MX2013014236A - Biogas a partir de bagazo tratado con enzimas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso para el tratamiento de un material derivado del bagazo tal tratamiento incrementa la degradabilidad de las fibras lignocelulósicas. En particular la invención se refiere a una producción de metano a partir de un material derivado del bagazo tratado enzimáticamente, en donde el tratamiento con la enzima de la invención es utilizado para incrementar la producción del metano en comparación con el bagazo no tratado.

Description

BIOGAS A PARTIR DE BAGAZO TRATADO CON ENZIMAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a un proceso para el tratamiento de un material derivado del bagazo que comprende fibras lignocelulósicas en las cuales el tratamiento incrementa la degradabilidad de las fibras lignocelulósicas. En particular la invención se refiere a una producción de metano a partir de un bagazo, en donde el tratamiento con la enzima de la invención es utilizado para incrementar la producción del metano en comparación con el bagazo no tratado.

Antecedentes de la Invención La mayoría del material a base de una planta natural comprende una cantidad significativa de fibras lignocelulósicas que no son digeribles o solamente digeribles lentamente en muchos sistemas biológicos. Esto tiene las consecuencias de que para muchos procesos biológicos que en la conversión de un material a base de una planta, una fracción significativa del material tratado no será digerida o solamente digerida a un grado bajo durante el tratamiento.

El bagazo es la materia fibrosa que permanece después de que los tallos del sorgo o de la caña de azúcar son triturados para extraer su jugo. El mismo es utilizado comúnmente como un biocombustible o como un recurso renovable Ref. 245295 en la fabricación de los productos de la pulpa y del papel y materiales de construcción. Para cada 10 toneladas de caña de azúcar trituradas, una fábrica de azúcar produce casi 3 toneladas de bagazo húmedo. Puesto que el bagazo es un subproducto de la industria del azúcar de la caña, la cantidad de la producción en cada país está en línea con la cantidad de caña de azúcar producida. El contenido del bagazo es típicamente del 40 % al 50 % y el contenido de los sólidos está compuesto de aproximadamente 45-50 % de celulosa, 20-25 % de hemicelulosa, 18-24 % de lignina y 1-4 % de ceniza sobre una base lavada y seca.

Breve Descripción de la Invención La invención se refiere a un proceso de producción de biogas basado en un material derivado del bagazo, en donde el proceso comprende al menos un pre-tratamiento enzimático del material previo a la fermentación para la producción de un biogas anaeróbico en el tanque digestor, o al menos una etapa de tratamiento enzimático en el tanque digestor del biogas ya sea previo a, o durante la fermentación anaeróbica.

En consecuencia, en un primer aspecto, la invención se refiere a un proceso de producción del biogas que comprende las etapas de proporcionar una suspensión que comprende un material derivado del bagazo y agua, y: (a) efectuar un pre-tratamiento que comprende agregar una o más enzimas a la suspensión para degradar el material derivado del bagazo a una temperatura y pH adecuados, y luego agregar el material degradado con la enzima a un tanque digestor del biogas a una velocidad y proporción adecuadas para convertir efectivamente el material al biogas en el digestor; o (b) agregar una o más enzimas a la suspensión antes de agregar la suspensión a un tanque digestor del biogas, o (c) agregar una o más enzimas al tanque digestor después de agregar la suspensión al tanque digestor, para degradar el material derivado del bagazo a una temperatura y pH adecuados y para convertir efectivamente el material al biogas en el digestor.

Varias ventajas son provistas por el proceso de la invención, incluyendo, pero sin estar limitado a: - Una velocidad de conversión más elevada en EL tanque digestor del biogas .

Una productividad más elevada por unidad de volumen en el tanque digestor.

- Una inversión inferior en la capacidad del tanque .

- Una producción más elevada del gas por volumen del tanque.

Una conversión más eficiente del material derivado del bagazo a una concentración de la materia seca más elevada.

- Cantidades reducidas del material no convertido en la purga .

- Un contenido más elevado de la materia seca en los sólidos no convertidos.

- Ninguna necesidad de un post- convertidor o un tanque de almacenamiento.

Un desaguado más facilitado del material no convertido .

- Una limpieza más facilitada de la fase gaseosa. Definiciones Biogas El término "biogas" de acuerdo con la invención está propuesto para que signifique el gas obtenido en el termentador anaeróbico convencional. El componente principal del biogas es el metano y los términos "biogas" y "metano" son utilizados intercambiablemente en esta solicitud y las reivindicaciones .

El término "digestor primario" en esta solicitud y en las reivindicaciones está propuesto para que signifique el recipiente en donde la primera fermentación anaeróbica se lleva a cabo.

El término "digestor secundario" en está solicitud y las reivindicaciones está propuesto para que signifique el recipiente en donde se lleva a cabo la segunda fermentación anaeróbica. Dependiendo de la configuración particular de la instalación del biogas, el digestor primario también puede servir como el digestor secundario.

Material derivado del bagazo: El término "material derivado del bagazo" en esta solicitud y las reivindicaciones está propuesto para que signifique cualquier material que comprende el bagazo o el material derivado del mismo, en cualquier forma, cantidad o proporción. El material derivado del bagazo puede comprender otros componentes derivados de las plantas. La parte de los sólidos del bagazo está compuesta típicamente de aproximadamente 45-50 % de celulosa, 20-25 % de hemicelulosa, 18-24 % de lignina y 1-4 % de ceniza. Los componentes derivados de una planta, típicos, son el almidón, los glucanos, arábanos, galactanos, pectinas, mananos, galactomananos y hemicelulosas tales como los xilanos. El material derivado del bagazo puede ser cualquier material tratado o no tratado derivado del bagazo así como cualquier composición que comprenda tal material.

Pre-tratamiento : El término "pre-tratamiento" está propuesto para incluir cualquier tratamiento adecuado del material previo a la etapa de producción del biogas, real. El material derivado del bagazo, el cual simplemente puede ser el bagazo de la caña de azúcar, puede ser pretratado de cualquier manera adecuada. El pre-tratamiento se lleva a cabo antes o al mismo tiempo que la hidrólisis enzimática. El propósito del pre-tratamiento es reducir el tamaño de partícula, la separación y/o la liberación de la celulosa; la hemicelulosa y/o la lignina y de esta manera aumentar la velocidad de la hidrólisis. Los procesos de pre-tratamiento tales como la oxidación en fase húmeda y el pre-tratamiento alcalino tienen como objetivo la lignina, mientras que la disolución con un ácido y la auto-hidrólisis tienen como objetivo la hemicelulosa. La explosión de vapor es un ejemplo de un pre-tratamiento que tiene como objetivo la lignina.

La etapa de pre-tratamiento puede ser una etapa de pre-tratamiento convencional que utiliza las técnicas bien conocidas en el arte, tales como, la molienda o la molienda en húmedo. En una modalidad preferida, el pre-tratamiento se lleva a cabo en una suspensión del material derivado del bagazo y el agua. El material derivado del bagazo puede estar presente durante el pre-tratamiento en una cantidad entre 10-80 % en peso, preferentemente entre 20-70 % en peso, especialmente entre 30-60 % en peso, tal como alrededor de 50 % en peso.

Pre-tratamiento Químico, Mecánico y/o Biológico El material derivado del bagazo de acuerdo con la invención puede ser pre-tratado químicamente, mecánicamente y/o biológicamente antes de la hidrólisis de acuerdo con el proceso de la invención. El pre- ratamiento mecánico (referido frecuentemente como el pre-tratamiento "físico") puede ser llevado a cabo solo o puede ser combinado con otros procesos de pre-tratamiento .

Preferentemente, el pre-tratamiento químico, mecánico y/o biológico se lleva a cabo previo a la hidrólisis. Alternativamente, el pre-tratamiento químico, mecánico y/o biológico puede ser llevado a cabo simultáneamente con la hidrólisis, tal como simultáneamente con la adición de una o más enzimas de hidrolización, y/u otras actividades de la enzima, para liberar los azúcares fermentables , tales como la glucosa y/o la maltosa.

Pre-tratamiento Químico El término "pre-tratamiento químico" se refiere a cualquier pre-tratamiento químico que promueva la separación y/o la liberación de la celulosa, hemicelulosa y/o lignina. Los ejemplos de los pre-tratamientos químicos adecuados incluyen el tratamiento con; por ejemplo, el ácido diluido, la cal, substancias alcalinas, un solvente orgánico, amoniaco, dióxido de azufre, dióxido de carbono. Además, la oxidación en fase húmeda y la hidrotermólisis controlada por el pH también son consideradas un pre-tratamiento químico.

Otras técnicas de pre-tratamiento también están contempladas de acuerdo con la invención. El tratamiento con un solvente de celulosa se ha mostrado que convierte aproximadamente 90 % de la celulosa a la glucosa. También se ha mostrado que la hidrólisis enzimática podría ser mejorada ampliamente cuando la estructura de la lignocelulosa es alterada. El H202 alcalino, el ozono, el organosolv (que utiliza los ácidos de Lewis, FaCl3, Al2(S04)3 en los alcoholes acuosos), el glicerol, el dioxano, fenol, o etilen glicol, están entre los solventes que se sabe que alteran la estructura de la celulosa y promueven la hidrólisis (Mosier et al. Bioresource Technology 96 (2005), p. 673-686).

El pre-tratamiento químico alcalino con una base, por ejemplo, NaOH, Na2C03, NaHC03, Ca(OH)2, hidrato de cal, amoniaco y/o KOH o semejantes, también está dentro del alcance de la invención. Los procesos de pre-tratamiento que utilizan el amoniaco se describen, por ejemplo, en WO 2006/110891, WO 2006/11899, WO 2006/11900, WO 2006/110901, las cuales son incorporadas por el presente para referencia. También, los procesos de fabricación de la pulpa Kraft como se describen por ejemplo en "Pulp Processes" por Sven A. Rydholm, páginas 583-684. ISBN 0-89874-856-9 (1985) podrían ser utilizados. La pulpa sólida (aproximadamente 50 % en peso basado en los fragmentos de madera seca) es recolectada y se lava antes de los tratamientos enzimáticos.

Las técnicas de oxidación en fase húmeda involucran el uso de agentes oxidantes, tales como: agentes oxidantes basados en el sulfito o semejantes. Los ejemplos de los pre- tratamientos con un solvente incluyen el tratamiento con DMSO (sulfóxido de dimetilo) o semejantes. El pre-tratamiento químico generalmente es llevado a cabo durante 1 a 60 minutos, tal como desde 5 hasta 30 minutos, pero puede ser llevado a cabo durante periodos más breves o más prolongados del tiempo dependiendo del material que va a ser pre-tratado .

Otros ejemplos de los procesos de pre-tratamiento adecuados son descritos por Schell et al. (2003) Appl . Biochem and Biotechn. Vol . 105-108, p. 69-85, y Mosier et al. Bioresource Technology 96 (2005) 673-686, y la publicación US No. 2002/0164730, tales referencias son incorporadas todas para referencia por el presente.

Pre-tratamiento Mecánico El término "pre-tratamiento mecánico" se refiere a cualquier pre-tratamiento mecánico (o físico) que promueva la separación y/o la liberación de la celulosa, hemicelulosa y/o lignina del material derivado del bagazo. Por ejemplo, el pre-tratamiento mecánico incluye varios tipos de molienda, irradiación, aplicación de vapor/explosión de vapor, e hidrotermólisis .

El pre-tratamiento mecánico incluye la trituración (reducción mecánica del tamaño) . La trituración incluye la molienda en seco, la molienda en húmedo y la molienda en un molino de bolas, vibratorio. El pre-tratamiento mecánico puede involucrar la alta presión y/o la alta temperatura (explosión de vapor) . En una modalidad de la invención, la alta presión significa la presión en el intervalo desde 21.11 kg/cm2 (300 psi) hasta 42.22 kg/cm2 (600 psi) , preferentemente 28.14 kg/cm2 (400 psi) hasta 35.18 kg/cm2 (500 psi), tal como alrededor de 31.66 kg/cm2 (450 psi). En una modalidad de la invención, alta temperatura significa las temperaturas en el intervalo desde aproximadamente 100 hasta 300 °C, preferentemente desde aproximadamente 140 hasta 235 °C. En una modalidad preferida el pre-tratamiento mecánico es llevado a cabo como un proceso por lotes, en un sistema con hidrolizador con pistola de vapor el cual utiliza la alta presión y la alta temperatura como se definieron anteriormente. Un hidrolizador de Sunds (disponible de Sunds Defibrator AB (Suecia) puede ser utilizado para esto.

En una modalidad preferida, el material derivado del bagazo es sometido a un pre-tratamiento con irradiación. El término "pre-tratamiento con irradiación" se refiere a cualquier pre-tratamiento por microondas, por ejemplo como se describe por Zhu et al. "Production of ethanol from microwave-assisted alkali pre-treated wheat straw" en Process Biochemistry 41 (2006) 869-873 o el pre-tratamiento ultrasónico, por ejemplo, como se describe por ejemplo por Li et al. "A kinetic study on enzymatic hydrolysis of a variety of pulps for its enhancement with continuous ultrasonic irradiation" , en Biochemical Engineering Journal 19 (2004) 155-164. Preferentemente, el material derivado del bagazo previo a la etapa (a) o (b) ha sido sometido a tratamiento con microondas y/o a un tratamiento con irradiación ultrasónica .

En otra modalidad preferida, el material derivado del bagazo o la suspensión es homogeneizado ; preferentemente por molienda, molienda en húmedo, trituración o trituración en húmedo previo a, o durante la etapa (a) o previo a la etapa (b) .

Pre-tratamiento Químico y Mecánico Combinado En una modalidad preferida el material derivado del bagazo es sometido a un pre-tratamiento tanto químico como mecánico. Por ejemplo, la etapa de pre-tratamiento puede involucrar el tratamiento con un ácido diluido o un ácido suave y el tratamiento a temperatura y/o presión elevadas. Los pre-tratamientos químicos y mecánicos pueden ser llevados a cabo de manera consecutiva o simultánea, como sea deseable .

En una modalidad preferida, el pre-tratamiento se lleva a cabo con una etapa de explosión de vapor con un ácido diluido y/o suave. En otra modalidad preferida, el pre-tratamiento se lleva a cabo como una etapa de explosión de una fibra de amoniaco (o una etapa de pre-tratamiento con AFEX) .

En todavía otra modalidad preferida, se agrega una base al material derivado del bagazo o a la suspensión previo a, o mientras que está siendo homogeneizado; preferentemente la base es NaOH, Na2C03, NaHC03, Ca(OH)2, hidrato de cal, amoniaco y/o KOH.

Pre-tratamiento Biológico El término "pre-tratamiento biológico" se refiere a cualquier pre-tratamiento biológico que promueva la separación y/o la liberación de la celulosa, hemicelulosa, y/o la lignina del material derivado del bagazo. Las técnicas de pre-tratamiento biológico, conocidas, involucran la aplicación de microorganismos solubilizantes de la lignina (véase, por ejemplo Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, en Handbook on Bioethanol : Production and Utilization, Wyman, C. E., ed. , Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh, P., y Singh, A., 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversión of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, en Enzymatic Conversión of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., y Overend, R. P., eds . , ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J. , y Tsao, G. T., 1999, Ethanol product ion from renewable resources, en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology , Scheper, T., ed. , Springer-Verlag Berlín Heidelberg, Alemania, 65: 207-241; Olsson, L., y Hahn-Hagerdal , B., 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz . Microb. Tech. 18: 312-331; y Vallander, L. , y Eriksson, K. -E. L. , 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng . /Biotechnol . 42 : 63-95) .

En una modalidad preferida, el material derivado del bagazo ha sido tratado químicamente, mecánicamente y/o biológicamente, previo a la etapa (a) o (b) .

Descripción Detallada de la Invención En un primer aspecto, la invención se refiere a un proceso de producción de biogas que comprende las etapas de proporcionar una suspensión que comprende un material derivado del bagazo y agua, y: (a) efectuar un pre- tratamiento que comprende agregar una o más enzimas a la suspensión para degradar el material derivado del bagazo a una temperatura y pH adecuados, y luego agregar el material degradado con la enzima a un tanque digestor del biogas a una velocidad y proporción adecuadas para convertir efectivamente el material al biogas en el digestor; o (b) agregar una o más enzimas a la suspensión antes de agregar la suspensión a un tanque digestor del biogas, o agregar una o más enzimas al tanque digestor después de agregar la suspensión al tanque digestor, para degradar el material derivado del bagazo a una temperatura y pH adecuados y para convertir efectivamente el material al biogas en el digestor .

Hidrólisis enzimática Antes o mientras que el material derivado del bagazo es fermentado, el mismo es hidrolizado enzimáticamente para el desdoblamiento especialmente de la hemicelulosa y/o la celulosa en los azúcares fermentables . Durante la licuefacción enzimática, los polisacáridos semejantes al almidón, hemicelulosas , mañano y celulosa, son solubilizados y convertidos principalmente a los oligosacáridos , cualquier proteína es hidrolizada principalmente a los péptidos y la celulosa es convertida a celodextrinas . Esto puede ser logrado en un pre-tratamiento enzimático.

Antes o durante el pre-tratamiento, se puede hacer una molienda de la biomasa, preferentemente una molienda en húmedo, facilitada opcionalmente por la adición de las enzimas de acuerdo con la invención. La temperatura y el pH son ajustados para permitir que las enzimas funcionen. El material derivado del bagazo que va a ser hidrolizado constituye típicamente arriba de 2.5 % en peso de DS (sólidos secos) , preferentemente arriba de 5 % peso-% de DS , preferentemente arriba de 10 % peso-% de DS, preferentemente arriba de 15 % en peso de DS, preferentemente arriba de 20 % en peso de DS, más preferentemente arriba de 25 % en peso de DS de una suspensión.

Preferentemente, el contenido del material derivado del bagazo en la suspensión es ajustado por la adición continua o por etapas del material a la suspensión durante la etapa (a) o (b) .

En una modalidad preferida, una etapa de separación de los sólidos es efectuada en la etapa (a) después que el material derivado del bagazo sea degradado pero antes de que el mismo sea agregado al tanque digestor, para purgar los sólidos no solubilizados y opcionalmente alimentarlos de regreso a la etapa (a) del proceso.

El material derivado del bagazo puede ser sometido además a la acción de uno, o varios o la totalidad de las actividades de la enzima seleccionadas del grupo que consiste de una enzima amilolítica, una enzima lipolítica, una enzima proteolítica, una enzima celulolítica, una óxido-reductasa y una enzima de degradación de la pared celular de la planta.

En una modalidad preferida, una o más enzimas son seleccionadas del grupo que consiste de aminopeptidasa, alfa-amilasa, amiloglucosidasa , arabinofuranosidasa , arabinoxilanasa, beta-glucanasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, ácido ferúlico esterasa, desoxirribonucleasa , endo-celulasa, endo-glucanasa, endo-xilanasa, esterasa, galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, glucosa oxidasa, glucosidasa, haloperoxidasa, hemicelulasa, invertasa, isomerasa, lacasa, ligasa, lipasa, liasa, mananasa, manosidasa, oxidasa, pectato liasa, pectina liasa, pectina trans-eliminasa, pectina etilesterasa , pectina metilesterasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, proteasa, fitasa, fenoloxidasa, poligalacturonasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ramnogalacturonano liasa, ramnoglucanasa, ramnogalacturonasa , ribonucleasa, SPS-asa, transferasa, transglutaminasa, xilanasa y xiloglucanasa.

En otra modalidad preferida, una o más enzimas es una proteasa, una pectato liasa, una ácido ferúlico esterasa y/o una mananas .

Desde un tanque de pre-tratamiento, el material licuado enzimáticamente es alimentado a un tanque digestor del biogas en una relación y proporción que se ajusta con la velocidad de conversión para el gas. En el sistema de licuefacción, el pH es mantenido idéntico al pH que en el tanque digestor.

Es notable, que en el material de biomasa pre-tratado, el mismo debe tener preferentemente un valor de pH neutral a básico cuando es agregado al digestor del biogas, se piensa que la adición de la biomasa ácida puede detener el proceso de conversión del biogas debido a la inhibición de los microorganismos metanogénicos comunes.

En una modalidad preferida del método del primer aspecto, el pH está entre 7 y 10, tal como desde 7.6 hasta 10; preferentemente desde 8 hasta 10, o desde 8 hasta 9, preferentemente alrededor de pH 8.5. El pH puede ser ajustado utilizando NaOH, Na2C03, NaHC03, Ca(0H)2, hidrato de cal, amoniaco y/o KOH. La temperatura puede estar entre 20-70 °C, preferentemente 30-60 °C, y más preferentemente 40-55 °C, por ejemplo, alrededor de 50 °C. En una etapa de la hidrólisis, las paredes de la célula son degradadas y las fibrillas de la celulosa se hace que estén accesibles para la hidrólisis adicional. La etapa de la hidrólisis puede ser llevada a cabo como un proceso por lotes de alimentación en donde el material derivado del bagazo pre-tratado, es alimentado continuamente/gradualmente o por etapas en una solución que contiene las enzimas de hidrolización .

En una modalidad una pectato liasa, una ácido ferúlico esterasa, y una mananasa están presentes en una segunda etapa de hidrólisis en el pre-tratamiento . En una modalidad, una pectato liasa, una ácido ferúlico esterasa, una mananasa y una celulasa, están presentes. En una modalidad, una pectato liasa, una ácido ferúlico esterasa, una mananasa, una celulasa y una proteasa, están presentes.

Opcionalmente , las fibrillas de la celulosa pueden ser aisladas y tratadas con una composición de endo-glucanasa alcalina bajo condiciones de pH neutrales hasta básicas. En esta etapa, los sólidos secos (DS, por sus siglas en inglés) están preferentemente arriba de 10 % en peso de DS, preferentemente arriba de 15 % en peso de DS, preferentemente arriba de 20 % en peso de DS, más preferentemente arriba de 25 % en peso de DS .

El pH debe estar entre 7 y 10, tal como desde 8 hasta 9, preferentemente alrededor de pH 8.5. Previo a las etapas (a) o (b) , el pH puede ser ajustado utilizando NaOH, Na2C03, NaHC03 , Ca(OH)2, hidrato de cal, amoniaco y/o KOH. La temperatura puede estar el intervalo desde 20-70 °C, preferentemente 30-60 °C, y más preferentemente 40-50 °C.

Las fibrillas de la celulosa pueden ser tratados con una composición de celulasa que comprende una actividad celulolítica bajo condiciones de pH neutrales hasta ácidas . Preferentemente, el pH está entre 4-7, preferentemente 5-7, tal como alrededor de 5.5. El pH es ajustado preferentemente utilizando ácido fosfórico, ácido succínico, ácido clorhídrico y/o ácido sulfúrico. Preferentemente con una temperatura en el intervalo de 20-70 °C, preferentemente 30-60 °C, y más preferentemente 40-50 °C.

Enzimas Aún si no está mencionado específicamente en el contexto de un proceso o procesos de la invención, se va a entender que la(s) enzima (s) así como otros compuestos, son utilizados en una "cantidad efectiva" .

Proteasas Cualquier proteasa adecuada para su uso bajo condiciones alcalinas puede ser utilizada. Las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefieren las de origen microbiano. Se incluyen mutantes modificados químicamente o genéticamente. La proteasa puede ser una serina proteasa, preferentemente una proteasa de microbios, alcalina, o una proteasa semejante a la tripsina. Los ejemplos de las proteasas alcalinas son las subtilisinas , especialmente aquellas derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279) . Los ejemplos de las proteasas semejantes a la tripsina son la tripsina (por ejemplo de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270.

Las enzimas de proteasa disponibles comercialmente , preferidas, incluyen aquellas vendidas bajo los nombres registrados Everlase™, Kannase™, Alcalase™, Savinase™, Primase , Durazym , y Esperase por Novozymes A/S (Dinamarca) , aquellos vendidos bajo los nombres registrados Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect y Purafect OXP por Genencor International, y aquellas vendidas bajo el nombre registrado Opticlean y Optimase por Solvay Enzymes. Enzimas hemicelulolíticas Cualquier hemicelulasa adecuada para su uso en la hidrolización de la hemicelulosa , puede ser utilizada. Las hemicelulasas preferidas incluyen las pectato liasas, xilanasas, arabinofuranosidasas , acetil xilano esterasa, ácido ferúlico esterasa, glucuronidasa, endo-galactanasa, manasas, endo o exo-arabinasas , exo-galactanasas , y mezclas de dos o más de las mismas. Preferentemente, la hemicelulasa para su uso en la presente invención es una hemicelulasa de actuación endo, y más preferentemente, la hemicelulasa es una hemicelulasa de actuación endo la cual tiene la capacidad para hidrolizar la hemicelulosa bajo condiciones básicas de arriba de pH 7, preferentemente pH 7-10.

En una modalidad, la hemicelulasa es una xilanasa. En una modalidad, la xilanasa puede ser preferentemente de origen microbiano, tal como de origen fungoso (tal como por ejemplo, Trichoderma, Meripilus, Humicola, Aspergillus, Fusarium) o de una bacteria (por ejemplo, Bacillus) . En una modalidad preferida la xilanasa es derivada de un hongo filamentoso, preferentemente derivado de una cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus aculeatus; o una cepa de Humicola, preferentemente Humicola lanuginosa. La xilanasa puede ser preferentemente una endo-1, 4-beta-xilanasa, más preferentemente una endo- 1 , 4 -beta-xinalasa de GH10 o GH11. Los ejemplos de las xilanasas comerciales incluyen SHEARZYME® 200L, SHEARZYME® 500L, BIOFEED HEAT® , y PULPZYME™ HC (de Novozymes) y GC 880, SPEZYME® CP (de Genencor Int.) .

La hemicelulasa puede ser agregada en una cantidad efectiva para hidrolizar la hemicelulosa , tal como, en cantidades desde aproximadamente 0.001 hasta 0.5 % en peso de los sólidos totales (TS, por sus siglas en inglés) , más preferentemente desde aproximadamente 0.05 hasta 0.5 % en peso de TS .

Las xilanasas pueden ser agregadas en cantidades de 1.0-1000 FXU/kg de los sólidos secos, preferentemente desde 5-500 FXU/kg de los sólido secos, preferentemente desde 5-100 FXU/kg de los sólidos secos y aún más preferentemente desde 10-100 FXU/kg de los sólidos secos.

Las xilanasas pueden ser agregadas alternativamente en cantidades de 0.001-1.0 g/kg del substrato de DS, preferentemente en las cantidades de 0.005-0.5 g/kg del substrato de DS, y aún más preferentemente desde 0.05-0.10 g/kg del substrato de DS .

Enzimas pectolíticas (o Pectinasas) Cualquier enzima pectinolítica que puede degradar la composición de pectina de las paredes de las células de las plantas puede ser utilizada en la práctica de la presente invención. Las pectinas adecuadas incluyen, sin limitación, aquellas de origen fungoso o bacteriano. Las pectinasas modificadas químicamente o genéticamente también están abarcadas. Preferentemente, las pectinasas utilizadas en la invención son producidas recombinantemente y son enzimas de mono-componentes .

Las pectinasas pueden ser clasificadas de acuerdo con su substrato preferible, la pectina altamente esterificada con metilo o la pectina esterificada de manera escasa con metilo y el ácido poligalacturónico (pectato) , y su mecanismo de reacción, la eliminación beta o la hidrólisis. Las pectinasas pueden ser principalmente de actuación endo, cortando el polímero en sitios aleatorios dentro de la cadena para proporcionar una mezcla de oligómeros, o los mismos pueden ser de actuación exo, atacando desde un extremo del polímero y produciendo monómeros o dímeros . Varias actividades de pectinasa que actúan sobre las regiones lisas de la pectina están incluidas en la clasificación de las enzimas provistas por la Nomenclatura de las Enzimas (1992), por ejemplo, la pectato liasa (EC 4.2.2.2), la pectina liasa (EC 4.2.2.10), poligalacturonasa (EC 3.2.1.15), exo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.67), exo-poligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) y exo-poli-alfa-galacturonosidasa (EC 3.2.1.82) .

En las modalidades, la pectinasa es una pectato liasa. La actividad enzimática de la pectato liasa como se utiliza aquí, se refiere a la catálisis de la segmentación aleatoria de los enlaces alfa-1, 4 -glucosídicos en el ácido péctico (también llamado el ácido poligalacturónico) por la transeliminación. Las pectato liasas también son denominadas las poligalacturonato liasas y las poli ( 1 , 4 -a-D-galacturónido) liasas.

La pectato liasa (EC 4.2.2.2) es una enzima que cataliza la segmentación aleatoria de los enlaces a-1,4-glucosídicos en el ácido péctico (también llamado el ácido poligalacturónico) por transeliminación. Las pectato liasas también incluyen las poligalacturonato liasas y las poli (1,4-cc-D-galacturónido) liasas.

Los ejemplos de las pectato liasas preferidas son aquellas que han sido clonadas de diferentes géneros de bacterias tales como Erwinia, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas y Bacillus, especialmente Bacillus licheniformis (solicitud de patente US 6,124,127), así como de Bacillus subtilis (Nasser et al. (1993) FEBS Letts. 335:319-326) y Bacillus sp. YA-14 (Kim et al. (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58:947-949). La purificación de las pectato liasas con la actividad máxima en el intervalo de pH de 8-10 producidas por Bacillus pumilus (Dave y Vaughn (1971) J. Bacteriol . 108:166-174), B. Polymyxa (Nagel y Vaughn (1961) Arch. Biochem. Biophys . 93:344-352), B. stearothermophilus Karbassi y Vaughn (1980) Can. J. Microbiol. 26:377-384), Bacillus sp. (Hasegawa y Nagel (1966) J. Food Sci. 31:838-845) y Bacillus sp. RK9 (Kelly y Fogarty (1978) Can. J. Microbiol. 24:1164-1172) también han sido descritas.

Una pectato liasa preferida puede ser obtenida de Bacillus licheniformis como se describe en la solicitud de patente US 6,124,127.

Otras pectato liasas pueden ser aquellas que comprenden las secuencias de aminoácidos de una pectato liasa descrita en Heffron et al., (1995) Mol. Plant-Microbe Interact . 8: 331-334 y Henrissat et al., (1995) Plant Physiol. 107: 963-976.

Una enzima única o una combinación de pectato liasas puede ser utilizada. Una preparación de pectato liasa comercial, preferida, adecuada para la invención, es BioPrep® 3000 L disponible de Novozymes A/S.

Mananasas En el contexto de la presente invención, una mananasa es una beta-mananasa y definida como una enzima que pertenece a EC 3.2.1.78.

Las mananasas han sido identificadas en varios organismos de Bacillus. Por ejemplo, Talbot et al., Ap l . Environ. Microbiol., Vol.56, No. 11, pp . 3505-3510 (1990) describe una beta-mananasa derivada de Bacillus stearothermophilus que tiene un pH de 5.5-7.5. Mendoza et al., World J. Microbiol. Biotech. , Vol . 10, No. 5, pp. 551-555 (1994) describe una beta-mananasa derivada de Bacillus subtilis que tiene una actividad óptima a pH 5.0 y 55 °C. JP-03047076 describe una beta-mananasa derivada de Bacillus sp . , que tiene un pH óptimo de 8-10. JP-63056289 describe la producción de una beta-mananasa termoestable , alcalina. JP08051975 describe beta-mananasas alcalinas de Bacillus sp . AM-001, alcalofílicas . Una mananasa purificada de Bacillus amyloliquefaciens se describe en WO 97/11164. WO 94/25576 describe una enzima de Aspergillus aculeatus, CBS 101.43, que exhibe una actividad de mananasa y WO 93/24622 describe una mananasa aislada de Trichoderma reesei .

La mananasa puede ser derivada de una cepa del género Bacillus, tal como la secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia depositada como el número de acceso AAY54122 de GENESEQP o una secuencia de aminoácidos que es homologa con respecto a esta secuencia de aminoácidos. Una preparación de mananasa comercial, adecuada, es Mannaway® producida por Novozymes A/S.

Esterasas ferúlicas En el contexto de la presente invención, una esterasa ferúlica está definida como una enzima que pertenece a EC 3.1.1.73.

Una preparación de esterasa ferúlica, adecuada, puede ser obtenida de Malabrancea, por ejemplo, de P. cinnamomea, tal como por ejemplo una preparación que comprende una esterasa ferúlica que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 en la solicitud de patente Europea número 07121322.7, o una secuencia de aminoácidos que es homologa con respecto a esta secuencia de aminoácidos.

Otra preparación de esterasa ferúlica, adecuada, puede ser obtenida de Penicillium, por ejemplo, de P. aurantiogriseum, tal como por ejemplo una preparación que comprende la esterasa ferúlica que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 en la solicitud de patente Europea número 0815469.7, o una secuencia de aminoácidos que es homologa con respecto a esta secuencia de aminoácidos. Una preparación de esterasa ferúlica comercial, adecuada, es NOVOZYM® 342 L producida por Novozymes A/S.

Endo-glucanasas alcalinas El término "endoglucanasa" significa una endo-1,4-(1,3,-1,4) -beta-D-glucano 4-glucanohidrolasa (E.C. 3.2.1.4), que cataliza la endo-hidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en la celulosa, los derivados de celulosa (tales como la carboximetil celulosa y la hidroxietil celulosa) , liquenina, los enlaces beta-1,4 en los beta-1,3 glucanos mezclados tales como los beta-D-glucanos o los xiloglucanos del cereal, y otro material de la planta que contiene los componentes celulósicos. Las endo-glucanasas alcalinas son las endo-glucanasas que tienen actividad bajo condiciones alcalinas.

En una modalidad preferida, las endoglucanasas pueden ser derivadas de una cepa del género Trichoderma, preferentemente una cepa de Trichoderma reesei; una cepa del género Humicola, tal como una cepa de Humicola insolens; o una cepa de Chrysosporium, preferentemente una cepa de Chrysosporium lucknowense .

En una modalidad preferida las endoglucanasas pueden ser derivadas de una cepa del género Bacillus akibai .

En una modalidad, la composición de endo-glucanasa alcalina es uno de los productos disponibles comercialmente CAREZIME®, ENDOLASE® y CELLUCLEAN® (Novozymes A/S, Dinamarca) . La enzima puede ser aplicada en una dosificación de 1-100 g/kg de celulosa.

Actividad celulolítica ácida El término "actividad celulolítica ácida" como se utiliza aquí, se entiende que comprende las enzimas que tienen actividad de celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) por ejemplo, la celobiohidrolasa I y/o la celobiohidrolasa II, así como la actividad de endo-glucanasa (EC 3.2.1.4) y/o la actividad de la beta-glucosidasa (EC 3.2.1.21) que tiene actividad a un pH abajo de 6.

La actividad celulolítica, en una modalidad preferida, puede estar en la forma de una preparación de enzimas de origen fungoso, tal como a partir de una cepa del género Trichoder a, preferentemente una cepa de Trichoderma reesei; una cepa del género Humicola, tal como una cepa de Humicola insolens; o una cepa de Chrysosporium, preferentemente una cepa de Chrysosporium lucknowense.

En una modalidad preferida, la preparación de la enzima celulolítica contiene una o más de las siguientes actividades: endoglucanasa, celobiohidrolasa I y II, y la actividad de beta-glucosidasa .

En una modalidad preferida la preparación de la enzima celulolítica es una composición descrita en WO2008/151079 , que es incorporada aquí para referencia. En una modalidad preferida la preparación de la enzima celulolítica que comprende un polipéptido que tiene una actividad mejoradora celulolítica, preferentemente un polipéptido de la familia GH61A, preferentemente aquellas descritas en WO 2005/074656 (Novozymes) . La preparación de la enzima celulolítica puede comprender además la beta-glucosidasa, tal como una beta-glucosidasa derivada de una cepa del género Trichoderma, Aspergillus o Penicillium, incluyendo la proteína de fusión que tiene la actividad de beta-glucosidasa descrita en WO 2008/057637 (Novozymes). En una modalidad preferida, la preparación de la enzima celulolítica también puede comprender una enzima de CBH II, preferentemente la celobiohidrolasa II de Thielavia terrestris (CEL6A) . En un otra modalidad preferida, la preparación de la enzima celulolítica también puede comprender enzimas celulolíticas ,- preferentemente aquellas derivadas de Trichoderma reesei o Humicola insolens .

La composición de la enzima celulolítica también puede comprender un polipéptido que tiene una actividad mejoradora celulolítica (GH61A) descrita en WO 2005/074656; una proteína de fusión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637), y las enzimas celulolíticas derivadas de Trichoderma reesei.

La composición de la enzima celulolítica también puede comprender la xilanasa GH10 de Aspergillus aculeatus (WO 94/021785) y una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (WO 2005/047499) y el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656) .

La composición de la enzima celulolítica también puede comprender una xilanasa GH10 de Aspergillus aculeatus (WO 94/021785) y/o una preparación de la celulasa de Trichoderma reesei.

En otra modalidad preferida, la composición celulolítica que comprende un polipéptido que tiene una actividad mejoradora celulolítica (GH61A) descrita en WO 2005/074656; una proteína de fusión de la beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637) , una celobiohidrolasa II de Thielavia terrestris (CEL6A) , y la preparación de enzimas celulolíticas derivada de Trichoderma reesei.

En una modalidad, la composición de la enzima celulolítica es el producto disponible comercialmente CELLUCLAST™ 1.5L, CELLUZYME™, Cellic™ CTec, Cellic™ CTec2 , Cellic™ HTec , Cellic™ HTec2 (todos de Novozymes A/S, Dinamarca) o ACCELLARASE™ 1000 (Genencor Int, Inc., USA) .

La actividad celulolítica puede ser dosificada en un intervalo desde 0.1-100 FPU por gramo de los sólidos totales (TS) , preferentemente 0.5-50 FPU por gramo de TS, especialmente 1-20 FPU por gramo de TS .

Actividad de Celulasa Utilizando el Ensayo de Papel Filtro (ensayo de FPU) El proceso se describe en el documento titulado "Measurement of Cellulase Activities" por Adney, B. y Baker, J. 1996. Laboratory Analytical Procedure, LAP-006, National Renewable Energy Laboratory (NREL) . El mismo está basado en el proceso de la IUPAC para la medición de la actividad de la celulasa (Ghose, T. K. , Measurement of Cellulase Activities, Puré & Appl . Chem. 59, p . 257-268, 1987.

El proceso se lleva a cabo como se describe por Adney y Baker, 1995, supra, excepto por el uso de placas de 96 cavidades para leer los valores de la absorbancia después del desarrollo del color, como se describe posteriormente: Tubos de ensayo de la enzima: - Una tira de papel filtro enrollada (#1 hatman; 1 X 6 era; 50 mg) es agregada al fondo de un tubo de prueba (13 X 100 mm) .

- Al tubo se agrega 1.0 mi del amortiguador de citrato de Na 0.05 M (pH 4.80).

Los tubos que contienen el papel filtro y el amortiguador son incubados 5 minutos a 50 °C (+ 0.1 °C) en un baño de agua circulante.

- Después de la incubación, se agregan 0.5 mi de la disolución de la enzima del amortiguador de citrato al tubo.

Las disoluciones de la enzima son diseñadas para producir valores ligeramente arriba y abajo del valor objetivo de 2.0 mg de la glucosa.

- Los contenidos del tubo son mezclados agitando suavemente en forma de remolino durante 3 segundos.

- Después de la agitación en forma de remolino, los tubos son incubados durante 60 minutos a 50 °C (+ 0.1 °C) en un baño de agua circulante.

Inmediatamente después de los 60 minutos de incubación, los tubos son removidos del baño de agua, y se agregan 3.0 mi del reactivo de DNS a cada tubo para detener la reacción. Los tubos se agitan en forma de remolino 3 segundos para el mezclado.

Modelos y Controles : - Un modelo del reactivo se prepara agregando 1.5 mi del amortiguador de citrato a un tubo de prueba.

- Un control del substrato es preparado colocando una tira de papel filtro enrollado en el fondo de un tubo de prueba, y agregando 1.5 mi del amortiguador de citrato.

- Los controles de la enzima son preparados para cada disolución de la enzima mezclando 1.0 mi del amortiguador de citrato con 0.5 mi de la disolución de la enzima apropiada.

- El modelo del reactivo, el control del substrato, y los controles de la enzima son ensayados de la misma manera que los tubos de ensayo de la enzima, y se hace en compañía de ellos.

Estándares de la Glucosa: - Unos 100 mi de la solución en almacenamiento de la glucosa (10.0 mg/ml) son preparados, y se congelan alícuotas de 5 mi. Previo al uso, las alícuotas son descongeladas y se agitan en forma de remolino para el mezclado .

Se hacen disoluciones de la solución en almacenamiento en un amortiguador de citrato como sigue: Gl = 1.0 mi del material en almacenamiento + 0.5 mi del amortiguador = 6.7 mg/ml = 3.3 mg/0.5 mi G2 = 0.75 mi del material en almacenamiento + 0.75 mi del amortiguador = 5.0 mg/ml = 2.5 mg/0.5 mi G3 = 0.5 mi del material en almacenamiento + 1.0 mi del amortiguador = 3.3 mg/ml = 1.7 mg/0.5 mi G4 = 0.2 mi del material en almacenamiento + 0.8 mi del amortiguador = 2.0 mg/ml = 1.0 mg/0.5 mi - Los tubos estándares de glucosa son preparados agregando 0.5 mi de cada disolución a 1.0 mi del amortiguador de citrato.

- Los tubos estándares de glucosa son ensayados de la misma manera que los tubos de ensayo de la enzima, y se hace en compañía de ellos.

Desarrollo del color: - Después de 60 minutos de incubación y adición del DNS, todos los tubos son hervidos conjuntamente durante 5 minutos en un baño de agua .

Después de la ebullición, los mismos son enfriados inmediatamente en un baño de hielo/agua.

Cuando se enfrían, los tubos son agitados en forma de remolino brevemente, y la pulpa se deja que se sedimente. Luego cada tubo es diluido agregando 50 microL del tubo a 200 microL del ddH20 en una placa de 96 cavidades. Cada cavidad es mezclada, y la absorbancia se lee a 540 nm. Cálculos (los ejemplos son provistos en el documento NREL) Una curva estándar de glucosa es preparada graficando la concentración de la glucosa (mg/0.5 mi) para los cuatro estándares (G1-G4) contra A540. Esta es ajustada utilizando una regresión lineal (Prism Software) , y la ecuación para la línea es utilizada para determinar la glucosa producida para cada uno de los tubos de ensayo de la enzima .

Una gráfica de glucosa producida (mg/0.5 mi) contra la disolución de la enzima total, es preparada, con el eje Y (disolución con la enzima) que está sobre una escala logarítmica .

Se traza una línea entre la disolución de la enzima que produjo justo arriba de 2.0 mg de glucosa y la disolución que produjo solo una cantidad abajo de esta. A partir de esta línea, se determina la disolución de la enzima que podría haber producido exactamente 2.0 mg de glucosa.

- Las Unidades del Papel Filtro/ml (FPU/ml) son calculadas como sigue: FPU/ml = 0.37/disolución de la enzima que produce 2.0 mg de glucosa.

Actividad Mej oradora Celulolítica El término "actividad mejoradora celulolítica" está definido aquí como una actividad biológica que mejora la hidrólisis de un material derivado del bagazo por las proteínas que tienen actividad celulolítica. Para los propósitos de la presente invención, la actividad mejoradora celulolítica es determinada midiendo el incremento en los azúcares reductores o en el incremento del total de la celobiosa y la glucosa de la hidrólisis de un material derivado del bagazo, por ejemplo, un material derivado del bagazo, pre-tratado, por la proteína celulolítica bajo las siguientes condiciones: 1-50 mg de la proteína total/g de celulosa en PCS (rastrojo del maíz pre-tratado) , en donde la proteína total está comprendida de 80-99.5 % p/p de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS y 0.5-20 % p/p de proteína de la actividad mejoradora celulolítica durante 1-7 días a 50 °C comparado con una hidrólisis de control con una carga de la proteína total igual, sin actividad mejoradora celulolítica (1-50 mg de la proteína celulolítica/g de celulosa en PCS) .

Los polipéptidos que tienen una actividad mejoradora celulolítica mejoran la hidrólisis de un material derivado del bagazo, catalizado por las proteínas que tienen una actividad celulolítica por la reducción de la cantidad de la enzima celulolítica requerida para alcanzar el mismo grado de hidrólisis preferentemente al menos 0.1 veces, más preferentemente al menos 0.2 veces, más preferentemente al menos 0.3 veces, más preferentemente al menos 0.4 veces, más preferentemente al menos 0.5 veces, más preferentemente al menos 1 vez, más preferentemente al menos 3 veces, más preferentemente al menos 4 veces, más preferentemente al menos 5 veces, más preferentemente al menos 10 veces, más preferentemente al menos 20 veces, aún más preferentemente al menos 30 veces, todavía más preferentemente al menos 50 veces, y todavía aún más preferentemente al menos 100 veces.

En una modalidad preferida, la hidrólisis y/o la fermentación se lleva a cabo en la presencia de una enzima celulolítica en combinación con un polipéptido que tiene una actividad mejoradora celulolítica. En una modalidad preferida, el polipéptido que tiene una actividad mejoradora celulolítica es un polipéptido de la familia GH61A. O 2005/074647 describe polipéptidos aislados que tienen una actividad mejoradora celulolítica y polinucleótidos de los mismos a partir de Thielavia terrestris. WO 2005/074656 describe un polipéptido aislado que tiene actividad mejoradora celulolítica y un polinucleótido del mismo a partir de Thermoascus aurantiacus. La solicitud publicada U. S. No. de serie 2007/0077630 describe un polipéptido aislado que tiene actividad mejoradora celulolítica y un polinucleótido del mismo de Trichoderma reesei .

Alfa-Amilasa De acuerdo con la invención, se puede utilizar cualquier alfa-amilasa, tal como de origen fungoso, bacteriano o vegetal. En una modalidad preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida, por ejemplo una alfa-amilasa fungosa ácida o una alfa-amilasa bacteriana ácida. El término "alfa-amilasa ácida" significa una alfa-amilasa (E. C. 3.2.1.1) que es agregada en una cantidad efectiva para que tenga una actividad óptima a un pH en el intervalo de 3 a 7 , preferentemente desde 3.5 hasta 6, o más preferentemente desde 4-5.

Alfa-Amilasa Bacteriana De acuerdo con la invención, una alfa-amilasa bacteriana es derivada preferentemente del género de Bacillus .

En una modalidad preferida, la alfa-amilasa de Bacillus es derivada de una cepa de Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens , Bacillus subtilis o Bacillus stearothermophilus , pero también puede ser derivada de otros Bacillus s . Los ejemplos específicos de las alfa-amilasas contempladas incluyen la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4 en WO 99/19467, la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens SEC ID NO : 5 en WO 99/19467 y la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrado en la SEC ID NO : 3 en WO 99/19467 (todas las secuencias son incorporadas por el presente para referencia) . En una modalidad, la alfa-amilasa puede ser una enzima que tiene un grado de identidad de al menos 60 %, preferentemente de al menos 70 %, más preferentemente de al menos 80 %, aún más preferentemente de al menos 90 %, tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de cualquiera de las secuencias mostradas en las SEC ID NOS: 1, 2 o 3, respectivamente en WO 99/19467.

La alfa-amilasa de Bacillus también puede ser una variante y/o un híbrido, especialmente una descrita en cualquiera de WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059, y WO 02/10355 (todos los documentos incorporados por el presente para referencia) . Las variantes de alfa-amilasa contemplados específicamente se describen en las patentes US Nos. 6,093,562, 6,297,038 o la patente US No. 6,187,576 (incorporada por el presente para referencia) e incluye las variantes de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (BSG alfa-amilasa) que tienen una deleción de uno o dos aminoácidos en las posiciones R179 hasta G182, preferentemente una doble deleción descrita en WO 1996/023873 - véase, por ejemplo, la página 20, líneas 1-10 (incorporada por el presente para referencia) , preferentemente que corresponde a delta (181-182) comparado con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa de BSG, del tipo silvestre, descrita en la SEC ID NO : 3 mancionada en WO 99/19467 o la deleción de los aminoácidos R179 y G180 utilizando la SEC ID NO : 3 en WO 99/19467 para la numeración (tal referencia es incorporada por el presente para referencia) . Son aún más preferidas las alfa-amilasas de Bacillus, especialmente la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, la cual tiene una doble deleción que corresponde a delta (181-182) y que comprende además una sustitución de N193F (también denotada como 1181* + G182* + N193F) comparada con la secuencia de aminoácidos de la alfa- amilasa de BSG del tipo silvestre descrita en la SEC ID NO: 3 mencionada en WO 99/19437.

En una modalidad la alfa-amilasa bacteriana es dosificada en una cantidad desde 0.0005-5 KNU por g de DS, preferentemente 0.001-1 KNU por g de DS, tal como alrededor de 0.050 KNU por g de DS .

Alfa-Amilasa Fungosa Las alfa-amilasas fungosas incluyen las alfa-amilasas derivadas de una cepa del género Aspergillus, tales como, las alfa-amilasas de Aspergillus oryzae, Aspergillus niger y Aspergillus kawachii.

Una alfa-amilasa fungosa ácida, preferida, es una alfa-amilasa semejante a Fungamilo, la cual es derivada de una cepa de Aspergillus oryzae. De acuerdo con la presente invención, el término "alfa-amilasa semejante a Fungamilo" indica una alfa-amilasa que exhibe una identidad elevada, es decir, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o aún 100 % de la identidad con respecto a la parte madura de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 10 en WO 96/23874.

Otra alfa-amilasa ácida, preferida, es derivada de una cepa de Aspergillus niger. En una modalidad preferida la alfa-amilasa fungosa ácida es una de Aspergillus niger descrita como "AMYA ASPNG" en la base de datos Swiss- prot/TeEMBL bajo el no. de acceso primario P56271 y descrita en WO 89/01969 (Ejemplo 3 - incorporada para referencia) . Una alfa-amilasa fungosa ácida, disponible comercialmente , derivada de Aspergillus niger es SP288 (disponible de Novozymes A/S , Dinamarca) .

Otras alfa-amilasas del tipo silvestre contempladas incluyen aquellas derivadas de una cepa del género Rhizomucor y Meripilus, preferentemente una cepa de Rhizomucor pusillus (WO 2004/055178 incorporada para referencia) o Meripilus giganteus .

En una modalidad preferida la alfa-amilasa es derivada de Aspergillus kawachii y descrita por Kaneko et al. J. Ferment. Bioeng. 81:292-298(1996) "Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii"; y además como EMBL : #AB008370.

La alfa-amilasa fungosa también puede ser una enzima del tipo silvestre que comprende un dominio de aglutinación del almidón (SBD, por sus siglas en inglés) y un dominio catalítico de la alfa-amilasa (es decir, ningún híbrido) , o una variante de la misma. En una modalidad, la alfa-amilasa del tipo silvestre es derivada de una cepa de Aspergillus kawachii .

Una de las alfa-amilasas ácidas de acuerdo con la invención puede ser agregada en una cantidad de 0.001 hasta 10 AFAU/g de DS, preferentemente desde 0.01 hasta 5 AFAU/g de DS, especialmente 0.3 hasta 2 AFAU/g de DS o 0.001 hasta 1 AFAU/g de DS, preferentemente 0.01 hasta 1 AFAU/g de DS .

Productos de Alfa-Amilasa Comerciales Las composiciones comerciales preferidas que comprenden alfa-amilasa incluyen MYCOLASE™ de DSM (Gist Brocades) , BA ™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ X, LIQUOZYME™ SC y SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) y CLARASE™ L-40,000, DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, y SPEZYME™ DELTA AA (Genencor Int.), y la alfa-amilasa fungosa ácida vendida bajo el nombre registrado SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca).

Enzima Generadora de una Fuente de Carbohidratos El término "enzima generadora de una fuente de carbohidratos" incluye la glucoamilasa (que son generadoras de glucosa) , la beta-amilasa y la amilasa maltogénica (que son generadores de maltosa) , y también la pululanasa y la alfa-glucosidasa . Una enzima generadora de una fuente de carbohidratos es capaz de producir un carbohidrato que puede ser utilizado como una fuente de energía por el (los) organismo (s) termentador (es) en cuestión, por ejemplo, cuando se utiliza en un proceso de la invención para producir un producto de la fermentación, tal como etanol . El carbohidrato generado puede ser convertido directamente o indirectamente al producto de fermentación deseado, preferentemente el etanol . De acuerdo con la invención, una mezcla de enzimas generadoras de una fuente de carbohidratos puede ser utilizada. Las mezclas contempladas especialmente son mezclas de al menos una glucoamilasa y una alfa-amilasa; especialmente una amilasa ácida, se prefiere aún más una alfa-amilasa fungosa ácida. La relación entre la actividad de la alfa-amilasa fungosa ácida (FAU-F) y la actividad de la glucoamilasa (AGU) , (es decir, FAU-F por AGU) , puede estar una modalidad de la invención entre 0.1 y 100, en particular entre 2 y 50, tal como en el intervalo desde 10-40.

Glucoamilasa Una glucoamilasa utilizada de acuerdo con la invención puede ser derivada de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, derivada de un microorganismo o una planta. Las glucoamilasas preferidas son de origen bacteriano o fungoso, seleccionadas del grupo que consiste de las glucoamilasas de Aspergillus, en particular la glucoamilasa de Aspergillus niger Gl o G2 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5) , p. 1097-1102) , o las variantes de la misma, tales como aquellas descritas en WO 92/00381, WO 00/04136 y WO 01/04273 (de Novozymnes, Dinamarca); la glucoamilasa de A. Awamori descrita en WO 84/02921, la glucoamilasa de Aspergillus oryzae (Agrie. Biol . Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949) , o las variantes o fragmentos de las mismas. Otras variantes de la glucoamilasa de Aspergillus incluyen las variantes con una estabilidad térmica mejorada: G137A y G139A (Chen et al. (1996), Prot . Eng. 9, 499-505); D257E y D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); los enlaces de disulfuro, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704); y la introducción de los residuos Pro en las posicionew A435 y S436 (Li et al. (1997), Protein Eng. 10, 1199-1204.

Otras glucoamilasas incluyen la glucoamilasa de Athelia rolfsii (denotada previamente como Corticium rolfsii) (véase la patente US No. 4,727,026 y (Nagasaka, Y. et al. (1998) "Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii, Appl Microbiol Biotechnol 50:323-330), las glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de Talaromyces emersonii ( O 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente US no. Re. 32,153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (patente US no. 4,587,215).

Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen las glucoamilasas del género Clostridium, en particular C. thermoamylolyticum (EP 135,138), y C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831) y Trametes cingulata, Pachykytospora papyracea; y Leucopaxillus giganteus todas descritas en WO 2006/069289; o Peniophora rufomarginata descrita en PCT/US2007/066618 ; o una mezcla de las mismas. También están contempladas las glucoamilasas híbridas de acuerdo con la invención. Los ejemplos de las glucoamilasas híbridas se describen en O 2005/045018. Los ejemplos específicos incluyen la glucoamilasa híbrida descrita en las Tablas 1 y 4 del Ejemplo 1 (tales híbridos son incorporados por el presente para referencia) .

También están contempladas las glucoamilasas que exhiben una identidad elevada con respecto a cualquiera de las glucoamilasas mencionadas anteriormente, es decir, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o aún 100 % de identidad con respecto a las secuencias de las enzimas maduras mencionadas anteriormente .

Las composiciones disponibles comercialmente que comprenden glucoamilasa incluyen AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U y AMG™ E (de Novozymes A/S) ; OPTIDEX™ 300 (de Genencor Int.) ; AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (de DSM) ; G-ZYME™ G900, G-ZYME™ y G990 ZR (de Genencor Int.) .

Las glucoamilasas pueden ser agregadas, en una modalidad, en una cantidad de 0.0001-20 AGU/g de DS, preferentemente 0.001-10 AGU/g de DS, especialmente entre 0.01-5 AGU/g de DS, tal como 0.1-2 AGU/g DS .

Tratamiento Biológico Los microorganismos para el tratamiento biológico adicional o el pre-tratamiento, pueden ser seleccionados entre las bacterias, levaduras u hongos, o mezclas de los mismos. Los microorganismos o mezclas de dos o más microorganismos pueden proporcionar una producción de metano mejorada en la etapa de fermentación anaeróbica del proceso de producción del biogas . Los ejemplos preferidos de los microorganismos de acuerdo con la invención incluyen las cepas del género: Bacillus, Pseudomonas, Enterobacter, Rhodococcus, Acinetobacter, y Aspergillus tales como Bacillus licheniformis, Pseudomonas putida, Enterobacter dissolvens, Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus pyridinivorans, Acinetobacter baumanii, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas pseudoacaligenes, Pseudomonas antárctica, Pseudomonas monteilii , Pseudomonas mendocina, Bacillus subtilis, Aspergillus niger y Aspergillus oryzae y cualesquiera combinaciones de dos o más de las mismas.

Las cepas preferidas particulares incluyen: Bacillus subtilis (NRRL B-50136) , Pseudomonas monteilii (NRRL B-50256) , Enterobacter dissolvens (NRRL B-50257) , Pseudomonas monteilii (NRRL B-50258) , Pseudomonas plecoglossicida (ATCC 31483) , Pseudomonas putida (NRRL B-50247) , Pseudomonas plecoglossicida (NRRL B-50248), Rhodococcus pyridinivorans (NRRL50249) , Pseudomonas putida (ATCC 49451) , Pseudomonas mendocina (ATCC 53757) , Acinetobacter baumanii (NRRL B-50254) , Bacillus pumilus (NRRL B-50255) , Bacillus licheniformis (NRRL B-50141) , Bacillus amyloliquefaciens (NRRL B-50151) , Bacillus amyloliquefaciens (NRRL B-50019) , Pseudomonas mendocina (ATCC 53757) , Pseudomonas monteilii (NRRL B-50250) , Pseudomonas monteilii (NRRL B-50251) , Pseudomonas monteilii (NRRL B-50252), Pseudomonas monteilii (NRRL B-50253) , Pseudomonas antárctica (NRRL B50259) , Bacillus amyloliquefaciens (ATCC 55405) , Aspergillus niger (NRRL-50245) , y Aspergillus oryzae (NRRL-50246) .

La persona experta apreciará cómo determinar las cantidades adecuadas de estas cepas preferidas en los usos de acuerdo con la invención, utilizando las técnicas bien conocidas. En las modalidades preferidas, las cepas son agregadas en cantidades en el intervalo de 1.0 x 106 hasta 5.0 x 109 CFU/g.

Como ejemplos de los microorganismos preferidos particulares o las mezclas de dos o más microorganismos, se pueden mencionar: - Una mezcla que contiene: Bacillus subtilis (NRRL B-50136; 1.1 x 109 CFU/g) , Pseudomonas monteilii (NRRL B-50256; 0.6 x 109 CFU/g) , Enterobacter dissolvens (NRRL B-50257; 0.6 x 109 CFU/g) , Pseudomonas monteilii (NRRL B-50258; 0.8 x 109 CFU/g), Pseudomonas fluorescens (ATCC 31483; 0.8 x 109 CFU/g) , Pseudomonas putida (NRRL B-50247; 0.4 x 109 CFU/g) , Pseudomonas plecoglossicida (NRRL B-50248; 0.4 x 109 CFU/g), Rhodococcus pyridinivorans (NRRL- 50249 ; 0.8 x 109 CFU/g), Pseudomonas putida (ATCC 49451, 0.4 x 109 CFU/g), Pseudomonas mendocina (ATCC 53757; 0.8 x 109 CFU/g), y Acinetobacter baumanii (NRRL B-50254; 0.2 x 109 CFU/g; - Una mezcla que contiene: Bacillus subtilis (NRRL B-50136; 1.6 x 109 CFU/g) , Bacillus pumilus (NRRL B-50255 0.2 x 109 CFU/g), Bacillus amyloliquefaciens (NRRL B-50141 0.2 x 109 CFU/g), Bacillus amyloliquefaciens (NRRL B-50151 0.2 x 109 CFU/g), Bacillus amyloliquefaciens (NRRL B-50019 0.2 x 109 CFU/g), Pseudomonas monteilii (NRRL B-50256; 0.2 x 109 CFU/g), Enterobacter dissolvens (NRRL B-50257; 0.3 x 109 CFU/g), Pseudomonas monteilii (NRRL B-50258; 0.8 x 109 CFU/g), Pseudomonas plecoglossicida (ATCC 31483; 0.7 x 109 CFU/g), Pseudomonas putida (NRRL B-50247; 0.2 x 109 CFU/g), Pseudomonas plecoglossxcida (NRRL B-50248; 0.2 x 109 CFU/g), Rhodococcus pyridinivorans (NRRL-50249; 0.3 x 109 CFU/g), Pseudomonas putida (ATCC 49451; 0.2 x 109) , Pseudomonas mendocina (ATCC 53757; 0.3 x 109 CFU/g), Pseudomonas monteilii (NRRL B-50250; 0.1 x 109 CFU/g), Pseudomonas monteilii (NRRL B-50251; 0.1 x 109 CFU/g), Pseudomonas monteilii (NRRL B-50252; 0.1 x 109 CFU/g), Pseudomonas monteilii (NRRL B-50253; 0.1 x 109 CFU/g) , y Pseudomonas antárctica (NRRLB-50259 ; 0.2 x 109 CFU/g) ; y - Una mezcla que contiene: Bacillus subtilis (NRRL B-50136; 3.5 x 109 CFU/g) , Bacillus amyloliquefaciens (ATCC 55405; 1.0 x 109 CFU/g) , Pseudomonas antárctica (NRRL B-50259; 0.2 x 109 CFU/g) , Aspergillus niger (NRRL 50245; 0.8 x 109 CFU/g), y Aspergillus oryzae (NRRL 50246; 0.8 x 109 CFU/g) .

Además, el microorganismo o la mezcla de dos o más microorganismos disponibles comercialmente de Novozymes Biological Inc., bajo los nombres registrados: BI-CHEM ABRHydrocarbon, BI-CHEM DC 1008 CB y Manure Degrader también son adecuados .

La incubación bajo condiciones aeróbicas puede ser efectuada como un proceso por lotes, un proceso por lotes de alimentación o un proceso continuo. En un proceso por lotes, el recipiente es llenado, un inoculo adecuado del microorganismo es agregado y el proceso procede durante un periodo de tiempo deseado. En un proceso por lotes de alimentación, un volumen inicial del material derivado del bagazo es agregado en el recipiente, típicamente el 25-75 % del volumen operativo total del recipiente, un inoculo adecuado del microorganismo es agregado y el proceso está procediendo hasta que una cierta conversión/densidad celular es alcanzada en donde la alimentación adicional en la forma del material derivado del bagazo es agregada a una velocidad adecuada y el proceso es continuado hasta que el recipiente está lleno y opcionalmente durante un periodo de tiempo adicional sin una alimentación adicional. En un proceso continuo, el proceso es empezado agregando el material en el recipiente y se agrega un inoculo adecuado del microorganismo, cuando una densidad celular deseada es alcanzada, una corriente de la composición en el recipiente es removida y simultáneamente una corriente del material es agregada al recipiente de modo que el volumen permanezca esencialmente constante y el proceso es continuado en un principio siempre que sea deseado. Aún puede ser posible utilizar una combinación de estas técnicas. Estas técnicas ya son conocidas dentro del arte y la persona experta apreciará cómo encontrar los parámetros adecuados para un proceso particular dependiendo de las dimensiones y propiedades particulares del recipiente.

Los medios para la ventilación ya son bien conocidos en el arte y está dentro de las capacidades de la persona experta seleccionar los medios adecuados para la ventilación de la presente invención. Usualmente la ventilación es efectuada por soplado del aire atmosférico a través de la composición típicamente por medio de uno o más tubo(s) o tubería (s) colocada (s) en la parte inferior del recipiente, los uno o más tubo(s) o tubería (s) está/están provisto (s) con orificios a intervalos regulares para proporcionar una distribución uniforme del aire en la composición. Otros medios para la ventilación también pueden ser utilizados de acuerdo con la invención.

La velocidad de la ventilación durante la etapa de fermentación aeróbica es seleccionada para proporcionar una velocidad de crecimiento conveniente de los microorganismos. La velocidad de la ventilación puede ser medida en volumen del aire por volumen del fermento por minuto (v/v/m) y usualmente la ventilación en el intervalo de 0.01 v/v/m hasta 10 v/v/m es adecuada, preferentemente 0.05 v/v/m hasta 5 v/v/m, más preferentemente 0.1 v/v/m hasta 2 v/v/m, más preferentemente 0.15 v/v/m hasta 1.5 v/v/m, y aún más preferentemente 0.2 v/v/m hasta 1 v/v/m.

La duración de esta etapa será decidida tomando en cuenta que un lado de la incubación bajo condiciones aeróbicas debe ser continuado durante un periodo de tiempo suficientemente prolongado para hacer soluble una parte satisfactoria del material lignocelulósico y disponible para el siguiente proceso microbiano o biológico, por otra parte, la etapa aeróbica no debe ser extendida de modo que una fracción demasiado grande de la fracción de la fibra sea quemada. Usualmente, la fermentación aeróbica es continuada durante 5 hasta 30 días, preferentemente desde 7 hasta 25 días, más preferentemente desde 10 hasta 20 días y aún más preferentemente alrededor de 15 días. Se ha encontrado que utilizando tal periodo de incubación, una fracción elevada adecuada de las fibras lignocelulósicas es convertida en una forma que puede ser convertida en un proceso microbiano o biológico siguiente.

La temperatura en esta etapa debe ser seleccionada tomando en cuenta los requerimientos particulares del microorganismo o la mezcla de dos o más microorganismos utilizados de acuerdo con la invención. Usualmente, la temperatura es seleccionada en el intervalo de 10 °C hasta 60 °C, preferentemente en el intervalo de 15 °C a 50 °C, más preferentemente en el intervalo de 20 °C a 45 °C, aún más preferentemente en el intervalo de 25 °C a 40 °C y aún más preferentemente alrededor de 35 °C.

El método de acuerdo con la invención incrementa la degradabilidad del material derivado del bagazo haciéndolo más accesible para un proceso microbiano o biológico siguiente, tal como por ejemplo un proceso de producción de biogas que conduce a un rendimiento más elevado ' de lo que podría haber sido posible sin el método de la invención.

La incubación bajo condiciones aeróbicas es continuada hasta que la degradabilidad de las fibras lignocelulósicas haya sido incrementada a un grado satisfactorio de modo que una fracción elevada, considerable, de las fibras lignocelulósicas se haya hecho accesible para un proceso microbiano o biológico siguiente.

Cuando las fibras lignocelulósicas se han hecho accesibles de acuerdo con la presente invención, las fibras accesibles o una parte de las mismas estarán disponibles para el siguiente proceso microbiano o biológico, significando que las fibras accesibles o una parte de las mismas puedan ser convertidas en el siguiente proceso microbiano o biológico. Por consiguiente, se puede determinar si la accesibilidad de las fibras lignocelulósicas se ha incrementado por el método de la invención efectuando un proceso microbiano o biológico siguiente sobre el material tratado de acuerdo con la invención y comparando el rendimiento del proceso microbiano siguiente con un proceso microbiano o biológico siguiente, correspondiente, utilizando un mismo material que comprende las fibras lignocelulósicas pero sin el método de la invención.

Un material que comprende las fibras lignocelulósicas puede ser tratado utilizando un método de la invención, seguido por un proceso de formación de un biogas anaeróbico usual y el rendimiento del biogas utilizando el material que comprende las fibras lignocelulósicas tratadas de acuerdo con la invención puede ser determinado y comparado con el mismo proceso de formación del biogas pero sin el método de la invención. Si el rendimiento del biogas es más elevado utilizando el método de la invención, de acuerdo con la invención, la accesibilidad de las fibras lignocelulósicas se ha incrementado. La persona experta apreciará que la accesibilidad incrementada de acuerdo con la invención puede ser determinada de otras maneras utilizando diferentes métodos microbianos o biológicos siguientes.

En una modalidad un método de la invención se refiere a la producción de metano. En esta modalidad la producción de metano puede ser llevada a cabo como un proceso de dos etapas que comprende una etapa aeróbica microbiológica y/o un pre-tratamiento enzimático seguido por un proceso para la producción del biogas. En otra modalidad, la producción del metano puede ser llevada a cabo como un proceso de dos etapas que comprende una etapa aeróbica microbiológica y/o un pre-tratamiento seguido por un proceso para la producción del biogas con un tratamiento enzimático simultáneo antes o durante el proceso de producción del biogas. En un principio, cualquier proceso de formación del biogas como es conocido dentro del arte puede ser utilizado aquí.

En otra modalidad, la producción del metano puede ser llevada a cabo como un proceso que comprende un primer proceso para la formación del biogas, seguido por una etapa aeróbica microbiológica y/o un tratamiento enzimático, nuevamente seguido por un segundo proceso para la formación del biogas.

Ej emplos Ejemplo 1. Caracterización del substrato de las materias primas y el bagazo tratado con una explosión de vapor Las pruebas se efectuaron sobre un bagazo de caña de azúcar el cual es un substrato rico en un material lignocelulósico, difícil de biodegradar. La muestra de bagazo originada de un molino de azúcar brasileño, y fue tratada en un proceso con explosión de vapor a escala industrial (STEX, por sus siglas en inglés) .

Dos muestras diferentes del bagazo fueron obtenidas y caracterizadas, una fue el bagazo de entrada como tal y el otro el bagazo tratado con una explosión de vapor. Este último es el bagazo de entrada que fue sometido a una alta presión y una alta temperatura, con vapor saturado a 170 °C en un reactor cerrado durante 15 minutos, seguido por la liberación rápida de la presión al final del tratamiento. Este proceso es referido como una explosión de vapor que es aplicada para incrementar la digestibilidad del bagazo, el cual es utilizado como forraje para el ganado. Para el análisis de los substratos, fue importante tener una muestra homogénea de tamaño de mm. Por lo tanto, las muestras del bagazo fueron desmenuzadas para reducir adicionalmente el tamaño de partícula. Esto se hizo por medio de un mezclador de cocina.

Tabla 1: Caracterización de la muestra del bagazo de entrada y de las muestras del bagazo después de la explosión de vapor Tabla 1 (cont.) Los análisis estándares fueron efectuados como se describió en el arte. Brevemente, los sólidos totales (TS) se determinaron por secado a 105 grados Celsius hasta que ningún cambio de peso adicional ocurrió. La ceniza fue determinada en un horno de mufla calentando la muestra a 600 grados Celsius en un crisol hasta que ningún cambio de peso adicional ocurrió. Los sólidos volátiles (VS, por sus siglas en inglés) fueron calculados restando los sólidos totales con el contenido de ceniza. Los ácidos grasos volátiles totales fueron determinados por la destilación y titulación al pH subsiguiente de acuerdo con los métodos estándares en el arte (Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, Eaton et al., Amer Public Health Assn; 21, 15 de octubre 2005) .

La demanda química de oxígeno (COD, por sus siglas en inglés) fue medida por el método del dicromato de potasio como se describió por Greenberg et al . en Standard Methods for the examination of water and wastewater. 18/a. Edición, 1992, p. 5 - 7. El pH fue medido agregando 1 g del material de peso húmedo a 100 mi de agua destilada y agitando durante 24 horas, seguido por la medición del pH por un electrodo de pH calibrado .

Ejemplo 2. Caracterización del lodo de siembra Todas las pruebas de la fermentación fueron iniciadas con el mismo tipo de lodo de siembra termofílico. Para cada serie de prueba, se recolectó una muestra fresca. Esta última se originó de las diferentes plantas de instalación de biogas a escala completa, termofílicas , el tratamiento de los abonos, los desechos de mataderos y/o los subproductos de las industrias de procesamiento de los alimentos .

Al inicio de los experimentos, este lodo de siembra fue caracterizado en términos de la concentración de la biomasa como los sólidos suspendidos totales (TSS, por sus siglas en inglés) y los sólidos suspendidos volátiles (VSS, por sus siglas en inglés) , los compuestos solubles residuales (solubles en COD y VFA) y la actividad metanogénica específica (SMA, por sus siglas en inglés) .

Las muestras de lodo de siembra fueron centrifugadas durante 10 minutos a 1750 g. El sobrenadante fue desechado y las pelotillas se lavaron con agua desionizada para remover las sales solubles. Las muestras fueron centrifugadas nuevamente durante 10 minutos a 1750 g. Las pelotillas resultantes se transfirieron a un crisol y se secaron a peso constante a 105 °C. Las muestras fueron enfriadas en un desecador y el TSS se determinó por medio de la masa. Después de la determinación de TSS, el crisol fue transferido a un horno de la mufla y se calentó a 600 °C durante 2 horas. Después del enfriamiento en un desecador, la masa de la ceniza residual fue determinada. El WS se determinó restando la ceniza residual del TSS. En la Tabla 2, se presenta una revisión de las características principales de un lodo de siembra típico.

La actividad metanogénica específica fue medida de acuerdo con un procedimiento estándar: En un matraz Erlenmeyer de 1.0 1, se ponen en contacto 800 mi del lodo junto con una alimentación fácilmente biodegradable , sintética, que consiste de 1.5 mi de etanol y 4 g de acetato de sodio, la cual corresponde a aproximadamente 5 g de COD . El reactor fue conectado a una columna de biogas y se colocó en un baño de agua caliente a 53 °C. El volumen y la velocidad de la producción del biogas fueron seguidos durante el transcurso del tiempo. Al final de la prueba de actividad del lodo, la concentración del metano del biogas producido fue analizada y la actividad metanogénica específica (SMA) fue expresada en gramos de CH4 calculado como COD por g de VSS por día (COD/g VSS.d) basado en la suposición teórica de que 1 g de COD es convertido en 0.35 1 de CH4. Los resultados de la prueba de actividad del lodo del inoculo son resumidos en la Tabla 2.

Tabla 2. Revisión de las características principales del lodo de siembra Para un lodo de siembra termofílico, la concentración de VSS fue considerada como el mejor método para medir la concentración de la biomassa anaeróbica activa. Todavía, se debe señalar que para esta medición, existe interferencia de la materia particular orgánica, no degradada, residual, desde el substrato, la cual fue alimentada previamente a esta biomasa. Además, una centrifugación fue requerida para separar la biomasa de la fase líquida.

Los resultados de la prueba de actividad del lodo indicaron que el lodo de siembra termofílico utilizado para los experimentos anaeróbicos, tuvo una actividad metanogénica específica satisfactoria. El lodo termofílico fue altamente amortiguado en el pH.

Ejemplo 3. Digestión anaeróbica por lotes del bagazo tratado con una explosión de vapor y el bagazo de entrada Para evaluar el efecto del tratamiento con una explosión de vapor del bagazo en un proceso de biogas, se llevaron a cabo los siguientes experimentos: Botellas de 500 mi fueron inoculadas con 200 mi del lodo anaeróbico, termofílico, obtenido de una planta de biogas a escala completa que funciona con desechos industriales y abonos. El substrato, ya sea en la forma de un bagazo de entrada o el bagazo tratado con una explosión de vapor, fue agregado a las botellas, las cuales fueron limpiadas entonces con una corriente de nitrógeno y se sellan con tapones de caucho de butilo para asegurar las condiciones anaeróbicas y un sello hermético al aire.

Las botellas fueron incubadas a 53 °C hasta que ninguna producción de metano adicional fue observada. Durante el transcurso del experimento, las botellas fueron ventiladas sobre una base regular para evitar la acumulación de la presión en las botellas. Antes de la ventilación, se determinó la cantidad precisa de metano en cada recipiente para permitir una cuantificación exacta del metano producido de principio a fin del experimento.

Para analizar la formación del metano, las muestras de los volúmenes del espacio superior de la botella fueron tomadas con una jeringa para gas de Hamilltion y se sometieron al análisis de GC sobre un cromatógrafo de gases Varían 3900 con una columna de separación de sílice fusionada de 25 m x 0.32 mm de PoraPLOT Q (10 µ??) (Varían, Agilent Technlogies, EUA) . Los viales para las muestras utilizados para todas las muestras del gas fueron viales con tapa atornillable clara de 2 cm3, prelimpiados , de Supelco (Supelco, Bellafonte, PA, EUA) . Las muestras de gas fueron cuant ificadas por la comparación con una curva estándar obtenida con los estándares de gas metano (Mikrolab, Aarhus, Dinamarca) .

Se efectuaron tres diferentes digestiones anaeróbicas : 1) Solamente del lodo anaeróbico 2) Del lodo anaeróbico con 1.67 g (peso seco) del bagazo de entrada 3) Del lodo anaeróbico con 1.67 g (peso seco) del bagazo tratado con una explosión de vapor.

Tres réplicas biológicas independientes se hicieron para cada tratamiento y dos réplicas se hicieron para todas las mediciones del metano y los estándares. Los resultados finales de las tres digestiones son mostrados en la Tabla 3.

Tabla 3. Rendimientos de metano finales obtenidos en el experimento por lotes sobre el bagazo. Los datos del metano son provistos a una condición estándar (20 °C, 1 atm. ) . La producción del metano de la base del lodo de inoculación ha sido restada.

Basado en los datos obtenidos fue claro que tratamiento con una explosión del vapor del bagazo condujo a un incremento significativo en la capacidad de digestión anaeróbica, tanto con respecto a la velocidad de conversión inicial como a la conversión obtenible máxima. El efecto observado en este ejemplo después de la sustracción de la producción del metano de la base del lodo fue un incremento del 20.5 % en el rendimiento del metano del bagazo tratado con una explosión de vapor comparado con el bagazo de entrada. Ejemplo 4. Digestión por lotes del bagazo tratado con una explosión de vapor con un pre- tratamiento enzimático En una segunda serie de pruebas de digestión anaeróbica, se utilizaron muestras de bagazo tratadas con una explosión de vapor como el substrato. La intención fue investigar si el pre-tratamiento físico por una explosión de vapor alteró la estructura de la pared celular del bagazo a tal grado que esto hizo más accesible el material lignocelulósico a las enzimas. El objeto de esta serie de pruebas fue examinar el efecto de la adición de la enzima dosificada ya sea antes de la fermentación o directamente en el reactor de la fermentación durante la digestión del bagazo tratado con una explosión de vapor.

Para evaluar el efecto de la adición de las enzimas sobre la biodegradabildad anaeróbica del material lignocelulósico, se efectuaron varias series de pruebas por lotes a corto plazo termofílicas (53 °C) a la escala de laboratorio .

Cada disposición del reactor consistió de un recipiente Erlenmeyer de 1.0 1 colocado en un baño de agua caliente termoestático (temperatura regulada a 53 °C) y se conectó a una columna de biogas para la recolección y la medición del biogas producido.

Al inicio de cada serie de prueba, los reactores fueron sembrados con la misma cantidad del lodo anaeróbico termofílico fresco. La alimentación del lodo de siembra con una cierta cantidad de substratos lignocelulósicos diferentes se hizo manualmente por lotes. Después de la alimentación y de la medición del pH de los licores mezclados, cada reactor fue conectado a una columna para seguir la producción del biogas. Al final del periodo de digestión (aproximadamente 1 semana o más por ciclo de alimentación) las muestras fueron tomadas para analizar la concentración del metano del biogas producido por cromatografía gaseosa. Para cada tratamiento, tres a cuatro alimentaciones sucesivas con el mismo substrato fueron efectuadas.

El tratamiento enzimático fue llevado a cabo ya sea como un tratamiento enzimático previo a la digestión anaeróbica o por la adición de la enzima directa al reactor. En ambos casos, las enzimas fueron una mezcla de dos productos de enzimas A y B.

La enzima A es una preparación de la celulasa de Trichoderma reesei que contiene la proteína de fusión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637) y el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656) . La enzima B es una xilanasa GH10 de Aspergillus aculeatus (WO 94(021785).

El pre-tratamiento enzimático se hizo al 5 % de TS del bagazo tratado con una explosión de vapor (o 110 g del bagazo pre-tratado en peso húmedo + 1 1 de agua del grifo) en un recipiente cerrado. Cada recipiente se coloca sobre un agitador magnético y se agita continuamente de principio a fin del tratamiento de hidrólisis enzimática. El tiempo de la hidrólisis enzimática total fue ajustado a 48 horas con la temperatura regulada a 50 °C durante el periodo completo. Las enzimas fueron dosificadas a: Enzima A = 59 mg del producto/g de TS (u 8.9 mg de la proteína de la enzima/g de TS) y Enzima B = 2.5 mg del producto/g de TS (o 0.1 mg de la proteína de la enzima/g de TS) . Se llevaron a cabo las siguientes pruebas : - Prueba de la base: El lodo de siembra sin adición del substrato - Prueba de control : El lodo de la siembra + el bagazo tratado con una explosión de vapor (flujo a 5 % del TS) - Prueba 1: Lodo de la siembra + bagazo tratado con una explosión de vapor, pre-tratado enzimáticamente - Prueba 2: Lodo de siembra + bagazo tratado con una explosión de vapor + mezcla de enzima.

Para todas las pruebas con el substrato de bagazo, incluyendo la prueba de control, el bagazo en el agua del grifo a una concentración de aproximadamente 5 % de TS (110 g de bagazo pre-tratado en peso húmedo + 1 1 de agua del grifo) fue aplicado como la alimentación. Al inicio, los 4 reactores fueron sembrados con la misma cantidad de lodo termofílico, especialmente 800 mi, que corresponden a una concentración de la biomasa de aproximadamente 17 g de VSS . El bagazo tratado con una explosión de vapor fue agregado como el substrato. La entrada del bagazo en el reactor de control y en los dos reactores de prueba se cuantificaron hasta aproximadamente 5 g de los sólidos totales por ciclo de alimentación. La cantidad correspondiente de la entrada de COD total varió alrededor de 6.2 g de COD por ciclo de alimentación.

Cuatro alimentaciones sucesivas (ciclos de alimentación) con la misma cantidad de la entrada de bagazo fueron probadas. Después de cada alimentación, un período de digestión de 7 a 8 días fue tomado en cuenta. Al final de cada ciclo de alimentación, la concentración del metano del biogas producido y las concentraciones de solubles en COD y VFA residuales fueron medidas . Los resultados acumulativos totales para los 4 ciclos de alimentación son resumidos en la Tabla 4. Tabla 4: Resumen de las pruebas de digestión con el bagazo tratado con una explosión de vapor como el substrato; la parte superior resume los resultados para el bagazo tratado con una explosión de vapor a 5 g de TS y 6.2 g de COD; la parte inferior resume los resultados para el bagazo tratado con una explosión de vapor a 20 g de TS y 24.8 g de COD.

Tabla 4. (cont.) *) Volumen del biogas después de restar el volumen del biogas de la prueba de la base a 32 grados Celsius, 1 atm.

**) Volumen del biogas neto tomando en cuenta la conversión total de COD de la enzima.

Basado en los datos dados en la Tabla 4, es evidente que la adición de la mezcla de la enzima dosificada ya sea durante la digestión o en un pre-tratamiento separado previo, mejoró considerablemente las producciones de biogas y metano totales en 30 % (Prueba 1) hasta 36 % (Prueba 2) . Cualquier efecto basado en la diferencia entre el tiempo de dosificación de estas enzimas (en un pre - tratamiento separado o directamente en el reactor anaeróbico) fue menos pronunciado en este experimento. Sin embargo, basado en las pruebas a escala de laboratorio con el bagazo pre-tratado como el substrato se encontró un efecto importante, positivo, neto de las enzimas .

Ejemplo 5. Digestión anaeróbica semi-continua a largo plazo del bagazo tratado con una explosión de vapor con ya sea un pre- tratamiento enzimático o con una adición directa de la enzima Para evaluar el efecto positivo de la adición de la enzima sobre la digestión termofílica anaeróbica, continua, del bagazo tratado con una explosión de vapor a largo plazo y para determinar experimentalmente el impacto de la adición de la enzima sobre la velocidad de carga volumétrica, las eficiencias de la remoción, la producción del metano y del biogas y el funcionamiento total del reactor anaeróbico, el tratamiento con el bagazo tratado con una explosión de vapor, 3 reactores (semi-) continuos fueron arrancados y se operaron durante 4 meses.

Cada disposición experimental de estas pruebas CSTR semi -continuas (reactor de tanque completamente agitado) consistieron de un reactor anaeróbico con un volumen del reactor activo de 1.8 1, colocado en un baño de agua caliente termoestática a 52 °C y conectado a una columna de biogas para seguir la producción del biogas. El líquido de cada reactor fue mezclado continuamente por medio de un dispositivo de agitación para mejorar el contacto entre el substrato y la biomasa y para prevenir la sedimentación y la acumulación de los sólidos en los reactores. A causa de la naturaleza del substrato de bagazo tratado con una explosión de vapor, la alimentación se hizo manualmente, todavía sobre una base de la frecuencia de tres veces a la semana. Previo a la alimentación, la misma cantidad del material digerido (licor mezclado) fue extraída manualmente de cada reactor. El bagazo tratado con una explosión de vapor fue dosificado en la forma de 8 % de TS . El lodo utilizado para inocular los 3 reactores continuos se adaptó bien al bagazo pretratado como el substrato de la alimentación y se tomó de un digestor anaeróbico que ha estado funcionando con el bagazo durante varios meses.

La mezcla de la enzima en este experimento fue una mezcla de xilanasa GH10 de Aspergillus aculeatus (WO 94/021785) y una preparación de la celulasa de Trichoderma reesei que contiene la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (WO 2005/047499) y el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656). La dosificación fue de 55 mg de la mezcla de enzima/g de TS (o 7.8 mg de la proteína de enzima/g de TS) .

Para examinar el efecto de la enzima sobre la conversión anaeróbica del bagazo tratado con una explosión de vapor y para determinar el efecto del punto de dosificación de esta enzima (directamente en el reactor anaeróbico o durante un pre-tratamiento específico) , tres reactores de CSTR semejantes fueron operados simultáneamente durante un periodo de 111 días (después de la semana de arranque) .

El primer reactor actuó como el reactor de control y fue alimentado solamente con el substrato como tal, el segundo y tercer reactores fueron operados como los reactores de prueba con la misma adición de enzima. En ambos reactores de prueba, la misma dosificación de enzima fue aplicada durante el período de prueba completo. En el primer reactor de prueba, la enzima fue agregada siempre directamente en el reactor después de cada alimentación por lotes. La corriente de alimentación para el segundo reactor de prueba fue sometida previamente a pre-tratamiento . El bagazo fue llevado en contacto con el agua del grifo (aproximadamente 8 % de TS) , la misma dosificación de enzima fue agregada, el pH fue ajustado a aproximadamente 5 y el recipiente de los lodos sin tratar fue colocado sobre un agitador magnético con mezclado continuo y en un incubador a 50 °C durante un período de 2 días .

Para tener la capacidad de deducir el efecto neto de la adición de la enzima sobre la digestión anaeróbica, las dos otras entradas también fueron sometidas al mismo pre-tratamiento, excepto por la adición de la enzima.

Las pruebas con el pre-tratamiento y la adición de la enzima se llevaron a cabo durante un período de 4 meses. Durante los dos primeros meses, los tres reactores fueron operados bajo condiciones estables a la misma velocidad de carga volumétrica relativamente baja. Los tres reactores de CSTR fueron empezados a una velocidad de carga volumétrica de aproximadamente 2.3 g de TS/1 del reactor por día, que corresponde con un tiempo de retención del lodo y del material hidráulico de 35 días.

En las siguientes semanas, la velocidad de carga volumétrica de los reactores fue incrementada por etapas por el aumento de la cantidad de bagazo de STEX (tratado con explosión de vapor) y agua del grifo. Puesto que el bagazo STEX fue agregado siempre bajo la forma de 8 % de TS, el incremento de la alimentación del bagazo estuvo acompañado por una reducción del tiempo de retención del lodo y del material hidráulico en los reactores. Nunca existió ninguna diferencia en la velocidad de carga entre los tres reactores.

Para seguir el funcionamiento del reactor, los efluentes de cada reactor fueron agrupados en una base por semana. Las características principales (TSS, VSS, soluble en CDO, TAN, conductividad y ácidos grasos volátiles) fueron determinadas al final de cada período de prueba.

Los reactores fueron suplementados con nitrógeno (NH4C1) y fósforo (KH2P04) a causa del contenido bajo de N y P del substrato de bagazo tratado con una explosión de vapor. Además de los suplementos de nitrógeno y fósforo, una mezcla de los elementos de trazas también es agregada a los reactores para asegurar que ninguno de los micronutrientes pudiera llegar a ser limitativo.

El período de prueba total fue dividido en 5 sub-períodos con base en la velocidad de carga volumétrica. En la Tabla 5, una revisión general de los parámetros de proceso y la producción del biogas resultante de los tres reactores continuos es mostrada para cada sub-período en el experimento.

Tabla 5. Revisión de la alimentación y de la producción del biogas de los 3 reactores de CSTR durante el período de prueba .

Tabla 5 Cont .

Tabla 6. Resumen de la composición del efluente de los 3 reactores de CSTR durante el periodo de prueba; todas las mediciones están en mg/1.

Tabla 7. Resultados acumulativos de las producciones de la alimentación y del biogas de las 3 pruebas de CSTR continuas; período de prueba total desde el día 8 hasta el día 119.

Tabla 8. Resultados acumulativos de las producciones de la alimentación y del biogas de las 3 pruebas de CSTR continuas; período de prueba de la velocidad de carga más elevada desde el día 64 hasta el día 119.

Tabla 8 (Cont . ) El impacto de la enzima sobre la digestión termofílica del bagazo STEX en un reactor de CSTR fue investigado en una prueba a escala de laboratorio a largo plazo. Tres reactores semejantes (1.8 1 del volumen del reactor activo) fueron operados a velocidades de carga gradualmente crecientes, partiendo desde 2.25 g de TS/1 del reactor por día y aumentado gradualmente hasta 5.56 g de TS/1 del reactor por día. Esto está relacionado con un reactor de control sin adición de enzima, un reactor de prueba con adición de enzima directamente en el reactor anaeróbico y un reactor de prueba con adición de enzima en un pre - tratamiento específico (2 días de agitación a 50 °C y un pH de aproximadamente 5) . El funcionamiento de estos reactores fue seguido por las mediciones de la producción del biogas y del metano por una parte y la caracterización de los efluentes anaeróbicos.

Cuando los resultados del período de prueba total de 111 días fueron tomados en cuenta, un incremento total del volumen total de la producción del biogas con 13 % fue obtenido en el reactor de prueba 1 con la adición de la enzima directamente en el reactor. Un efecto inferior pero todavía significativo sobre la producción del biogas total del 8 % de incremento fue obtenido en el otro reactor de prueba con la adición de enzima en el pre-tratamiento (Tabla 7) .

Un impacto positivo más elevado de la adición de la enzima fue logrado cuando los reactores de CSTR fueron operados a velocidades de carga volumétrica más elevadas. Por lo tanto, las producciones del biogas, promedio y totales, también fueron calculadas para el período de prueba desde el día 64 hasta el día 119 con las velocidades de carga volumétricas que varían entre 3.08 g y 5.56 g de TS/1 del reactor, d. El incremento en la producción del biogas total comparado con la prueba de control se cuantifico hasta el 16 % en el reactor de prueba 1 y 10 % en el reactor de prueba 2. Además, se debe señalar que el rendimiento del metano (1/g del TS) se mantuvo a un nivel constante de 0.30 hasta 0.31 en el reactor de prueba 1 durante los períodos de prueba 3 a 5, mientras que el rendimiento del metano en el reactor de control fue reducido desde 0.3 en el período de prueba 3 hasta 0.23 en el período de prueba 5. Por consiguiente, el mejor y más estable efecto positivo de la enzima fue obtenido cuando las enzimas fueron agregadas directamente en el reactor anaeróbico (Tabla 8) .

De los resultados de los diferentes sub-periodos , se podría derivar que mientras más elevada es la velocidad de la carga, más pronunciado fue el impacto de la adición de la enzima. Las diferencias mutuas en la producción del biogas entre los reactores de prueba y el reactor de control en los períodos de prueba de las velocidades de carga elevadas, se debieron principalmente a una conversión incompleta del bagazo STEX en la prueba de control (sobrecarga). Esto último condujo a producciones de biogas que se reducen gradualmente por g del bagazo de STEX de TS agregado en la prueba de control. Todavía, en el reactor de prueba con la adición de la enzima directamente en el reactor, la cantidad de biogas por g de TS agregado permaneció más o menos constante (aproximadamente 0.3 1 de biogas/g de TS agregado) . La adición de la enzima en la pre-tratamiento ocasionó resultados más fluctuantes. En resumen, el impacto de la enzima sobre la producción del biogas fue interior en esta prueba (es decir con las enzimas agregadas durante el pre-tratamiento) comparado con cuando las enzimas son agregadas directamente, pero todavía mejoró significativamente comparado con el reactor de control .

El mejor funcionamiento de los reactores de prueba con la adición directa de la enzima, especialmente a las velocidades de carga más elevadas probadas, fue confirmado por las concentraciones inferiores de COD solubles y de VFA del efluente. También para estos parámetros, los resultados más bajos y más estables fueron logrados en el reactor de prueba con la adición de la enzima directamente en el reactor (Tabla 6).

En resumen, la conclusión principal de esta prueba a escala de laboratorio a largo plazo fue que la enzima, cuando es agregada directamente en el reactor anaeróbico, garantizó un funcionamiento más estable y eficiente del reactor de CSTR anaeróbico termofílico tratando el bagazo con una explosión de vapor (8 % de TS) . Especialmente en períodos de velocidades de carga elevadas, se lograron producciones del biogas y del metano significativamente más elevadas, así como compuestos solubles residuales inferiores, en las pruebas, indicando el impacto positivo de la adición de la enzima sobre la conversión anaeróbica del bagazo tratado con una explosión de vapor .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso de producción de biogas, caracterizado porque comprende las etapas de proporcionar una suspensión que comprende un material derivado del bagazo y agua , y: (a) efectuar un pre-tratamiento que comprende agregar una o más enzimas a la suspensión para degradar el material derivado del bagazo a una temperatura y pH adecuados, y luego agregar el material degradado con la enzima a un tanque digestor del biogas a una velocidad y proporción adecuadas para convertir efectivamente el material al biogas en el digestor; o (b) agregar una o más enzimas a la suspensión antes de agregar la suspensión a un tanque digestor del biogas; o (c) agregar una o más enzimas al tanque digestor después de agregar la suspensión al tanque digestor, para degradar el material derivado del bagazo a una temperatura y pH adecuados y para convertir efectivamente el material al biogas en el digestor.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una o más enzimas son seleccionadas del grupo que consiste de una enzima amilolítica, una enzima lipolítica, una enzima proteolítica, una enzima celulolítica, una óxido-reductasa y una enzima de degradación de la pared celular de la planta.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque una o más enzimas son seleccionadas del grupo que consiste de aminopeptidasa , alfa-amilasa, amiloglucosidasa, arabinofuranosidasa, arabinoxilanasa, beta-glucanasa , carbohidrasa , carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, ácido ferúlico esterasa, desoxirribonucleasa, endo-celulasa, endo-glucanasa, endo-xilanasa, esterasa, galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, glucosa oxidasa, glucosidasa, haloperoxidasa, hemicelulasa, invertasa, isomerasa, lacasa, ligasa, lipasa, liasa, mananasa, manosidasa, oxidasa, pectato liasa, pectina liasa, pectina trans-eliminasa , pectina etilesterasa, pectina metilesterasa , enzima pectinolítica, peroxidasa, proteasa, fitasa, fenoloxidasa, poligalacturonasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ramnogalacturonano liasa, ramnoglucanasa, ramnogalacturonasa , ribonucleasa, SPS-asa, transferasa, transglutaminasa, xilanasa y xiloglucanasa .

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque una o más enzimas son una proteasa, una pectato liasa, una ácido ferúlico esterasa y/o una mananasa .

5. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una o más enzimas se seleccionan de una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene la proteína de fusión de beta-glucosidasa de Aspergillus orizae y el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus y/o una xilanasa GH10 de Aspergillus aculeatus .

6. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el material derivado del bagazo o la suspensión es homogeneizado ; preferentemente por molienda, molienda en húmedo, trituración o trituración en húmedo previo a, o durante la etapa (a) o previo a la etapa (b) .

7. El proceso de · conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque una base es agregada al material derivado del bagazo o a la suspensión previo a, o mientras que es homogeneizada ; preferentemente la base es NaOH, Na2C03, NaHC03, Ca(OH)2, hidrato de cal, amoniaco y/o KOH.

8. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el contenido del material derivado del bagazo en la suspensión es ajustado por adición continua o por etapas del material a la suspensión durante las etapas (a) o (b) .

9. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el material que contiene lignocelulosa constituye arriba de 2.5 % en peso de DS, preferentemente arriba de 5 % peso - % de DS, preferentemente arriba de 10 % peso - % de DS, preferentemente arriba de 15 % en peso de DS, preferentemente arriba de 20 % en peso de DS, más preferentemente arriba de 25 % en peso de DS de la suspensión.

10. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el material derivado del bagazo es degradado a un pH en el intervalo desde 7 hasta 10; preferentemente desde 8 hasta 9; aún más preferentemente alrededor de 8.5.

11. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque el material derivado del bagazo es degradado a una temperatura en el intervalo desde 20-70 °C, preferentemente 30-60 °C, y más preferentemente 40-50 °C.

12. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque una etapa de separación de los sólidos es efectuada en la etapa (a) después que el material derivado del bagazo es degradado pero antes que el mismo sea agregado al tanque digestor, para purgar los sólidos no solubilizados y opcionalmente retroalimentarlos hacia la etapa (a) del proceso.

13. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque el material derivado del bagazo previo a las etapas (a) o (b) ha sido sometido a un tratamiento de irradiación con microondas y/o uno ultrasónico.

14. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque el material derivado del bagazo ha sido tratado químicamente, mecánicamente y/o biológicamente previo a las etapas (a) o (b) .