂量一般可定义为获得85–95％的功效。
本发明表现非常适合工业应用，包含大规模的工业应用。在一些实施方式中，本发明的方法是使用每小时至少约100、200、500kg废料实践的。在一些实施方式中，每小时(h)可处理至少1、5、10、15、20、25、50或100吨(t)废料。
在本发明的上下文中，术语“厌氧消化(anaerobic digestion)”意在包括生物处理，其中，微生物在缺氧的情况下分解生物可降解材料。最终产物中的一个可能是沼气，其例如可被燃以生成电力和/或热量。沼气也可直接或升级后用作可再生天然气和/或运输燃料。沼气可被注到天然气和/或沼气网中。
在本发明的上下文中，术语“厌氧消化系统(anaerobic digestion system)”是指包括一个或多个在受控曝气条件下操作的消解器的发酵系统，其中，在包括该系统的每个反应器中产生甲烷气体。甲烷气体的产生达到“厌氧消化系统(anaerobic digestionsystem)”内发酵混合物含水相中代谢生成的溶解甲烷浓度在所用条件下饱和并且甲烷气体从系统中排出的程度。“厌氧消化系统(anaerobic digestion system)”可以是固定过滤系统。“固定过滤器厌氧消化系统(fixed filter anaerobic digestion system)”是指其中厌氧消化聚生体，可选地在生物膜内，被固(immobilized)在物理支持基质上的系统。
术语“发酵器(fermenter)”和“消解器(digester)”可互换地使用。“消解器(digester)”一般用于厌氧消化，常常用于沼气生产的文中。
同样，术语“发酵(fermentation)”和“消化(digestion)”可互换地使用。“消化(Digestion)”一般用于厌氧消化，常常用于沼气生产的文中。
在本发明的上下文中，术语“消解物(digestate)”或“AD流出物(AD effluent)”被定义为来自用于沼气生产的厌氧消化(AD)的残余输出。厌氧消解器在厌氧条件下用微生物可持续地加工来自城市、工业和/或农业操作的有机废料，用以生产沼气。常常，“消解物”具有碱性pH，并主要包括水，但也包括悬浮固体和溶解物质，诸如可包含无机盐和有机盐这两者的盐。
“废水(Reject water)”定义为在AD消解物的一个或多个固液分开之后获得的液体部分，并且相应地该术语适用于表示从AD处理中获得的处理水。所述一个或多个固液分开可包括倾析、离心、过滤、絮凝、按压和沉降中的一个或多个。与AD消解物一样，废水具有碱性pH，并包括溶解物质，诸如可包含无机盐和有机盐两者的盐。废水还可包括一些来自AD处理的悬浮物质和活微生物。此类水可根据国家要求经受卫生化和/或其他净化步骤，例如在被从AD厂释放之前的动物副产品法规(APB)。
“洗涤水(Wash water)”定义为用于洗涤在生物反应器流出物的固液分开之后获得的任何固体部分的任何水流。洗涤水的示例是用于洗涤2D部分(平面材料，诸如纺织品、塑料薄膜、未消化的纸板)和/或3D部分(金属和固体塑料)的水，用于洗涤2D和3D部分的洗涤水可能是来自消解物脱水的废水，如图1a所示。然而，来自洗涤单元的用过(spent)的洗涤水可用作生物反应器中的处理水。由于此水的pH较低，并且含有洗涤掉的有机物和残留的酶，因此pH调节酸消耗、生物反应器处理和例如沼气产量将受益于生物反应器中用过的洗涤水的再使用。洗涤水的其他示例是用于洗涤惰性物、金属和/或塑料的水。在一个实施方式中，洗涤水可以是稀释的生物液体。
“来自外部来源的水(Water from external sources)”包含从任何来源获得的水，其中，所述水之前没有经受酶促和/或微生物废料加工处理中的任何步骤。因此，来自外部来源的水包括自来水、未经受酶促和/或微生物废料加工处理的废水，以及来自天然来源的水。
“来自天然来源的水(Water from natural sources)”是指从诸如河流、湖泊和池塘的天然来源中获取的水。
“卫生化(Hygienization)”是指减少某些微生物活性的处理。国家或地区当局为减少或消除废料中的微生物含量而采用的各种卫生化处理是例如如在Liu X.,LendormiT.,Lanoiselle J.-L.,2018,A review of hygienization technology of biowastesfor anaerobic digestion:effect on pathogen inactivation and methaneproduction,Chemical Engineering Transactions,70,529-534中所描述和比较的。
术语“pH调节的处理水(pH-adjusted process water)”意在包括在pH调节步骤之后的处理水，常常是在添加酸以提供弱碱性pH之后。
“处理水(Process water)”处理水可包括从工业处理中回收的水，其中，例如废料经过酶促和/或微生物加工，诸如根据包含洗涤水、废水和生物液体的本发明的处理。处理水的质量低于饮用水，诸如就有机和/或无机盐、微生物有机体/平板计数、悬浮固体、DM和/或pH、包括其的任何组合中的任何这方面而言。处理水可就矿物质/盐含量、pH等方面进行调整。处理水包含如上所述的生物液体、废水和洗涤水。在一个实施方式中，处理水为不是外部水的水，例如自来水。
“自来水(Tap water)”定义为任何类型的淡水，包含城市水、来自雨水收集池的水、来自乡村水泵或城镇水泵的水以及从溪流、河流或湖泊中抽取的水。
在本发明的上下文中，术语“产乳酸菌(lactic acid producing bacteria)”包括乳酸菌目(lactic acid bacteria order)“LAB”的细菌两者，其中，当前接受的分类法基于原核生物命名列表(LPSN)-一个维持原核生物命名和分类学信息的在线数据库，遵循国际细菌命名法典的分类学要求和规定。目的系统发生学基于“全物种生命树”项目的16SrRNA-based LTP release 106。除了属于LAB目细菌之外，本文所用的术语“产乳酸菌(lactic acid producing bacteria)”还包括不属于LAB目但仍然能够产生乳酸的细菌。
“可溶物(Solubles)”是指从废料的酶促和/或微生物处理中获得的降解产物，有时称为微生物代谢物。可溶物相应地存在于生物液体中，并且一般是底物的混合物，诸如蛋白质、脂肪、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乳酸盐、乙酸盐、乙醇和/或其他成分，其取决于废料的成分(诸如蛋白质和脂肪的成分可以是可溶和/或不可溶的形式)。可溶物/微生物代谢物为生产气体提供底物，适合于厌氧消化的底物，例如用于生产沼气。
“废料(Waste)”包括已分类和未分类的城市固体废料(MSW)、农业废料、医院废料、工业废料，例如来自诸如餐饮业、食品处理业、一般工业的行业的废料部分；来自造纸业的废料部分；来自回收设施的废料部分；来自食品或饲料行业的废料部分；来自医药或制药行业的废料部分；来自医院和诊所的废料部分，从农业或农场相关部门得到的废料部分；来自含糖或富含淀粉制品的处理的废料部分；被污染(contaminated)或以其他方式变质(spoiled)的不能用于食品或饲料目的的诸如谷物、土豆和甜菜的农制品；或园艺废弃物。
“城市固体废料(Municipal solid waste)”(MSW)是指一般在城市中可用的废料部分，但本身不一定来自任何市政当局，即MSW是指来自任何市政当局的每个固体废料，但不一定是典型的家庭废料–可以是来自机场、大学、校园、食堂、一般食物废料等的废料。MSW可以是纤维素、植物、动物、塑料、金属或玻璃废料中一种或多种的任意组合，包含但不限于以下的任何一种或多种：在正常的市政收集系统中收集的垃圾，可选地在中央分类、切碎或制浆设备中处理，诸如例如或/>从家庭中分类的固体废料，包含有机部分和富含纸张部分两者；一般，世界西部地区的城市固体废料一般包括以下一种或多种：动物食物废料、植物食物废料、新闻纸、杂志、广告、书籍、办公用纸、其他清洁纸、纸和纸盒容器、其他纸板、牛奶盒等，果汁盒和其他铝箔纸盒、厨房纸巾、其他脏纸、其他脏纸板、软塑料、塑料瓶、其他硬塑料、不可回收塑料、庭院废料、鲜花等，动物和排泄物、尿布和卫生棉条、棉棒等，其他棉花，木材、纺织品、鞋子、皮革、橡胶等，办公用品、空化学瓶、塑料制品、烟蒂、其他可燃物，吸尘器袋、透明玻璃、绿色玻璃、棕色玻璃、其他玻璃、铝容器、铝盘、铝箔(包含蜡烛箔)、金属容器(-Al)、金属箔(-Al)、其他种类的金属、土壤、岩石、石头和砾石、陶瓷、猫垫、电池(纽扣电池、碱、温度计等)、其他不可燃物和细屑(fines)。
词汇“Renescience”指的是旗下的一公司，该公司是丹麦成立的能源解决方案提供商。Renescience应用酶促和/或微生物废料处理技术用以加工包括有机物的废料，并将来自废料的液化有机物转变为能量。
具体实施方式
通过本发明，令人惊奇地发现，从AD处理获得的处理水，诸如生物液体、洗涤水和废水，可再使用作生物反应器中的水来源，其中，废料经受酶促和/或微生物降解。这减少在废料的酶促和/或微生物降解中本应所需的水量。本文示出，处理水在被添加到生物反应器中之前不一定要经受卫生化。如果处理水，例如废水已经受卫生化，此约为70℃的水优选地在液化前被回收并与废料混合。以便使液化处理在生物反应器中连续进行，已发现生物反应器中的pH优选地在pH 2到6.5内，诸如在3.5和6之间，或在3和5之间。生物反应器中的pH可连续或间断地监测。因此，在一个实施方式中，通过添加酸和/或通过降低铵含量将废水的pH调节到在3.5和6之间。处理水可与来自外部来源，诸如自来水/纯净水的水一起添加或混合。
本文示出，在添加自来水(pH7)且不对生物反应器中的pH进行任何调整的情况下，在废料的结合的酶促和微生物处理期间，在前24小时期间观察到酸化。发现这些实验中的酸化主要是由于乳酸的形成。在约24小时后，发现pH降到约4.8，且乳酸的生产率明显地降低。在48hrs之后，乳酸盐的产生停止。
在本文中发现，当将来自AD处理的废水添加到生物反应器时，生物反应器中的pH(其中pH已稳定在4.8左右)增加。pH的此增加对废料的酶促和/或微生物液化有负面影响，并导致生物液体有较少的有机酸，并因此对于进一步加工成有价值的能源来说有较差的质量。还如本文所示，发现较少量添加废水、废料和酶是实现4.8左右pH的更快方法。不受特定理论的束缚，认为通过添加较少的废水实现更快的酸化并且这主要是两个因素的结果：1)当添加废水时已经有建立的乳酸群落，2)低pH生物液体的存在限制了由于添加废水而导致的pH增加，这反过来又允许酶在添加的MSW的转化中更有效地发挥作用。相应地，在本发明的一个优选的实施方式中，如果在将处理水添加到生物反应器前不对处理水的pH进行调整，则分批添加处理水以将pH保持在pH 3.5–6内，以便提供连续的可溶物的产生。
来自脱水消解物的废水主要包括古细菌，在该废水进入生物反应器时没有预先卫生化。如果乳酸菌可胜过进入生物反应器的古细菌种群，那么这对于液化处理来说不是问题。此处示出，当废水进入生物反应器时，乳酸种群衰退但随后重新建立，而古细菌种群在进入生物反应器后稳定地衰退。因此，使用未卫生化的处理水，诸如废水，包括例如古细菌，不抑制液化处理。
总之，所公开的示例表明处理水，诸如废水，其作为来自厌氧消化的废料产物，包括但不限于大量的盐和古细菌，可成功地代替外部水在将废料中的有机物(诸如碳水化合物)到可溶物，诸如有机酸，例如乳酸、乙酸和琥珀酸，的酶促和/或微生物转化中使用。因此，现在可在商业规模上对废料进行酶促和/或微生物加工，其中，很大一部分水被回收，从而减少该处理的总耗水量。
本发明的方法是连续或分批处理废料的方法，包括：
a)在生物反应器中使废料经受酶促和/或微生物加工
b)使来自步骤a)的经加工的废料经受一个或多个分开步骤，从而提供生物液体和固体部分；
c)使所述生物液体和/或固体部分经受下游处理，其提供处理水；
d)将从步骤c)获得的处理水和可选地来自外部水源的水添加到步骤a)中的生物反应器。
根据本发明的第一方面的方法可在单个废料处理厂内执行，该废料处理厂包括一个或多个生物反应器和/或一个或多个下游处理步骤，诸如作为相同废料处理回路的部分的AD消解器；或者处理水可从一个或多个不同且可能独立的废料处理和/或沼气生产场所获得。
步骤a)
步骤a)中废料的酶促和/或微生物加工在反应器中执行，此处表示为生物反应器。通过添加一种或多种酶以及通过废料中存在的细菌来执行加工。可选地，可将标准的、培养的或操纵的酵母、细菌或任何其他能够将存在于废料中的有机物转化为适合于厌氧消化处理中的后续沼气生产的组合物的微生物添加到生物反应器。酶以天然形式或以表达该酶的微生物有机体的形式供应。取决于废料的干物质含量，常常必须将水添加到处理中。在本发明的上下文中，至少部分这样添加的水将是被回收的水，例如处理水。
步骤a)中的酶促和/或微生物加工可利用以下来执行：通过添加一种或多种酶，以天然形式和/或以引起此类酶表达的微生物有机体的形式被供应；和/或通过存在于废料中的细菌和/或可选地通过添加标准的、培养的或被操纵的酵母、细菌或能够进行以下的任何其他微生物：将存在于废料中的有机物转化为的有机酸或其他组合物，诸如乳酸、3-羟基丙酸(3-HPA)、1,4-丁二醇(BDO)、丁二酸(琥珀酸)、乙烷-1,2-二醇(乙二醇)、丁醇或1,2-丙二醇(丙二醇)，其适合于厌氧消化处理中的后续沼气生产。
在一个实施方式中，本发明的方法是一方法，在所述方法中，步骤a)中的所述酶促和/或微生物加工利用以下来执行：通过添加酶，其以天然形式或以引起此类酶表达的微生物有机体的形式被供应，和/或通过存在于废料中的细菌和可选地通过添加标准的、培养的或被操纵的酵母、细菌或任何其他能够产生生化品、乙醇或沼气的微生物来执行。
可在步骤a)中被添加到生物反应器的微生物包含酵母和/或真菌和/或细菌。
可在步骤a)中被添加到生物反应器的其他微生物包含可有效地发酵己糖和戊糖(包含但不限于纤维二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖)的细菌到短链有机酸(包含但不限于柠檬酸、乳酸、甲酸酸、乙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和丙酸)以及醇，其包含但不限于乙醇。
可在步骤a)中被添加到生物反应器的其他微生物包含发酵有机体，诸如：Bacillus sp.,例如Bacillus coagulans；Candida sp.,诸如C.sonorensis,C.methanosorbosa,C.diddensiae,C.parapsilosis,C.naedodendra,C.blankii,C.entomophilia,C.brassicae,C.pseudotropicalis,C.boidinii,C.utilis,以及C.scehatae；Clostridium sp.,诸如C.acetobutylicum,C.thermocellum,以及C.phytofermentans；Escherichia sp.,诸如E.coli,尤其是E.coli菌株，其经过基因改造以提高乙醇、生物乙醇或乳酸产量；Geobacillus sp.；Hansenula sp.,诸如Hansenulaanomala；Klebsiella sp.,诸如K.oxytoca；Kluyveromyces sp.,诸如K.marxianus,K.lactis,K.thermotolerans,以及K.fragilis；Schizosaccharomyces sp.,诸如S.pombe；Thermoanaerobacter sp.,诸如Thermoanaerobacter saccharolyticum；以及Zymomonassp.,诸如Zymomonas mobilis.Lactobacillus sp.,例如Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus,Lactobacillus ultunensis,Lactobacillus senmaizukei,Lactobacillus equicursoris,Lactobacillus tucceti,Lactobacillus brantae,Lactobacillus parakefiri,Lactobacillus crispatus,Lactobacillus intermedius,Lactobacillus mucosae,Lactobacillus agili,s Lactobacillus equi,Lactobacillusdelbrueckii,Lactobacillus frumenti,Lactobacillus letivazi,Lactobacillusthailandensis,Lactobacillus helveticus,Lactobacillus apis,Lactobacillusacidifarinae,Lactobacillus gallinarum,Lactobacillus kalixensis,Lactobacillushayakitensis Lactobacillus gastricus,Lactobacillus homohiochii,Lactobacillusguizhouensis,Lactobacillus intestinalis,Lactobacillus hilgardii,Lactobacillusiners,Lactobacillus brevis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus oris,Lactobacillus coleohominis,Lactobacillus panis,Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus ruminis,Lactobacillus suebicus,Lactobacillus pobuzihii,Lactobacillus similis,Lactobacillus rhamnosus,Lactobacillus manihotivorans,Lactobacillus nodensis,Lactobacillus aviaries,Lactobacillus vaginalis,Lactobacillus namurensis,Lactobacillus rossiae,Lactobacillus buchneri,Lactobacillus jensenii,Lactobacillus parabrevis,Lactobacillus equigenerosi,Lactobacillus oligofermentans,Lactobacillus farciminis,Lactobacillusjohnsonii,Lactobacillus parabuchneri,Lactobacillus parabuchneri,Lactobacillushamsteri,Lactobacillus pentosus,Lactobacillus bobalius,LactobacillusAlimentarius,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus pontis,Lactobacillussalivarius,Lactobacillus taiwanensis Lactobacillus antri,Lactobacillussiliginis,Lactobacillus kitasatonis,Lactobacillus camelliae,Lactobacillussecaliphilus,Lactobacillus ingluviei,Pediococcus spp.,Fructobacilluspseudoficulneus,Lactobacillus gigeriorum,Pediococcus sp.,例如Pediococcusargentinicus,Pediococcus stilesii,Pediococcus cellicola,Streptococcus spp.,Alkalibacterium spp.,Leuconostoc spp.,Enterococcus spp.,Tetragenococcus sp.,例如Tetragenococcus doogicus,Weissella spp.,Streptococcus fryi,Oenococcusspp.,Enterococcus cecorum,Vagococcus teuberi,Streptococcus bovis,Lactobacillus faeni,Pediococcus acidilactici,Leuconostoc carnosum,Lactobacillus japonicus,Trichococcus spp.,Weissella minor,Weissellasalipiscis,Facklamia,Vagococcus,Enterococcus camelliae,Streptococcusinfantarius,Aerococcus viridans,Lactococcus fujiensis,Alkalibacteriumsubtropicum,Weissella viridescens,Lactobacillus amylolyticus,Facklamiatabacinasalis,Streptococcus dentirousetti,Streptococcus vestibularis,Desemziaincerta,Pediococcus parvulus,Streptococcus dentapri,Granulicatella elegans,Enterococcus columbae,Aerococcus urinaeequi,Pediococcus siamensis,Weissellasoli,Aerococcus spp.,Enterococcus rotate,Streptococcus milleri,Carnobacteriuminhibens,Streptococcus ursoris,Desemzia spp.,Vagococcus penaei,Streptococcus castoreus,Enterococcus asini,Enterococcus lactis,Weissellaparamesenteroides,Melissococcus spp.,Vagococcus fluvialis,Lactobacillusversmoldensis,Streptococcus gallinaceus,Enterococcus hawaiiensis,Leuconostocpalmae,Pediococcus inopinatus,Tetragenococcusspp.,Facklamia languida,Lactococcus spp.,Abiotrophia defective,Weissella thailandensis,Facklamiahominis,Lactobacillus paracasei,Streptococcus halichoeri,Streptococcusequinus,Enterococcus gilvus,Enterococcus inusitatus,Streptococcusalactolyticus,Enterococcus aquimarinus,Carnobacterium mobile,Streptococcusparasanguinis,Streptococcus tigurinus,Streptococcus luteciae,Granulicatellaadiacens,Lactococcus sp.,例如Lactococcus raffinolactis,Carnobacteriummaltaromaticum,Enterococcus avium,Streptococcus peroris,Streptococcusplurextorum,Lactobacillus vaccinostercus,Streptococcus troglodytae,Tetragenococcus solitaries,Weissella hanii,Carnobacterium spp.,Lactococcusgarvieae,Lactococcus lactis,Streptococcus lactarius,Marinilactibacilluspsychrotolerans,Carnobacterium funditum,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostocpseudomesenteroides,Enterococcus haemoperoxidus,Enterococcus gallinarum,Enterococcus italicus,Aerococcus christensenii,Streptococcus didelphis,Streptococcus orisratti,Alkalibacterium iburiense,Lactobacillus collinoides,Trichococcus flocculiformis,Aerococcus sanguinicola Lactobacillus amylovorus,Leuconostoc gelidum,Leuconostoc gasicomitatum,Granulicatella spp.,Leuconostockimchi,Leuconostoc argentinum,Streptococcus sanguinis,Streptococcuspseudopneumoniae,Weissella koreensis,Fructobacillus spp.,Leuconostocgarlicum,Weissella cibaria,Leuconostoc citreum,Lactobacillus zymae,Fructobacillus fructosus,Leuconostoc inhae,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus hammesii,Lactobacillus nantensis,Lactobacillus paralimentarius,Streptococcus thermophilus,Leuconostoc lactis,Weissella confuse,Lactobacillusacetotolerans,Lactobacillus otakiensis,Fructobacillus ficulneus,Lactobacilluskefiri,Lactobacillus zeae,Lactobacillus casei,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus pantheris,Marinilactibacillus piezotolerans,Lactobacillusacidipiscis,Lactobacillus malefermentans,Lactobacillus gasseri,Lactobacillusparafarraginis,Carnobacterium gallinarum,Vagococcus carniphilus,Streptococcusparauberis,Lactobacillus sanfranciscensis,Carnobacterium divergens,Streptococcus oralis,Streptococcus infantis,Enterococcus casseliflavus,Streptococcus oligofermentans,Lactobacillus kefiranofaciens,Streptococcusaustralis,Pediococcus claussenii,Alkalibacterium psychrotolerans,Enterococcusdurans,Vagococcus salmoninarum,Vagococcus lutrae,Enterococcus faecalisCarnobacterium viridans,Lactobacillus kisonensis,Pediococcus pentosaceus,Enterococcus mundtii,Enterococcus sulfureus,Enterococcus silesiacus,Lactobacillus kimchi,Fructobacillus tropaeol,i Abiotrophia spp.,Streptococcusanginosus,Pediococcus ethanolidurans。
发酵微生物可已转基因以提供发酵戊糖的能力，诸如利用木糖的、利用阿拉伯糖的，以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
发酵有机体可包括编码本文所描述的一种或多种纤维素分解酶、半纤维素分解酶和辅助酶的一种或多种多核苷酸。
存在于废料中或添加到生物反应器的微生物可产生可发酵糖和有机酸或其他成分，诸如乳酸、3-羟基丙酸(3–HPA)、1,4-丁二醇(BDO)、丁二酸(琥珀酸)、乙烷-1,2-二醇(乙二醇)、丁醇或1,2-丙二醇(丙二醇)，其可用作后续厌氧消化处理中的养料。这些有机酸或其他组合物还包含乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐。适合于加工的废料一般至少包括产乳酸菌。
当添加微生物和/或接种废料在步骤a)中的酶促和/或微生物降解之前时，可使用一种或多种类产乳酸菌。
本领域技术人员将容易理解，用于接种的细菌制剂可包括不同有机体的群落。可使用一种或多种天然存在的细菌，其存在于任何给定的地理区域并且适配为在来自该区域的废料，诸如MSW，中繁殖。如本领域所熟知的，产乳酸菌无处不在并且一般将包括在诸如MSW的废料中任何天然存在的细菌群落的主要成分。
在优选的实施方式中，步骤a)中的微生物加工通过微生物组合物执行，其中，大部分活微生物是包含例如Bacillus coagulans的产乳酸菌。
步骤a)中的微生物加工可通过微生物组合物执行，其中，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的活微生物是产乳酸菌。
处理步骤a)可包括使废料与活乳酸菌和/或其他包含诸如Bacillus coagulans的发酵有机体的微生物接触，其浓度约为1x105CFU/ml、1x106CFU/ml、1x107CFU/ml、9x107CFU/ml、1.0x108或1.0x109CFU/ml。当这些微生物被添加到废料中时，它们的添加浓度应至少为1x105CFU/ml、1x106CFU/ml、1x107CFU/ml、9x107CFU/ml、1.0x108、1.0x109或1.0x1010CFU/ml。在一个优选的实施方式中，这些微生物以1x106CFU/ml到9x106CFU/ml的浓度被添加到和/或存在于废料中。在一个优选的实施方式中，这些微生物已经存在于废料中并且没有添加附加的微生物。
在本发明的方法的一个实施方式中，步骤a)中的加工包括使废料与浓度至少为1.0×106、1.0×107、1.0×108或1.0×109CFU/L的活乳酸菌接触。
在本发明的方法的一个实施方式中，步骤a)中的加工包括以1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109或1.0×1010CFU/L的浓度添加微生物到废料。
加工步骤a)可包括通过接种一种或多种呈现细胞外纤维素酶活性的微生物来增加纤维素酶活性。
在步骤a)中，可用酶组合物加工废料。合适的酶组合物是本领域中熟知的并且是可商购的，例如诸如纤维素分解背景组合物。
以便找出可添加多少给定的酶促组合物的酶，可应用酶组合物关于模型废料的增溶测试以提供最佳的酶促增溶处理。
增溶测试不仅可确定在处理初始时待添加的酶的量。当确定包含在步骤d)中可选地添加到生物反应器的酶(其被包括在处理水中)的总酶促性能时，也可应用增溶测试。无论酶是作为新鲜酶添加到废料中还是作为包括在处理水中的“可再使用”酶或作为新鲜和再使用的酶的混合添加，反应器中的酶功效一般可以是实验室测定中模型底物的35–70％的增溶，其取决于模型底物组合物和被测试的酶组合物。
当添加到处理中时，纤维素分解背景组合物(CBC)可包括商业纤维素分解酶制剂。适用于在根据本发明的方法中使用的商业纤维素分解酶制剂的示例包含但不限于，例如CTec(Novozymes A/S)、/>CTec2(Novozymes A/S)、/>CTec3(Novozymes A/S)、/>(Novozymes A/S)、NOVOZYMTM188(Novozymes A/S)、SPEZYMETMCP(Genencor Int.)、ACCELLERASETMTRIO(DuPont)、/>NL(DSM)；S/L 100(DSM)、ROHAMENTTM7069W(/>GmbH)或CMAX3TM(Dyadic International,Inc.)。
当酶组合物包括除存在于CBC中的活性之外的其他酶促活性时，此类酶活性可从单独来源添加或作为酶混合物的部分一起添加。合适的混合物包含但不限于来自DyadicInternational(Jupiter,FL,USA)的可商购酶组合物Cellulase PLUS、Xylanase PLUS、BrewZyme LP、FibreZyme G200和NCE BG PLUS或来自Genencor(Rochester,NY,USA)的Optimash BG。
CBC可包含以下酶活性：
纤维二糖水解酶I：
Endo-1,4-beta-葡聚糖酶
Beta-葡糖苷酶
Endo-1,4-beta-木聚糖酶
Beta-木糖苷酶
Beta-L-阿拉伯呋喃糖苷酶
淀粉糖苷酶
Alpha-淀粉酶
乙酰木聚糖酯酶
当废料的组成对应于MSW模型底物(41％的部分I(植物来源的食物废料)，13％的部分II(动物来源的食物废料)和46％的部分III(纸盒、纸、木材和纺织品))，其模拟了来自北欧家庭的MSW的有机部分，可添加纤维素分解酶制剂以有效量为从约0.5到约10wt.％的固体，例如约1到约5wt.％的固体。在来自其他地理区域的MSW中，MSW的组合物可与模型底物不匹配，在这种情况下，应通过应用溶解度测试(诸如本文公开的测试)在合适的模型底物上测试酶性能，以便明确需要的酶的量以获得足够的增溶。
可添加的其他酶，例如除了CBC之外，如下面所列。
可用在步骤a)中的酶促降解处理中的细菌内切葡聚糖酶(endoglucanases)的示例包括但不限于以下的一种或多种：Acidothermus cellulolyticus内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；U.S.Patent No.5,275,944；WO 96/02551；U.S.Patent No.5,536,655；WO 00/70031；WO 05/093050)、Erwinia carotovara endoglucanase(Saarilahti etal.,1990,Gene 90:9-14)、Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。
可用在步骤a)中的酶促降解处理中的真菌内切葡聚糖酶的示例包含但不限于以下的一种或多种：Trichoderma reesei内切葡聚糖酶I(Penttila et al.,1986,Gene 45:253-263)、Trichoderma reesei Cel7B内切葡聚糖酶I(GenBank：M15665)、Trichodermareesei内切葡聚糖酶II(Saloheimo et al.,1988,Gene 63:11-22)、Trichoderma reeseiCel5A内切葡聚糖酶II(GenBank：M19373)、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶III(Okadaet al.,1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563,GenBank:AB003694)、Trichodermareesei内切葡聚糖酶V(Saloheimo et al.,1994,Molecular Microbiology 13:219-228,GenBank:Z33381)、Aspergillus aculeatus内切葡聚糖酶(Ooi et al.,1990,NucleicAcids Research 18:5884)、Aspergillus kawachii内切葡聚糖酶(Sakamoto et al.,1995,Current Genetics 27:435-439)、Fusarium oxysporum内切葡聚糖酶(GenBank:L29381)、Humicola grisea var.thermoidea内切葡聚糖酶(GenBank:AB003107)、Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GenBank:MAL515703)、Neurospora crassa内切葡聚糖酶(GenBank:XM_324477)、Humicola insolens内切葡聚糖酶V、Myceliophthorathermophila CBS117.65内切葡聚糖酶、Thermoascus aurantiacus内切葡聚糖酶I(GenBank:AF487830)、Trichoderma reesei strain No.VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GenBank：M15665)以及Penicillium pinophilum内切葡聚糖酶(WO 2012/062220)和由Aspergillus niger产生的内切葡聚糖酶。
可用在步骤a)中的酶促降解处理中的纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases)的示例包含但不限于以下的一种或多种：Aspergillus aculeatus纤维二糖水解酶II(WO2011/059740)、Aspergillus fumigatus纤维二糖水解酶I(WO 2013/028928)、Aspergillusfumigatus纤维二糖水解酶II(WO 2013/028928)、Chaetomium thermophilum纤维二糖水解酶I、Chaetomium thermophilum纤维二糖水解酶II、Humicola insolens纤维二糖水解酶I、Myceliophthora thermophila纤维二糖水解酶II(WO 2009/042871)、Penicilliumoccitanis纤维二糖水解酶I(GenBank:AY690482)、Talaromyces emersonii纤维二糖水解酶I(GenBank:AF439936)、Thielavia hyrcanie纤维二糖水解酶II(WO 2010/141325)、Thielavia terrestris纤维二糖水解酶II(CEL6A,WO 2006/074435)、Trichoderma reesei纤维二糖水解酶I、Trichoderma reesei纤维二糖水解酶II和Trichophaea saccata纤维二糖水解酶II(WO 2010/057086)。
可用在步骤a)中的酶促降解处理中的beta-葡糖苷酶(beta-glucosidases)的示例包含但不限于以下的一种或多种：来自Aspergillus aculeatus的beta-葡糖苷酶(Kawaguchi et al.,1996,Gene 173:287-288)、Aspergillus fumigatus(WO 2005/047499)、Aspergillus niger(Dan et al.,2000,J.Biol.Chem.275:4973-4980)、Aspergillus oryzae(WO 02/095014)、Penicillium brasilianum IBT 20888(WO 2007/019442和WO 2010/088387)、Thielavia terrestris(WO 2011/035029)和Trichophaeasaccata(WO 2007/019442)。
使用根据Henrissat,1991,Biochem.J.280:309-316，以及Henrissat andBairoch,1996,Biochem.J.316:695-696的归类，其他有用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和beta-葡糖苷酶在大量糖基水解酶家族(Glycosyl Hydrolase families)中公开。
任何“辅助活性9多肽(Auxiliary Activity 9polypeptide)”或“AA9”多肽可用作酶组合物的成分。
可用在步骤a)中的酶促降解处理中的beta-葡糖苷酶(beta-glucosidases)的示例包含但不限于以下的一种或多种：
可用在步骤a)中的酶促降解处理中的AA9多肽(AA9 polypeptides)的示例包括但不限于以下的一种或多种：来自Thielavia terrestris的AA9多肽(WO 2005/074647、WO2008/148131和WO 2011/035027)、Thermoascus aurantiacus(WO 2005/074656和WO 2010/065830)、Trichoderma reesei(WO 2007/089290和WO 2012/149344)、Myceliophthorathermophila(WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868和WO2009/033071)、Aspergillus fumigatus(WO 2010/138754)、Penicillium pinophilum(WO2011/005867)、Thermoascus sp.(WO 2011/039319)、Penicillium sp.emersoni(WO 2011/041397和WO 2012/000892)、Thermoascus crustaceous(WO 2011/041504)、Aspergillusaculeatus(WO 2012/125925)、Thermomyces lanuginosus(WO 2012/113340、WO 2012/129699、WO 2012/130964和WO 2012/129699)、Aurantiporus alborubescens(WO 2012/122477)、Trichophaea saccata(WO 2012/122477)、Penicillium thomii(WO 2012/122477)、Talaromyces stipitatus(WO 2012/135659)、Humicola insolens(WO 2012/146171)、Malbranchea cinnamomea(WO 2012/101206)、Talaromyces leycettanus(WO2012/101206)和Chaetomium thermophilum(WO 2012/101206)以及Talaromycesthermophilus(WO 2012/129697和WO 2012/130950)。
可用在步骤a)中的酶促降解处理中的蛋白酶的示例可源自诸如例如Bacillusamyloliquefaciens的芽孢杆菌属，诸如例如WO17076421中公开的由SEQ ID NO:1编码的蛋白酶，或具有与WO17076421中公开的SEQ ID NO:1至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
可用在步骤a)中的酶促降解处理中的脂肪酶的示例可源自诸如例如Thermomyceslanuginosus的嗜热菌属(genus Thermomyces sp.)，诸如例如WO17076421中公开的由SEQID NO:2编码的脂肪酶(或具有与WO17076421中公开的SEQ ID NO:2至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性)或源自腐质霉属(genus Humicola sp.)，诸如例如Humicola insolens的脂肪酶。
可用在步骤a)中的酶促降解处理中的beta-葡聚糖酶(beta-glucanases)的示例可源自曲霉属(genus Aspergillus)，诸如例如Aspergillus aculeatus的成员，诸如例如WO17076421中公开的由SEQ ID NO:4编码的序列编码的beta-葡聚糖酶或其同系物(例如，具有与WO17076421中公开的SEQ ID NO:4至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的beta-葡聚糖酶)。
可用在步骤a)中的酶促降解处理中的果胶酸裂合酶(pectate lyases)的示例可形成包括果胶酸裂合酶、木聚糖酶和纤维素酶活性，诸如例如Novozym 81243TM，的多成分酶组合物的一部分。
可用在步骤a)中的酶促降解处理中的甘露聚糖酶(mannanases)的示例可以是淀粉酶可以是源自根毛霉属(genus Rhizomucor)，诸如例如Rhizomucor pusillus的alpha-淀粉酶，诸如例如WO17076421中公开的由SEQ ID NO:5编码的alpha-淀粉酶或其同系物(例如，具有与WO17076421中公开的SEQ ID NO:5至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的alpha-淀粉酶)。
根据步骤a)的可选地与微生物发酵同时进行的废料的可生物降解部份的酶促加工可在高于20℃和高达75℃的温度下执行，导致废料的可生物降解部份的液化和/或糖化，以及糖和其他可溶性降解产物的积累。
根据加工步骤a)的方法可在20和75℃之间、30℃和70℃之间、40℃和65℃之间、45℃和65℃之间的温度下执行。
在本发明的方法的优选的实施方式中，加工步骤a)在20和75°之间C、30℃和70℃之间、40℃和60℃之间、45和55℃之间或50℃左右的温度下执行。
一个优选的温度范围是对于大多数当前合适的酶组合物来说的最佳温度，即在50℃–56℃之间，诸如53℃。另一优选的温度范围是其他合适的酶组合物的最佳温度，即在55℃–57℃之间。
在开始酶促加工之前调节诸如MSW的废料的温度能够是有利的。如本领域所熟知的，纤维素酶和其他酶一般呈现最佳温度范围。虽然从极端嗜热有机体中孤立出的酶的示例当然是已知的，其最佳温度接近于60℃或甚至是70℃，但酶的最佳温度范围一般落在35℃到55℃的范围内。酶促加工可在30℃到35℃、或35℃到40℃、或40℃到45℃、或45℃到50℃、或50℃到55℃、或55℃到60℃、或60℃到65℃、或65℃到70℃、或70℃到75℃的温度范围内进行。
如本文所使用，诸如MSW的废料被加热到的温度是诸如MSW的废料在反应器内达到的最高平均温度。最高平均温度可不一定在整个期间都保持。加热反应器可包括不同的领域，使得加热以不同的温度分阶段发生。可使用其中进行酶促加工的同一反应器实现加热。加热的目的仅仅是使多数纤维素废料和相当大部分植物废料处于对于酶促加工来说最佳的条件下。为了处于对于酶促加工来说最佳的条件，废料应理想地具有适合于用于酶促加工的酶活性的温度和水含量。
在加热期间搅拌以达到均匀加热的废料能够是有利的。搅拌进一步实现机械能的引入以在废料和废料混合中创造剪切力。搅拌可包括自由落体混合，诸如在以下中混合：在具有沿基本水平轴线旋转的室的反应器中或在具有提升诸如MSW的废料的旋转轴的混合器中或在具有提升诸如MSW的废料的水平杆(shafts)或桨叶的混合器中。搅拌可包括摇动、搅动或通过输送螺旋输送器输送中一个的或多个。在诸如MSW的废料已被加热到期望温度之后，可继续搅拌。
步骤a)中的生物反应器可适配为处理多于1；5；10；15；20；25；30；35；40；45或50t废料/h。
本发明的方法可应用于任何厂大小。其已在实验室测试中进行了小规模测试，在测试厂和大型废料处理厂进行了中等规模测试。在一个实施方式中，在操作期间，步骤a)中的生物反应器的填充体积大于10、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500m3，且能够更加大，诸如6000m3，并且适用于每小时处理超过5、10、15、20、25、30、35、40、45或50吨废料的厂。
废料，例如MSW，的干物质(DM)含量可在10％–90％；20％–85％；30％–80％；40％–75％；50％–70％；或55％–65％(w/w)的范围内；和/或10％；15％；20％；25％；30％；35％；40％；45％；50％；55％；60％；65％；70％；75％；80％；85％；或90％(重量/重量)左右。步骤a)中的添加水量取决于废料的干物质含量，当干物质含量低时，到步骤a的处理的需要的水添加也低。当干物质含量高于XX％时，需要添加水到处理a)。到步骤a)的处理的水添加可总是有益的，并且常常，由于废料中的干物质含量，到步骤a)的处理的水添加是必要的。在本发明的上下文中，至少部分添加到步骤a)的水是处理水。
在本发明的一个实施方式中，干物质含量的量高于60％，诸如至少70％，诸如至少75％，诸如至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少97％，诸如至少98％或甚至诸如至少99％的干物质。
干物质可如下测量：通过添加1.5g矿物基(耐热)垫，例如猫垫。在550℃的炉中加热1小时，然后在使用金属舌将坩埚转移到填充有硅胶的干燥器中之前允许冷却到200℃。允许冷却到室温。称量坩埚Wcrucible并添加25g样品以及重新称量并记下重量Wsample。将坩埚放在合适的托盘上并放到预热好的烤箱中，并且在105℃下加热24小时。从烤箱中取出坩埚并将其返回干燥器中。当冷却到室温时，称量坩埚加上内容物并记下重量Wdry。干物质(DM)计算为DM＝((Wdry–Wcrucible/Wsample–Wcrucible)*100)。
废料的DM含量可在不同的时间点确定。可在以下情况测量或评估废料的DM含量：(i)在进入步骤a)中的生物反应器之前，诸如在废料坑或转运站中；(ii)在进入步骤a)中的生物反应器的废料的所述酶促和/或微生物加工开始时；和/或(iii)在通过一个或多个固/液分开步骤提供步骤a)中获得的生物液体之前。
因此，可在以下时间点中的一个或多个测量或评估废料的DM含量：(i)在进入步骤a)中的生物反应器之前；ii)在进入步骤a)中的生物反应器的废料的所述酶促和/或微生物加工开始时；(iii)在通过一个或多个固/液分开步骤提供步骤a)中获得的生物液体之前。
作为一个实际问题，尽管被处理的废料的组合物中有一些变化，但在步骤a)中加入相对恒定质量比的水(包括水溶液)是方便的。例如，当待加工的废料是城市固体废料(MSW)时，每kg MSW添加在0.8和1.8kg之间的水，或每kg MSW添加在0.5和2.5kg之间的水，或每kg MSW添加在1.0和3.0kg的水将是方便的。因此，处理期间废料(或MSW)的实际非水含量可在适当范围内变化。
为了对在步骤a)中的生物反应器中的废料进行酶促和/或微生物液化以提供包括最佳量的短链羧酸和糖，诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乳酸/乳酸盐、乙酸/乙酸盐和/或乙醇的生物液体，生物反应器中的pH一般应保持在pH 3–6.5之间的pH范围内。
步骤b)
步骤b)是分开步骤，其中，将生物液体从不可降解的固体废料部分分开。清洁和有效地使用诸如MSW的废料中的可降解成分，与回收的结合一般需要一些分类或分开方法，以将可降解材料从不可降解材料分开。步骤b)中的分开可通过本领域已知的任何方式执行，诸如在弹道分开器、洗涤滚筒和/或液压机中。在一个实施方式中，分开在酶促加工之前执行。液体和固体的分开可例如在不同的压力机(诸如螺旋压力机和/或活塞压力机)中完成，或者例如使用更简单的筛选功能。弹道分开器一般用于将固体分开成2D和3D部分，并且仅次要地分开液体。
步骤b)可在生物反应器中的酶促和/或微生物加工之前、期间或之后进行一次或多次，其中，在一个实施方式中，所述步骤b)，在酶促和/或微生物加工被进行期间可发生在生物反应器中的所述酶促加工之后但所述微生物处理之前。
可通过多种方式实现将废料的液化和/或糖化、可发酵部份从不可发酵固体分开。使用一个分开操作或至少两个不同的分开操作的组合是适用的，该分开操作包含但不限于螺旋压力机操作、弹道分开器操作、振动筛操作或本领域已知的其他分开操作。
分开一般通过一个或多个分开步骤装置执行，这可示例性地由一个或多个弹道分开器、筛子、洗涤滚筒、压力机和/或液压机的那些执行。所述一个或多个分开装置将废料(诸如经过酶和/或微生物作用加工的MSW)分开成生物液体、一部分不可生物降解的2D材料(诸如纺织品、塑料薄膜、未消化的纸板的平面材料)和一部分3D材料(包含金属和固体塑料)。一般从生物液体中移除例如筛分为沙子和玻璃的惰性材料。一般从所有提到的部分中移除金属。从源自步骤a)的固体废料的这些下游处理中的一个或多个获得的处理水，即从洗涤滚筒获得的洗涤水可再循环到根据本发明的方法中的步骤a)中。
步骤c)
在步骤c)中，进一步处理在步骤b)中获得的生物液体和/或固体部分。生物液体一般被进一步处理以适于在用以提供能量或生物化学的方法中使用，此类方法包含将增溶的废料热化学转化为电、热、甲醇、氢气、二甲醚、石油、生物柴油和/或将增溶的废料生化转化为沼气、氢气、生物乙醇、生物柴油等。
离开生物反应器的一个或多个固体部分一般在固体废料的任何后续再使用处理之前经受一个或多个洗涤步骤。
步骤b)中获得的固体部分的2D部分可进一步分开成可回收物和/或残余物，诸如SRF(固体回收燃料)、RDF(拒绝衍生燃料)和/或惰性物。3D部分还可进一步分开成可回收物和/或残余物，诸如金属、3D塑料和/或RDF。
3D部分(诸如罐头和塑料瓶)不会粘合(bind)大量生物液体，因此单个洗涤步骤常常足以清洁3D部分。2D部分(例如纺织品和箔)一般会粘合大量的生物液体。因此，一般使用例如螺旋压力机按压、清洗并再次按压2D部分以优化生物液体的回收并获得更清洁和更干燥的2D部分。
洗涤水是用于洗涤在步骤b)中固液分开之后获得的任何固体部分的任何水流。洗涤水的示例是用于洗涤2D部分和/或3D部分的水。洗涤水的其他示例是用于洗涤惰性物、金属和/或塑料的水。洗涤水也可以是从根据本发明的方法中的步骤a)得到的稀释的生物液体。在一个实施方式中，洗涤水是用于洗涤2D和/或3D部分的水。
在本发明的方法的一个优选的实施方式中，步骤c)中的下游处理是固体废料的洗涤处理，诸如2D固体废料部分或3D固体废料部分的洗涤。来自固体废料的不同下游洗涤处理的水可被合并以提供如图1a所示的处理水。
在本发明的方法的另一优选的实施方式中，步骤c)中的下游处理是蒸发处理，其中，来自脱水消解物的水(例如来自AD处理的水)或来自另一下游处理的水被蒸发和收集。处理水，例如在蒸发器系统中加工的废水或洗涤水将产生干净的水冷凝物和称为盐水的富含营养的液体。也是根据本发明处理水定义的清洁水可在2D和3D机械废料加工阶段中再使用以洗涤回收的材料或可再循环回到反应器。
在本发明的另一优选的实施方式中，步骤c)中的下游处理是收集步骤b)中获得的生物液体或部分生物液体。
在一个优选的实施方式中，步骤c)中生物液体的进一步处理是厌氧消化(AD)。厌氧消化(AD)是系列生物处理，其中，微生物在没有氧气的情况下分解可生物降解的材料。最终产物中的一个是沼气，其可被燃以生成电力和/或热量，或者可处理成可再生的天然气、生物甲烷气体和/或运输燃料。现有技术中存在各种用于转化废料，诸如城市固体废料、城市污水固体、食物废料、高强度工业废水和残留物、脂肪、油和油脂(FOG)以及各种其他有机废料流成沼气的厌氧消化技术。许多不同的厌氧消解器系统是可商购的，并且技术人员将熟悉如何应用和优化厌氧消化处理。参与厌氧消化的微生物群落的代谢动力学是复杂的。
在用于生产甲烷沼气的典型厌氧消化(AD)中，由微生物介导的生物处理实现了四个主要步骤-将生物大分子水解成组成单体或其他代谢物；酸生成，由此产生短链烃酸和醇；乙酸生成，由此将可用营养物质分解代谢为乙酸、氢气和二氧化碳；以及甲烷生成，由此乙酸和氢被特定的古细菌分解代谢为甲烷和二氧化碳。水解步骤一般是限速的并且取决于生物质类型。在生物液体中，产甲烷生物限制了处理速率。从AD中还获得消解物，包括固体部分和液体部分(废水)。
在本领域中熟知的，在厌氧消化处理之后的酶促和/或微生物处理期间，三大类微生物有助于可生物降解的有机材料例如在废料中到CH4和CO2的转化。发酵微生物通过例如通过细胞外酶的水解和水解产物的后续发酵将有机物质转化为短链脂肪酸(诸如乳酸)。发酵处理的其他产物是乳酸、醇、CO2和H2。来自发酵和产酸菌的最终产物(乳酸、甲酸、乙酸和H2)通过产甲烷的微生物转化为CH4和CO2。产甲烷的微生物包括属于古细菌域的微生物。
当步骤c)中的进一步处理是厌氧消化时，厌氧消化可包括在受控曝气条件下操作的一个或多个消解器，消除或最小化可用氧气，其中，在包括该系统的消解器的每一个中产生甲烷气体。AD反应器可但不必是与步骤a)中的生物反应器相同的废料处理厂的一部分，并且可但不必连接到步骤a)中的生物反应器。此外，AD处理可以是固定过滤系统的形式。固定过滤器厌氧消化系统是其中厌氧消化聚生体，可选地在生物膜内，被固在物理支持基质上的系统。
在本发明的方法的一个优选的实施方式中，步骤c)中的下游处理是厌氧消化，其提供厌氧消化流出物，产生来自消解物脱水的废水。
由于处理水可包括微生物，因此可期望在步骤a)中将处理水再循环到生物反应器内之前，消毒处理水。以下可以例如是这种情况：如果从消解物中获得处理水，即废水，其中微生物菌群不同于生物反应器中的微生物菌群。
在本发明的方法的一个实施方式中，在步骤c)中获得的处理水在经受步骤d)之前经受卫生化。
可附加地，可将处理水分批添加到反应器以将pH保持在3.5–6内。
在本发明的方法的一个实施方式中，将步骤c)中获得的处理水分批添加到步骤a)中，使得反应器中的pH在pH 3.5–6之间。
卫生化是指将参考有机体浓度降低至少6个十进位的任何处理，并且也可通过热处理、过滤、紫外线处理、通电、在50℃下加工超过一小时等的方式实现。动物副产品协议(EU Regulation No 142/2011)描述了在70℃下卫生化60分钟。
在一个实施方式中，本发明的方法包括卫生化步骤，其中，步骤c)中获得的处理水经受卫生化。在优选的实施方式中，卫生化包括在60℃到75℃的范围中，优选地70℃或优选地70℃左右的温度下加工处理水至少一个小时，优选地60–80分钟，优选地60–70分钟或优选地约60分钟。
由于消解物中盐量以及由于消解物中微生物有机体的存在，预计废水的添加主要会对生物反应器中的酶促和/或微生物加工产生负面影响。然而，令人惊奇的是，包括废水的处理水已示出不会减少反应器中的液化处理，并因此此类水可在本发明的处理期间连续地循环。
步骤d)
在步骤d)中，将从步骤c)中获得的处理水和可选地来自外部水源的水添加到步骤a)中的生物反应器中。
来自外部水源的水可在添加到生物反应器中之前与处理水混合，或者处理水和来自外部水源的水可同时或在不同的时间点分开地添加并且添加可以是连续或以不同频率和体积的，这取决于生物反应器中废料的量和废料的组合。
来自外部来源的水包含从任何来源获得的水，其中，所述水之前没有经受酶促和/或微生物废料加工处理中的任何步骤。因此，来自外部来源的水包括自来水、未经受酶促和/或微生物废料加工处理的废水，以及来自诸如河流和湖泊的天然来源的水。
在本发明的方法的一个实施方式中，步骤d)中的外部水源选自以下：诸如河流、湖泊和池塘的天然来源；水库；自来水；及其任何组合。
如果处理水的pH不在步骤a)中液化处理的最佳pH范围内，则处理水和可选地来自外部来源的水的pH能够可选地通过任何已知的方式，诸如通过添加酸或碱来调节。
在一个实施方式中，通过添加酸来调节处理水的pH直到处理水的pH在pH 3.5–6之间，诸如pH 3.5、pH 4、pH 4.5、pH 5、pH 5.5和pH 6或在这些pH值之间的任何pH值。
可使用任何酸来调节pH。优选地，酸是有机酸，因为此类酸不太可能在再循环回路中积累水溶性盐。
如果处理水和可选地来自外部来源的水的pH低于pH 3，则可通过添加碱将处理水的pH调节到pH 3.5–6。
当处理水由AD处理提供时，处理水(即废水)的pH可通过降低氨浓度来调节。氨浓度的降低可能是唯一的pH调节，或者氨浓度的降低可能是除了通过添加酸调节pH之外的。
用以降低氨浓度的方式可以是本领域可用的任何合适的方式。
在本发明的方法的一个实施方式中，步骤c)中的下游处理是厌氧消化处理，并且在步骤a)中被添加到生物反应器之前，废水的pH通过添加酸和/或通过降低铵含量来调节。例如可借助于蒸发或通过使用特定的铵提取设备来降低铵含量。
在本发明的一些实施方式中，处理水和可选地来自一个或多个外部来源的水连续进入生物反应器且进行废料的酶促和/或微生物处理。
在本发明的其他实施方式中，处理水和可选地来自一个或多个外部来源的水不连续地进入生物反应器且进行废料的酶促和微生物处理。即，处理水和可选地来自外部来源的水在需要时进入生物反应器，可选地经受存在于生物反应器中的生物液体的监测pH。在本发明的一个实施方式中，处理水分批添加到步骤a)，使得反应器中的pH在pH3.5–6之间。因此，即使在添加处理水时，pH也保持在pH 3.5–6的最佳范围内。
正如本领域技术人员容易理解的那样，将固体组合物变成液体浆料的能力随着水含量的增加而增加。例如，在一些国家占MSW的相当大部分的纸张和纸板的有效制浆是一般在水含量增加的情况下被改善。水含量提供了微生物制剂可在其中繁殖并溶解代谢物的介质。此外，当加工在低水含量的条件下进行时，酶活性可呈现出降低的活性。例如，纤维素酶一般在非水含量高于约以重量的10％的加工混合物中呈现出降低的活性。对于降解纸张和纸板的纤维素酶的情况，在底物浓度与来自每克底物的酶促反应的产量之间存在有效的线性反比关系，参见Kristensen et al.2009。
待处理废料，诸如例如在一个优选的实施方式中，MSW的非水含量可在高于10％或更高和低于45％之间。在另一优选的实施方式中，待处理废料的水含量可为40–85％。诸如MSW的废料常常可包括大量的水。然而，可调节水含量以便达到适当的非水含量。
在本发明的方法的一个实施方式中，在步骤d)中将处理水和可选地来自外部来源的水添加到步骤a)中的生物反应器中的流率基本上恒定和/或基本上与废料量成比例，该废料具有在1:1和3:1之间的水:废料比例。
在步骤c)中的下游处理是提供消解物或其碱性部分的AD处理的情况下，由消解物脱水产生的废水将包括参与AD处理的微生物。
此处已令人惊奇地发现，添加包括在步骤c)中获得的废水的处理水，其中，废水在进入步骤a)中的生物反应器之前未经受卫生化不会取消继续的液化处理。
因此，在根据本发明的方法的一些实施方式中，在步骤c)中获得的废水包括来自厌氧消化的产甲烷微生物，诸如古细菌。
同样，在根据本发明的方法的一些实施方式中，在步骤d)中在将包括在步骤c)中获得的废水的处理水添加到生物反应器之前，废水未经受卫生化步骤。
在根据本发明的方法的一些实施方式中，在步骤d)中，步骤c)中获得的废水中包括的产甲烷微生物在将包括步骤c)中获得的废水的处理水添加到的酶促和/或微生物处理后被消灭。
在废料的酶促和/或微生物处理之前和/或期间，可在步骤d)中不同时间点连续或不连续地将处理水和可选地来自外部来源的水添加到生物反应器。优选地，步骤d)中当处理水和可选地来自外部来源的水进入生物反应器时，步骤a)中的加工处于稳定状态。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，在废料的酶促和/或微生物加工开始之前，在步骤d)中将处理水和可选地来自外部来源的水添加到所述生物反应器。
在根据本发明的方法的另一实施方式中，在废料的酶促和/或微生物处理期间，在步骤d)中将处理水和可选地来自外部来源的水添加到所述生物反应器。
在根据本发明的方法的又一实施方式中，在废料的酶促和/或微生物加工之前和期间，在步骤d)中将处理水和可选地来自外部来源的水添加到所述生物反应器。
本领域技术人员将能够容易地确定适当量的水含量，以添加到废料中以调节其中发生酶促和/或微生物降解的生物反应器中的水含量，诸如在本发明的步骤a)中。一般，作为实际问题，尽管正在处理的废料的组合物存在一些可变性，但添加相对恒定质量比的水(包含水溶液)是方便的。例如，当待加工的废料是城市固体废料(MSW)时，每kg MSW添加在0.8和1.8kg的水，或在0.5和2.5kg的水，或在1.0和3.0kg的水将是方便的。因此，在处理期间，废料(或MSW)的实际非水含量可在适当的范围内变化，例如在高于10％或更高和低于45％之间。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，步骤d)中处理水和可选地来自外部来源的水进入生物反应器的流率基本上恒定和/或基本与进入所述生物反应器的废料量成比例。
添加到生物反应器的洗涤水、生物液体或自来水/纯化水的量与步骤c)中获得的处理水一起或附加于步骤c)中获得的处理水都取决于废料的成分，诸如干物质含量和有机物相对于无机物或不可生物降解物的比率，以及处理水的盐和微生物含量。因此，在根据本发明的方法的实施方式中，在步骤d)中被添加到所述废料中超过1.0、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98％(w/w)的水的是处理水，可选地包含来自外部来源的水。
在步骤c)中获得的处理水与来自外部来源的水之间的比率将必须针对具体的废料和处理水的组合物进行优化。然而，这对于使用常规测试来确定废料的DM和对于确定处理水的盐浓度和处理水中的微生物活性水平的技术人员来说应该是可能的。因此，在根据本发明的方法的实施方式中，步骤c)中获得的处理水与来自外源来源的水的比率在0.01-0.1；0.1-0.25；0.25-0.50；0.50-1.0；1.0-2.0；2.0-4.0；4.0-6.0；6.0-8.0；8.0-10；10-20、20-40；40-60；60-80；或90-100的范围中。
步骤c)获得的进入步骤d)中的生物反应器的处理水的干物质(DM)含量取决于步骤b)中执行的具体分开步骤和处理水在进入生物反应器之前的不溶物质含量。在根据本发明的方法中，优选地步骤c)中获得的处理水具有以下的DM含量(w/w％)：1.0或更高；1.5或更高；2.0或更高；2.5或更高；3.0或更高；3.5或更高；4.0或更高；4.5或更高；5.0或更高；5.5或更高；6.0或更高；6.5或更高；7.0或更高；7.5或更高；或8.0或更高。
类似地，在步骤c)中获得的进入步骤d)中的生物反应器的处理水的盐含量取决于在步骤a)中加工的废料的组合物、所应用的具体洗涤和分开步骤以及处理水在进入生物反应器之前的不溶物质含量。在根据本发明的方法中，步骤c)中获得的处理水可具有以下有机盐含量和/或无机盐含量(w/w％)：1.5或更少；3或更少；4.5或更少；6或更少；7.5或更少；9或更少；10.5或更少；12或更少；13.5或更少；15或更少；16.5或更少；18或更少；19或更少；19.5或更少；或20或更少。
在根据本发明的方法中，步骤c)中获得的处理水可包括盐，诸如铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐、氯化物、钠、钾、硫酸盐、铁、钙、碳酸盐、碳酸氢盐、镁或其他盐中的一种或多种。
在一个实施方式中，在根据本发明的方法中，在步骤c)中获得的处理水包括以下元素中的一种或多种：高达3800mg-N/kg-FW氨/铵；高达4700mg-N/kg-FW氮；高达280mg-P/kg-FW磷；高达3300mg/kg-FW水溶性氯；高达3300mg/kg-FW水溶性钠；高达2900mg/kg-FW钾；高达430mg/kg-FW硫；高达590mg/kg-FW铁：高达6000mg/kg-FW钙；高达3mg/kg-FW镍；高达3mg/kg-FW铅；高达3mg/kg-FW锌。
在另一实施方式中，在根据本发明的方法中，在步骤c)中获得的处理水包括以下元素中的一种或多种：高达800 0mg-N/kg-FW氨/铵；高达10000mg-N/kg-FW氮；高达600mg-P/kg-FW磷；高达7000mg/kg-FW水溶性氯；高达7000mg/kg-FW水溶性钠；高达6000mg/kg-FW钾；高达900mg/kg-FW硫；高达1200mg/kg-FW铁：高达12000mg/kg-FW钙；高达6mg/kg-FW镍；高达6mg/kg-FW铅；高达6mg/kg-FW锌。
根据本发明的方法已经证明在步骤a)中的生物反应器较小的小规模实验中以及在大规模废料处理反应器中都是有效的。相应地，在根据本发明的方法的一个实施方式中，操作期间，步骤a)中生物反应器的填充体积大于10；50；100；150；200；250；300；350；400；450；或500m3。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，步骤a)中的生物反应器适配为处理多于5；10；15；20；25；30；35；40；45；或50t废料/h。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，其中废料，例如MSW，的DM含量在以下范围内：10–90；20–85；30–80；40–75；50–70；或55–65％(w/w)；和/或10；15；20；25；30；35；40；45；50；55；60；65；70；75；80；85；或90％(w/w)左右。
废料的DM含量可在不同的时间点确定。在根据本发明的方法中，废料的DM含量可在以下情况测量或评估：(i)在步骤a)中进入生物反应器之前。(ii)在步骤a)中进入生物反应器的废料的所述结合的酶促和微生物加工开始时；和/或(iii)在通过一个或多个固/液分开步骤提供步骤a)中获得的生物液体之前。
在一个实施方式中，废料的DM含量在以下情况测量或评估：(i)在步骤a)中进入生物反应器之前。
在一个实施方式中，废料的DM含量在以下情况测量或评估：(ii)在步骤a)中进入生物反应器的废料的所述酶促和/或微生物加工开始时。
在一个实施方式中，废料的DM含量在以下情况测量或评估：(iii)在通过一个或多个固/液分开步骤提供步骤a)中获得的生物液体之前。
在一个实施方式中，在以下一个或多个时间点测量或评估废料的DM含量：(i)在步骤a)中进入生物反应器之前)；ii)在步骤a)中进入生物反应器的废料的所述酶促和/或微生物加工开始时；(iii)在通过一个或多个固/液分开步骤提供步骤a)中获得的生物液体之前。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，步骤c)中获得的废水或其碱性部分通过使用诸如WO2016/050893或WO2017/174093中公开的消解器提供。
废料
任何包括可生物降解和不可生物降解材料的混合物的废料都可在本发明的方法中使用。
在一个实施方式中，在根据本发明的方法中，废料包括可生物降解和不可生物降解材料两者。
在根据本发明的方法的优选的实施方式中，所述废料选自以下中的一种或多种：未分类的城市固体废料、集中分类的城市固体废料、来自家庭的来源分类的城市固体废料、通过切碎或制浆处理的城市固体废料、有机部分和富纸张部分、废料衍生燃料部分和城市固体废料，其中，所述废料中的可生物降解材料包括选自以下的一种或多种项目的组合：食物残渣、纸张、纸板和细屑。
适合于通过根据本发明的步骤a)中的酶促和/或微生物加工进行处理的相关类型的含单糖和/或多糖的废料可包含：
来自家庭的废料部分，诸如：
·未分类的城市固体废料(MSW)
·在一些集中分类、切碎或制浆装置中处理的MSW，诸如例如或
·从家庭中分类的固体废料，包含有机部分和富纸张部分两者
·RDF(废料衍生燃料)部分
来自工业的废料部分，诸如例如：
·含有纸张或其他有机部分的一般工业废料部分，现作为家庭废料被加工
·来自造纸业的废料部分，例如来自回收设施
·来自食品和饲料行业的废料部分
·来自医药行业的废料部分
来自农业或农场相关部门的废料部分，诸如例如：
·来自处理的废料部分，包含富含糖或淀粉的制品，诸如土豆和甜菜
·受污染或以其他方式变质的不能用作食物或饲料的农产品，诸如谷物、土豆和甜菜，
·园艺废弃物
·粪便或粪便衍生制品
来自城市、县或州相关或受监管活动的废料部分，诸如例如：
·来自污水加工厂的污泥
·来自沼气处理的纤维或污泥部分
·来自公共部门的一般废料部分，含有纸张或其他有机部分。
在一个实施方式中，在步骤a)中酶促处理和发酵处理中含单糖和/或多糖的废料部分的干物质含量高于20％，诸如20–100％，诸如20–50％，诸如20–45％，诸如20–40％和诸如20–80％以及还诸如80–100％，优选地90–100％，最优选地约95％。
废料，诸如MSW，一般是异质性的。为各国之间关于废料成分的比较提供坚实基础的统计数据并不被广泛地知道。用于正确采样和表征的标准和操作程序仍未标准化。事实上，只有少数标准化的采样方法被报道过。至少就家庭废料而言，即使在200-300km的小距离内，其成分也呈现出季节性和地理差异。作为一般规则，来自西欧的现代城废料的干重一般包括约以重量从10到25％的“蔬菜和食物废料”。
城市固体废料尤其可包括以下中的一种或多种：厨房易腐烂、园艺易腐烂、纸张、卡片、塑料、各种可燃和不可燃物质、纺织品、玻璃、陶瓷、金属和电子装置。一般来说，世界西部地区的城市固体废料常常包括以下的一种或多种：动物食物废料、植物食物废料、新闻纸、杂志、广告、书籍和电话簿、办公用纸、其他清洁纸、纸和纸盒容器、其他纸板、牛奶盒等、果汁盒和其他铝箔纸盒、厨房纸巾、其他脏纸、其他脏纸板、软塑料、塑料瓶、其他硬塑料、不可回收塑料、庭院废料、鲜花等、动物和排泄物、尿布和卫生棉条、棉签等、其他棉花等、木材、纺织品、鞋、皮革、橡胶等、办公用品、空化学瓶、塑料制品、烟头、其他可燃物、吸尘器袋、透明玻璃、绿色玻璃、棕色玻璃、其他玻璃、铝容器、铝托盘、铝箔(包含蜡烛箔)、金属容器(-Al)、金属箔(-Al)、其他金属、土壤、岩石、石头和砾石、陶瓷、猫砂、电池(纽扣电池、碱、温度计等)、其他不可燃物和细屑。
可在本发明中处理的废料可以是分类或未分类的。
在一个实施方式中，步骤a)中经受结合的酶促和微生物加工的废料是未分类的废料，诸如未分类的MSW。
在另一实施方式中，步骤a)中经受结合的酶促和微生物加工的废料是分类的MSW。
在本发明的一优选的实施方式中，步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料是MSW。
一般，未分类的MSW可包括有机废料，包含以下中的一种或多种：食物和厨房废料；含纸和/或纸板的材料；可回收材料，包含玻璃、瓶子、罐头、金属和某些塑料；可燃材料；以及惰性材料，包含陶瓷、岩石和碎片。
步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料，诸如MSW能够是来源分开的有机废料，主要包括水果、蔬菜和/或动物废料。各种不同的分类系统可适用于MSW，例如来源分类，其中，每个家庭分开处理不同的废料材料。来源分类系统目前在奥地利、德国、卢森堡、瑞典、比利时、荷兰、西班牙和丹麦的一些城市中就位。可替代地，在让废料经受结合的酶促和微生物加工之前，可在大型厂应用工业分类系统。机械分类和分开的方式可包含本领域已知的任何方法，包含但不限于US2012/0305688；WO2004/101183；WO2004/101098；WO2001/052993；WO2000/0024531；WO1997/020643；WO1995/0003139；CA2563845；US5465847中描述的系统。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料来源于以下情况或包括来源于以下情况中的一种或多种的废料：家庭、工业、农业、农场、县或州活动。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料包括以干基的10–100％的可生物降解材料。在根据本发明的方法的另一实施方式中，步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料包括以干基的10–20％的可生物降解材料，以干基的20–30％的可生物降解材料，
以干基的30–40％的可生物降解材料，以干基的40–50％的可生物降解材料，
以干基的50–60％的可生物降解材料，以干基的60–70％的可生物降解材料，
以干基的70–80％的可生物降解材料，以干基的80–90％的可生物降解材料，
以干基的90–100％的可生物降解材料，或这些区间的任意组合。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料包括以干基的20–30％的可生物降解材料。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料包括以干基的10–100％的可生物降解材料。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料包括以湿基的25–60％，诸如35–50％的可生物降解材料。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料选自以下中的一种或多种：未分类的城市固体废料、集中分类的城市固体废料、来自家庭的来源分类的城市固体废料、通过切碎或制浆处理的城市固体废料、有机部分和富纸张部分、废料衍生燃料部分。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料中的可生物降解材料包括选自以下的一种或多种项目的组合：食物残渣、纸、纸板和细屑。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料是分类的城市固体废料，不包括选自以下中的一个或多个的项目：家用电器、玻璃、陶瓷、电池、新闻纸、杂志、广告、书籍、塑料、织物、纺织品、庭院废料、电气和电子设备、化学品、药品、金属。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，在步骤a)中的酶促和/或微生物加工之前，从废料中移除以下项目的组中的一个或多个：树叶、草、木材、织物、石头、塑料、金属。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料选自以下中的一种或多种：含有纸或其他有机部分的一般工业废料部分、来自造纸行业或回收设施的废料部分、来自食品和饲料行业的废料部分、来自医药行业的废料部分。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，在步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料选自以下中的一种或多种：农业或农场、来自富含糖或淀粉的制品的处理的废料部分、受污染或变质的不能用作食物或饲料的农产品、粪便、粪便衍生制品。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，步骤a)中经受酶促和/或微生物加工的废料选自以下中的一种或多种：来自城市、县或州相关或受监管活动的废料部分、来自污水加工厂的污泥、来自沼气处理的纤维或污泥部分、来自公共部门的含有纸张或其他有机部分的一般废料部分。
总之，本文示出，以便保持由废料产生的生物液体处于稳定状态，其中，酶促和/或微生物处理两者都是活跃的并且优化了保留时间和相应的成本，处理水和可选的来自外部来源的水可添加到生物反应器中。这是令人惊讶的，因为在使用自来水(如一般在废料的结合的酶促和微生物液化中完成)和处理水(诸如从包括大量盐、其他可溶物和活微生物的消解物中获得的废水)之间的差异，预计会很大。然而，本文公开的示例令人惊讶地示出，当处理水被添加到生物反应器时，产生作为例如AD沼气生产的进料所需的有价值的有机酸的酶活性和微生物活性在生物反应器中得到维持。
编号的实施方式
本发明的相关实施方式也可在以下段中找到，称为“编号的实施方式”。
1.用于连续或分批处理废料的方法，包括：
a)使废料在生物反应器中经受酶促和/或微生物加工
b)使来自步骤a)的加工的废料经受一个或多个分开步骤，从而提供生物液体和固体部分；
c)使所述生物液体和/或固体部分经受下游处理，其提供处理水；
d)添加从步骤c)中获得的处理水和可选地来自外部水源的水到步骤a)中的生物反应器。
2.根据实施方式1的方法，其中，步骤c)中的提供所述处理水的下游处理选自以下中的一个或多个：厌氧消化处理、固体废料部分的洗涤、生物液体的蒸发和收集。
3.根据实施方式1的方法，其中，处理水来自厌氧消化处理和/或固体废料部分的洗涤。
4.根据前述实施方式的方法，其中，在步骤c)之前将步骤c)中获得的处理水的pH调节到在3.5和6之间。
5.根据前述实施方式的方法，其中，步骤c)中的下游处理是提供废水的厌氧消化处理。
6.根据实施方式5的方法，其中，通过添加酸和/或通过降低铵含量将废水的pH调节到在3.5和6之间。
7.根据实施方式5或6的方法，其中，从所述厌氧消化处理中获得的处理水在经受步骤d)之前经受卫生化。
8.根据前述实施方式的方法，其中，将处理水分批添加到步骤a)，使得反应器中的pH在pH 3.5–6之间。
9.根据前述实施方式的方法，其中，步骤d)中的外部水选自从以下获得的水：诸如河流、湖泊和池塘的天然来源；水库；自来水及其任意组合。
10.根据前述实施方式的方法，其中，步骤a)中生物反应器的填充体积在操作期间大于10、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500m3，并且其中，该生物反应器适配为每小时处理超过5、10、15、20、25、30、35、40、45或50吨的废料。
11.根据前述实施方式的方法，其中，所述废料选自未分类的城市固体废料、集中分类的城市固体废料、来自家庭的来源分类的城市固体废料、通过切碎或制浆处理的城市固体废料、有机部分和富纸张部分、废料衍生燃料部分或城市固体废料，其中，所述废料中的可生物降解材料包括选自以下中一种或多种项目的组合：食物残渣、纸张、纸板或细屑。
12.根据前述实施方式的方法，其中，步骤a)中的所述酶促和/或微生物处理利用以下来执行：通过添加酶，其以天然形式或以引起此类酶表达的微生物有机体的形式被供应，和/或通过存在于废料中的细菌和可选地通过添加标准的、培养的或操纵的酵母、细菌或任何其他能够产生生化品、乙醇或沼气的微生物。
13.根据前述实施方式的方法，其中，步骤a)中的加工包括使废料与浓度至少为1.0×106、1.0×107、1.0×108、或1.0×109CFU/L的活乳酸菌接触。
14.根据前述实施方式的方法，其中，步骤a)中的加工包括以1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109或1.0×1010CFU/L的浓度添加微生物到废料。
15.根据前述实施方式的方法，其中，加工步骤a)以在20和75℃之间、30℃和70℃之间、40℃和60℃之间、45和55℃之间或50℃左右的温度执行。
16.根据前述实施方式的方法，其中，在步骤d)中将处理水和可选地来自外部来源的水添加到步骤a)中的生物反应器中的流率基本上恒定和/或基本上与废料量成比例，所述废料具有在1:1和3:1之间的水:废料比例。
17.根据前述实施方式的方法，其中，所述废料选自未分类的城市固体废料、集中分类的城市固体废料、来自家庭的来源分类的城市固体废料、通过切碎或制浆处理的城市固体废料、有机部分和富纸张部分、废料衍生燃料部分或城市固体废料，其中，所述废料中的可生物降解材料包括选自以下中一种或多种项目的组合：食物残渣、纸张、纸板或细屑。
18.根据前述实施方式的方法，其中，步骤a)中的所述酶促和/或微生物处理利用以下来执行：通过添加酶，其以天然形式或以引起此类酶表达的微生物有机体的形式被供应；以及通过存在于废料中的细菌和可选地通过添加标准的、培养的或操纵的酵母、细菌或任何其他能够产生生化品、乙醇或沼气的微生物。
19.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，步骤a)中的加工由以下中的一种或多种完成：产乳酸菌、产乙酸菌、产丙酸菌或产丁酸菌，包含其的任何组合。
20.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，加工步骤a)包括使废料与浓度至少为1.0×106、1.0×107、1.0×108、或1.0×109CFU/L的活乳酸菌接触。
21.根据前述实施方式中任一项的方法，其中，加工步骤a)包括通过接种一种或多种呈现出细胞外纤维素酶活性的微生物来增加纤维素酶活性。
22.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，加工步骤a)以在20和75℃之间、30℃和70℃之间、40℃和60℃之间、45和55°C之间或50℃左右的温度执行。
23.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，步骤a)中的微生物加工通过微生物组合物执行，其中，大部分活微生物是产乳酸菌。
24.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，处理水从下游AD处理获得并且包括来自厌氧消化的产甲烷微生物。
25.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，处理水从下游AD处理获得并且在步骤d)之前未经受卫生化步骤。
26.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中废料的结合的酶促和微生物加工之前和/或期间，将所述处理水和可选地来自外部来源的水添加到步骤d)中的所述生物反应器。
27.根据前述实施方式中任一项的方法，其中，一种或多种碳水化合物，诸如选自多糖、寡糖、二糖或单糖的一种或多种碳水化合物，包含其任何组合，是除了添加所述处理水和可选地来自外部来源的水之外，在步骤a)中添加到生物反应器。
28.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，进入生物反应器的步骤d)中处理水的流率和可选地来自外部水源的流率是被定期或不定期地添加的。
29.根据前述实施方式中任一项的方法，其中，多于1.0、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98(w/w)的步骤a)中被添加到所述废料中的水是步骤c)中获得的处理水。
30.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，步骤c)中获得的处理水与步骤d)中来自外部来源的水的比率在以下范围中：0.01-0.1；0.1-0.25；0.25-0.50；0.50-1.0；1.0-2.0；2.0-4.0；4.0-6.0；6.0-8.0；8.0-10；10-20、20-40；40-60；60-80；或90-100。
31.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，步骤c)中获得的处理水具有以下的DM含量(w/w％)：1.0或更高；1.5或更高；2.0或更高；2.5或更高；3.0或更高；3.5或更高；4.0或更高；4.5或更高；5.0或更高；5.5或更高；6.0或更高；6.5或更高；7.0或更高；7.5或更高；或8.0或更高。
32.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，步骤c)中获得的处理水具有以下的盐含量(w/w％)：1.0或更高；1.5或更高；2.0或更高；2.5或更高；3.0或更高；3.5或更高；4.0或更高；4.5或更高；5.0或更高；5.5或更高；6.0或更高；6.5或更高；7.0或更高；7.5或更高；或8.0或更高。
33.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，步骤c)中获得的处理水可包括盐，所述盐包括以下中的一种或多种：铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐、氯化物、钠、钾、硫酸盐、铁、钙、镍、铅和锌。
34.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，处理水从提供包括以下元素中的一种或多种的消解物的AD处理获得：高达3800mg-N/kg-FW氨/铵；高达4700mg-N/kg-FW氮；高达280mg-P/kg-FW磷；高达3300mg/kg-FW水溶性氯；高达3300mg/kg-FW水溶性钠；高达2900mg/kg-FW钾；高达430mg/kg-FW硫；高达590mg/kg-FW铁：高达6000mg/kg-FW钙；高达3mg/kg-FW镍；高达3mg/kg-FW铅；高达3mg/kg-FW锌。
35.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，步骤a)中的生物反应器的填充体积在操作期间大于10；50；100；150；200；250；300；350；400；450；或500m3。
36.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，步骤a)中的生物反应器适配为处理大于5；10；15；20；25；30；35；40；45；或50吨废料/h。
37.根据前述实施方式中任一项的方法，其中，废料，例如MSW的DM含量在以下范围中：10-90；20-85；30-80；40-5；50-70；或55-65％(w/w)；和/或大约10；15；20；25；30；35；40；45；50；55；60；65；70；75；80；85；或90％(w/w)。
38.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，在以下情况测量或评估废料的DM含量：(i)在步骤a)中进入生物反应器之前；(ii)在步骤a)中进入生物反应器的废料的所述结合的酶促和微生物加工开始时；和/或(iii)在通过一个或多个固/液分开步骤提供步骤a)中获得的生物液体之前。
39.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，处理水从使用一个或多个厌氧消解器的AD处理获得，该厌氧消解器包括用于微生物生物膜的附着装置，诸如包括载体基质的装置，诸如在WO2016050893或WO2017/174093中公开的消解器。
40.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，废料包括可生物降解和不可生物降解的材料两者。
41.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述废料是未分类或分类的城市固体废料(MSW)。
42.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述废料源自以下情况或包括来自以下情况的废料中的一种或多种：家庭、工业、农业、农场、县或州活动。
43.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述废料包括以干基的10–100％的可生物降解材料。
44.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述废料包括以干基的20–30％的可生物降解材料。
45.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述废料包括以湿基的10–100％的可生物降解材料。
46.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述废料包括以湿基的25–60％，诸如35–50％的可生物降解材料。
47.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述废料选自以下中的一种或多种：未分类的城市固体废料、集中分类的城市固体废料、来自家庭的来源分类的城市固体废料、通过切碎或制浆处理的城市固体废料、有机部分和富纸张部分、废料衍生燃料部分。
48.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述废料城市固体废料中的可生物降解材料包括选自以下中的一种或多种项目的组合：食物残渣、纸张、纸板和细屑。
49.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述废料是分类的城市固体废料，不包括选自以下中的一个或多个的项目：家用电器、玻璃、陶瓷、电池、新闻纸、杂志、广告、书籍、塑料、织物、纺织品、庭院废料、电气和电子设备、化学品、药品、金属。
50.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中的结合的酶促和微生物加工之前，从废料中移除以下项目的组中的一个或多个：树叶、草、木材、织物、石头、塑料、金属。
51.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述废料选自以下中的一种或多种：还有纸或其他有机部分的一般工业废料部分、来自造纸行业或回收设施的废料部分、来自食品和饲料工业的废料部分、来自医药行业的废料部分。
52.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述废料选自以下中的一种或多种：农业或农场、来自富含糖或淀粉的制品的处理的废料部分、受污染或变质的不能用于食物或饲料目的的农产品、粪便、粪便衍生制品。
53.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述废料选自以下中的一种或多种：来自城市、县或州相关或受监管活动的废料部分、来自污水加工厂的污泥、来自沼气处理的纤维或污泥部分、来自公共部门的含有纸张或其他有机部分的一般废料部分。
54.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，在步骤a)之前使所述废料经受预处理。
55.根据实施方式54的方法，其中，所述预处理是以下中的一种或多种：酸水解、汽爆、氧化、碱提取、乙醇提取、分类、切碎、制浆、压力、大小分级、开袋，自由落体混合、搅拌或旋转。
56.根据实施方式54到55中任一项所述的方法，其中，分类或未分类的MSW按照大小分成部分，提供大小范围为例如0到60cm的部分，和/或提供超大部分(散装垃圾部分)，诸如包括大小超过60cm或更多的废料的部分。
57.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述预加工是长达120min的非加压预处理，温度范围在60-110℃之间且蒸汽进入量高达2kg/kg干物质。
58.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，干物质含量高于20％的废料被机械地处理，例如通过自由落体混合同时经受预处理和/或步骤a)。
示例
示例中使用的一般方法和材料
这部分描述了用于本申请中的示例的一般方法和材料。如果偏离一般方法和材料，将在示例中特别说明。图1a示出了废料加工处理和处理水再循环的示意图。图1b示出了下游处理的示例。在以下示例中，来自下游处理的再循环到生物反应器中的处理水是从AD处理中获得的废水，如图1b中所示。
城市固体废料(“模型MSW”)模型底物的制剂
在以下其中使用MSW模型底物的示例中，准备了50kg“model MSW”以模拟真实城市固体废料的成分。基本上如例如WO2016/030480中公开的那样准备模型底物。
模型底物由3部分组成：
–41％植物部分(cf.表1)
–13％蛋白质/脂肪部分(动物来源)(cf.表2)以及
–46％的纤维素部分(cf.表3)。
表1：MSW模型底物的植物部分(用于产生50kg模型MSW)
表2：MSW模型底物的蛋白质/脂肪部分(动物来源)(用于产生50kg模型MSW)
％蛋白质/脂肪部分(动物来源) 重量kg
烧肉 6 0.388
狗粮/猫粮 6 0.388
肝酱 5 0.323
萨拉米 5 0.323
熟香肠 5 0.323
肝肠 5 0.323
火腿 5 0.323
卷香肠 5 0.323
辣鸡翅 10 0.647
排骨 5.5 0.356
动物脂肪加香料 10 0.647
奶酪 4 0.259
Ymer(酸奶) 10 0.647
蛋 3 0.194
虾 3 0.194
鲱鱼 5 0.323
碎牛肉 1.5 0.097
整只鸡 2 0.129
鸡柳 4 0.259
总和 100 6.467
表3：MSW模型底物的纤维素部分(用于产生50kg模型MSW)
酶
CTec3TM购自Novozymes A/S。/>CTec3TM是最先进的纤维素酶和半纤维素酶复合物，包括GH61化合物和beta-葡萄糖苷酶。此外，测试了另一种酶活性与CTec3相似的酶组合物。
待添加到废料以充分地酶促加工的酶促组合物的量通过增溶测试确定，如上文定义的“增溶测试”中所述。
据信，使用用以生物质转化优化的其他市售纤维素酶制剂，诸如CTec2TM(Novozymes A/S)和ACCELLERASE1500TM(Genencor)，将获得类似的结果。根据我们的评估，CTec2和/>CTec3以及/>1500均含有超过200U/g的内切木聚糖酶活性、超过85U/g的木糖苷酶活性、超过9U/g的B-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性、超过15U/g的淀粉葡萄糖苷酶活性以及超过2U/g的alpha-淀粉酶活性水平。更简单的分开纤维素酶制剂也可有效地用以实践本发明的方法。
废水
废水如下提供。作为可行性研究的部分，荷兰家庭废料被运输到哥本哈根，并在丹麦阿迈格的Renescience示范设施处进行处理。废料进入一长度为16m、直径为2.5m、从而体积为78.5m3的生物反应器中，用于在50℃下的结合的酶促和微生物加工，总负载(废料+水)为13.5吨。生物反应器中的保留时间为20.6小时，自来水：MSW的比率为1.9，且酶剂量为0.97％w/w(CTec3购自Novozymes A/S)。产生的生物液体在丹麦技术大学的CSTR(Continued Stirred Reactor连续搅拌反应器)中进行加工。Pilot-scale CSTR是由VEOLIA/BiothaneTM提供的移动式SEAD厌氧消解器。SEAD厌氧消解器是一500升的罐生物厌氧消化在其中进行。由于在反应器的底部重新注入沼气(230L/h)和再循环泵(2-6m3/h)，AD罐的内容物混合。消解物的再循环部分通过喷嘴重新注入，其施加剪切力并有助于颗粒物质的分解。Biothane SEAD消解器配备有从消解器的顶部到底部的内部垂直管道。内管在底部穿孔并允许消耗器内容物循环遍及整个消解器罐。
SEAD消解器配备有pH和温度的在线监测，并连接到进料泵和采样出口。消解物通过溢流被排放到沉淀罐其中污泥和水被被动地分开。沉淀罐中消解物的下部分被循环回到主消解器罐，上清液通过溢流排出。原料储存在一100升的罐中，该罐被不断搅拌。5mm的网可防止将过大的颗粒引入进料罐。
将由SEAD产生的消解物冷冻储存，然后解冻并离心，以允许在Thermo ScientificSL40R离心机(4700rpm，15分钟，4C)上将固体消解物从剩余的废水分开，以沉淀大部分悬浮固体，如细胞、剩余的纤维和无机物。
由此获得的废水的pH为8.35，且总碱度通过用5mL的1M HCl手动滴定50mL废水样品来确定，使所得溶液的pH低于4。在工业规模中，该处理应在消解物和/或其一部分(诸如废水)再循环到生物反应器的条件下操作。这将导致更高浓度的盐分，还可增加废水的碱度。以便获得具有更高盐浓度的废水，将适量的废水置于加热的开口器中，直到废水的体积已减少到初始体积的大约一半。除非在示例1到5中另有说明，否则这是在以下示例中使用的废水。
示例1：MSW模型底物的液化
用于废料液化的模型系统
对于示例1、2、3、4和5中的实验室规模实验，发酵在配备有机械搅拌器、加热套、用于废气的冷却塔和pH-计的SartoriusTM 1L或5L发酵器中执行。包括MSW模型底物、酶和水和/或废水的发酵器的填充度大约为80–90％(v/v)。使用电加热套将温度保持在50℃，并且搅拌为600rpm，但第一小时除外，其中使用更剧烈的搅拌来开始增溶(1200rpm)。添加的组合物(固体和液体)在添加到发酵器之前没有预热。
样品采集
如下表所示，从发酵器中取出约10mL的样品，并经受离心以移除固体(3600rpm，10分钟)。随后对上清液进行热处理以使酶失活(100℃，10分钟)。随后使样品经受第二离心(4000rpm，10分钟)，并通过0.2μmPTFE过滤器(PhenexTM)过滤，并且随后经受HPLC分析。
HPLC分析
使用配备有折光率检测器(Shodex(R)RI–101)和250nm的UV检测器的UltiMate3000HPLC(Thermo Scientific DionexTM)测量相关化合物，诸如糖、有机酸和乙醇的浓度。分开在Rezex RHM单糖柱(PhenomenexTM)上在80℃下执行，使用5mM H2SO4作为洗脱剂，流率为0.6ml/分钟。使用Chromeleon软件程序(DionexTM)分析结果。
使用去离子水对MSW模型底物进行标准液化
使用166g MSW模型底物、1L去离子水和4gCTec3(Novozymes A/S)实现MSW模型底物的液化。首先，将水和MSW模型底物加热到50℃，同时搅拌(300rpm)。达到期望温度后，添加/>Ctec3(4g)并增加搅拌到1200rpm进行5分钟，然后增加到900rpm进行1小时。1小时后，搅拌减小到600rpm，直到实验结束。如表4所示，在时间点16、24、40、48和64，使用HPLC测量葡萄糖、木糖、乳酸盐、乙酸盐的含量。
表4：使用166g MSW模型底物、4gCTec3和去离子水获得的数据(均以g/L为单位)。
时间(h) 葡萄糖 木糖 乳酸 乙酸 pH
16 14.1 1.6 4.5 0.2 4.91
24 14.1 1.9 6.4 0.2 4.77
40 14.2 2.2 7.5 0.3 4.60
48 15.5 2.5 8.7 0.4 4.57
64 13.1 2.3 8.3 0.5 4.49
图2示出了在发酵器中测量的pH作为时间的函数。在第一24小时期间，有明显的酸化，这主要是由于乳酸的形成。在约24小时之后，pH落到约4.8，并且乳酸的生产率显著地下降(在8小时(16–24)中生成1.9g/Lvs.在24小时(24–48)中生成2.3g/L。在48小时后，停止产生乳酸，而pH为4.57。在64小时后，pH达到4.49，而葡萄糖和乳酸的浓度分别为13.1g/L和8.3g/L。我们决定研究是否有可能通过使用废水连续地中和形成的乳酸来增加乳酸的生产(cf.下面的(B)和(C))，即通过添加碱性废水来增加生物反应器中的pH。
示例2：在预先调节和不调节pH的情况下添加废水到生物反应器的影响
应用与示例1中相同的实验装置(set-up)和条件。然而，以便确定pH约为8.3的废水(如示例的介绍段所述制剂)对MSW模型底物发酵的影响，使用废水代替中性pH的去离子水执行系列实验。一个发酵器使用废水(1L)、MSW模型底物(166g)和4gCtec3运行。在另外三个发酵器中，废水在进入发酵器之前分别使用乙酸酐滴定到pH 7、pH 6或pH 5，假定乙酸酐在溶液中水解为乙酸。
表5使用4gCtec3和废水获得的数据(均以g/L为单位)。
时间(h) 葡萄糖 木糖 乳酸 乙酸 pH
0.5hr 1.8 1.2 0.1 0.1 7.29
16.5 0.9 1.1 5.1 0.7 6.67
24.5 1.4 0.3 3.0 0.5 6.31
41.5 2.0 0.5 4.3 0.7 5.99
48.5 4.4 1.0 5.9 1.2 5.80
64.5 3.7 1.2 7.3 1.3 5.48
72.5 3.6 1.2 7.4 1.3 5.41
88.5 3.0 1.3 8.3 1.5 5.28
161.5 0.2 1.1 12.4 1.1 5.00
表6使用4gCtec3和调节到7.0的废水获得的数据(均以g/L为单位)
时间(h) 葡萄糖 木糖 乳酸 乙酸 pH
0.5 4.3 2.0 0.1 0.6 7.03
16.5 4.3 1.3 2.5 1.8 6.67
24.5 2.1 0.5 2.2 1.0 6.07
41.5 2.8 1.0 11.2 2.1 5.23
48.5 2.2 1.1 12.0 2.1 5.11
64.5 1.0 1.3 13.9 2.1 4.90
72.5 0.2 1.3 14.0 2.0 4.89
88.5 0.2 1.4 14.7 2.0 4.84
161.5 1.0 1.6 15.5 2.4 4.85
表7使用4gCtec3和调节到6.0的废水获得的数据(均以g/L为单位)。
时间(h) 葡萄糖 木糖 乳酸 乙酸 pH
0.5 8.7 3.0 0.1 3.5 6.14
16.5 12.2 2.1 6.3 3.8 5.64
24.5 6.3 1.2 5.6 2.2 4.95
41.5 10.8 2.4 12.1 3.9 4.64
48.5 10.9 2.4 12.1 3.9 4.62
64.5 11.1 2.5 11.9 4.0 4.64
72.5 11.0 2.5 11.9 3.7 4.65
88.5 10.8 2.5 12.0 3.8 4.65
表8使用4gCtec3和调节到5.0的废水获得的数据(均以g/L为单位)。
时间(h) 葡萄糖 木糖 乳酸 乙酸 pH
0.5hr 10.1 3.3 0.1 6.1 5.48
16.5 17.3 4.3 0.3 6.8 5.59
24.5 8.1 1.9 2.2 3.6 5.15
41.5 14.8 2.8 8.1 7.0 4.86
48.5 14.6 2.9 8.2 7.1 4.86
64.5 14.5 3.0 8.1 7.3 4.87
72.5 14.1 2.9 7.7 6.6 4.90
88.5 14.2 2.9 7.7 6.7 4.94
图3示出了在发酵之前使用进行或不进行pH调节的废水的MSW模型底物发酵期间的pH。
当使用未调节pH的废水时，乳酸的产生很慢，并花费大约60小时才能达到pH 5.5。这被认为是由在较高pH下酶活性较低引起的，这反过来可为微生物生长生成较少的葡萄糖，从而延迟乳酸的产生。通过废水的pH调节，处理可被加速，尽管在所有情况下它都慢于用自来水(中性pH)，cf.示例1。
示例3：pH对添加废水的影响
将(如上述示例的介绍段所述制剂的)废水逐部分地添加到生物反应器。
使用250g废水、1.0gCtec3和41g MSW模型底物开始发酵。1L SartoriusTM发酵器中的初始pH>7。在26小时之后，pH已降到5.0以下(这称为时间＝0小时)。HPLC分析示出葡萄糖(5.2g/L)和乳酸盐(6.7g/L)这两者在时间＝0小时处均存在。如下表9所述，在不同时间点(表征为时间＝0小时后的小时数)添加废水、/>Ctec3和MSW。在时间＝15小时处，乳酸盐和葡萄糖的浓度分别为13.1g/L和4.1g/L。在时间＝39小时处，乳酸和葡萄糖浓度分别为14.3g/L和4.2g/L。
表9：在时间0、15和39小时添加MSW、废水和CTec3的概要以及在发酵器中测量的相应pH值
*在添加MSW模型底物、废水和CTec3TM之前的指定时间测量pH
**在添加MSW模型底物、废水和CTec3TM之后的指定时间测量pH
实验示出，与单次添加大量废水相比较，数次较少量添加废水可能是实现酸化的更快方式。我们认为，通过添加较少的废水可实现更快的酸化，而这主要是两个因素的结果：1)在添加废水时已经建立了可溶性生产群落。2)低pH生物液体的存在限制了由于添加废水而导致的pH增加，这反过来又允许酶在添加的MSW的转化中更有效地发挥作用。相应地，在已建立合适的条件之后发酵器的重复调节pH有利于系统返回到具有低pH的状态以及能够产生期望可溶物的微生物群落的能力。
示例4：添加pH为8.3的废水
使用250g废水、1.0gCtec3和41g MSW模型底物开始发酵。1L SartoriusTM发酵器中的初始pH>7。在26小时后，pH低于5.0。将pH控制设置为pH＝6.0，并将如示例的介绍段所描述的获得的pH为8.3的废水自动泵入系统以持续地将pH保持在6.0。在24小时之后，废水的添加自动停止，因为pH没有降到6以下，假设是因为没有更多的糖可用于微生物转化。在此实验的第一24h期间总共添加了433mL废水。然后加入1.0g/>Ctec3和41gMSW模型底物。在30h之后，自动添加附加的464mL废水以便保持pH恒定。/>
实验示出，连续添加废水有助于将反应混合物的pH保持在最佳范围(pH 4.0–6.0)用以进行酶促降解和可溶物的产生这两者。
从MSW模型底物(41g)的量，有望产生约6g可溶物，当可溶物是乳酸时，这相当于0.070摩尔。对于废水，滴定表征浓度大约为0.1M，相当于700mL。在此实验中，我们使用总共897mL废水。这表征在反应中处理的MSW量与添加的废水量之间存在直接相关性。明显地，此相关性取决于MSW(即食物废料和纤维素材料)中可用糖的含量以及使用的废水的碱度这两者。
示例5：通过顺序移除生物液体和废料以及添加等分的废水、MSW和酶来模拟连续处理
在具有3升去离子水、500g MSW模型底物和12g Cellic Ctec3TM的5升的发酵器中开始发酵。第二天，pH已落到4.3，且葡萄糖和乳酸盐的浓度分别为8.0g/L和8.8g/L。这表征为时间＝0小时(cf.图4)。材料(液体和固体这两者)在时间＝0之后的不同时间点从发酵器中移除，并替代为MSW模型底物、废水和Ctec3，如下表10中所列。
表10：在不同时间点添加MSW/葡萄糖、废水和CTec3的概要以及在发酵器中测量的相应pH值。
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*在添加MSW模型底物、废水和CTec3TM之前的指定时间测量pH
**在添加MSW模型底物、废水和CTec3TM之后的指定时间测量pH
pH持续增加直到时间＝14.5小时而在废水的新添加之间pH没有明显下降的事实示出，葡萄糖到乳酸等的微生物转化非常缓慢，这反过来表明可溶性生产微生物种群尚未建立。
47.5小时处的pH值表征在如此低的pH(4.72)下，可溶性生产细菌的种群再次减少，并且因此预期的pH降低非常缓慢。
52.5小时处的数据点和随后的pH快速下降示出，可溶性生产微生物群落的大小现在再次增加，并且系统能够快速中和废水。
我们推测MSW模型底物可用更直接的葡萄糖来源代替。这在废水量很大但可添加到反应器的废料量有限或废料有机物含量低的情况下可能很重要。在时间＝52.5和pH4.80处，我们测试了一起添加20g葡萄糖和500mL废水。在三小时之后，pH已落到4.74。
示例6：MSW模型底物在旋转卧式反应器中发酵并添加废水
具有与CTec3相似酶促活性的酶组合物购自Novozymes A/S，并储存在–20℃。酶在使用前解冻。Superfloc C498HMW购自Kemira。如在示例的介绍段所描述的制剂MSW模型底物。废水是在2017年11月16日从Northwich Renescience厂的一大型废料加工厂获得，该废料加工厂包括2500m3的进水罐、四个4500m3的AD消解器、一个2500m3的后储罐。在食物废料的厌氧消化后获得的废水上清液(自然预水解，约25％的干物质，90％的干物质可转化)，然后使用0.3％的Superfloc C498HMW聚合物溶液进行絮凝(聚合物流1220L/h，进料23m3/h)以及使用卧螺离心机倾析，且在厌氧消化系统中无需任何附加的热加工。
在不锈钢旋转卧式反应器(总体积63L，长度2m)中填充MSW模型底物(2kg)、自来水(5L)和具有与在自来水(1L)中、购自Novozymes A/S的CTec3(32g)相似酶促活性的酶组合物。混合物在50℃在恒定旋转(4rpm)下混合。在48h之后，将自来水(3L)、MSW模型底物(1kg)和具有与在自来水(400mL)中购自Novozymes A/S的/>CTec3(16g)相似酶促活性的酶组合物的溶液被添加并继续混合24h。随后添加MSW模型底物(1kg)、废水(3L)和酶组合物的溶液，该酶组合物具有与在自来水(400mL)中购自Novozymes A/S的/>CTec3(16g)相似的酶活性，并且继续混合24h。然后，通过出料器(与反应器的进料端相反地定位)移除10kg的反应器内容物。此后，MSW模型底物(1.5kg)、废水(4L)和具有与在自来水(400mL)中购自Novozymes A/S的/>CTec3(24g)相似酶促活性的酶组合物的溶液被添加到反应器并继续混合93h。
通过在线pH测量和HPLC分析监测发酵进程，以确定在下表11所示出的时间点处取自出料器的样品中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乳酸盐、乙酸盐和乙醇的浓度。
图5示出了50℃下旋转卧式反应器中MSW模型底物发酵的pH曲线(pH探头安装在距反应器的进料端约1.75m处)。
表11.MSW模型底物在50℃的旋转卧式反应器中发酵期间形成的选定化合物的浓度(以g每kg干物质计)。
*在48小时之后，添加MSW模型底物(1kg)和具有与在自来水(400mL)中购自Novozymes A/S的CTec3(16g)相似酶促活性的酶组合物的溶液
**在72小时之后，添加MSW模型底物(1kg)、废水(3L)和具有与在自来水(400mL)中购自Novozymes A/S的CTec3(16g)相似酶促活性的酶组合物的溶液
***在96小时之后，移除10kg的反应器内容物，并添加MSW模型底物(1.5kg)、废水(4L)和具有与在自来水(400mL)中购自Novozymes A/S的CTec3(24g)相似酶促活性的酶组合物的溶液。
添加废水(高达56vol.％)对使用自来水开始的发酵处理没有负面影响。这可通过在添加废水之后pH的持续降低以及乳酸和糖浓度的增加来证明。
示例7：确定微生物区系
下表12中列出的样品是从示例6中的微型反应器中获得的样品。使用购自QIAGEN的Kit分析样品。遵循制造商QIAGEN提供的2016年6月的快速启动协议。
表12
DNA纯化、1stPCR和2nd PCR分别于12–12–2017、13–12–2017和14–12–2017进行。
*在48小时之后，添加自来水(3L)、MSW模型底物(1kg)和具有与在自来水(400mL)中购自Novozymes A/S的CTec3(16g)相似酶促活性的酶组合物的溶液
**在72小时之后，MSW模型底物(1kg)、废水(3L)和具有与在自来水(400mL)中购自Novozymes A/S的CTec3(16g)相似酶促活性的酶组合物的溶液
***在96小时之后，移除10kg的反应器内容物，并添加MSW模型底物(1.5kg)、废水(4L)和具有与在自来水(400mL)中购自Novozymes A/S的CTec3(24g)相似酶促活性的酶组合物的溶液。
DNA纯化：
将0.25g样品添加到PowerBead Tube(QIAGEN)中。将管轻轻地涡旋并混合。添加体积为60μl的溶液C1并颠倒数次或短暂涡旋。PowerBead管使用涡旋适配器管架水平地固定。将管以最大速度涡旋10min。管以10,000xg离心30s。将上清液转移到干净的2ml收集管中。添加250μl的溶液C2并涡旋5s。孵育在4℃下进行5min。将管以10,000xg离心1min。避开团粒，将多达600μl的上清液转移到干净的2ml收集管中。随后添加200μl的溶液C3并短暂涡旋。孵育在4℃下进行5min。将管以10,000xg离心1min。避开团粒，将多达750μl的上清液添加到干净的2ml收集管中。将C4溶液震荡混合，并且添加1200μl到上清液。将溶液涡旋5s。将675μl加载到MB离心柱上并以10,000g离心1min。废液被丢弃。最后一步重复两次。添加500μl的溶液C5。以10,000xg离心30s。废液被丢弃。在10,000xg下再次离心1min。MB离心柱放置在干净的2ml收集管中。将50μl的溶液C6添加到白色滤膜的中央。在室温下以10,000xg离心30s。MB离心柱被丢弃。此时DNA已准备好用于下游应用。
用于测序的DNA的制剂：
在DNA纯化之后，在Illumina MiSeq systemTM上测序之前进行进一步的制剂步骤。遵循制造商Illumina提供的程序：(https://support.illumina.com/downloads/16s_metagenomic_sequencing_librar y_preparation.html accessed 11-01-2018,16SMetagenomic Sequencing Library Preparation,Preparing 16S Ribosomal RNA GeneAmplicons for the Illumina MiSeq System,Part#15044223Rev.B.)
16S文库制剂工作流程如下：1)1st Stage PCR，2)PCR Clean-Up，3)2nd StagePCR，4)PCR Clean-Up 2，5)Library Quantification and Normalization，以及6)LibraryDenaturing an MiSeq Sample Loading。
使用程序中描述的16S PCR步骤制剂纯化的DNA样品。将引物添加到溶液并执行PCR。随后使用索引引物根据索引PCR程序对溶液进行索引。在索引PCR之后，根据PCRClean–Up2程序纯化溶液。随后通过在PCR Clean-Up 2步骤中移除任何游离引物和引物二聚体物种来纯化溶液。使用dsDNA结合染料通过荧光定量法对DNA文库进行定量。DNA浓度是基于使用Qibit 3.0TM进行的分析计算的。文库被归一化和汇集。汇集的文库被变性并加载到MiSeq系统上。加载样品后，MiSeq系统使用16S宏基因组数据库提供仪器内二次分析。如本领域已知的，特定物种的确定可取决于所应用的特定数据库，并且实际上可包含不止一个物种，或者可指代能够/将/可能在另一数据库中被不同归类的物种。然而，无论应用的数据库和各种数据库可能应用的具体物种鉴定如何，就目前的目的而言，在产乳酸菌和非产乳酸菌之间的区别应该是相同的。
结论
图6描述了产乳酸菌(包括乳酸菌目“LAB”的细菌)的％，其中，当前接受的分类法基于具有标准命名法的原核生物名称列表(LPSN)-维护有关原核生物的命名和分类信息的在线数据库，遵循国际细菌命名法典的分类要求和规则。系统发生学目基于“全物种生命树”项目的16SrRNA-based LTP release 106。与实验中七个不同时间点(称为S3、S6、S12、S16、S18、S20和S22，并在表12中定义)处样品中存在的所有其他细菌物种相比较，此处提及的产乳酸菌还包括不属于LAB目但仍然能够产生乳酸的细菌。
在将废料、去离子水和酶添加到小型反应器(S3)之后1.75小时，反应器中33％的细菌种群由产乳酸菌组成。而所有其他细菌物种占剩余的67％。
在20.25小时之后(S6)，LAB量增加到种群的55％，而其他细菌物种减少到45％。
在49.75小时(S12)和72.5小时(S16)处，与其他细菌物种分别占21％和24％相比较，产乳酸菌分别以79％和76％主导种群。
在72.5小时之后(S16)，添加废水。在91小时(S18)，产乳酸菌的总量减少到51％，而其他细菌物种增加到49％。
有趣的是，在162.75小时(S20)和189.25小时(S22)之后，产乳酸菌的存在再次分别增加到77％和65％。其他细菌物种分别减少到23％和35％。
因此，即使在91小时后引入许多其他细菌物种和经由废水提高pH以及产乳酸菌种群数量减少之后，生物反应器内与其他细菌物种相比较，产乳酸菌仍然能够在种群大小方面令人惊讶地重新获得领先地位。即使在生物反应器中环境发生显著变化之后，产乳酸菌仍然令人惊讶地是主要的细菌贡献者。
图7a–7d描述了在实验的七个不同时间点(称为S3、S6、S12、S16、S18、S20和S22，并在表12中定义)处，与样品中存在的所有其他细菌相比较主导种群的细菌物种。下面描述图7a到图7g。
7a)在将废料、去离子水和酶添加到小型反应器(S3)之后1.75小时，与所有其他细菌物种(71％)相比较，Calothrix parietina以29％主导细菌种群。
在20.25小时之后(S6)，与其他细菌物种45％相比较，Bacillus coagulans以55％主导细菌种群。请注意，这等于此样品中产乳酸菌的总量(图6)。B.coagulans是熟知的乳酸菌的生产者(T.Michelson et al.,2006,Enzyme and Microbial Technology)。
7b)在49.75小时(S12)处，与其他细菌物种的25％相比较，B.coagulans的种群增加到75％。再次注意，B.coagulans几乎代表了整个产乳酸菌种群(图6)
在72.5小时(S16)处，B.coagulans的种群稳定在73％，再次代表整个产乳酸菌种群的绝大多数。在此样品之后添加废水。
7c)在91小时处添加废水(S18)。B.coagulans的种群减少到51％，占整个产乳酸菌种群的大部分。这表明，B.coagulans正在抗拒废水的添加。
实际上，在162.75小时(S20)之后，Lactobacillus ultunensis以53％主导细菌种群。请注意，除了L.ultunensis之外，LAB还包括24％的其他产乳酸菌物种，这表明除了L.ultunensis之外的其他LAB物种在添加废水之后，可在生物反应器环境中成长。
7d)在189.25小时之后(S22)，L.ultunensis仍以44％是主导物种。
非常令人惊讶的是，产乳酸菌能够在包括废水的环境中存活。令人惊讶的是，由废水的添加引起生物反应器环境发生变化的结果是，细菌种群从一种主导产乳酸菌物种变为另一种。
图8a到8d描述了实验中相同的七个时间点(称为S3、S6、S12、S16、S18、S20和S22，如12表中定义)处，与存在于样本中的其他细菌物种相比较，种群中五个最主导的物种。“未归类”表示该方法无法归类的细菌物种，可能是任何数据库中都不存在的新物种。下面描述图8a到8d。
8a)在将废料、去离子水和酶添加到小型反应器(S3)后1.75小时，Calothrixparietina以29％主导细菌种群，其次是5％的Leuconostoc sp.和5％未归类的细菌。Weissella viridescens和Leuconostoc mesenteriodes分别占4％和3％。其他细菌物种占细菌总数的54％。Leuconostoc sp.、W.viridescens和L.mesenteriodes都是产乳酸菌。随着时间的推移，这些保留的都没有成为种群的主导物种(见下文)。
在20.25小时之后(S6)，B.coagulans以55％主导细菌种群细菌种群，且Bacillusthermoamylovorans占17％。未归类的细菌，Bacillus sp.和Sporolactobacillus putidus的含量分别为8％、3％和2％。其他细菌物种占细菌总数的15％。与图7a相比较，有清晰的细菌种群偏移。所有顶级物种都发生了变化，即在种群大小上能够在生物反应器环境中生存的细菌增加了。生物反应器群体以产乳酸菌为主。请注意，S.putidus是产乳酸菌。
8b)在49.75小时(S12)处，B.coagulans的种群增加到75％。其次是“未归类细菌”(6％)，Bacillus sp.(3％)、S.putidus和Enterococcus lactis(2％)以及占12％的其他细菌物种。请注意，图8a中的数个顶级物种仍存在，这表明种群正在稳定。请注意，E.lactis是产乳酸菌。
在72.5小时(S16)处，B.coagulans的种群稳定在73％，再次代表整个产乳酸菌种群的绝大多数。其次是“未分类细菌”(11％)，Bacillus sp.(3％)、Lactobacillusultunensis(2％)、S.putidus(1％)和占11％的其他细菌物种。请注意，L.ultenensis是产乳酸菌。这示出生物反应器种群是稳定的。在此样品之后添加废水。
8c)在91小时(S18)处，B.coagulans的种群减少到51％。稳定条件被废水中断，这显著地影响了细菌种群。“未分类细菌(Unclassified bacteria)”(13％)，Aminobacteriumsp.(7％)、S.putidus(3％)、Anaerobaculum sp.(2％)和占24％的其他细菌物种也存在。由于生物反应器中环境的变化，与图8b相比较，除了B.coagulans和“未分类细菌”之外，其他主导物种发生了变化。其他细菌物种从10％增加到24％，这表明整个种群中的偏移。
事实上，在162.75小时(S20)之后，整个细菌种群由另一种产乳酸菌种群(即Lactobacillus ultunensis)以53％主导。B.coagulans已降到8％，再次表明生物反应器中的新环境不利于此种物种。“未分类细菌(Unclassified bacteria)”(8％)，Lactobacillussp.(3％)，Aminobacterium sp.(3％)和占25％的其他细菌物种仍存在。随着新的主导物种，整个种群偏移朝向再次变得稳定。
8d)在189.25小时之后(S22)，L.ultunensis仍以45％是主导物种，其次是“未分类”细菌(15％)、B.coagulans(5％)、Aminobacterium sp.(4％)、Lactobacillusdelbrueckii(3％)和占28％的其他细菌物种。请注意，L.delbrueckii是产乳酸菌。
非常令人惊讶的是，产乳酸菌能够在包括废水的环境中存活。令人惊讶的是，由废水的添加引起生物反应器环境发生变化的结果是，细菌种群从一种主导LAB物种变为另一种。
示例8：开环和闭环生物液体的厌氧消化比较
如示例的介绍段所述，从厌氧消化获得的AD流出物是使用丹麦Amager ResourceCetner处的Renescience示范规模的城市固体废料产生的生物液体获得的。此Renescience示范厂不包括生物液体利用装置和补水单元，且相应地是其中不应用水再循环的厂。出于此示例的目的，这被称为“开环”厂。因此，此示范厂获得的生物液体(针对此示例的目的可称为“Renescience生物液体”，该术语不限于本示例的范围)中盐和氨的结果浓度，并进一步用于厌氧消化，比从其中将自来水以外的水添加到生物反应器中的厂获得的生物液体中预期的那些要低。“闭环”厂相应地是废料加工厂，其中，废料的结合的酶促和微生物加工包括水的再循环。
厌氧消化领域的建模和实验结果这两者均示出，转化率和生物甲烷产量受钠浓度的负面影响(Hierholtzer,A et al 2012；Modelling sodiuminhibition on theanaerobic digestion process；Water Science and Technology；1565–1573)。事实上，引用的研究示出，在添加0.083mol/L(1.91g/L)的钠之后，已经可感知到对厌氧消化的抑制效应。以类似的方式，氨浓度的增加常常会导致产甲烷活性的丧失，以及生物质增长的减少(Chen,Y et al.2008；Inhibition of anaerobic digestion process:areview.Bioresource Technology,99(10),4044–64)。
由于可溶性盐和氨浓度对厌氧消化中底物的转化率有很大的负面影响，因此进行了实验以比较具有不同钠、氨和钙浓度的生物液体的厌氧消化。
实验说明：
在此研究中，用于沼气生产的传统连续搅拌罐反应器(CSTR)使用Renescience生物液体和分别补充有钠、钙、氯和氨的Renescience生物液体操作，以在与预测的质量平衡一致上比较来自开环生物液体的AD和闭环生物液体的AD，其中，水被再循环。在20天的水力保留时间(HRT)下执行至少4次完全保留的连续测试，这可以是用于全尺寸厌氧消解器操作的预期标准流率，所述操作加工根据本发明的步骤a)的处理下游的生物液体。
材料：
1.用于厌氧消化的初始种子(接种物)来自丹麦的厂Foulum Biogas，用以通过厌氧消化将来自农业秸秆的富含粪便和纤维的残留物转化成沼气。
2.从2016年荷兰城市固体废料的结合的酶促和微生物加工获得的Renescience生物液体，在丹麦Amager的示范设施中生产。生物液体通过2mm筛网进行筛选，以减少实验室规模CSTRS中的堵塞。
3.两个10升沼气反应器：一CSTR用以加工具有加强的盐和氨浓度的Renescience生物液体(闭环)，而第二个使用包括较低浓度盐和氨的Renescience生物液体(开环)作为阳性控制。
4.气体采样袋US大气气体方法和甲烷产量的GC量化。
5.气体流量测量装置。生物处理控制，瑞典。
方法：
该实验是通过所述两个10升CSTR反应器的连续进料进行的，其之前接种了接种物并掺入了生物液体一周以维持活微生物。活性体积内容物的搅动是通过蠕动泵的主动再循环实现的。反应器的处理保持在38℃的适温的温度范围内，每个反应器中都有加热夹套。通过取样口定期地在反应器内取样。
闭环CSTR消解器被使用以将补充有氯化钠、碳酸氢钙和氨的生物液体转化成类似于质量平衡计算中高盐AD进料的预期浓度。底物还通过2mm厨房网筛进行筛选，以移除较大的颗粒并降低堵塞实验室规模泵再循环的风险。底物的表征基于符合NREL(NationalRenewable Energy Laboratory,US)指南的以下预期的盐和氨浓度。
调节盐和氨浓度以满足来自闭环系统的生物液体底物的预期的盐和氨浓度：
Na：2.3g/l；Cl：2.g/l；TAN(总氨氮)：2.5g/l；Ca：5.1g/l。
所有反应器的斜坡上升在50天HRT处开始，并且增加进料速率直到在5天周期内达到20天HRT。当达到目标HRT时，反应器操作至少6个总保留时间。针对不同的总保留的反应器的操作确保生物甲烷反应器的消化介质已被完全地替代。在已开始实验的第二保留之后，对应于操作的25天，将收集的流出物作为处理的代表性流出物储存以量化反应器的盐和氨浓度。将以下产量进行比较：在用类似于“闭环”生物液体的生物液体进料的反应器中获得的产量，和在用类似于“开环”生物液体，即未添加盐和氨的生物液体的生物液体的控制反应器中获得的产量。
厌氧消化处理期间产生的沼气通过从Bioprocess ControlAB(瑞典隆德)获得的气流装置进行定量监测。气体成分经由气相色谱法(model GC82Mikrolab Aarhus A/S，Denmark)确定。消解物中的化学需氧量(COD)和挥发性脂肪酸(VFA)以使用DR 3900分光光度计(Hach,Düsseldorf,Germany)的Hach LCK514 COD和LCK365 Organic Acid cuvette测试进行量化。
结果：
执行连续沼气测试以估计Renescience生物液体的沼气产量，增加盐和氨浓度以模拟包括闭环的全规模Renescience AD处理。作为控制，Renescience生物液体是在Amager的开环演示规模Renescience试点厂(pilot plant)中生产的，不添加盐也在相同的处理条件下进行了尝试(“Digester A”)。
图10示出了20HRT的四个保留时间期间CSTR反应器产生的甲烷。数据示出，使用浓缩闭环生物液体作为底物用于厌氧消化可产生甲烷。20天HRT期间的甲烷生产趋势表征，该处理在反应器的整个操作期间保持稳定。此实验示出，在研究条件下，从闭环厂获得的生物液体中对应于预期盐和氨浓度的Na、Cl、Ca和氨浓度的增加令人惊讶地没有对Renescience生物液体的厌氧消化产生有害效应。
示例9：MSW模型底物在pH高于6的发酵器中发酵
实验中使用的碳酸氢铵和氨溶液购自Sigma Aldrich。
以MSW模型底物(166g)和自来水(900mL)填充1-L Sartorius发酵器。将NH4HCO3(13g)和氨(水溶，25％，2mL)溶解在自来水(100mL)中，并将溶液添加到发酵器中。在持续搅拌(500rpm)下将混合物升到50℃。在混合物已达到50℃后，将具有与购自Novozymes A/S的CTec3(4g)相似酶促活性的酶组合物添加到发酵器中，并且在持续搅拌(500rpm)，50℃下进行发酵。
表13.在添加有NH4HCO3和氨的发酵器中发酵MSW模型底物期间形成的选定化合物的浓度(以g/L为单位)
时间(h) 葡萄糖 木糖 乳酸 乙酸 丙酸盐 丁酸盐 甲酸盐 pH
1.5 0.69 0.00 1.28 0.53 0.00 0.00 0.00 7.80
3.4 0.77 0.00 1.31 0.59 0.00 0.00 0.00 7.88
5.2 0.81 0.00 1.30 0.58 0.00 0.00 0.00 7.95
22.0 0.18 0.00 2.75 0.86 0.00 0.00 0.29 7.94
24.1 0.19 0.00 3.11 0.97 0.00 0.00 0.45 7.90
29.2 0.14 0.13 3.56 1.16 0.00 0.00 0.75 7.68
45.2 0.12 0.62 5.78 2.29 0.00 0.09 2.48 6.98
51.7 0.00 0.88 5.77 2.49 0.00 0.19 2.81 6.57
68.2 0.00 1.07 5.60 3.23 0.10 0.80 3.34 6.15
75.7 0.00 0.94 4.82 3.17 0.00 1.48 3.38 6.17
92.2 0.00 0.16 1.57 2.60 0.00 4.35 3.50 6.45
100.2 0.00 0.00 0.23 2.53 0.11 5.68 3.55 6.66
165.4 0.00 0.00 0.00 3.99 0.24 6.03 3.29 6.46
171.2 0.00 0.00 0.00 3.93 0.20 5.82 3.26 6.49
189.4 0.00 0.00 0.00 4.35 0.27 5.86 2.94 6.49
结论.从图11和表13可看出，实验期间的pH始终高于6，这导致乳酸消失并产生一些其他有机酸(甲酸、丙酸和丁酸)。这些新形成的酸在生物液体中是不期望的，因为它们可能会给AD处理带来困难。因此，此实验证明发酵的pH不应高于pH 6。
示例10：MSW模型底物在恒定pH 3.5的发酵器中的发酵
实验中使用的HCl(水溶，4M)购自Sigma Aldrich。
1-L Sartorius发酵器中填充有MSW模型底物(166g)和蒸馏水(1L)。用4M HCl水溶液将混合物的pH调节到3.5。在持续搅拌(600rpm)下将混合物升到50℃。在混合物已达到50℃后，将具有与购自Novozymes A/S的CTec3(4g)相似酶促活性的酶组合物添加到发酵器中，并在持续搅拌(600rpm)和恒定pH 3.5(其通过添加4M HCl水溶液由发酵器自动地维持)，50℃下进行发酵。
表14.在恒定pH 3.5下，MSW模型底物发酵期间形成的选定化合物的浓度(以g/L为单位)
时间(h) 葡萄糖 木糖 乳酸 乙酸 丙酸盐 丁酸盐 甲酸盐 pH
0 1.52 0.00 0.18 0.23 0.00 0.00 0.00 3.50
1.8 8.86 2.06 0.21 0.25 0.00 0.00 0.00 3.50
20.8 15.74 3.50 0.28 0.27 0.00 0.00 0.00 3.50
45.6 17.77 3.68 0.33 0.22 0.00 0.00 0.00 3.50
139.6 20.35 3.49 0.37 0.27 0.00 0.00 0.00 3.50
结论.实验示出，在pH 3.5处，几乎没有产生乳酸盐、乙酸盐和其他羧酸盐，这表征优选的细菌活性在pH 3.5处仍存在，但与pH在3.5和6之间时的细菌活性相比较有降低。
示例11：MSW模型底物在旋转卧式反应器中发酵并添加废水和葡萄糖
表15.实验中使用的MSW模型底物的成分
成分 重量(kg)
黑麦面包 0.8
苹果 0.6
土豆 2.8
抹酱 0.2
肉肠 1.6
报纸 1.8
杂志 0.6
果汁盒 1.6
锯末 0.8
粘胶布 1.2
塑料袋(LDPE) 3.2
硬塑料 4.8
将成分穿通过切碎机(Frandsen Industri findeler type 5500)三次，并将所得混合物穿通过切碎机(具有6-disc转子的Retsch sm300)一次。如此获得的MSW模型基质的干物质为77％。
MSW模型底物(1kg，表X)、自来水(3L)和具有与在自来水(1L)中购自Novozymes A/S的CTec3(23g)相似酶促活性的酶组合物的溶液被添加到不锈钢旋转卧式反应器中(总体积63L，长度2m)。将混合物在50℃，持续旋转(4rpm)下混合。实验开始之后24h，添加废水(4L)、MSW模型底物(1.2kg)和具有与购自Novozymes A/S的/>CTec3(24g)相似酶促活性的酶组合物。实验开始之后47h，添加具有与购自Novozymes A/S的/>CTec3(20g)相似酶促活性的酶组合物。实验开始之后49h，添加MSW模型底物(1kg)、自来水(2kg)、废水(1kg)和具有与购自Novozymes A/S的/>CTec3(20g)相似酶促活性的酶组合物。实验开始之后117h，通过出料器移除5kg反应器内容物。实验开始之后121h，将葡萄糖(200g)添加到反应器。
通过pH测量和HPLC分析监测发酵进程，以确定在表16中示出的时间点处取自出料器的样品中糖、有机酸和乙醇的浓度。
表16.MSW模型底物在添加有废水和葡萄糖的50℃的旋转卧式反应器中发酵期间形成的选定化合物的浓度(以g每kg干物质计)。
样品D 时间(h) 葡萄糖 木糖 乳酸 乙酸 丁酸盐 甲酸盐 乙醇 pH
S1 18.50 0.16 2.66 13.43 6.26 0.19 0.00 0.32 4.88
S2 22.58 0.07 2.44 10.71 8.41 0.25 0.00 0.38 4.96
S3* 25.50 3.87 2.48 9.72 6.88 0.18 0.00 0.23 7.84
S4 27.50 0.16 1.87 14.38 7.92 0.21 1.14 0.16 7.67
S5 42.50 0.06 0.05 0.00 15.63 13.06 4.41 1.94 6.93
S6 44.75 0.00 0.06 0.00 17.32 13.31 4.15 1.82 6.90
S7** 49.25 0.11 0.08 0.45 19.48 13.10 3.76 1.37 6.82
S8 51.00 1.70 0.72 3.18 16.62 9.53 2.89 0.98 6.81
S9 114.50 0.12 0.10 0.63 13.31 30.51 4.55 5.03 5.26
S10*** 122.25 61.15 0.00 0.55 14.60 31.40 3.75 4.74 5.25
S11 123.00 52.31 0.00 0.64 13.56 28.24 3.37 4.33 5.25
S12 138.50 36.64 0.38 10.82 19.05 26.71 2.83 2.90 5.00
S13 145.50 29.09 0.36 17.62 20.46 26.91 3.00 2.87 4.85
S14 163.58 23.36 0.40 28.22 22.66 29.08 3.16 3.33 4.64
S15 194.00 22.83 1.92 30.84 23.65 29.27 4.60 3.45 4.88
*–在24h之后，添加废水(4L)、MSW模型底物(1.2kg)和具有与购自Novozymes A/S的CTec3(24g)相似酶促活性的酶组合物，**–在47h之后，添加具有与购自Novozymes A/S的/>CTec3(20g)相似酶促活性的酶组合物。在49h之后，添加MSW模型底物(1kg)、自来水(2kg)、废水(1kg)和具有与购自Novozymes A/S的/>CTec3(20g)相似酶促活性的酶组合物，***–在117h之后，通过出料器移除5kg反应器内容物。在121h之后，添加葡萄糖(200g)。
同样，如在示例7中所述测量LAB相对于其他细菌物种存在的种群。如图12所示，当pH增加时，LAB相对于其他细菌物种的百分比严重下降。在26小时处，pH已增加到大约7.84，LAB的存在减少并保持为低，直到在49小时之后pH仍靠近pH 7。在139小时处，pH已落到pH 5左右，相对于其他细菌物种，LAB的百分比增加到大约90％。
结论：
发酵成功地用不同于在其他示例中使用的MSW模型底物的MSW模型底物来进行。还示出，当处理在pH>6下长时间操作时，会产生对于AD处理来说不期望的丁酸。此外，pH偏移到6以上会改变微生物区系的成分，其中，产生对能量生产有价值的可溶物的细菌种群的相对％显著地降低。

Claims (14)

1.用于连续或分批处理废料的方法，包括：
a)使废料在生物反应器中经受酶促和/或微生物加工；
b)使来自步骤a)的被加工的废料经受一个或多个分开步骤，从而提供生物液体和固体部分；
c)使所述生物液体和/或固体部分经受下游处理，其提供处理水；
d)添加从步骤c)中获得的处理水和可选地来自外部水源的水到步骤a)中的生物反应器，其中，处理水连续地或分批地被添加，使得反应器中的pH在pH 3.5-6之间，或者其中，在将处理水添加到步骤a)中的生物反应器之前将pH调节到3.5和6之间。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤c)中的提供所述处理水的下游处理选自以下中的一个或多个：厌氧消化处理、固体废料部分的洗涤、生物液体的蒸发和收集。
3.根据前述权利要求所述的方法，其中，步骤c)中的下游处理是提供废水的厌氧消化处理。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，通过添加酸和/或通过降低铵含量，将废水的pH调节到3.5和6之间。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，从所述厌氧消化处理获得的废水在经受步骤d)之前经受卫生化。
6.根据前述权利要求所述的方法，其中，步骤d)中的外部水选自从以下获得的水：诸如河流、湖泊和池塘的天然来源；水库；自来水，及其任意组合。
7.根据前述权利要求所述的方法，其中，步骤a)中的生物反应器的填充体积在操作期间大于10、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500m3，以及其中，生物反应器适配为每小时处理超过5、10、15、20、25、30、35、40、45或50吨的废料。
8.根据前述权利要求所述的方法，其中，所述废料是未分类的城市固体废料、集中分类的城市固体废料、来自家庭的来源分类的城市固体废料、通过切碎或制浆处理的城市固体废料、有机部分和富纸张部分、废料衍生燃料部分或城市固体废料，其中，所述废料中的可生物降解材料包括选自以下中一种或多种项目的组合：食物残渣、纸张、纸板或细屑。
9.根据前述权利要求所述的方法，其中，步骤a)中的所述酶促加工是通过以下来执行：添加酶，所述酶以天然形式或以引起此类酶表达的微生物有机体的形式被供应，或被操纵的酵母、细菌或任何其他能够产生所述酶的微生物。
10.根据前述权利要求所述的方法，其中，所述微生物加工通过添加微生物来执行，所述微生物诸如能够产生例如生化品、乙醇或沼气的细菌，和/或通过存在于废料中的微生物例如细菌来执行。
11.根据前述权利要求所述的方法，其中，步骤a)中的加工包括使废料与浓度至少为1.0×106、1.0×107、1.0×108、或1.0×109CFU/L的活乳酸菌接触。
12.根据前述权利要求所述的方法，其中，步骤a)中的加工包括以1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109或1.0×1010CFU/L的浓度添加微生物到废料。
13.根据前述权利要求所述的方法，其中，加工步骤a)以在20和75°C之间、30℃和70℃之间、40℃和60℃之间、45和55℃之间或50℃左右的温度执行。
14.根据前述权利要求所述的方法，其中，在步骤d)中将处理水和可选地来自外部来源的水添加到步骤a)中的生物反应器中的流率基本上恒定和/或基本上与废料量成比例，其具有1:1和3:1之间的水:废料比例。
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