JPH0347076A - β―マンナナーゼおよびその製法 - Google Patents
β―マンナナーゼおよびその製法Info
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- JPH0347076A JPH0347076A JP21995189A JP21995189A JPH0347076A JP H0347076 A JPH0347076 A JP H0347076A JP 21995189 A JP21995189 A JP 21995189A JP 21995189 A JP21995189 A JP 21995189A JP H0347076 A JPH0347076 A JP H0347076A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は新規なβマンナナーゼ並びにその製造法に関す
る。更に詳しくは、バチルス属に属し、生育の至適ｐＨ
をアルカリ性に有する好アルカリ性の新規微生物を培養
して得られ、酵素反応の至適ｐＨをアルカリ性に有する
菌体外β−マンナナーゼおよびその製造法に関する。
る。更に詳しくは、バチルス属に属し、生育の至適ｐＨ
をアルカリ性に有する好アルカリ性の新規微生物を培養
して得られ、酵素反応の至適ｐＨをアルカリ性に有する
菌体外β−マンナナーゼおよびその製造法に関する。
従来の技術
β−マンナナーゼは分子内にβ−１，４−Ｄマンノピラ
ノシド結合を持つホモおよびヘテロのβ−Ｄ−マンナン
であるマンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、
ガラクトグルコマンナンなどの主要骨格であるβ−１，
４−Ｄ−マンノピラノシド結合を任意に加水分解し、粘
性を低下せしめると同時に一連のマンノオリゴ糖を生成
する酵素である。
ノシド結合を持つホモおよびヘテロのβ−Ｄ−マンナン
であるマンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、
ガラクトグルコマンナンなどの主要骨格であるβ−１，
４−Ｄ−マンノピラノシド結合を任意に加水分解し、粘
性を低下せしめると同時に一連のマンノオリゴ糖を生成
する酵素である。
まず、β−１，４−Ｄ−マンナンを含むものとして、ア
イポリ−ナツツ（学名：フイテレファス・マクロカルバ
）やコロゾがよく知られている。その他β−１．４−マ
ンナン含有植物としてはヤシ科のフオエニクス・カナリ
エンシス、オーキス・マキュラタなどが知られている。
イポリ−ナツツ（学名：フイテレファス・マクロカルバ
）やコロゾがよく知られている。その他β−１．４−マ
ンナン含有植物としてはヤシ科のフオエニクス・カナリ
エンシス、オーキス・マキュラタなどが知られている。
ガラクトマンナンはイナゴマメ及びグアーの種子に含ま
れる各々の粘質物、ローカストビーンガム及びグアーガ
ムが代表的なものであり、この二種のガラクトマンナン
は、そのままあるいは化学的な改質をほどこした後、工
業的に広く使用されている。また、ガラクトマンナンは
大豆、コーヒー豆、ムラサキウマゴヤシ、アカツメフサ
、コロハなどマメ科の植物にも多く含まれている。その
他のガラクトマンナン含有植物としてはゲニスタ・スコ
パリア、ブレデイラシャ・フエロラス、レウカエナ・グ
ラウカなどが知られている。
れる各々の粘質物、ローカストビーンガム及びグアーガ
ムが代表的なものであり、この二種のガラクトマンナン
は、そのままあるいは化学的な改質をほどこした後、工
業的に広く使用されている。また、ガラクトマンナンは
大豆、コーヒー豆、ムラサキウマゴヤシ、アカツメフサ
、コロハなどマメ科の植物にも多く含まれている。その
他のガラクトマンナン含有植物としてはゲニスタ・スコ
パリア、ブレデイラシャ・フエロラス、レウカエナ・グ
ラウカなどが知られている。
グルコマンナン含有物としてはコンニャク（学名ニアモ
ルフオファラス・コンニャク）が最も有名であるが、サ
トイモ科のアルム根、マツ属のジャックパイン、ラン科
の球根、ニジマツやハリモミなどのトウヒ属の植物など
が知られている。その他のグルコマンナン含有植物とし
ては、アスパラガス・オフィシナリス、エレムラス・ラ
スカス、エレムラス・レゲリー、エレムラス・スペクタ
ピリス、ファセオラス・アウレウスなどが知られている
。これらは、一般にアルカリ抽出法などにより得られて
いる。また、これらβ−Ｄ−マンナンは糊料あるいは増
粘剤として、食品工業や繊維産業で工業的に大量に消費
されているものである。
ルフオファラス・コンニャク）が最も有名であるが、サ
トイモ科のアルム根、マツ属のジャックパイン、ラン科
の球根、ニジマツやハリモミなどのトウヒ属の植物など
が知られている。その他のグルコマンナン含有植物とし
ては、アスパラガス・オフィシナリス、エレムラス・ラ
スカス、エレムラス・レゲリー、エレムラス・スペクタ
ピリス、ファセオラス・アウレウスなどが知られている
。これらは、一般にアルカリ抽出法などにより得られて
いる。また、これらβ−Ｄ−マンナンは糊料あるいは増
粘剤として、食品工業や繊維産業で工業的に大量に消費
されているものである。
これらβ−Ｄ−マンナンを任意に加水分解する酵素とし
て知られているβ−マンナナーゼは、従来から多数の研
究者の研究対象とされており、非常に多くの微生物由来
のものが検討されてきた。
て知られているβ−マンナナーゼは、従来から多数の研
究者の研究対象とされており、非常に多くの微生物由来
のものが検討されてきた。
例えば、〔アトパンスズ イン カルボハイドレート
ケミストリー アンド バイオケミストリー（Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、
１９７６、 ３２． ２９９−３１６）特に、糸状菌
〔アクタ ケミ力 スカンジナビ力（Ａｃｔａ。
ケミストリー アンド バイオケミストリー（Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、
１９７６、 ３２． ２９９−３１６）特に、糸状菌
〔アクタ ケミ力 スカンジナビ力（Ａｃｔａ。
Ｃｈｅｍ、 ５ｃａｎｄ、）、 １９６８，２２．
１９２４； 濃化、 １９６９゜４３、３１７；バ
イオケミカル ジャーナ／ｌ／ （Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、
Ｊ、）、 １９８４． ２１９．８５７） 、放線菌〔
アグリカルチュラル アンド バイオロジカル ケミス
トリー（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）、
１９８４．４８．２１８９〕、細菌〔ジャーナル オブ
バイオケミストリー （Ｊ。
１９２４； 濃化、 １９６９゜４３、３１７；バ
イオケミカル ジャーナ／ｌ／ （Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、
Ｊ、）、 １９８４． ２１９．８５７） 、放線菌〔
アグリカルチュラル アンド バイオロジカル ケミス
トリー（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）、
１９８４．４８．２１８９〕、細菌〔ジャーナル オブ
バイオケミストリー （Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、 １９８２，９１．１１８１ ；
特開昭５７−６５１８２号〕などの酵素が良く研究され
ている。
特開昭５７−６５１８２号〕などの酵素が良く研究され
ている。
しかしながら、これらの酵素はいずれも温度安定性に劣
る場合や、培養に長時間必要なものが多く、該酵素を工
業的に安価に使用する場合に難点を残していた。
る場合や、培養に長時間必要なものが多く、該酵素を工
業的に安価に使用する場合に難点を残していた。
発明が解決しようとする問題点
天然界に再生可能な資源として大量に存在するβ−Ｄ−
マンナンの有効利用、特に該物質の酵素的加水分解によ
るマンノオリゴ糖やマンノース、グルコース、ガラクト
ースなどの糖類を効率良く回収利用するためには耐熱性
に優れ、かつβ−マンナンの各種植物からの抽出操作が
主にアルカリ性で行われていることから、中和操作を簡
略化し、かつ分解工程を単純化するためにも、アルカリ
側に酵素反応の至適ｐＨを有することが好ましい。
マンナンの有効利用、特に該物質の酵素的加水分解によ
るマンノオリゴ糖やマンノース、グルコース、ガラクト
ースなどの糖類を効率良く回収利用するためには耐熱性
に優れ、かつβ−マンナンの各種植物からの抽出操作が
主にアルカリ性で行われていることから、中和操作を簡
略化し、かつ分解工程を単純化するためにも、アルカリ
側に酵素反応の至適ｐＨを有することが好ましい。
さらに、高温度下で酵素反応を行うことにより腐敗を防
止したり、酵素反応速度を増大し、生成物の量産性を高
めるなどが期待できることから、至適温度も高温である
ことが望ましい。
止したり、酵素反応速度を増大し、生成物の量産性を高
めるなどが期待できることから、至適温度も高温である
ことが望ましい。
しかしながら、既に述べたように、従来のβ−マンナナ
ーゼはいずれも温度安定性の点で不十分であったり、該
酵素の生成のためには長い培養時間が必要である等の欠
点を有しており、従ってこれら酵素を工業的規模で、β
−Ｄ−マンナンの加水分解生成物を得るために利用する
ことは困難であるか、コストの点で不満であった。
ーゼはいずれも温度安定性の点で不十分であったり、該
酵素の生成のためには長い培養時間が必要である等の欠
点を有しており、従ってこれら酵素を工業的規模で、β
−Ｄ−マンナンの加水分解生成物を得るために利用する
ことは困難であるか、コストの点で不満であった。
そこで、本発明の目的は上記のような酵素反応における
各種要件を満足し、β−Ｄ−マンナンの加水分解を、経
済的かつ工業的規模で実施することを可能とする新規な
β−マンナナーゼを提供することにある。
各種要件を満足し、β−Ｄ−マンナンの加水分解を、経
済的かつ工業的規模で実施することを可能とする新規な
β−マンナナーゼを提供することにある。
また、本発明のもう一つの目的は、上記の新規なβ−マ
ンナナーゼの製造方法を提供することにある。
ンナナーゼの製造方法を提供することにある。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、工業的に使用するためのβ−マンナナー
ゼが具備すべきこれらの諸性質を有する酵素を生産する
能力を持つ微生物を得るべく広く天然界を検索した結果
、アルカリ性に生育の至適ｐＨを有し、バチルス属に属
するいくつかの細菌が上記要件を備えた酵素を産生じ、
またこれを量産性良く産生ずることを見出し、本発明を
完成したものである。
ゼが具備すべきこれらの諸性質を有する酵素を生産する
能力を持つ微生物を得るべく広く天然界を検索した結果
、アルカリ性に生育の至適ｐＨを有し、バチルス属に属
するいくつかの細菌が上記要件を備えた酵素を産生じ、
またこれを量産性良く産生ずることを見出し、本発明を
完成したものである。
即ち、本発明は、まず新規β−マンナナーゼを提供する
ものであり、これは以下のような理化学的緒特性を有し
ている。
ものであり、これは以下のような理化学的緒特性を有し
ている。
（イ）作用：
マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラク
トグルコマンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド
結合を非特異的に加水分解し、マンノオリゴ糖を生成す
る。
トグルコマンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド
結合を非特異的に加水分解し、マンノオリゴ糖を生成す
る。
（ロ）基質特異性：
β−マンナンに特異的に作用し、α−マンナンに作用し
ない。β−１，４−Ｄ−マンノテトラオース以上の分子
量をもつマンノオリゴ糖に作用し、これを加水分解する
。
ない。β−１，４−Ｄ−マンノテトラオース以上の分子
量をもつマンノオリゴ糖に作用し、これを加水分解する
。
（ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：
至適ｐＨは８〜１０であり、６０℃、３０分間の加熱条
件下ではｐ）１６〜１０の範囲内で安定である。
件下ではｐ）１６〜１０の範囲内で安定である。
（ニ）温度に対す・る安定性：
ｐＨ８，０，３０分間の加熱条件下では６５℃まで安定
である。
である。
（ホ）作用適温の範囲ニ
７０℃近傍に至適作用温度を有する。
（へ）失活条件二
６０℃、３０分間の処理条件ではｐＨ５，Ｏおよび１２
．５で完全に失活する。また、ｐＨ８，０，３０分間の
処理では、８０℃で完全に失活する。
．５で完全に失活する。また、ｐＨ８，０，３０分間の
処理では、８０℃で完全に失活する。
（ト）阻害および活性化：
塩化第二水銀、硝酸銀、エチレンジアミン四酢酸二ナト
リウム（ＥＤＴＡＮａ２）、尿素、ドデシル硫酸ナトリ
ウム、ドデシルベンゼンスルフォン酸す） ＋Ｊウムに
より阻害を受ける。
リウム（ＥＤＴＡＮａ２）、尿素、ドデシル硫酸ナトリ
ウム、ドデシルベンゼンスルフォン酸す） ＋Ｊウムに
より阻害を受ける。
（チ）クロマトフオーカシング法による等電点：５．３
〜５．４ （す）ゲルろ過法による分子量： ３７、０００±３．０００ 本発明は、さらに、上記の新規β−マンナナーゼの製法
にも関り、この方法によれば該β−マンナナーゼはバチ
ルス属に属し、上記β−マンナナーゼを菌体外生産する
微生物を培養し、培養液中に該酵素を生成・蓄積せしめ
、これを分離・精製することによって得ることができる
。
〜５．４ （す）ゲルろ過法による分子量： ３７、０００±３．０００ 本発明は、さらに、上記の新規β−マンナナーゼの製法
にも関り、この方法によれば該β−マンナナーゼはバチ
ルス属に属し、上記β−マンナナーゼを菌体外生産する
微生物を培養し、培養液中に該酵素を生成・蓄積せしめ
、これを分離・精製することによって得ることができる
。
本発明の方法において使用する新規菌体外β−マンナナ
ーゼ生産菌株は本発明者等により新たに天然界から検索
・単離されたものである。これらの菌株ヲバージェーズ
マニュアル オブ デターミナティブ バクテリオロ
ジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ ｓＭａｎｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ’ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）、第８版およびザ・ジーナス・バチルス（Ｔｈｅ Ｇ
ｅｎｕｓＢａｃｉｌｌｕｓ、米国、デパートメント オ
ブ アグリカルチャー（Ｄｅｐｔ、ｏｆ Ａｇｒｉｃａ
ｌｔｕｒｅ）版〕に従って同定すると、いずれも好気性
有胞子桿菌であり、運動性があり、周ペン毛を有し、ダ
ラム染色陽性もしくはバリアプル、カタラーゼテスト陽
性であることから、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に
属することは明らかであったが、ｐＨ７，５〜１１．５
のアルカリ性で良く生育することから、既知のバチルス
属菌とは分類学上異なる新菌株と考えた。
ーゼ生産菌株は本発明者等により新たに天然界から検索
・単離されたものである。これらの菌株ヲバージェーズ
マニュアル オブ デターミナティブ バクテリオロ
ジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ ｓＭａｎｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ’ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）、第８版およびザ・ジーナス・バチルス（Ｔｈｅ Ｇ
ｅｎｕｓＢａｃｉｌｌｕｓ、米国、デパートメント オ
ブ アグリカルチャー（Ｄｅｐｔ、ｏｆ Ａｇｒｉｃａ
ｌｔｕｒｅ）版〕に従って同定すると、いずれも好気性
有胞子桿菌であり、運動性があり、周ペン毛を有し、ダ
ラム染色陽性もしくはバリアプル、カタラーゼテスト陽
性であることから、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に
属することは明らかであったが、ｐＨ７，５〜１１．５
のアルカリ性で良く生育することから、既知のバチルス
属菌とは分類学上異なる新菌株と考えた。
以下の第１表に単離した菌体外β−マンナナーゼ生産菌
の菌学的諸性質を示す。
の菌学的諸性質を示す。
第１表
尚、上記菌は工業技術院微生物工業技術研究所に、寄託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−８８５８（ＡＭ−０４４）として寄
託しである。
番号ＦＥＲＭ Ｐ−８８５８（ＡＭ−０４４）として寄
託しである。
本発明の新規な菌体外β−マンナナーゼの製造法につき
更に詳しく説明する。上記のような菌体外β−マンナナ
ーゼ生産菌を適当な培地に接種し、菌体の生育温度の観
点から３０〜４０℃にて、４８〜７２時間、好気的に培
養するが、培地は炭素源、窒素源の他、必要に応じて無
機塩、微量栄養素等を含むものである。
更に詳しく説明する。上記のような菌体外β−マンナナ
ーゼ生産菌を適当な培地に接種し、菌体の生育温度の観
点から３０〜４０℃にて、４８〜７２時間、好気的に培
養するが、培地は炭素源、窒素源の他、必要に応じて無
機塩、微量栄養素等を含むものである。
まず、炭素源としては従来公知の各種材料を使用するこ
とができ、例えばコンニャク粉、ローカストビーンガム
、キャロブガム、グアーガムあるいはこれらを含有する
植物などを典型例として例示できる。
とができ、例えばコンニャク粉、ローカストビーンガム
、キャロブガム、グアーガムあるいはこれらを含有する
植物などを典型例として例示できる。
また、窒素源としても特に制限はなく、酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス、コーンスティ、−７’ ＋Ｊカー、
アミノ酸液、大豆粕などの有機態窒素、あるいは硫安、
尿素、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機
態窒素などが安価かつ人手窓。
プトン、肉エキス、コーンスティ、−７’ ＋Ｊカー、
アミノ酸液、大豆粕などの有機態窒素、あるいは硫安、
尿素、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機
態窒素などが安価かつ人手窓。
易なものとして例示できる。
尚、有機態窒素源は炭素源ともなることはいうまでもな
い。更に、このような炭素源、窒素源の他、一般に使用
されている各種の塩、例えばマグネシウム塩、カリウム
塩、リン酸塩、鉄塩等の無機塩、ビタミンなどを添加す
ることも可能である。
い。更に、このような炭素源、窒素源の他、一般に使用
されている各種の塩、例えばマグネシウム塩、カリウム
塩、リン酸塩、鉄塩等の無機塩、ビタミンなどを添加す
ることも可能である。
本発明の方法において使用するのに適した培地は、例え
ば１％のコンニャク粉、２％のポリペプトン、０．２％
の酵母エキス、０．１％のに、ＨＰＯ。
ば１％のコンニャク粉、２％のポリペプトン、０．２％
の酵母エキス、０．１％のに、ＨＰＯ。
および０．２％のＭｇ５Ｃ）ｓ・７Ｈ２０を含有する液
体培地であり得る。
体培地であり得る。
また、本発明の方法で使用する微生物の生育ｐＨは塩基
性の範囲内であるので、適当なアルカリを用いて上記培
地のｐＨ値を調整する必要がある。そのために０．５％
炭酸水素ナトリウムを典型例として挙げることができる
が、これに限定されず水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化カルシ
ウムなどのアルカリ試薬も使用できる。
性の範囲内であるので、適当なアルカリを用いて上記培
地のｐＨ値を調整する必要がある。そのために０．５％
炭酸水素ナトリウムを典型例として挙げることができる
が、これに限定されず水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化カルシ
ウムなどのアルカリ試薬も使用できる。
本発明の方法において使用する菌はβ−マンナナーゼを
菌体外生産するので、生産されるβ−マンナナーゼは培
養液中に放出され、そこに蓄積される。これら菌の培養
はバッチ式、連続式のいずれによって行うこともでき、
生成される酵素の分離精製は例えば以下のようにして実
施することができる。
菌体外生産するので、生産されるβ−マンナナーゼは培
養液中に放出され、そこに蓄積される。これら菌の培養
はバッチ式、連続式のいずれによって行うこともでき、
生成される酵素の分離精製は例えば以下のようにして実
施することができる。
即ち、まず培養液中の菌体を遠心分離、濾過などで除去
した後、得られる上澄液（粗酵素液）をそのままβ−マ
ンナンの加水分解反応に適用することも可能であり、こ
れは経済的に有利である。
した後、得られる上澄液（粗酵素液）をそのままβ−マ
ンナンの加水分解反応に適用することも可能であり、こ
れは経済的に有利である。
また、これを更に精製して使用することもできる。
そのためには、例えば硫安等による塩析、エタノール、
アセトン、インプロパツール等による溶媒沈殿法、限外
濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等による一般的な
酵素精製法により精製することができる。
アセトン、インプロパツール等による溶媒沈殿法、限外
濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等による一般的な
酵素精製法により精製することができる。
以下に、本発明のβ−マンナナーゼの好ましい精製法の
１例につき説明する。
１例につき説明する。
好アルカリ性バチルス属に属するＡＭ−０４４菌株を、
例えば上記のような培地に植菌し、３７℃にて７２時間
好気的に培養して得られる培養液に０．８％（ｗ／ｖ）
のセタブロン（セチルトリメチルアンモニウムブロマイ
ド）を添加し、３０分間放置後、７． ＱＱＱｒｐｍ。
例えば上記のような培地に植菌し、３７℃にて７２時間
好気的に培養して得られる培養液に０．８％（ｗ／ｖ）
のセタブロン（セチルトリメチルアンモニウムブロマイ
ド）を添加し、３０分間放置後、７． ＱＱＱｒｐｍ。
０℃にて２０分間遠心分離して菌体を除き、３βの上澄
液を得る。次いで、該上澄液に硫酸アンモニウムを加え
て７５％飽和とし、４℃で一夜放置する。
液を得る。次いで、該上澄液に硫酸アンモニウムを加え
て７５％飽和とし、４℃で一夜放置する。
生じた沈殿をろ別し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０
）に溶解させ、−夜４℃で同緩衝液に対して透析する。
）に溶解させ、−夜４℃で同緩衝液に対して透析する。
生じた沈殿を遠心分離して除いた上澄液を同上緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥ−１−ヨパール６５０Ｍに吸着させ
、０．１〜０．５Ｍのｊ軸Ｃ１を含む同上緩衝液の濃度
勾配法によって酵素を溶出する。溶出した活性画分を集
め、同上緩衝液に対して一夜４℃で透析した後、同上緩
衝液で平衡化したハイドロオキシアパタイトに吸着させ
る。ついで、０．４！、（リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）
で酵素を溶出させ、活性画分を集めて、平均分画分子量
１０．０００の限外濾過膜を用いて濃縮する。濃縮酵素
は、高速液体クロマトグラフ用蛋白質分取精製用カラム
、ショデックス プロティン（ＳＨＯＤＥＸ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ） ＷＳ−２００３、に充填し、１０ ｍ ！、
４リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて溶出する。かく
して得られた活性画分は濃縮した後再度同上刃ラムを用
いて同一条件で再度クロマトグラフィーにかけ、得られ
る活性画分を濃縮し、ポリアクリルアミドゲルディスク
電気泳動法〔アナルズ オブ ヂニューヨーク アカデ
ミーオブサイエンス（ＡＮＮ。
平衡化したＤＥＡＥ−１−ヨパール６５０Ｍに吸着させ
、０．１〜０．５Ｍのｊ軸Ｃ１を含む同上緩衝液の濃度
勾配法によって酵素を溶出する。溶出した活性画分を集
め、同上緩衝液に対して一夜４℃で透析した後、同上緩
衝液で平衡化したハイドロオキシアパタイトに吸着させ
る。ついで、０．４！、（リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）
で酵素を溶出させ、活性画分を集めて、平均分画分子量
１０．０００の限外濾過膜を用いて濃縮する。濃縮酵素
は、高速液体クロマトグラフ用蛋白質分取精製用カラム
、ショデックス プロティン（ＳＨＯＤＥＸ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ） ＷＳ−２００３、に充填し、１０ ｍ ！、
４リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて溶出する。かく
して得られた活性画分は濃縮した後再度同上刃ラムを用
いて同一条件で再度クロマトグラフィーにかけ、得られ
る活性画分を濃縮し、ポリアクリルアミドゲルディスク
電気泳動法〔アナルズ オブ ヂニューヨーク アカデ
ミーオブサイエンス（ＡＮＮ。
Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）、１９６４．１２１．
４０４）において均一な酵素標品１８ｍｇが得られ、活
性収率は２３％であった。
４０４）において均一な酵素標品１８ｍｇが得られ、活
性収率は２３％であった。
なお、β−マンナナーゼ活性の測定法並びに活性表示法
は以下の通りである。即ち、０．１Ｍのグリシン−Ｎａ
ＯＨＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ９，０） ０．４ｍｌと１％
（Ｗ／Ｖ）のコンニャクマンナン水溶液Ｑ、５ｍｌに酵
素液Ｑ、１ｍｌを混合し、５０℃で１０分間反応させた
後、ソモギー［Ｓｏｍｏｇｙｉ；ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈ
ｅｍ、）、 １９５２゜１９５、１９ ’］液液１．
ｍｌ を添加して酵素を失活させた後、沸騰水浴中で加
熱する。１０分後、水浴中で急冷し、ネルソン［：Ｎｅ
１ｓｏｎ、 ジャーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）。
は以下の通りである。即ち、０．１Ｍのグリシン−Ｎａ
ＯＨＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ９，０） ０．４ｍｌと１％
（Ｗ／Ｖ）のコンニャクマンナン水溶液Ｑ、５ｍｌに酵
素液Ｑ、１ｍｌを混合し、５０℃で１０分間反応させた
後、ソモギー［Ｓｏｍｏｇｙｉ；ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈ
ｅｍ、）、 １９５２゜１９５、１９ ’］液液１．
ｍｌ を添加して酵素を失活させた後、沸騰水浴中で加
熱する。１０分後、水浴中で急冷し、ネルソン［：Ｎｅ
１ｓｏｎ、 ジャーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）。
１９４４、１５３．．３７５）液１．Ｑｍｌを加えよく
撹拌した後、水を加えて１０ｍ１にする。着色度を紫外
光（波長：６６０ｎｍ）で１００ ｔ−ｔ ｇ ／ｉｔ
のマンノースをｌ”ｉｆｔ、：！：して測定する。酵素
活性の単位は前述の条件下で１分間に１ＭＭｏｌのマン
ノースに相当する還元糖を生成するのに要する酵素量を
１単位として表示する。
撹拌した後、水を加えて１０ｍ１にする。着色度を紫外
光（波長：６６０ｎｍ）で１００ ｔ−ｔ ｇ ／ｉｔ
のマンノースをｌ”ｉｆｔ、：！：して測定する。酵素
活性の単位は前述の条件下で１分間に１ＭＭｏｌのマン
ノースに相当する還元糖を生成するのに要する酵素量を
１単位として表示する。
上記の菌株ＡＭ−０４４から得られる酵素の分子量は３
７、０００±３．０００である。尚、この分子量はゲル
濾過法で求めたものである。本発明のβ−マンナナーゼ
と、従来公知の微生物由来のβ−マンナナーゼの理化学
的性質および酵素化学的性質を比較して第２表に示す。
７、０００±３．０００である。尚、この分子量はゲル
濾過法で求めたものである。本発明のβ−マンナナーゼ
と、従来公知の微生物由来のβ−マンナナーゼの理化学
的性質および酵素化学的性質を比較して第２表に示す。
作用
天然界に多量に存在するβ−Ｄ−マンナンは、デンプン
と同様に、食品、繊維、農薬、化糖品等の各種分野で広
範に利用されている。ところで、このβ−Ｄ−マンナン
を有効利用するためには、これを効率良く加水分解し得
る酵素（β−マンナナーゼ）の開発が必要となる。即ち
、β−Ｄ−マンナンを高効率で加水分解し得る酵素を得
ることは、これを分解して有用なマンノオリゴ糖、マン
ノース、グルコース、ガラクトースなどの糖類とし、こ
れを回収、利用したり、あるいはβ−Ｄ＝マンナン自体
として使用した後にこれを分解・除去するなどの目的の
ために重要である。
と同様に、食品、繊維、農薬、化糖品等の各種分野で広
範に利用されている。ところで、このβ−Ｄ−マンナン
を有効利用するためには、これを効率良く加水分解し得
る酵素（β−マンナナーゼ）の開発が必要となる。即ち
、β−Ｄ−マンナンを高効率で加水分解し得る酵素を得
ることは、これを分解して有用なマンノオリゴ糖、マン
ノース、グルコース、ガラクトースなどの糖類とし、こ
れを回収、利用したり、あるいはβ−Ｄ＝マンナン自体
として使用した後にこれを分解・除去するなどの目的の
ために重要である。
このような用途において、β−マンナナーゼは高温安定
性を有し、しかもアルカリ側に酵素反応の至適ｐＨを有
するものであることが、工業的応用という観点から極め
て望ましい。
性を有し、しかもアルカリ側に酵素反応の至適ｐＨを有
するものであることが、工業的応用という観点から極め
て望ましい。
このような目的で、従来から様々な起源のマンナン加水
分解酵素が見出され、利用されてきたが、いずれも工業
的観点から十分満足し得るものではなかった。即ち、従
来研究され、また実用化されていた酵素はいずれも高温
安定性に劣るものであったり、酵素産生微生物の培養時
間が著しく長いものであった。
分解酵素が見出され、利用されてきたが、いずれも工業
的観点から十分満足し得るものではなかった。即ち、従
来研究され、また実用化されていた酵素はいずれも高温
安定性に劣るものであったり、酵素産生微生物の培養時
間が著しく長いものであった。
そこで、本発明者等は種々検索し、好アルカリ性バチル
ス属に属する細菌が有効なβ−マンナナーゼを高い生産
率で生産することを見出した。この酵素は、上記β−Ｄ
−マンナンの加水分解反応における諸要件をいずれも満
足するものであり、従来知られていた酵素の諸問題点を
いずれも解決した。
ス属に属する細菌が有効なβ−マンナナーゼを高い生産
率で生産することを見出した。この酵素は、上記β−Ｄ
−マンナンの加水分解反応における諸要件をいずれも満
足するものであり、従来知られていた酵素の諸問題点を
いずれも解決した。
即ち、まず本発明のβ−マンナナーゼ酵素は上記微生物
により菌体外生産されるので、分離・精製法が極めて簡
単であり、労力、製造コストの点で大巾な改善が期待で
きる。
により菌体外生産されるので、分離・精製法が極めて簡
単であり、労力、製造コストの点で大巾な改善が期待で
きる。
更に、高温安定性に１憂れ、しかもアルカリ側に酵素反
応の至適ｐＨを有するので、アルカリ条件下で行われる
各種植物からのβ−マンナンの抽出操作後、中和操作等
を施すことなしに、そのまま酵素分解反応に付すること
が可能であるので、作業が著しく簡略化されると共に、
余分な試薬の使用が不用となるので、分解生成物の製造
コストも節減できる。
応の至適ｐＨを有するので、アルカリ条件下で行われる
各種植物からのβ−マンナンの抽出操作後、中和操作等
を施すことなしに、そのまま酵素分解反応に付すること
が可能であるので、作業が著しく簡略化されると共に、
余分な試薬の使用が不用となるので、分解生成物の製造
コストも節減できる。
かくして、本発明の新規な酵素によれば、工業的規模で
のβ−Ｄ−マンナンの分解利用が可能となる。また、コ
ストパーフォーマンスの点でモ極めて有利である。
のβ−Ｄ−マンナンの分解利用が可能となる。また、コ
ストパーフォーマンスの点でモ極めて有利である。
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。
実施例
好アルカリ性細菌バチルスＮｏ−ＡＭ−０４４株（ＦＢ
ＲＭＰ−８８５８）を５００ｍ１容の三角フラスコ中の
やし搾油カス２％、大豆カス１％、ＫＮ○３０．２％、
Ｎａ２ＨＰ０゜０．１％、！ＪｇＳ○、・７Ｈ２００，
０２％および炭酸ソーダ０．５％を含む培養液１００ｍ
１ （ｐＨ１，００）に植菌し、４０℃で５０時間、２
５Ｏｒ、 ｐｏｍ、 で振とう培養した。ついで該培
養液上澄中のβ−マンナナーゼ活性を、上記同様に測定
した結果、３０単位／ｍ １であった。
ＲＭＰ−８８５８）を５００ｍ１容の三角フラスコ中の
やし搾油カス２％、大豆カス１％、ＫＮ○３０．２％、
Ｎａ２ＨＰ０゜０．１％、！ＪｇＳ○、・７Ｈ２００，
０２％および炭酸ソーダ０．５％を含む培養液１００ｍ
１ （ｐＨ１，００）に植菌し、４０℃で５０時間、２
５Ｏｒ、 ｐｏｍ、 で振とう培養した。ついで該培
養液上澄中のβ−マンナナーゼ活性を、上記同様に測定
した結果、３０単位／ｍ １であった。
発明の効果
以上詳しく述べたように、本発明の新規なβ−マンナナ
ーゼはアルカリ側に酵素反応の至適ｐＨを有しかつ高温
安定性にも優れている。従って、β−マンナンの酵素分
解反応をアルカリ側で実施でき、このことはマンナン抽
出工程後ただちに酵素分解反応を行うことを可能とする
。更に、高温度下で酵素反応を実施し得ることから反応
速度を大巾に高めることができる。
ーゼはアルカリ側に酵素反応の至適ｐＨを有しかつ高温
安定性にも優れている。従って、β−マンナンの酵素分
解反応をアルカリ側で実施でき、このことはマンナン抽
出工程後ただちに酵素分解反応を行うことを可能とする
。更に、高温度下で酵素反応を実施し得ることから反応
速度を大巾に高めることができる。
かくして、本発明のβ−マンナナーゼによれば、工業的
に有利に、不要となったβ−Ｄ−マンナンの分解・廃棄
並びにその分解生成物の製造を行うことができ、高い分
解効率、分解生成物の生産性を達成でき、しかも製造コ
ストの節減を図ることが可能となる。
に有利に、不要となったβ−Ｄ−マンナンの分解・廃棄
並びにその分解生成物の製造を行うことができ、高い分
解効率、分解生成物の生産性を達成でき、しかも製造コ
ストの節減を図ることが可能となる。
また、本発明のβ−マンナナーゼはこれを菌体外生産す
る好アルカリ性のバチルス属に属する微生物から得るこ
とができるので、分離・精製が容易であり、従って安価
に量産できるものである。
る好アルカリ性のバチルス属に属する微生物から得るこ
とができるので、分離・精製が容易であり、従って安価
に量産できるものである。
Claims (5)
- （１）下記の理化学的性質を有する新規β−マンナナー
ゼ： （イ）作用： マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラク
トグルコマンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド
結合を非特異的に加水分解し、マンノオリゴ糖を生成す
る。 （ロ）基質特異性： β−マンナンに特異的に作用し、α−マンナンに作用し
ない。β−１，４−Ｄ−マンノテトラオース以上の分子
量をもつマンノオリゴ糖に作用し、これを加水分解する
。 （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは８〜１０であり、６０℃、３０分間の加熱条
件下ではｐＨ６〜１０の範囲内で安定である。 （ニ）温度に対する安定性： ｐＨ８．０、３０分間の加熱条件下では６５℃まで安定
である。 （ホ）作用適温の範囲： ７０℃近傍に至適作用温度を有する。 （へ）失活条件： ６０℃、３０分間の処理条件ではｐＨ５．０および１２
．５で完全に失活する。また、ｐＨ８．０、３０分間の
処理では、８０℃で完全に失活する。 （ト）阻害および活性化： 塩化第二水銀、硝酸銀、エチレンジアミン四酢酸二ナト
リウム（ＥＤＴＡＮａ＿２）、尿素、ドデシル硫酸ナト
リウム、ドデシルベンゼンスルフォン酸ナトリウムによ
り阻害を受ける。 （チ）クロマトフォーカシング法による等電点：５．３
〜５．４ （リ）ゲルろ過法による分子量： ３７，０００±３，０００ - （２）下記の理化学的性質： （イ）作用： マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラク
トグルコマンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド
結合を非特異的に加水分解し、マンノオリゴ糖を生成す
る。 （ロ）基質特異性： β−マンナンに特異的に作用し、α−マンナンに作用し
ない。β−１，４−Ｄ−マンノテトラオース以上の分子
量をもつマンノオリゴ糖に作用し、これを加水分解する
。 （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは８〜１０であり、６０℃、３０分間の加熱条
件下ではｐＨ６〜１０の範囲内で安定である。 （ニ）温度に対する安定性： ｐＨ８．０、３０分間の加熱条件下では６５℃まで安定
である。 （ホ）作用適温の範囲： ７０℃近傍に至適作用温度を有する。 （ヘ）失活条件： ６０℃、３０分間の処理条件ではｐＨ５．０および１２
．５で完全に失活する。また、ｐＨ８．０、３０分間の
処理では、８０℃で完全に失活する。 （ト）阻害および活性化： 塩化第二水銀、硝酸銀、エチレンジアミン四酢酸二ナト
リウム（ＥＤＴＡＮａ＿２）、尿素、ドデシル硫酸ナト
リウム、ドデシルベンゼンスルフォン酸ナトリウムによ
り阻害を受ける。 （チ）クロマトフォーカシング法による等電点：５．３
〜５．４ （リ）ゲルろ過法による分子量： ３７，０００±３，０００ を有するβ−マンナナーゼ生産能を有し、生育の至適ｐ
Ｈをアルカリ性に有するバチルス属に属する微生物を培
養し、該β−マンナナーゼを培養液中に生成・蓄積させ
、これを採取することを特徴とする上記新規菌体外β−
マンナナーゼの製造方法。 - （３）上記のβ−マンナナーゼ生産能を有する微生物が
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭＰ
−８８５８（ＡＭ−０４４）として寄託された菌株であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方法
。 - （４）上記培養を３０〜５０℃の範囲内の温度下で好気
的に行うことを特徴とする特許請求の範囲第２項または
第３項に記載の菌体外βマンナナーゼの製造方法。 - （５）上記培養液のｐＨが、７．５〜１１．５の範囲内
にあることを特徴とする特許請求の範囲第２〜４項のい
ずれか一項に記載の菌体外β−マンナナーゼの製造方法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21995189A JPH0347076A (ja) | 1989-08-25 | 1989-08-25 | β―マンナナーゼおよびその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21995189A JPH0347076A (ja) | 1989-08-25 | 1989-08-25 | β―マンナナーゼおよびその製法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17958686A Division JPS6356289A (ja) | 1986-07-30 | 1986-07-30 | β−マンナナ−ゼおよびその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0347076A true JPH0347076A (ja) | 1991-02-28 |
| JPH0518554B2 JPH0518554B2 (ja) | 1993-03-12 |
Family
ID=16743597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21995189A Granted JPH0347076A (ja) | 1989-08-25 | 1989-08-25 | β―マンナナーゼおよびその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0347076A (ja) |
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