JPH0347076A - β―マンナナーゼおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なβマンナナーゼ並びにその製造法に関す
る。更に詳しくは、バチルス属に属し、生育の至適ｐＨ
をアルカリ性に有する好アルカリ性の新規微生物を培養
して得られ、酵素反応の至適ｐＨをアルカリ性に有する
菌体外β−マンナナーゼおよびその製造法に関する。

従来の技術 β−マンナナーゼは分子内にβ−１，４−Ｄマンノピラ
ノシド結合を持つホモおよびヘテロのβ−Ｄ−マンナン
であるマンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、
ガラクトグルコマンナンなどの主要骨格であるβ−１，
４−Ｄ−マンノピラノシド結合を任意に加水分解し、粘
性を低下せしめると同時に一連のマンノオリゴ糖を生成
する酵素である。

まず、β−１，４−Ｄ−マンナンを含むものとして、ア
イポリ−ナツツ（学名：フイテレファス・マクロカルバ
）やコロゾがよく知られている。その他β−１．４−マ
ンナン含有植物としてはヤシ科のフオエニクス・カナリ
エンシス、オーキス・マキュラタなどが知られている。

ガラクトマンナンはイナゴマメ及びグアーの種子に含ま
れる各々の粘質物、ローカストビーンガム及びグアーガ
ムが代表的なものであり、この二種のガラクトマンナン
は、そのままあるいは化学的な改質をほどこした後、工
業的に広く使用されている。また、ガラクトマンナンは
大豆、コーヒー豆、ムラサキウマゴヤシ、アカツメフサ
、コロハなどマメ科の植物にも多く含まれている。その
他のガラクトマンナン含有植物としてはゲニスタ・スコ
パリア、ブレデイラシャ・フエロラス、レウカエナ・グ
ラウカなどが知られている。

グルコマンナン含有物としてはコンニャク（学名ニアモ
ルフオファラス・コンニャク）が最も有名であるが、サ
トイモ科のアルム根、マツ属のジャックパイン、ラン科
の球根、ニジマツやハリモミなどのトウヒ属の植物など
が知られている。その他のグルコマンナン含有植物とし
ては、アスパラガス・オフィシナリス、エレムラス・ラ
スカス、エレムラス・レゲリー、エレムラス・スペクタ
ピリス、ファセオラス・アウレウスなどが知られている
。これらは、一般にアルカリ抽出法などにより得られて
いる。また、これらβ−Ｄ−マンナンは糊料あるいは増
粘剤として、食品工業や繊維産業で工業的に大量に消費
されているものである。

これらβ−Ｄ−マンナンを任意に加水分解する酵素とし
て知られているβ−マンナナーゼは、従来から多数の研
究者の研究対象とされており、非常に多くの微生物由来
のものが検討されてきた。

例えば、〔アトパンスズ　イン　カルボハイドレート　
ケミストリー　アンド　バイオケミストリー（Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　　ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　
　１９７６、　３２．　２９９−３１６）特に、糸状菌
〔アクタ　ケミ力　スカンジナビ力（Ａｃｔａ。

Ｃｈｅｍ、　　５ｃａｎｄ、）、　　１９６８，２２．
　１９２４；　濃化、　　１９６９゜４３、３１７；バ
イオケミカル　ジャーナ／ｌ／　（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、
Ｊ、）、　１９８４．　２１９．８５７）　、放線菌〔
アグリカルチュラル　アンド　バイオロジカル　ケミス
トリー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、　
１９８４．４８．２１８９〕、細菌〔ジャーナル　オブ
　バイオケミストリー　（Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、　１９８２，９１．１１８１　；
特開昭５７−６５１８２号〕などの酵素が良く研究され
ている。

しかしながら、これらの酵素はいずれも温度安定性に劣
る場合や、培養に長時間必要なものが多く、該酵素を工
業的に安価に使用する場合に難点を残していた。

発明が解決しようとする問題点 天然界に再生可能な資源として大量に存在するβ−Ｄ−
マンナンの有効利用、特に該物質の酵素的加水分解によ
るマンノオリゴ糖やマンノース、グルコース、ガラクト
ースなどの糖類を効率良く回収利用するためには耐熱性
に優れ、かつβ−マンナンの各種植物からの抽出操作が
主にアルカリ性で行われていることから、中和操作を簡
略化し、かつ分解工程を単純化するためにも、アルカリ
側に酵素反応の至適ｐＨを有することが好ましい。

さらに、高温度下で酵素反応を行うことにより腐敗を防
止したり、酵素反応速度を増大し、生成物の量産性を高
めるなどが期待できることから、至適温度も高温である
ことが望ましい。

しかしながら、既に述べたように、従来のβ−マンナナ
ーゼはいずれも温度安定性の点で不十分であったり、該
酵素の生成のためには長い培養時間が必要である等の欠
点を有しており、従ってこれら酵素を工業的規模で、β
−Ｄ−マンナンの加水分解生成物を得るために利用する
ことは困難であるか、コストの点で不満であった。

そこで、本発明の目的は上記のような酵素反応における
各種要件を満足し、β−Ｄ−マンナンの加水分解を、経
済的かつ工業的規模で実施することを可能とする新規な
β−マンナナーゼを提供することにある。

また、本発明のもう一つの目的は、上記の新規なβ−マ
ンナナーゼの製造方法を提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、工業的に使用するためのβ−マンナナー
ゼが具備すべきこれらの諸性質を有する酵素を生産する
能力を持つ微生物を得るべく広く天然界を検索した結果
、アルカリ性に生育の至適ｐＨを有し、バチルス属に属
するいくつかの細菌が上記要件を備えた酵素を産生じ、
またこれを量産性良く産生ずることを見出し、本発明を
完成したものである。

即ち、本発明は、まず新規β−マンナナーゼを提供する
ものであり、これは以下のような理化学的緒特性を有し
ている。

（イ）作用： マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラク
トグルコマンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド
結合を非特異的に加水分解し、マンノオリゴ糖を生成す
る。

（ロ）基質特異性： β−マンナンに特異的に作用し、α−マンナンに作用し
ない。β−１，４−Ｄ−マンノテトラオース以上の分子
量をもつマンノオリゴ糖に作用し、これを加水分解する
。

（ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは８〜１０であり、６０℃、３０分間の加熱条
件下ではｐ）１６〜１０の範囲内で安定である。

（ニ）温度に対す・る安定性： ｐＨ８，０，３０分間の加熱条件下では６５℃まで安定
である。

（ホ）作用適温の範囲ニ ７０℃近傍に至適作用温度を有する。

（へ）失活条件二 ６０℃、３０分間の処理条件ではｐＨ５，Ｏおよび１２
．５で完全に失活する。また、ｐＨ８，０，３０分間の
処理では、８０℃で完全に失活する。

（ト）阻害および活性化： 塩化第二水銀、硝酸銀、エチレンジアミン四酢酸二ナト
リウム（ＥＤＴＡＮａ２）、尿素、ドデシル硫酸ナトリ
ウム、ドデシルベンゼンスルフォン酸す）　＋Ｊウムに
より阻害を受ける。

（チ）クロマトフオーカシング法による等電点：５．３
〜５．４ （す）ゲルろ過法による分子量： ３７、０００±３．０００ 本発明は、さらに、上記の新規β−マンナナーゼの製法
にも関り、この方法によれば該β−マンナナーゼはバチ
ルス属に属し、上記β−マンナナーゼを菌体外生産する
微生物を培養し、培養液中に該酵素を生成・蓄積せしめ
、これを分離・精製することによって得ることができる
。

本発明の方法において使用する新規菌体外β−マンナナ
ーゼ生産菌株は本発明者等により新たに天然界から検索
・単離されたものである。これらの菌株ヲバージェーズ
　マニュアル　オブ　デターミナティブ　バクテリオロ
ジー（Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓＭａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ’　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）、第８版およびザ・ジーナス・バチルス（Ｔｈｅ　Ｇ
ｅｎｕｓＢａｃｉｌｌｕｓ、米国、デパートメント　オ
ブ　アグリカルチャー（Ｄｅｐｔ、ｏｆ　Ａｇｒｉｃａ
ｌｔｕｒｅ）版〕に従って同定すると、いずれも好気性
有胞子桿菌であり、運動性があり、周ペン毛を有し、ダ
ラム染色陽性もしくはバリアプル、カタラーゼテスト陽
性であることから、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に
属することは明らかであったが、ｐＨ７，５〜１１．５
のアルカリ性で良く生育することから、既知のバチルス
属菌とは分類学上異なる新菌株と考えた。

以下の第１表に単離した菌体外β−マンナナーゼ生産菌
の菌学的諸性質を示す。

第１表 尚、上記菌は工業技術院微生物工業技術研究所に、寄託
番号ＦＥＲＭ　Ｐ−８８５８（ＡＭ−０４４）として寄
託しである。

本発明の新規な菌体外β−マンナナーゼの製造法につき
更に詳しく説明する。上記のような菌体外β−マンナナ
ーゼ生産菌を適当な培地に接種し、菌体の生育温度の観
点から３０〜４０℃にて、４８〜７２時間、好気的に培
養するが、培地は炭素源、窒素源の他、必要に応じて無
機塩、微量栄養素等を含むものである。

まず、炭素源としては従来公知の各種材料を使用するこ
とができ、例えばコンニャク粉、ローカストビーンガム
、キャロブガム、グアーガムあるいはこれらを含有する
植物などを典型例として例示できる。

また、窒素源としても特に制限はなく、酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス、コーンスティ、−７’　＋Ｊカー、
アミノ酸液、大豆粕などの有機態窒素、あるいは硫安、
尿素、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機
態窒素などが安価かつ人手窓。

易なものとして例示できる。

尚、有機態窒素源は炭素源ともなることはいうまでもな
い。更に、このような炭素源、窒素源の他、一般に使用
されている各種の塩、例えばマグネシウム塩、カリウム
塩、リン酸塩、鉄塩等の無機塩、ビタミンなどを添加す
ることも可能である。

本発明の方法において使用するのに適した培地は、例え
ば１％のコンニャク粉、２％のポリペプトン、０．２％
の酵母エキス、０．１％のに、ＨＰＯ。

および０．２％のＭｇ５Ｃ）ｓ・７Ｈ２０を含有する液
体培地であり得る。

また、本発明の方法で使用する微生物の生育ｐＨは塩基
性の範囲内であるので、適当なアルカリを用いて上記培
地のｐＨ値を調整する必要がある。そのために０．５％
炭酸水素ナトリウムを典型例として挙げることができる
が、これに限定されず水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化カルシ
ウムなどのアルカリ試薬も使用できる。

本発明の方法において使用する菌はβ−マンナナーゼを
菌体外生産するので、生産されるβ−マンナナーゼは培
養液中に放出され、そこに蓄積される。これら菌の培養
はバッチ式、連続式のいずれによって行うこともでき、
生成される酵素の分離精製は例えば以下のようにして実
施することができる。

即ち、まず培養液中の菌体を遠心分離、濾過などで除去
した後、得られる上澄液（粗酵素液）をそのままβ−マ
ンナンの加水分解反応に適用することも可能であり、こ
れは経済的に有利である。

また、これを更に精製して使用することもできる。

そのためには、例えば硫安等による塩析、エタノール、
アセトン、インプロパツール等による溶媒沈殿法、限外
濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等による一般的な
酵素精製法により精製することができる。

以下に、本発明のβ−マンナナーゼの好ましい精製法の
１例につき説明する。

好アルカリ性バチルス属に属するＡＭ−０４４菌株を、
例えば上記のような培地に植菌し、３７℃にて７２時間
好気的に培養して得られる培養液に０．８％（ｗ／ｖ）
のセタブロン（セチルトリメチルアンモニウムブロマイ
ド）を添加し、３０分間放置後、７．　ＱＱＱｒｐｍ。

０℃にて２０分間遠心分離して菌体を除き、３βの上澄
液を得る。次いで、該上澄液に硫酸アンモニウムを加え
て７５％飽和とし、４℃で一夜放置する。

生じた沈殿をろ別し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０
）に溶解させ、−夜４℃で同緩衝液に対して透析する。

生じた沈殿を遠心分離して除いた上澄液を同上緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥ−１−ヨパール６５０Ｍに吸着させ
、０．１〜０．５Ｍのｊ軸Ｃ１を含む同上緩衝液の濃度
勾配法によって酵素を溶出する。溶出した活性画分を集
め、同上緩衝液に対して一夜４℃で透析した後、同上緩
衝液で平衡化したハイドロオキシアパタイトに吸着させ
る。ついで、０．４！、（リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）
で酵素を溶出させ、活性画分を集めて、平均分画分子量
１０．０００の限外濾過膜を用いて濃縮する。濃縮酵素
は、高速液体クロマトグラフ用蛋白質分取精製用カラム
、ショデックス　プロティン（ＳＨＯＤＥＸ　ｐｒｏｔ
ｅｉｎ）　ＷＳ−２００３、に充填し、１０　ｍ　！、
４リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて溶出する。かく
して得られた活性画分は濃縮した後再度同上刃ラムを用
いて同一条件で再度クロマトグラフィーにかけ、得られ
る活性画分を濃縮し、ポリアクリルアミドゲルディスク
電気泳動法〔アナルズ　オブ　ヂニューヨーク　アカデ
ミーオブサイエンス（ＡＮＮ。

Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、１９６４．１２１．
４０４）において均一な酵素標品１８ｍｇが得られ、活
性収率は２３％であった。

なお、β−マンナナーゼ活性の測定法並びに活性表示法
は以下の通りである。即ち、０．１Ｍのグリシン−Ｎａ
ＯＨＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ９，０）　０．４ｍｌと１％
（Ｗ／Ｖ）のコンニャクマンナン水溶液Ｑ、５ｍｌに酵
素液Ｑ、１ｍｌを混合し、５０℃で１０分間反応させた
後、ソモギー［Ｓｏｍｏｇｙｉ；ジャーナル　オブ　バ
イオロジカル　ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｍ、）、　　１９５２゜１９５、１９　’］液液１．
ｍｌ　を添加して酵素を失活させた後、沸騰水浴中で加
熱する。１０分後、水浴中で急冷し、ネルソン［：Ｎｅ
１ｓｏｎ、　　ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケ
ミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）。

１９４４、１５３．．３７５）液１．Ｑｍｌを加えよく
撹拌した後、水を加えて１０ｍ１にする。着色度を紫外
光（波長：６６０ｎｍ）で１００　ｔ−ｔ　ｇ　／ｉｔ
のマンノースをｌ”ｉｆｔ、：！：して測定する。酵素
活性の単位は前述の条件下で１分間に１ＭＭｏｌのマン
ノースに相当する還元糖を生成するのに要する酵素量を
１単位として表示する。

上記の菌株ＡＭ−０４４から得られる酵素の分子量は３
７、０００±３．０００である。尚、この分子量はゲル
濾過法で求めたものである。本発明のβ−マンナナーゼ
と、従来公知の微生物由来のβ−マンナナーゼの理化学
的性質および酵素化学的性質を比較して第２表に示す。

作用 天然界に多量に存在するβ−Ｄ−マンナンは、デンプン
と同様に、食品、繊維、農薬、化糖品等の各種分野で広
範に利用されている。ところで、このβ−Ｄ−マンナン
を有効利用するためには、これを効率良く加水分解し得
る酵素（β−マンナナーゼ）の開発が必要となる。即ち
、β−Ｄ−マンナンを高効率で加水分解し得る酵素を得
ることは、これを分解して有用なマンノオリゴ糖、マン
ノース、グルコース、ガラクトースなどの糖類とし、こ
れを回収、利用したり、あるいはβ−Ｄ＝マンナン自体
として使用した後にこれを分解・除去するなどの目的の
ために重要である。

このような用途において、β−マンナナーゼは高温安定
性を有し、しかもアルカリ側に酵素反応の至適ｐＨを有
するものであることが、工業的応用という観点から極め
て望ましい。

このような目的で、従来から様々な起源のマンナン加水
分解酵素が見出され、利用されてきたが、いずれも工業
的観点から十分満足し得るものではなかった。即ち、従
来研究され、また実用化されていた酵素はいずれも高温
安定性に劣るものであったり、酵素産生微生物の培養時
間が著しく長いものであった。

そこで、本発明者等は種々検索し、好アルカリ性バチル
ス属に属する細菌が有効なβ−マンナナーゼを高い生産
率で生産することを見出した。この酵素は、上記β−Ｄ
−マンナンの加水分解反応における諸要件をいずれも満
足するものであり、従来知られていた酵素の諸問題点を
いずれも解決した。

即ち、まず本発明のβ−マンナナーゼ酵素は上記微生物
により菌体外生産されるので、分離・精製法が極めて簡
単であり、労力、製造コストの点で大巾な改善が期待で
きる。

更に、高温安定性に１憂れ、しかもアルカリ側に酵素反
応の至適ｐＨを有するので、アルカリ条件下で行われる
各種植物からのβ−マンナンの抽出操作後、中和操作等
を施すことなしに、そのまま酵素分解反応に付すること
が可能であるので、作業が著しく簡略化されると共に、
余分な試薬の使用が不用となるので、分解生成物の製造
コストも節減できる。

かくして、本発明の新規な酵素によれば、工業的規模で
のβ−Ｄ−マンナンの分解利用が可能となる。また、コ
ストパーフォーマンスの点でモ極めて有利である。

以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。

実施例 好アルカリ性細菌バチルスＮｏ−ＡＭ−０４４株（ＦＢ
ＲＭＰ−８８５８）を５００ｍ１容の三角フラスコ中の
やし搾油カス２％、大豆カス１％、ＫＮ○３０．２％、
Ｎａ２ＨＰ０゜０．１％、！ＪｇＳ○、・７Ｈ２００，
０２％および炭酸ソーダ０．５％を含む培養液１００ｍ
１　（ｐＨ１，００）に植菌し、４０℃で５０時間、２
５Ｏｒ、　ｐｏｍ、　　で振とう培養した。ついで該培
養液上澄中のβ−マンナナーゼ活性を、上記同様に測定
した結果、３０単位／ｍ　１であった。

発明の効果 以上詳しく述べたように、本発明の新規なβ−マンナナ
ーゼはアルカリ側に酵素反応の至適ｐＨを有しかつ高温
安定性にも優れている。従って、β−マンナンの酵素分
解反応をアルカリ側で実施でき、このことはマンナン抽
出工程後ただちに酵素分解反応を行うことを可能とする
。更に、高温度下で酵素反応を実施し得ることから反応
速度を大巾に高めることができる。

かくして、本発明のβ−マンナナーゼによれば、工業的
に有利に、不要となったβ−Ｄ−マンナンの分解・廃棄
並びにその分解生成物の製造を行うことができ、高い分
解効率、分解生成物の生産性を達成でき、しかも製造コ
ストの節減を図ることが可能となる。

また、本発明のβ−マンナナーゼはこれを菌体外生産す
る好アルカリ性のバチルス属に属する微生物から得るこ
とができるので、分離・精製が容易であり、従って安価
に量産できるものである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有する新規β−マンナナー
   ゼ： （イ）作用： マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラク
   トグルコマンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド
   結合を非特異的に加水分解し、マンノオリゴ糖を生成す
   る。 （ロ）基質特異性： β−マンナンに特異的に作用し、α−マンナンに作用し
   ない。β−１，４−Ｄ−マンノテトラオース以上の分子
   量をもつマンノオリゴ糖に作用し、これを加水分解する
   。 （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは８〜１０であり、６０℃、３０分間の加熱条
   件下ではｐＨ６〜１０の範囲内で安定である。 （ニ）温度に対する安定性： ｐＨ８．０、３０分間の加熱条件下では６５℃まで安定
   である。 （ホ）作用適温の範囲： ７０℃近傍に至適作用温度を有する。 （へ）失活条件： ６０℃、３０分間の処理条件ではｐＨ５．０および１２
   ．５で完全に失活する。また、ｐＨ８．０、３０分間の
   処理では、８０℃で完全に失活する。 （ト）阻害および活性化： 塩化第二水銀、硝酸銀、エチレンジアミン四酢酸二ナト
   リウム（ＥＤＴＡＮａ＿２）、尿素、ドデシル硫酸ナト
   リウム、ドデシルベンゼンスルフォン酸ナトリウムによ
   り阻害を受ける。 （チ）クロマトフォーカシング法による等電点：５．３
   〜５．４ （リ）ゲルろ過法による分子量： ３７，０００±３，０００
2. （２）下記の理化学的性質： （イ）作用： マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラク
   トグルコマンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド
   結合を非特異的に加水分解し、マンノオリゴ糖を生成す
   る。 （ロ）基質特異性： β−マンナンに特異的に作用し、α−マンナンに作用し
   ない。β−１，４−Ｄ−マンノテトラオース以上の分子
   量をもつマンノオリゴ糖に作用し、これを加水分解する
   。 （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは８〜１０であり、６０℃、３０分間の加熱条
   件下ではｐＨ６〜１０の範囲内で安定である。 （ニ）温度に対する安定性： ｐＨ８．０、３０分間の加熱条件下では６５℃まで安定
   である。 （ホ）作用適温の範囲： ７０℃近傍に至適作用温度を有する。 （ヘ）失活条件： ６０℃、３０分間の処理条件ではｐＨ５．０および１２
   ．５で完全に失活する。また、ｐＨ８．０、３０分間の
   処理では、８０℃で完全に失活する。 （ト）阻害および活性化： 塩化第二水銀、硝酸銀、エチレンジアミン四酢酸二ナト
   リウム（ＥＤＴＡＮａ＿２）、尿素、ドデシル硫酸ナト
   リウム、ドデシルベンゼンスルフォン酸ナトリウムによ
   り阻害を受ける。 （チ）クロマトフォーカシング法による等電点：５．３
   〜５．４ （リ）ゲルろ過法による分子量： ３７，０００±３，０００ を有するβ−マンナナーゼ生産能を有し、生育の至適ｐ
   Ｈをアルカリ性に有するバチルス属に属する微生物を培
   養し、該β−マンナナーゼを培養液中に生成・蓄積させ
   、これを採取することを特徴とする上記新規菌体外β−
   マンナナーゼの製造方法。
3. （３）上記のβ−マンナナーゼ生産能を有する微生物が
   工業技術院微生物工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭＰ
   −８８５８（ＡＭ−０４４）として寄託された菌株であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方法
   。
4. （４）上記培養を３０〜５０℃の範囲内の温度下で好気
   的に行うことを特徴とする特許請求の範囲第２項または
   第３項に記載の菌体外βマンナナーゼの製造方法。
5. （５）上記培養液のｐＨが、７．５〜１１．５の範囲内
   にあることを特徴とする特許請求の範囲第２〜４項のい
   ずれか一項に記載の菌体外β−マンナナーゼの製造方法
   。