KR100808499B1 - 열안정성 글루코아밀라제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전분 전환 방법에 적합한 Talaromyces emersonii로부터 유도된, 분리된 열안정성 글루코아밀라제에 관한 것이다.
글루코아밀라제, 반감기, 미생물, 효소, 서열, 당화

Description

열안정성 글루코아밀라제{THERMOSTABLE GLUCOAMYLASE}
본 발명은, 예를 들어, 전분 전환에, 예를 들어, 전분으로부터 글루코스를 제조하기에 적합한 열안정성 글루코아밀라제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 많은 방법에서, 특히 전분 전환 방법의 당화 단계에서 열안정성 글루코아밀라제의 용도에 관한 것이다.
글루코아밀라제(1,4-α-D-글루칸 글루코하이드롤라제, EC 3.2.1.3)는 전분 또는 관련된 올리고당류 및 다당류 분자의 비환원 말단으로부터 D-글루코스의 방출을 촉매화하는 효소이다.
글루코아밀라제는 Aspergillus niger 및 Aspergillus awamori를 포함하여, 많은 사상 진균 및 효모에 의해 생산된다.
공업적으로, 글루코아밀라제는 α-아밀라제에 의해 글루코스로 이미 부분적으로 가수분해된 옥수수 전분을 전환시키는 데에 사용된다. 글루코스는 또한 글루코스 이소메라제에 의해 거의 동일한 글루코스 및 프럭토스로 이루어진 혼합물로 전환될 수 있다. 이 혼합물, 또는 추가로 프럭토스가 풍부한 혼합물은 전 세계에 걸쳐서 상업화된, 일반적으로 사용되는 고 프럭토스 옥수수 시럽이다. 이 시럽은 효소 방법으로 생산된 세계에서 가장 많은 톤수의 생산물이다. 생산되는 가장 중 요한 공업 효소중에 전분의 프럭토스로의 전환에 포함되는 세가지 효소가 있다.
고 프럭토스 옥수수 시럽의 생산에서 글루코아밀라제의 공업적 사용에 대해 존재하는 주요 문제중의 하나는 시판되는 Aspergillus niger 글루코아밀라제(즉, 에 Novo Nordisk A/S에 의해 AMG로 판매)와 같은 글루코아밀라제의 비교적 낮은 열 안정성이다. 공업용 Aspergillus 글루코아밀라제는 α-아밀라제 또는 글루코스 이소메라제만큼 열 안정성이지 않으며, α-아밀라제 또는 글루코스 이소메라제보다 낮은 pH에서 가장 활성이고 안정하다. 따라서, 이는 낮은 온도 및 pH에서 별도의 용기에서 사용해야 한다.
US 특허 제4,247,637호에는 액화된 전분 용액을 시럽으로 당화시키기에 적합한, Talaromyces duponti로부터 유도된 분자량 약 31,000Da의 열안정성 글루코아밀라제가 기술되어 있다. 글루코아밀라제는 70℃에서 10분동안 pH 4.5에서 유지하는 경우, 이의 최초 글루코아밀라제 활성의 약 90% 이상을 보유한다고 기술되어 있다.
US 특허 제4,587,215호에는 분자량이 약 45,000Da인, Talaromyces thermophillus종으로부터 유도된 열안정성 아밀로글루코시다제가 기술되어 있다. 기술된 아밀로글루코시다제(또는 글루코아밀라제)는 이의 효소 활성을 두가지 분명한 상, 급속히 붕괴되는 최초기, 다음에 서서히 붕괴되는 기로 상실한다. 70℃(pH 5.0)에서 급속한 붕괴에 대한 반감기는 제2 붕괴 상에서 1시간이내에 측정가능한 활성의 손실 없이 약 18분이다. 문헌[참조: Bunni L. et al., (1989), Enzyme Microb. Technol., Vol. 11, p. 370-375]은 하나 이상의 α-아밀라제 형태 및 Talaromyces emersonii CBS 814.70에 의해 생산된 α-글루코시다제의 한 형태로 이 루어진 세포외 가아밀로분해 시스템의 생산, 분리 및 부분적 특성화에 관한 것이다. α-아밀라제만이 분리되고, 정제되고, 특성화된다.
본 발명은, 예를 들어, 전분 전환 방법의 당화 단계에 사용하기에 적합한 신규한 열안정성 글루코아밀라제의 발견을 근거로 한다.
"글루코아밀라제" 및 "AMG"라는 용어는 다음에서 상호교환되어 사용된다.
본 발명의 글루코아밀라제의 열 안정성은 다음의 "물질 및 방법" 단락에 기술된 방법을 사용하여 T1/2(반감기)로서 측정된다.
본 발명의 발명자들은 Centraalbureau voor Schimmelcultures에 번호 CBS 793.97로 현재 기탁된 Talaromyces emersonii 균주로부터 열안정성 글루코아밀라제를 분리하고 정제하고 특성화하였다.
단백질에 적용하는 경우, "분리된"이란 용어는 단백질이 이의 천연 환경 이외의 다른 상태에서 발견되는 것을 지시한다. 바람직한 형태에서, 분리된 단백질은 다른 단백질, 특히 다른 상동성 단백질(즉, 상동성 불순물)을 실질적으로 함유하지 않는다(다음 참고).
단백질을 40% 이상 순수한 형태로, 더욱 바람직하게는 60% 이상 순수한 형태로 제공하는 것이 바람직하다. 더 더욱 바람직하게는, 단백질을 매우 순수한 형태로, 즉 SDS-PAGE에 의해 측정된 바와 같이, 80% 이상 순수한, 더욱 바람직하게는 95% 이상 순수한, 더 더욱 바람직하게는 99% 이상 순수한 형태로 제공하는 것이 바 람직하다.
"분리된 효소"라는 용어는 "정제된 효소"를 대신하는 명칭일 수 있다.
"상동성 불순물"이란 용어는 본 발명의 폴리펩타이드가 원래 수득되는 상동성 세포로부터 유래되는 불순물(예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드 이외의 다른 폴리펩타이드)을 의미한다.
분리된 글루코아밀라제는 Aspergillus niger 글루코아밀라제(즉, Novo Nordisk A/S에 의해 상품명 AMG로 판매)와 같은 선행 기술 글루코아밀라제에 비해서 매우 높은 열 안정성을 갖는다. T1/2(반감기)는 다음 실시예 2에 기술된 바와 같이 70℃(pH 4.5)에서 약 120분으로 측정되었다. 효모에서 발현된 재조합체 T. emersomii AMG의 T1/2은 실시예 12에 기술된 바와 같이 약 110분으로 측정되었다.
따라서, 제1 양태에서 본 발명은 50mM NaOAc중에, 0.2AGU/ml, pH 4.5, 70℃에서 100분 이상의 T1/2(반감기)를 갖는 글루코아밀라제 활성을 갖는 분리된 효소에 관한 것이다.
제2 양태에서, 본 발명은 SEQ ID N0: 1-6으로 나타낸 하나 이상의 부분 서열 또는 SEQ ID NO: 7로 나타낸 전체 길이 서열을 포함하는 글루코아밀라제 활성을 갖는 효소 또는 실질적으로 이와 상동성인 글루코아밀라제 활성을 갖는 효소에 관한 것이다.
"부분 서열"이란 용어는 폴리펩타이드 장서열에 포함된 부분 폴리펩타이드 서열을 나타내고, 여기에서 폴리펩타이드 장서열은 중요한 활성을 갖고 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 글루코아밀라제를 암호화하는 클로닝된 DNA 서열에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 전분 또는 부분적으로 가수분해된 전분을, 예를 들어, 덱스트로스를 함유하는 시럽으로 전환시키는 방법에 관한 것이기도 하며, 이 방법은 전분 가수분해물을 본 발명의 글루코아밀라제의 존재하에 당화시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 목적은 액화된 전분 용액을 당화시키는 방법을 제공하는 것이며, 여기에서 효소성 당화는 본 발명의 글루코아밀라제를 사용하여 수행된다.
또한, 본 발명은 전분 전환 방법, 예를 들어, 연속적 전분 전환 방법에서 본 발명의 글루코아밀라제의 용도에 관한 것이다. 연속적 전분 전환 방법의 양태에서, 이는 연속적 당화 단계를 포함한다.
본 발명의 글루코아밀라제는 또한 올리고당류 또는 특수 시럽을 제조하는 방법에 사용할 수 있다.
최종적으로, 본 발명은 본 발명의 글루코아밀라제를 생산할 수 있는 미생물 Talaromyces emersonii CBS 793.97 또는 이의 돌연변이체의 분리된 순수 배양물에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 정제된 Talaromyces emersonii CBS 793.97 글루코아밀라제의 분자량(Mw)을 측정하기 위해 사용되는 (Coomassie Blue로 염색된) SDS-PAGE 겔을 도시한다.
1. 표준 표지
2. Q 세파로스 풀(1. 수행)
3. S 세파로스 풀.
도 2는 60℃에서 0.5% 말토스중의 Talaromyces emersonii 및 Aspergillus niger 글루코아밀라제(AMG)의 pH 활성 프로필을 도시한다.
도 3은 Talaromyces emersonii CBS 793.97 글루코아밀라제 대 Aspergillus niger 글루코아밀라제(AMG)의 온도 활성 프로필을 도시한다.
도 4는 Talaromyces emersonii CBS 793.97 글루코아밀라제 대 Aspergillus niger 글루코아밀라제(AMG)의 50mM NaOAc중에, 0.2AGU/ml, pH 4.5, 70℃에서의 T1/2(반감기)를 측정하는 커브를 도시한다.
도 5는 Talaromyces emersonii AMG 유전자좌의 서열을 도시한다. 예측되는 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 서열 아래에 도시된다. 4개의 개재 배열이 하부 경우 문자로 나타나 있다. 공통 개재 배열은 밑줄쳐 있다. 추정되는 신호 및 프로-펩타이드는 각각 두 줄로 및 점선으로 밑줄쳐 있다.
도 6은 A. niger AMG (An_amg-1.pro), A. oryzae AMG(Ao_AMG.pro), 및 Talaromyces emersonii AMG(Tal-AMG.pro)의 아미노산 서열의 배열/비교를 도시한다. 동일한 아미노산 잔기는 *로 지시한다. 신호 및 프로펩타이드는 각각 한 줄 및 두 줄로 밑줄쳐 있다.
도 7은 실시예 5에 사용된 Aspergillus 발현 카세트 pCaHj483을 도시한다.
도 8은 Talaromyces emersonii AMG 유전자에 대한 Aspergillus 발현 플라스미드, pJaL518을 도시한다.
도 9는 A. niger 붕괴 플라스미드의 구조를 도시한다.
도 10은 본 발명의 Talaromyces emersonii 글루코아밀라제를 발현시키는, 두가지 형질전환체, JaL228#5.77 및 HowB112#8.10의 SDS 페이지 겔을 도시한다. JaL228 및 HowB112는 형질전환되지 않은 모 균주이다. MW: Promega의 단백질 분자.
도 11은 50mM NaOAc중에, pH 4.5, 70℃, 0.2AGU/ml에서 측정된 균주 A. niger HowB112를 생산하는 T. emersonii AMG의 열 안정성을 도시한다(T1/2은 20분으로 측정된다).
도 12는 효모에서 생산된, 효모에서 발현된 T. emersonii AMG 및 A. niger AMG의 발효 육즙의 68℃에서의 열 안정성을 비교한 것이다.
도 13은 효모중에 70℃, pH 4.5, 0.2AGU/ml에서 생산된 재조합체 Talaromyces emersonii AMG의 열안정성을 측정하기 위한 시험의 결과를 도시한다. T1/2는 약 110℃에서 측정되었다.
본 발명은, 예를 들어, 전분 전환 방법의 당화 단계에 사용하기에 적합한 신규한 열안정성 글루코아밀라제의 발견을 근거로 한다.
본 발명의 발명자들은 Talaromyces emersonii CBS 793.97 균주로부터 글루코아밀라제를 분리하고, 정제하고, 특성화하였다. 이 글루코아밀라제는 선행 기술 글루코아밀라제에 비해서 매우 높은 열 안정성을 갖도록 생산되었다.
따라서, 제1 양태에서 본 발명은 50mM NaOAc중에, 0.2AGU/ml, pH 4.5, 70℃에서 100분 이상, 예를 들어, 100분 내지 140분의 T1/2(반감기)를 갖는 글루코아밀라제 활성을 갖는 분리된 효소에 관한 것이다.
분리된 Talaromyces emersonii CBS 793.97 글루코아밀라제의 T1/2(반감기)는 다음 실시예 2에 기술된 바와 같이 70℃에서 약 120분으로 및 실시예 12에 기술된 바와 같이 효모에서 생성된 T. emersonii에 대해서는 약 110℃로 측정되었다.
분리된 글루코아밀라제의 분자량은 SDS-PAGE에 의해 약 70kDa로 측정된 것으로 밝혀졌다. 또한, 효소의 pI는 등전점 집속을 사용하여 3.5 이하인 것으로 측정되었다.
등전점, pI는 (임의로 결합된 금속 또는 다른 이온을 갖는) 효소 분자 착체가 중성인 경우, 즉 착체상의 정전기 전하의 합(순 정전기 전하, NEC)이 0과 동일한 경우의 pH 값으로 정의된다. 물론 이러한 합에서 정전기 전하의 양성 또는 음성 특성에 대한 사항은 고려되어야 한다.
유리한 특성이 동일한, 실질적으로 상동성인 효소가 다른 미생물, 특히 진균성 유기체(예: 사상 진균), 특히 다른 Talaromyces 균주, 특히 다른 Talaromyces emersonii 균주로부터 수득될 수 있음이 기대된다.
기탁된 미생물
본 발명의 글루코아밀라제가 분리된 사상 진균 균주의 분리물은 다음에 지시 된 일자로 특허 절차를 밟기 위해서 네덜란드 3740 아게 바안 피.오. 박스 273의 Centraalbureau voor Schimmelcultures에 기탁되었다. 부다페스트 조약하의 국제 기탁소인 CBS는 조약 9조에 따라서 기탁물의 영구성을 제공한다.
기탁일: 1997년 6월 2일
기탁자 참고 번호: NN049253
CBS 지정 번호: CBS 793.97
사상 진균 Talaromyces emersonii CBS No. 793.97의 분리물은 분리된 진균에의 입수가 본 특허 출원의 계류 동안에 37 C.F.R. § 1.14 및 35 U.S.C. § 122하에 이에 제목 붙여지는 특허 및 상표국장에 의해 결정된 것에 유효함을 보장하는 조건하에 기탁되었다. 기탁물은 분리된 진균의 실질적으로 순수한 배양물을 나타낸다. 기탁물은 해당 특허의 대응출원 또는 이의 연속출원이 출원되는 국가에서 외국 특허법에 의해 필요한 경우, 입수할 수 있다. 그러나 기탁물의 입수가능성은 정부의 행위에 의해 부여된 특허 권리의 감손에 있어서 당해 발명을 수행하는 면허를 구성하지 않음을 이해해야 한다.
Talaromyces emersonii 글루코아밀라제 아미노산 서열
본 발명자들은 다음 실시예 3에 추가로 기술되는 바와 같이 Talaromyces emersonii CBS 793.97로부터 유도된 열안정성 글루코아밀라제를 서열화했다. 본 발명에 따라서, Talaromyces AMG는 Asp145Asn(또는 D145N) 치환물을 가질 수 있다(SEQ ID NO: 7 넘버링을 사용).
따라서, 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1-6으로 나타낸 하나 이상의 부분 서열 또는 SEQ ID NO: 7로 나타낸 전체 길이 서열을 포함하는 글루코아밀라제 활성을 갖는 분리된 효소 또는 이와 실질적으로 상동성인 글루코아밀라제 활성을 갖는 효소에 관한 것이다. SEQ ID NO: 34는 아미노산 no. 1 내지 27로부터 신호 및 프리 프로펩타이드를 포함하는 전체 길이 서열을 나타낸다.
단백질 서열의 상동성
두개의 글루코아밀라제 사이의 상동성은 제1 서열의 제2 서열로부터의 유도를 지시하는 두개의 단백질 서열 사이의 일치도로서 결정된다. 상동성은 적합하게는 GCG 프로그램 패키지에 의해 제공되는 gap와 같은, 당해 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램에 의해 결정할 수 있다[참조: Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, p. 443-453]. 폴리펩타이드 서열 비교를 위한 다음 설정과 함께 gap를 사용: 3.0의 gap 형성 페널티 및 0.1의 gap 확장 페널티.
본 발명에 따라서, "실질적으로 상동성인" 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1-6 또는 SEQ ID NO: 7로 나타낸 부분 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 일치도를 나타낸다.
클로닝된 T alaromyces emersonii DNA 서열
본 발명은 또한 본 발명의 글루코아밀라제 활성을 나타내는 효소를 암호화하는 클로닝된 DNA 서열에 관한 것이며, 이러한 DNA 서열은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 33으로 나타낸 DNA 서열의 부분을 암호화하는 글루코아밀라제;
(b) SEQ ID NO: 33 또는 이의 상보성 스트랜드에서 위치 649-2724로 나타낸 DNA 서열;
(c) 상기 DNA 서열과 80% 이상 상동성인 (a) 또는 (b)로 정의된 DNA 서열의 유사물질;
(d) 낮은 엄격도에서 SEQ ID NO: 33에서 649-2724로 나타낸 서열을 포함하는 이중 스트랜드 DNA 프로브와 잡종형성되는 DNA 서열;
(e) 유전학적 코드의 변성 때문에, (b)의 서열과 잡종형성되지 않지만, (f) 이들 DNA 서열중의 하나에 의해 암호화되는 폴리펩타이드와 정확하게 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열;
(g) (a), (b), (c), (d) 또는 (e)에서 특정된 DNA 서열의 단편인 DNA 서열.
본 발명의 AMG의 성숙 부분은 SEQ ID NO: 33의 위치 728-2724에서의 DNA 서열에 의해 암호화된다. 효모, 예를 들어, Saccharomyces cerevisisae YNG318중에서 본 발명의 AMG를 발현시키는 경우, 개재 배열은 실시예 7에 기술된 바와 같이 절단될 필요가 있다.
DNA 서열의 상동성
상기에 언급된 DNA 서열 상동성은 제1 서열의 제2 서열로부터의 유도를 지시하는 두가지 서열 사이의 일치도로서 결정한다. 상동성은 적합하게는 GCG 프로그램 패키지에 의해 제공되는 GAP와 같은, 당해 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램에 의 해 결정할 수 있다[참조: Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, p. 443-453]. DNA 서열 비교를 위한 다음 설정과 함께 GAP를 사용: 5.0의 GAP 형성 페널티 및 0.3의 GAP 확장 페널티, 상기로 언급된 유사한 DNA 서열의 암호화 영역은 SEQ ID NO: 33으로 나타낸 DNA 서열의 AMG 암호화 부분 또는 개재 배열의 존재하에 또는 부재하에 글루코아밀라제 암호화 부분과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상의 일치도를 나타낸다.
잡종형성
상기 d)에서 정의된 유사한 DNA 서열을 정의하며, 상기로 언급되고, SEQ ID NO: 33에서의 위치 649-2748에 나타낸 서열을 포함하는 이중 스트랜드 프로브(즉, AMG 암호화 부분)로 적어도 낮은 엄격도 조건하에, 그러나 바람직하게는 중간 또는 높은 엄격도 조건하에 잡종형성하는 조건은 다음에 상세히 기술된 바와 같다.
뉴클레오타이드 프로브 및 상동성 DNA 또는 RNA 서열 사이에서 낮은, 중간 또는 높은 엄격도로 잡종형성을 측정하기에 적합한 실험 조건은 잡종형성하는 DNA 단편 또는 RNA를 함유하는 필터를 5 x SSC(염화나트륨/시트르산나트륨, Sambrook et al. 1989)중에 10분동안 예비침지시키고, 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액(Sambrook et al. 1989), 0.5% SDS 및 100μg/ml의 변성된 초음파처리 연어 정액 DNA(Sambrook et al. 1989)의 용액중에서 필터를 예비잡종형성시킨 다음에, 10ng/ml 농도의 임의 프라임된[참조: Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13], 32P-dCTP 표지된(특이 활성>1 x 109cpm/μg) 프로브를 함유하는 동일한 용액중에서 12시간동안 약 45℃에서 잡종형성시킴을 포함한다. 다음에, 필터를 30분동안 2 x SSC, 0.5% SDS중에 약 55℃에서(저 엄격도), 더욱 바람직하게는 약 60℃에서(중간 엄격도), 더욱 더 바람직하게는 약 65℃에서(중간/고 엄격도), 더욱 더 바람직하게는 약 70℃에서(고 엄격도), 및 더욱 더 바람직하게는 약 75℃에서(매우 높은 엄격도) 2회 세척한다.
올리고뉴클레오타이드 프로브가 이러한 조건하에 잡종형성되는 분자가 x선 필름을 사용하여 검출된다.
전분 전환
본 발명은 글루코스 등을 전분으로부터 제조하기 위해 본 발명의 열안정성 글루코아밀라제를 사용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이 방법은 전구체 전분을 α-아밀라제의 존재하에 부분적으로 가수분해시킨 다음에, 전분 또는 관련된 올리고당류 및 다당류 분자의 비환원 말단으로부터 D-글루코스의 방출물을 α-(1→4) 및 α-(1→6) 글루코시드성 결합을 분리함으로써 글루코아밀라제의 존재하에 추가로 가수분해시킴을 포함한다.
α-아밀라제를 사용하는 전구체 전분의 부분적 가수분해는 내부 α-(1→4)-결합을 가수분해하여 전분 분자의 초기 파괴를 제공한다. 공업적 용도에서, α-아밀라제를 사용하는 초기 가수분해는 약 105℃의 온도에서 수행된다. 매우 높은 전 분 농도가 처리되며, 일반적으로 30 내지 40% 고형분이다. 초기 가수분해는 일반적으로 5분동안 이러한 승온에서 수행된다. 다음에, 부분적으로 가수분해된 전분은 제2 탱크로 옮기고, 약 1시간동안 85 내지 90℃의 온도에서 배양하여 10 내지 15의 덱스트로스 당량(D.E.)을 유도할 수 있다.
전분 또는 관련된 올리고당류 및 다당류 분자의 비환원 말단으로부터 글루코아밀라제의 존재하에 D-글루코스의 방출물을 추가로 가수분해하는 단계는 일반적으로 별도의 탱크에서 30 내지 60℃의 감소된 온도에서 수행한다. 바람직하게는 기질 액체의 온도는 55 내지 60℃ 사이로 저하시킨다. 용액의 pH는 6 내지 6.5에서 3 내지 5.5 범위로 저하시킨다. 바람직하게는, 용액의 pH는 4 내지 4.5이다. 글루코아밀라제를 용액에 가하고, 반응은 24 내지 72시간동안, 바람직하게는 36 내지 48시간동안 수행한다.
본 발명의 열안정성 글루코아밀라제를 사용함으로써, 당화 공정은 전통적인 뱃치식 당화 공정보다 높은 온도에서 수행할 수 있다. 본 발명에 따라서, 당화는 60 내지 80℃ 이상, 바람직하게는 63 내지 75℃ 범위의 온도에서 수행할 수 있다. 이는 (상기에서 기술된) 전통적인 뱃치식 방법 및 연속적 당화 방법 둘다에 적용된다.
실제로, 하나 이상의 막 분리 단계, 즉 여과 단계를 포함하는 연속적 당화 공정은 60℃ 이상의 온도에서 수행하여 막에 대해 적당히 높은 유속을 유지할 수 있어야 한다. 따라서, 본 발명의 열안정성 글루코아밀라제는 대량 연속 당화 공정을 적합한 가격으로 산업상 당화 방법에 허용되는 시간내에 수행할 가능성을 제공 한다. 본 발명에 따라서, 당화 시간은 심지어 단축될 수 있다.
본 발명의 글루코아밀라제의 활성은 일반적으로, 전통적으로 사용되는 30 내지 60℃ 사이의 온도에서보다 60 내지 80℃ 사이의 온도에서 실질적으로 더욱 높다. 따라서, 글루코아밀라제가 처리되는 온도를 증가시킴으로써 당화 공정은 더욱 짧은 시간내에 수행될 수 있거나 공정은 소량의 효소를 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 글루코아밀라제의 열 안정성은, 예를 들어, 시판되는 Aspergillus niger 글루코아밀라제(즉, AMG)에 비해서 매우 높기 때문에, 소량의 글루코아밀라제를 가하여 당화 공정 동안에 불활성화되는 글루코아밀라제를 치환시킬 필요가 있다. 다량의 글루코아밀라제가 본 발명에 따르는 당화 공정 동안에 활성으로 유지된다. 또한, 미생물 오염의 위험은 또한, 당화 공정을 63℃ 이상의 온도에서 수행하는 경우, 감소된다.
(말토스에 대해 활성으로 측정된) 특이 활성이 증가된 글루코아밀라제를 사용함으로써, 소량의 효소가 당화 공정에 필요할 수 있다.
본 발명의 글루코아밀라제가 유리하게 사용될 수 있는 당화 공정의 예는 JP 제3-224493호, JP 제1-191693호, JP 제62-272987호 및 EP 제452,238호에 기술된 방법을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 글루코아밀라제를 사용하는 효소성 당화 단계를 포함하여, 액화된 전분 용액을 당화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 글루코아밀라제는 본 발명의 방법에서, 4개 이상의 글루코실 잔기를 갖는 분자내의 α-(1→6)-글루코시드성 결합만을 가수분해시키는 효소와 함께 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 글루코아밀라제는 풀룰라나제 또는 이소아밀라제와 함께 사용된다. 탈분지시키기 위한 이소아밀라제 및 풀룰라나제의 사용, 효소의 분자 특성, 및 글루코아밀라제를 사용하는 효소의 잠재적 용도가 문헌에 기술되어 있다[참조: G.M.A. van Beynum et al., Starch Conversion Technology, Marcel Dekker, New York, 1985, 101-142].
다른 양태에서, 본 발명은 전분 전환 방법에서의, 본 발명의 글루코아밀라제의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 글루코아밀라제는 연속적 당화 단계를 포함하는 연속적 전분 전환 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 글루코아밀라제는 또한 고정된 형태로 사용할 수 있다. 이는 특수 시럽(예: 말토스 시럽)의 제조에, 및 또한 프럭토스 시럽의 제조에 관해서 올리고당류의 라피네이트 스트림에 적합하고 자주 사용된다.
본 발명의 글루코아밀라제는 또한 연료 또는 음료용 에탄올을 제조하는 방법에 사용할 수 있거나 유기 화합물(예: 시트르산, 아스코르브산, 리신, 글루탐산)을 제조하는 발효 방법에 사용할 수 있다.
물질 및 방법
물질
효소:
기탁된 사상 진균 Talaromyces emersonii CBS 793.97로부터 유도된 글루코아밀라제는 다음에 지시된 일자로 특허 절차를 밟기 위해서 네덜란드 3740 아게 바안 피.오. 박스 273의 Centraalbureau voor Schimmelcultures에 기탁되었다. 부다페스트 조약하의 국제 기탁소인 CBS는 조약 9조에 따라서 기탁물의 영구성을 제공한다.
기탁일: 1997년 6월 2일
기탁자 참고 번호: NN049253
CBS 지정 번호: CBS 793.97
Aspergillus niger로부터 유도된 글루코아밀라제 G1은 문헌에 기술되어 있으며[참조: Boel et al., (1984), EMBO J. 3 (5), 1097-1102], Novo Nordisk로부터 입수가능하고, SEQ ID NO: 9로 나타낸다.
균주:
JaL228; 이 균주의 구성은 WO 제98/12300호에 기술되어 있다.
SMO110; 이 균주의 구성은 실시예 6에 기술되어 있다.
효모 균주: Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATa leu-D2 ura3-52 his4-539 pep4-D1[cir+]
유전자:
A. niger G1 글루코아밀라제 유전자는 SEQ ID NO: 8로 나타낸다.
개재 배열을 갖는 T. emersonii 글루코아밀라제 유전자는 도 5 및 SEQ ID NO: 33에 도시되어 있다. 개재 배열은 도 5에 도시되어 있다.
플라스미드:
pJSO026(S. cerevisiae 발현 플라스미드)[참조: J.S.Okkels, (1996), A URA3-promoter deletion in a pYES vector increases the expression level of a fungal lipase in Saccharomyces cerevisiae. Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences, vol. 782 of the Annals of the New York Academy of Sciences]. 특히, 발현 플라스미드 pJSO26는 pYES 2.0의 유도가능한 GAL1-프로모터를 Saccharomyces cerevisiae로부터 구성 성분으로 발현되는 TPI(트리오스 포스페이트 이소메라제)-프로모터로 대체하고[참조: Albert and Karwasaki, (1982), J. Mol. Appl Genet., 1, 419-434], URA3 프로모터의 일부를 결실시켜 pYES로부터 유도된다.
pJaL497; 이 플라스미드의 구성은 실시예 5에 기술되어 있다.
pJaL507; 이 플라스미드의 구성은 실시예 5에 기술되어 있다.
pJaL510; 이 플라스미드의 구성은 실시예 5에 기술되어 있다.
pJaL511; 이 플라스미드의 구성은 실시예 5에 기술되어 있다.
pJaL518; 이 플라스미드의 구성은 실시예 6에 기술되어 있다.
pCaHj483; 이 플라스미드의 구성은 실시예 6에 기술되어 있다.
pJRoy10; 이 플라스미드의 구성은 실시예 6에 기술되어 있다.
pJRoy17; 이 플라스미드의 구성은 실시예 6에 기술되어 있다.
pSMO127; 이 플라스미드의 구성은 실시예 6에 기술되어 있다.
pCR™II; 미국 샌디에이고 소재의 Invitrogen Corporation으로부터 입수가능.
장치:
자동 DNA 서열기(Applied Biosystems Model 377)
배지:
SC-ura 배지:
효모 질소 w/o ami 7.5g
베른슈타인산(Ravsyre) 11.3g
NaOH 6.8g
카사미노산 w/o vit 5.6g
트립토판 0.1g
증류수를 가하여 1000ml
20분동안 121℃에서 오토클레이브한다.
5% 트레오닌의 멸균 원액으로부터 4ml를 900ml의 용량에 멸균 20% 글루코스 100ml와 함께 가한다.
YPD 배지:
효모 추출물 10g
펩톤 20g
증류수를 가하여 1000ml
20분동안 121℃에서 오토클레이브한다.
멸균 20% 글루코스 100ml를 900ml에 가한다.
방법:
AGU 활성의 측정
1 Novo 아밀로글루코시다제 단위(AGU)는 다음 표준 조건하에 1분당 말토스 1 μmole을 가수분해시키는 효소의 양으로 정의된다:
기질. . . . . . . . . . . . 말토스
온도. . . . . . . . . . . . 25℃
pH. . . . . . . . . . . . . 4.3 (아세테이트 완충액)
반응 시간. . . . . . . . . . 30분
분석 방법(AF22)에 대한 상세한 설명은 필요시에 입수할 수 있다.
PUN 활성의 측정
PUN은 풀룰란(0.2% 풀룰란, 40℃, pH 5.0)을 가수분해시켜 1분당 글루코스 1μmole에 상당하는 환원력으로 환원 탄수화물을 유리시키는 효소의 양으로 정의된다.
AFAU 활성의 측정
활성은 pH 2.5, 40℃, 0.17g/l 전분에서 전분 농도의 감소로 계산되고 요드-전분 반응에 의해 측정되는 AFAU로 측정된다.
AMG의 열 안정성 I(T 1/2 (반감기)) 측정
(T1/2(반감기)로 측정된) 글루코아밀라제의 열 안정성은 다음 방법을 사용하여 시험한다: 950μl의 50mM 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)(NaOAc)을 5분동안 70℃에서 배양한다. 완충액중의 효소 50μl(4AGU/ml)를 가한다. 2 x 40μl 샘플을 0 내지 360분 사이의 고정기에 취하고, 빙냉시킨다. 샘플을 냉각시킨 후, 잔류 효소 활성은 (상기에서 기술된) AGU 측정 분석을 사용하여 측정한다.
배양 전에(0분) 측정된 활성(AGU/ml)은 기준(100%)으로서 사용한다. T1/2은 상대 활성 비율이 50% 감소할 때까지의 시간이다.
열 안정성 II의 측정
1600μl의 상청액 및 400μl의 0.5M NaAC(pH 4.5)을 혼합한다.
각각 250μl의 혼합물을 함유하는 에펜도르프(eppendorph) 튜브 7개를 Perkin Elmer 열순환기에서 68℃에서 또는 70℃에서 0, 5, 10, 20, 30, 45 및 60분동안 배양한다.
각각의 혼합물로부터 100μl를 미량적정웰에서 100μl의 5mM CNPG3(진자임(genzyme)으로부터의 2-클로로-4-니트로페닐-알파-말토트리오사이드)와 혼합한다. 30분동안 37℃에서 배양한 후, 흡광도는 405nm에서 측정한다.
글루코아밀라제의 특이 활성의 측정
750μl의 기질을 선택된 온도, 예를 들어, 37℃, 60℃ 또는 70℃에서 5분동안 배양한다.
아세트산나트륨에 희석된 50μl의 효소를 가하고, 활성은 상기에 기술된 AGU 표준 방법을 사용하여 측정한다. 동적 파라미터: Kcat 및 Km는 아세트산나트륨에 희석된 50μl의 효소를 예열된 750μl의 기질에 가하여 45℃에서 측정한다. 100μl의 분취액을 0, 3, 6, 9 및 12분 후에 제거하고, 100μl의 0.4M 수산화나트륨으로 옮겨서 반응을 중단시킨다. 블랭크가 포함된다.
20μl를 미량적정 플레이트로 옮기고, 200μl의 GOD-Perid 용액을 가한다. 흡광도는 실온에서 배양한 지 30분 후에 650nm에서 측정한다. 글루코스를 표준으로서 사용하고, 특이 활성은 kcat(sec-1)으로 계산한다.
Aspergillus oryzae의 형질전환(일반적 방법)
100ml의 YPD[참조: Sherman et al., (1981), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory]를 A. oryzae의 포자를 사용하여 접종하고, 교반하면서 약 24시간동안 배양한다. 균사체를 미라클로스(miracloth)를 통해 여과하여 수확하고, 0.6M MgSO4 200ml로 세척한다. 균사체를 15ml의 1.2M MgSO4, 10mM NaH2PO4(pH 5.8)에 현탁시킨다. 현탁액을 빙냉시키고, 120mg의 Novozym™ 234를 함유하는 완충액 1ml를 가한다. 5분 후, 1ml의 12 mg/ml BSA(Sigma type H25)를 가하고, 약간 교반하면서 1.5 내지 2.5시간동안 37℃에서, 현미경으로 검사되는 샘플중에 다수의 원형질체가 육안으로 보일 때까지 계속 배양한다.
현탁액을 미라클로스를 통해 여과하고, 여액을 멸균 튜브로 옮기고, 5ml의 0.6M 소르비톨, 100mM 트리스-HCl(pH 7.0)을 사용하여 위를 덮는다. 원심분리는 15분동안 1000g에서 수행하고, 원형질체를 MgSO4 쿠션의 상부로부터 수집한다. 2배 용량의 STC(1.2M 소르비톨, 10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10mM CaCl2)를 원형질체 현탁액에 가하고, 혼합물을 5분동안 1000g에서 원심분리한다. 원형질체 펠릿을 3ml의 STC에 재현탁시키고 다시 펠릿화한다. 이를 반복한다. 최종적으로, 원형질체를 0.2 내지 1ml의 STC에 재현탁시킨다.
100μl의 원형질체 현탁액을 10μl의 STC중의, 5-25μg의 p3SR2{문헌에 기술된, A. nidulans amdS 유전자 운반 플라스미드[참조: Hynes et al., Mol. and Cel. Biol., Vol. 3, No. 8, 1430-1439, Aug. 1983]}와 혼합한다. 혼합물을 실온에서 25분동안 방치한다. 0.2ml의 60% PEG 4000(BDH 29576), 10mM CaCl2 및 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)을 가하고, 조심해서 혼합하고(2회), 최종적으로 동일한 용액 0.85ml를 가하고, 조심해서 혼합한다. 혼합물을 실온에서 25분동안 방치하고, 15분동안 2.500g에서 방사하고, 펠릿을 2ml의 1.2M 소르비톨에 재현탁시킨다. 1회 이상 침강시킨 후, 원형질체를, 1.0M 수크로스(pH 7.0), 질소 공급원으로서 10mM 아세트아미드 및 20mM CsCl를 함유하는 최소 플레이트[참조: Cove, (1966), Biochem. Biophys. Acta 113, 51-56] 위에 살포하여 배경 성장을 억제한다. 4 내지 7일동안 37℃에서 배양한 후, 포자를 집어내고, 멸균수에 현탁시키고, 단일 군체에 대해 뿌린다. 이 방법을 반복하고, 제2 재분리 후에 단일 군체의 포자를 정의된 형질전환체로서 보관한다.
공급된 뱃치 발효
공급된 뱃치 발효는 탄소 공급원으로서 말토덱스트린을, 질소 공급원으로서 우레아를 및 효모 추출물을 포함하는 배지중에 수행한다. 공급된 뱃치 발효는 문제의 진균 숙주 세포의 교반 플라스크 배양물을 탄소 공급원 3.5% 및 질소 공급원 0.5%를 포함하는 배지에 접종하여 수행한다. pH 5.0 및 34℃에서 배양한 지 24시간 후, 추가의 탄소 및 질소 공급원의 연속 공급을 개시한다. 탄소 공급원은 제한 요인으로 유지되고, 산소는 확실히 과량으로 존재한다. 공급된 뱃치 배양을 4일동안 계속한 후, 효소를 원심분리, 한외여과, 투명 여과 및 미생물 여과에 의해 회수할 수 있다. 추가의 정제는 당해 분야에 공지된 음이온 교환 크로마토그래피 방법에 의해 수행할 수 있다.
Saccharomyces cerevisiae YNG318의 형질전환
DNA 단편 및 개방된 벡터를 혼합하고, 표준 방법에 의해 효모 Saccharomyces cerevisiae YNG318로 형질전환시킨다.
실시예 1
정제
0.05AGU/ml를 갖는, 야생형 발효로부터의 T. emersonii 배양 육즙 3500ml를 9000rpm에서 원심분리한 다음에, 여과지를 통해 진공 여과하고, 최종적으로 블랭크 여과하였다. 다음에, 다음 과정을 사용하여 효소를 정제시켰다.
페닐 세파로스(250ml): 1,3M AMS/10mM Tris/2mM CaCl2, pH 7; 10mM Tris/2mM CaCl2, pH 7로 용출
투석: 20mM NaAc, 2mM CaCl2, pH 5.
Q 세파로스(100ml): 20mM NaAc, 2mM CaCl2, pH 5; 0-0.4M NaCl로부터 선형 구배로 10배 컬럼 용량에 대해 용출.
투석: 20mM NaAc, 2mM CaCl2, pH 5.
색상 제거: 10분이내에 0.5% 석탄.
Q 세파로스(20ml): 20mM NaAc, 2mM CaCl2, pH 5; 0-0.4M NaCl로부터 선형 구배로 10배 컬럼 용량에 대해 용출.
투석: 20mM NaAc, 2mM CaCl2, pH 5.
S 세파로스(1ml): 5mM 시트르산, pH 2.9; 0-0.3M NaCl로부터 선형 구배로 10배 컬럼 용량에 대해 용출.
90% 이상의 효소 순도가 S 세파로스 단계 후에 수득되었다.
실시예 2
Talaromyces emersonii 글루코아밀라제의 특성화
정제된 Talaromyces emersonii CBS 793.97 글루코아밀라제가 특성화에 사용되었다.
분자량(Mw)
분자량은 도 1에 도시된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 약 70kDa으로 측정되었다.
pI
pI는 등전점 집속에 의해 3.5 이하인 것으로 측정되었다(Amploine PAG, pH 3.5-9.5, 제조원:Pharmacia)
pH 프로필
Talaromyces emersonii 글루코아밀라제의 pH 활성 의존도를 측정하고, Aspergillus niger 글루코아밀라제의 프로필과 비교하였다.
pH 활성 프로필은 0.1M 아세트산나트륨중의 기질로서 0.5% 말토스를 사용하여 60℃에서 측정되었다. pH는 0.1-1AGU/ml를 포함하는 2개의 샘플중에 측정되었다. 시험의 결과는 도 2에 도시되어 있다.
온도 프로필
본 발명의 Talaromyces emersonii 글루코아밀라제의 온도-활성 의존도를 측정하고, Aspergillus niger 글루코아밀라제의 프로필과 비교하였다. 200μl의 0.5% 말토스(pH 4.3)를 37, 50, 60, 70, 75, 80 및 90℃에서 배양하고, 반응은 10μl의 효소(0.25AGU/ml)를 가하여 개시시켰다; 반응 시간은 10분이었다. 시험의 결과는 도 3에 도시되어 있다.
온도 안정성 - T1/2(반감기)
Talaromyces emersonii 글루코아밀라제의 열 안정성을 측정하고, Aspergillus niger 글루코아밀라제의 열 안정성과 비교하였다. 사용된 방법은 "물질 및 방법" 단락에서 "AMG의 열 안정성 I(T1/2(반감기)) 측정"으로서 상기에 기술되어 있다.
Talaromyces emersonii 글루코아밀라제의 T1/2는 70℃에서 약 120분으로 측정되었다. Aspergillus niger 글루코아밀라제의 T1/2는 동일한 조건하에 7분으로 측정되었다(도 4 참고).
특이 활성
신장 계수는 280nm에서의 흡광도 및 단백질 농도를 기준으로 하여 ε = 2.44ml/mg*cm으로 측정되었다. 다음에, 37℃에서 말토스에 대한 특이 활성은 7.3AGU/mg으로 계산되었다. 샘플의 순도는 약 90%이었고, 따라서 보정된 특이 활성은 8.0AGU/mg이다. 다음 특이 활성이 측정되었다.
AMG 특이활성 (AGU/mg)
37℃ 60℃ 70℃
T. emersonil * A. niger 8.0 2.0 21 6.6 27 8.0
*) 순수한 효소에 대해 평가.
실시예 3
T. emersonii 글루코아밀라제의 N-말단의 서열화
T. emersonii 글루코아밀라제의 N-말단 아미노산 서열은 SDS-PAGE 및 PVDF-막상의 전기오염법(electroblotting)에 따라서 측정되었다. 펩타이드는 용해성-특이적 프로테아제를 사용하여 분리함으로써 환원되고 S-카복시메틸화된 글루코아밀라제로부터 유도되었다. 생산된 펩타이드를 분별하고, RP-HPLC를 사용하여 재정제한 후, N-말단 서열 측정에 적용하였다.
N-말단 서열(SEQ ID NO: 1):
Ala Asn Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Xaa Pro Ile Ala
Leu Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly
펩타이드 1(SEQ ID NO: 2):
Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu
Gly Glu Pro Lys
펩타이드 2(SEQ ID NO: 3):
Xaa Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Xaa Gly Arg Pro Gln
Arg Asp Gly Pro Ala Leu
펩타이드 3(SEQ ID NO: 4):
Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Gly
Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu Ala
Asn His Lys
펩타이드 4(SEQ ID NO: 5):
Thr Xaa Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys
펩타이드 5(SEQ ID NO: 6):
Ala Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser
Thr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp
Ser Trp Gln
Xaa는 배정되지 못한 잔기를 나타낸다.
실시예 4
전체 길이 T. emersonii 글루코아밀라제
SEQ ID NO: 7로 나타낸 전체 길이 T. emersonii 글루코아밀라제 아미노산 서열은 표준 방법을 사용하여 확인하였다.
실시예 5
Talaromyces emersonii 글루코아밀라제 유전자의 클로닝 및 서열화
Talaromyces emersonii AMG 유전자의 PCR 클로닝 부분
Talaromyces emersonii AMG 유전자를 클로닝하기 위해서, 표 1에 나타난 변성된 프라이머를 AMG 유전자의 부분을 PCR 증폭시키기 위해 고안하였다.
프라이머 no. 서열 설명
102434 (SEQ ID NO:10) 102435 (SEQ ID NO:11) V L N N I G 5'-GTNTTRAAYAAYATHGG 5'-GTNCTNAAYAAYATHGG N-말단 5'프라이머
117360 (SEQ ID NO:12) 117361 (SEQ ID NO:13) D L W E E V CTRGANACCCTYCTYCA-5' CTRAAYACCCTYCTYCA-5' 활성부위 공통 3'프라이머
127420 (SEQ ID NO:14) W E D D P N ACCCTYCTRCTRGGNTT-5' C-말단 3'프라이머
Talaromyces emersonii로부터의 지놈 DNA는 표준 방법에 의해 제조된 원형질체로부터 제조하고[참조: Christensen et al. Biotechnology 1989 6 1419-1422], PCR 반응에서의 원형으로서 사용하였다. 증폭 반응은 2.5 단위의 Taq-폴리메라제, 100ng의 A. oryzae 지놈 DNA, 50mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 1.5mM MgCl2, 각각의 dNTP 250nM, 및 각각의 다음 프라이머 세트 100pM을 함유하는 100μl 용량중에 수행하였다: 102434/117360, 102434/117361, 102435/117360, 102434/117361, 102434/127420, 및 102434/127420.
증폭은 Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480에서 수행되고, 94℃에서 3분의 1회 사이클, 다음에 94℃에서 1분, 40℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 30회 사이클로 이루어졌다. PCR 반응 102434/117360에 의해서만 생산물을 수득하였다. 4개의 밴 드를 다음 크기 1400, 800, 650 및 525bp를 사용하여 검출하였다. 4개의 밴드를 모두 정제하고, 벡터 pCR
Figure 112000010597602-pct00003
2.1(Invitrogen
Figure 112000010597602-pct00004
)로 클로닝하였다. 각각의 밴드로부터 수개의 클론의 서열화 및 A. niger AMG에 대한 서열 비교에 의해 650bp 밴드로부터의 클론이 Talaromyces emersonii AMG의 N-말단 부분을 암호화함이 밝혀졌다. 이 클론은 pJaL497로 지정되었다.
더욱 많은 유전자를 수득하기 위해서, 특이적 프라이머(123036: 5'-GTGAGCCCAAGTTCAATGTG-3'(SEQ ID NO: 15)를 클론 pJaL497의 서열로부터 제조하였다. 프라이머 세트 123036/127420을 Talaromyces 지놈 DNA에 대한 PCR에 대해 사용하여 1500bp에 대한 단일 단편이 수득되었다. PCR 단편은 벡터 pCR
Figure 112000010597602-pct00005
2.1로 클로닝되고, 서열화되었다. 서열화함으로써 클론은 Talaromyces emersonii AMG의 C-말단 부분을 암호화함이 확인되었다. 이 클론은 pJaL507로 지정되었다.
지놈 클론(들)의 지놈 제한 지도작성 및 클로닝
AMG 유전자의 약 95%를 덮는 두개의 클론 pJaL497 및 pJaL507을 함께 취한다. AMG 유전자의 상실 부분을 클로닝하기 위해서, 지놈 제한 지도는 단일 또는 다수의 제한 효소의 배합물을 사용하여 분해된 Talaromyces emersonii 지놈 DNA의 남쪽 얼룩에 대한 프로브로서 두개의 PCR 단편을 사용하여 구성되었다. 이는 Talaromyces emersonii AMG 유전자가 각각 약 5.6kb 및 6.3kb상의 두개의 EcoRI 단편상에 배치됨을 나타낸다.
Talaromyces emersonii 지놈 DNA를 EcoRI를 사용하여 분해시키고, 4 내지 7kb 사이의 크기를 갖는 단편을 정제시키고, 제조 지시서(Stratagene)에 의해 기술 된 바와 같이 Lambda ZAP II에 부분적 지놈 라이브러리(library)를 구성하기 위해 사용하였다. 라이브러리는 AMG 유전자를 출발시키는 프로브로서 (AMG 유전자의 N-말단을 암호화하는) pJaL497로부터 0.7kb EcoRI 단편을 사용하여 1차로 선별하였다. 하나의 클론이 수득되었으며, 이는 pJaL511로 지정되었다. 라이브러리의 제2 선별에서, AMG 유전자의 C-말단 끝을 수득하기 위한 프로브로서 (AMG 유전자의 C-말단 반쪽을 암호화하는) pJaL507로부터 0.75kb EcoRV 단편을 사용한다. 하나의 클론이 수득되었으며, 이는 pJaL510으로 지정되었다.
Talaromyces emersonii AMG 유전자의 서열 분석
AMG 유전자 서열은 플라스미드 pJaL497, pJaL507, pJaL510 및 pJaL511상에서 및 이의 아클론상에서 pUC에 대한 표준 역전 및 상향 프라이머를 사용하여 서열화하여 수득하였다. 잔류 gab는 프라이머로서 특이적 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 폐쇄하였다.
잠재적 개재 배열은 이 서열을 Aspergillus에서의 개재 배열에 일치하는 서열 및 A. niger AMG 서열과 비교하여 밝혀냈다. Talaromyces emersonii AMG 뉴클레오타이드 서열은 4개의 개재 배열, 57bp, 55bp, 48bp 및 59bp 각각에 의해 방해된, 618 아미노산상의 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임을 갖는다. (개재 배열을 갖는) 뉴클레오타이드 서열 및 추론된 아미노산 서열이 도 5에 도시되어 있다. (개재 배열을 갖는) DNA 서열은 또한 SEQ ID NO: 33에 나타나 있고, (1 내지 27의 신호 서열을 갖는) Talaromyces emersonii AMG 서열은 SEQ ID NO: 34에 나타나 있다. 추론된 아미노산 서열을 A. oryzae AMG 및 A. niger AMG와 비교하면 각 각 60.1% 및 60.5%의 일치도를 나타낸다. 도 6에 도시된 아미노산 서열의 배열은 Talaromyces AMG가 촉매 영역 및 전분 결합 영역 사이에 매우 짧은 힌지(hinge)를 가짐을 나타내고, 이는 또한 A. oryzae AMG에 대해서도 보인다.
실시예 6
Aspergillus 벡터 pCaHj483의 구성
pCaHj483의 구성은 도 7에 도시되어 있다. 상기 플라스미드는 다음 단편으로부터 구성된다:
a) EcoRI 및 XbaI로 절단된 벡터 pToC65(WO 제91/17243호)
b) amdS 유전자를 운반하는 A. nidulans로부터 2.7kb XbaI 단편[참조: C. M. Corrick et al., Gene 53, (1987), 63-71]. amdS 유전자는 진균 형질전환에서 선택성 표지로서 사용된다. amdS 유전자는 일반적으로 유전자에 존재하는 BamHI 부위가 파괴되도록 개질되어 있다. 이는 프라이머를 사용하여 비명기 지점 돌연변이를 도입함으로써 수행되었다:
5'-AGAAATCGGGTATCCTTTCAG-3'(SEQ ID NO: 16)
c) A. nidulans tpi 유전자의 mRNA의 5' 비전사 말단을 암호화하는 서열의 60bp DNA 단편에 융합된 A. niger NA2 프로모터를 운반하는 0.6 kb EcoRI/BamHI 단편. NA2 프로모터는 (WO 제89/01969호에 기술된) 플라스미드 pNA2로부터 분리되고, PCR에 의해 60bp tpi 서열로 융합되었다. 60bp tpi 서열을 암호화하는 프라이머는 다음 서열을 갖고 있었다:
5'-GCTCCTCATGGTGGATCCCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGAGGAAGGAAGAGAAGTGT
GGATAGAGGTAAATTGAGTTGGAAACTCCAAGCATGGCATCCTTGC - 3' (SEQ ID NO:17)
d) A. niger 글루코아밀라제 전사 종료 암호를 운반하는 675bp XbaI 단편. 단편은 (EP 제0238023호에 기술된) 플라스미드 pICAMG/Term으로부터 분리되었다.
단편 c의 BamHI 부위는 단편 d상의 전사 종료 암호의 앞에서 pIC19R 링커(BamHI에서 XbaI로)를 통해 XbaI 부위에 연결되었다.
AMG 발현 플라스미드, pJaL518의 구성
Talaromyces emersonii AMG 유전자의 암호화 영역은 다음 두개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다:
프라이머 139746:
5'-GACAGATCTCCACCATGGCGTCCCCTCGTTC 3' (SEQ ID NO: 18); 및
프라이머 139747:
5'-GACCTCGACTCACTGCCAACTATCGTC 3' (SEQ ID NO: 19).
밑줄친 영역은 Talaromyces emersonii AMG 유전자에 존재하는 서열을 지시한다. 클로닝을 용이하게 하기 위해서, 제한 효소 부위를 각각의 프라이머의 5' 말단에 삽입하였으며; 프라이머 139746은 BglII 부위를 함유하고, 프라이머 139747은 XhoI 부위를 함유한다.
Talaromyces emersonii 지놈 DNA는 PCR 반응에서 원형으로 사용되었다. 반응은 50mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 1.5mM MgCl2의 반응 완충액중의, 2.5단위의 Taq 폴리메라제, 100ng의 pSO2, 각각의 dNTP 250nM, 및 상기에서 기술된 각각의 두 가지 프라이머 10pM을 함유하는 100μl의 용량중에 수행되었다.
증폭은 Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480에서 수행되고, 94℃에서 3분의 1회 사이클, 다음에 94℃에서 1분, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 25회 사이클로 이루어졌다. PCR 반응은 2099bp의 단일 DNA 단편을 생산하였다. 이 단편은 BglII 및 XhoI로 분해되고, 겔 전기영동법에 의해 분리되고, 정제되고, BamHI 및 XhoI로 분해된 pCaHj483으로 클로닝되어 pJaL518로 지정된 플라스미드를 생산하였다. 따라서, 플라스미드 pJaL518의 구성에 의해 Talaromyces emersonii AMG 유전자에 대한 진균성 발현 플라스미드를 생산하였다(도 8).
Aspergillus niger 균주, SMO110의 구성
1. A. niger pyrG 유전자의 클로닝
A. niger BO-1의 라이브러리는 제조 지시서에 기술된 바와 같이 EMBL4에서 형성되었다. 라이브러리는 공개된 Aspergillus niger 서열로부터 고안된 DIG 표지된 올리고뉴클레오타이드(PyrG: 5'-CCCTCACCAGGGGTGCTGCAGTTGATG-3'(SEQ ID NO: 20)로 선별되었다[참조: Wilson et al. Nucleic Acids Res. 16, (1988), 2339-2339]. DIG 프로브로 잡종형성된 양성 EMBL4 클론이 BO-1 라이브러리로부터 분리되고, pyrG 유전자를 함유하는 3.9kb Xbal 단편이 EMBL4 클론으로부터 아클로닝되고, pUC118로 클로닝되어 pJRoy10을 형성하였다.
2. A. niger 글루코아밀라제(AMG) 유전자의 클로닝
상기 A. niger BO-1 라이브러리는 다음 올리고뉴클레오타이드 950847: 5'-CGCCATTCCTCGGCGACTT-3'(SEQ ID NO: 21), 및 올리고뉴클레오타이드 951216: 5'- CGCCGCGGTATTCTGCAG-3'(SEQ ID NO: 22)로 A. niger 지놈 DNA 상에서 증폭시켜 생성된 DIG 표지된 PCR 단편으로 선별되었으며, 이는 공개된 Aspergillus niger 서열로부터 고안되었다[참조: Boel et al., EMBO J. 3, (1984), 1581-1585]. DIG 프로브로 잡종형성된 양성 EMBL4 클론이 BO-1 라이브러리로부터 분리되고, AMG 유전자를 함유하는 4.0kb SpeI 단편이 EMBL4 클론으로 아클로닝되고, pBluescriptSK+으로 클로닝되어 플라스미드 pJRoy17a를 발생시켰다.
3. A. niger AMG 붕괴 카세트의 구성
pyrG를 함유하는 2.3kb SpeI-XhoI 단편이 pJRoy10로부터 겔 분리되고, 제한된 말단이 Klenow 폴리메라제로 충전되었다. 단편이 플라스미드 pSMO127를 형성하는 AMG 유전자내에서 절단되는 pJRoy17의 BglII 부위로 삽입되었다(도 9). pSMO127a의 두개의 SpeI 부위 사이에 각각 2.2kb 및 2.3kb 5' 및 3' AMG에 의해 접한 2.3kb pyrG 유전자가 함유되었다.
4. AMG, SMO110에 대해 붕괴된 A. niger 균주의 구성
A. niger JRoyP3은 A. niger BO-1의 자발적 pyrG 돌연변이체이며, 이는 5'-플루오로-오로트산(5'-FOA)을 함유하는 플레이트상에서 성장시키기 위해 선택되었다. pyrG 유전자는 오로티딘 5'-포스페이트 카복실라제를 암호화하며, 이의 부족한 돌연변이체는 유리딘 영양요구변이주로서 특성화될 수 있다. pyrG 돌연변이체의 일치도는 최소 배지상에서 성장을 A. nidulans pyrG 유전자로 보상함으로써 확인되었다.
플라스미드 pSMO127의 미생물 20개는 SpeI로 분해되었다. DNA는 0.8% 아가 로스 겔 상에서 용해되고, 선형 붕괴 카세트로 이루어진 6kb는 겔 분리되었다. 선형 DNA는 균주 JRoyP3으로 형질전환되었다. 지놈 DNA는 200개의 형질전환체로부터 제조되며, 이는 다음에 SpeI로 분해되었다. 겔-용해된 DNA는 하이본드 나일론 필터로 옮기고, AMG 개방 판독 프레임으로 이루어진 비방사선 DIG 프로브로 잡종형성되었다. AMG 위치로의 붕괴 카세트의 유전자 치환은 야생형 4kb AMG 밴드를 6.3kb로 증가시키고, 2.3kb pyrG 유전자에 기인하여 증가시킨다. 상기 특성을 갖는 하나의 형질전환체 #110이 추가의 분석을 위해 선택되었다.
형질전환체 #110은 YPM 배지를 함유하는 25ml 교반 플라스크에서 성장시켰다. 균주 BO-1 및 모 균주 JRoyP3은 AMG 생산 대조로서 성장시켰다. 3일 후, 30μl의 투명한 상청액을 8-16% SDS PAGE Novex 겔상에서 수행하였다. AMG 밴드는 형질전환체 #110에서 보이지 않는 반면, 많은 AMG 밴드가 양성 대조 균주 BO-1 및 모 균주 JRoyP3에서 생성되었다. 형질전환체 #110은 SMO110이라 명명하였다.
Aspergillus oryzae 및 Aspergillus niger 에서 Talaromyces emersonii AMG의 발현
균주 JaL228 및 SMO110은 문헌에 기술된 바와 같이 pJaL518로 형질전환되었다[참조: Christensen et al.,; Biotechnology 1988 6 1419-1422]. 일반적으로, A. oryzae 균사체는 영양소가 풍부한 육즙중에 성장시켰다. 균사체는 육즙으로부터 여과시켜 분리하였다. 효소 제제 Novozyme
Figure 112000010597602-pct00006
(Novo Nordisk)은 삼투적으로 안정화된 완충액(예: 인산나트륨을 사용하여 pH 5.0으로 완충된 1.2M MgSO4)중의 균사체에 가하였다. 현탁액은 60분동안 37℃에서 교반하면서 배양하였다. 원형질체는 미라클로스를 통해 여과하여 균사체 조각을 제거하였다. 원형질체를 수확하고, STC(1.2M 소르비톨, 10mM CaCl2, 10mM Tris-HCl, pH 7.5)로 2회 세척하였다. 원형질체를 최종적으로 200 내지 1000μl의 STC에 재현탁시켰다.
형질전환시키기 위해서, 5μg DNA를 100μl의 원형질체 현탁액에 가한 다음에, 200μl의 PEG 용액(60% PEG 4000, 10mM CaCl2, 10mM Tris-HCl, pH 7.5)을 가하고, 혼합물을 20분동안 실온에서 배양하였다. 원형질체를 수확하고, 1.2M 소르비톨로 2회 세척하였다. 원형질체를 최종적으로 200μl의 1.2M 소르비톨에 재현탁시키고, 선택된 플레이트(최소 배지 + 10g/l Bacto-Agar(Difco))상에서 배양하고, 37℃에서 배양하였다. 37℃에서 성장시킨 지 3내지 4일 후, 안정한 형질전환체가 급속하게 성장하고 포자 형성하는 군체로서 나타난다. 형질전환체는 2회 포자 분리되었다.
형질전환체는 교반 플라스크내에서 4일동안 30℃에서 100ml YPM 배지(2g/l 효모 추출물, 2g/l 펩톤 및 2% 말토스)중에 성장하였다. 상청액은 기술된 바와 같이 AMG 활성에 대해 시험하고, SDS 페이지 겔상에서 분석하였다(도 10).
실시예 7
효모에서 발현시키기 위한 Talaromyces emersonii AMG DNA 서열로부터 4개의 개재 배열의 제거
각각의 엑손에 대해서, PCR 반응은 다음 엑손과의 중복을 함유하는 프라이머로 제조되었다. Tal 1 및 Tal 4는 효모 벡터 pJSO026과의 중복을 함유한다. 엑손 1: Tal 1은 5' 프라이머로서 사용되고, Tal 5는 3' 프라이머로서 사용되며, AMG에 대한 지놈 서열 암호가 원형으로서 사용되었다. 엑손 2: Tal 6은 5' 프라이머로서 사용되고, Tal 7은 3' 프라이머로서 사용되며, AMG에 대한 지놈 서열 암호가 원형으로서 사용되었다. 엑손 3: Tal 8은 5' 프라이머로서 사용되고, Tal 9는 3' 프라이머로서 사용되며, AMG에 대한 지놈 서열 암호가 원형으로서 사용되었다. 엑손 4: Tal 10은 5' 프라이머로서 사용되고, Tal 11은 3' 프라이머로서 사용되며, AMG에 대한 지놈 서열 암호가 원형으로서 사용되었다. 엑손 5: Tal 12는 5' 프라이머로서 사용되고, Tal 4는 3' 프라이머로서 사용되며, AMG에 대한 지놈 서열 암호가 원형으로서 사용되었다.
최종 PCR 반응이 수행되어 5개의 엑손을 완전한 암호화 서열을 함유하는 서열로 결합시켰다. 이러한 PCR 반응에서, 제1 PCR 반응으로부터 5개의 단편이 원형으로서 사용되고, Tal 1은 5' 프라이머로서 사용되고, Tal 4는 3' 프라이머로서 사용되었다.
(암호화 영역을 제거하는 동시에, 각각의 말단에서 약 20bp의 중복을 형성하여 가능한 재조합 사건을 만들기 위해서) 암호화 영역을 함유하는 이러한 최종 PCR 단편은 효모중의 생체내 재조합에서 제한 효소 SmaI(또는 BamHI) 및 XbaI로 절단된 pJSO026과 함께 사용되었다.
Tal 1: 5'-CAA TAT AAA CGA CGG TAC CCG GGA GAT CTC CAC CATG GCG
TCC CTC GTT G-3' (SEQ ID NO:23);
Tal 4: 5'-CTA ATT ACA TCA TGC GGC CCT CTA GAT CAC TGC CAA CTA
TCG TC-3' (SEQ ID NO:24);
Tal 5: 5'-AAT TTG GGT CGC TCC TGC TCG-3' (SEQ ID NO:25);
Tal 6: 5'-CGA GCA GGA GCG ACC CAA ATT ATT TCT ACT CCT GGA CAC
G-3' (SEQ ID NO:26);
Tal 7: 5'-GAT GAG ATA GTT CGC ATA CG-3' (SEQ ID NO:27);
Tal 8: 5'-CGT ATG CGA ACT ATC TCA TCG ACA ACG GCG AGG CTT CGA
CTG C-3' (SEQ ID NO:28);
Tal 9: 5'-CGA AGG TGG ATG AGT TCC AG-3' (SEQ ID NO:29);
Tal 10: 5'-CTG GAA CTC ATC CAC CTT CGA CCT CTG GGA AGA AGT AGA
AGG-3' (SEQ ID NO:30);
Tal 11: 5'-GAC AAT ACT CAG ATA TCC ATC-3' (SEQ ID NO:31);
Tal 12: 5'-GAT GGA TAT CTG AGT ATT GTC GAG AAA TAT ACT CCC TCA
GAC G-3' (SEQ ID NO:32)
실시예 8
효모에서 Talaromyces emersonii 글루코아밀라제의 발현
효모 Saccharomyces cerevisiae YNG318에서 Talaromyces emersonii AMG를 발현시키기 위해서, 효모 발현 벡터 pJSO26는 상기 "물질 및 방법" 단락에서 기술된 바와 같이 구성되었다.
Talaromyces AMG를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 pJSO26은 표준 방법에 의해 효모로 형질전환되었다[참조: Sambrooks et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor].
효모 세포를 30℃에서 3일동안 Sc-ura 배지중에 성장시킨 다음에, 3일동안 YPD중에 성장시켰다. 다음에, 배양물을 원심분리시키고, 상청액은 "물질 및 방법" 단락에서 기술된 열안정성 분석에 사용하였다.
효모에서 68℃에서 발현된 Talaromyces AMG의 열 안정성
효모(Saccharomyces cerevisiae YNG318)에서 발현된 Talaromyces emersonii AMG의 발효 육즙이 "열 안정성 II의 측정"으로 상기에서 기술된 방법을 사용하여 68℃에서 열 안정성을 측정하기 위해서 사용되었다.
실시예 9
A. niger HowB112를 사용하여 생산된 재조합체 Talaromyces AMG의 정제
Talaromyces emersonii 유전자를 포함하는 A. niger HowB112의 발효로부터 배양 육즙 200ml를 9000rpm에서 원심분리시키고, 20mM NaOAc, pH 5에 대해 밤새 투석시켰다. 다음에, 용액을 20mM NaOAc, pH 5에 미리 평형화된 S 세파로스 컬럼(200ml)상에 적용하였다. 글루코아밀라제를 유출액중에 수집하고, 20mM NaOAc, pH 4.5에 미리 평형화된 Q 세파로스 컬럼(50ml)상에 적용하였다. 비결합 물질을 컬럼으로부터 세척하고, 글루코아밀라제는 20mM NaOAc중의 0-0.3M NaCl로부터 선형 구배를 10개의 컬럼 용량에 대해 사용하여 용출시켰다. 글루코아밀라제 분획의 순도는 SDS-PAGE에 의해 체크하고, 하나의 단일 밴드만이 관찰되었다. 분자량은 다시 야생형 글루코아밀라제에 대해 보여지는 바와 같이 약 70kdal으로 밝혀졌다. 말토스에 대한 특이 활성이 측정되고, 야생형 효소에 대한 데이터에 따르 는, 8.0AGU/ml(37℃) 및 21.0AGU/ml(60℃)의 특이 활성이 밝혀졌다.
실시예 10
동적 파라미터
말토스 및 이소말토스를, Aspergillus niger AMG 및 A. niger에서 발현된 재조합체 Talaromyces emersonii AMG에 의해 가수분해하기 위한 동적 파라미터
말토스 k cat (s-1)a Km (mM) k cat /Km (s-1mM-1)
Talaromyces emersonii 30.6 3.8 8.1
Aspergillus niger 10.7 1.2 8.8
a45℃에서 0.05M NaOAc, pH 4.5를 사용
이소말토스 k cat (s-1)a Km (mM) k cat /Km (s-1mM-1)
Talaromyces emersonii 2.70 53.6 0.050
Aspergillus niger 0.41 19.8 0.021
a45℃에서 0.05M NaOAc, pH 4.5를 사용
실시예 11
A. niger 에서 생산된 재조합체 Talaromyces emersonii AMG의 당화 성능
Talaromyces emersonii 글루코아밀라제의 당화 성능은 상이한 온도에서 산 α-아밀라제 및 풀룰라나제의 존재하에 및 부재하에 시험하였다. 당화는 다음 조건하에 수행하였다:
기질: 10 DE 말토덱스트린, 약 30% DS(w/w)
온도: 60, 65 또는 70℃
최초 pH: 4.5
효소 용량:
A. niger에서 생산된 재조합체 Talaromyces emersonii 글루코아밀라제: 0.24 또는 0.32AGU/g DS
A. niger로부터 유도된 산 α-아밀라제: 0.020AFAU/g DS
Bacillus로부터 유도된 풀룰라나제: 0.03PUN/g DS
Talaromyces를 단독으로 사용하는 경우, AMG는 다량으로(0.32AGU/g DS), 달리는 소량으로, 즉 0.24AGU/g DS으로 투입되었다.
당화
당화용 기질은 (보통의 옥수수로부터 제조된) 말토덱스트린을 비등 Milli-Q수에 용해시키고 무수 물질을 약 30%(w/w)로 조절하여 제조하였다. pH는 4.5로 조절하였다(60℃에서 측정). 150g의 무수 고체에 상응하는 기질의 분취액을 500ml 청색 뚜껑 유리 플라스크로 옮기고, 수욕중에 각각의 온도에서 교반하면서 두었다. 효소를 가하고, 필요한 경우, pH를 재조절하였다(배양 온도에서 측정). 샘플을 주기적으로 취하여 탄수화물 조성을 결정하기 위한 HPLC로 분석하였다.
당화 동안에 생산된 글루코스가 다음 표에 제공되고, 처음의 컬럼 3개는 글루코아밀라제 및 산 α-아밀라제 및 풀룰라나제를 사용하는 당화를 나타내고, 나중의 컬럼 3개는 글루코아밀라제를 단독으로 사용하는 당화를 나타낸다. 숫자는 DS 에 대한 %DP1이다.
시간 (시간) 0.24 AGU + 0.02 AFAU + 0.03 PUN 0.32 AGU
60℃ 65℃ 70℃ 60℃ 65℃ 70℃
24 88.96 90.51 87.91 84.98 86.28 84.35
48 94.03 94.28 91.90 88.86 89.51 86.98
72 95.08 94.75 93.12 90.18 90.42 87.99
98 95.03 94.59 93.64 90.65 90.72 88.51

95%의 상기 수율이, 0.03mg/g DS에 상응하는 0.24AGU/g DS의 효소 용량을 사용하여 72시간 후에 수득되었다. A. niger AMG의 대표적 용량은 og 95 내지 96% 글루코스 수율을 제공하는 0.09mg/g DS에 상응하는 0.18AGU/g DS이다. 따라서, Talaromyces AMG의 효소 단백질 mg에 대해 상당히 적은 효소 용량이, T. emersonii AMG의 높은 특이 활성에 기인하여 A. niger AMG와 비교되는 당화 공정에 필요하다.
실시예 12
온도 안정성-효모에서 발현된 재조합체 Talaromyces emersonii AMG의 T 1/2 (반감기)
(실시예 9에 기술된 방법을 사용하여 정제된) 효모에서 발현된 재조합체 Talaromyces emersonii 글루코아밀라제의 열 안정성은 70℃, pH 4.5, 0.2AGU/ml에서 "물질 및 방법" 단락에서 "AMG의 열 안정성 I(T1/2(반감기)) 측정"으로 상기에서 기술된 방법을 사용하여 측정하였다.
도 13은 시험의 결과를 나타낸다. 효모에서 발현된 재조합체 Talaromyces emersonii 글루코아밀라제의 T1/2은 70℃에서 약 110분으로 측정되었다.
출원인 또는 대리인 파일번호: 국제출원번호:

기탁된 미생물에 대한 언급
(PCT 제 13bis 규칙)
A. 상세한 설명 3페이지 10행의 미생물과 관련한 선택 용지
B. 기탁의 확인 다른 기탁이 추가용지상에서 확인됨 □
기탁기관명칭 센트라알뷰로 부르 쉼멜컬쳐스
기탁기관주소(우편번호와 국가명 포함) 네덜란드 엔엘-3740 에이지 바른 포스트버스 273 오스테르스트라트
기탁일 1997년 6월 2일 수탁번호 CBS 793.97
C. 추가지시(적용되지 않을 경우 공란). 별도의 첨부용지상에 본 정보가 계속됨 □
유럽특허 및/또는 호주특허 등록공고시까지 또는 출원이 거절되거나 포기되는 경우 출원일로부터 20년동안 기탁된 미생물 시료 분양이 시료를 요구하는 사람(EPC 28(4)/ 호주제정규칙 1991 No 71의 규정 3.25)에 의해서 지정된 전문가에게만 가능하다.
D. 지시가 적용될 지정국가(모든 지정국가에 대한 지시가 아닐 경우)
E. 지시의 별도 제공(적용되지 않을 경우 공란).
이하에 기술된 지시가 이후에 국제사무국에 제출될 것임(예를 들면, 기탁의 수탁번호와 같이 지시의 일반적 특성을 특정할 것).
? 본 용지는 국제출원이 출원될 때 국제출원과 함께 접수함 (수리관청이 점검함) ----------- (담당자) ? 국제사무국에 의한 접수일(출원인으로부터) ----------- (담당자)
<110> Novo Nordisk A/S <120> Thermostable Glucoamylase <130> 5279 <160> 34 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Talaromyces emersonii <220> <221> UNSURE <222> (0)...(0) <223> Xaa at position 13 denotes a residue that could not be assigned <400> 1 Ala Asn Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Xaa Pro Ile Ala 1 5 10 15 Leu Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly 20 25 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Talaromyces emersonii <400> 2 Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu 1 5 10 15 Gly Glu Pro Lys 20 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Talaromyces emersonii <220> <221> UNSURE <222> (0)...(0) <223> Xaa at positions 1 and 12 denotes a residue that could not be assigned <400> 3 Xaa Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Xaa Gly Arg Pro Gln 1 5 10 15 Arg Asp Gly Pro Ala Leu 20 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Talaromyces emersonii <400> 4 Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Gly 1 5 10 15 Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu Ala 20 25 30 Asn His Lys 35 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Talaromyces emersonii <220> <221> UNSURE <222> (0)...(0) <223> Xaa at position 2 denotes a residue that could not be assigned <400> 5 Thr Xaa Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 35 <212> PRT <213> Talaromyces emersonii <400> 6 Ala Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser 1 5 10 15 Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp 20 25 30 Ser Trp Gln 35 <210> 7 <211> 591 <212> PRT <213> Talaromyces emersonii <400> 7 Ala Thr Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala 1 5 10 15 Leu Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala 20 25 30 Gly Ala Ser Ala Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro 35 40 45 Asn Tyr Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr 50 55 60 Leu Val Asp Ala Phe Asn Arg Gly Asn Lys Asp Lew Glu Gln Thr Ile 65 70 75 80 Gln Gln Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro 85 90 95 Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val 100 105 110 Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly 115 120 125 Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile 130 135 140 Asp Asn Gly Glu Ala Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val 145 150 155 160 Gln Asn Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe 165 170 175 Asp Leu Trp Glu Glu Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val 180 185 190 Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn 195 200 205 His Thr Cys Ser Asn Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe 210 215 220 Leu Gln Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Arg Ser Gly Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His 245 250 255 Thr Phe Asp Pro Ala Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys 260 265 270 Ser Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg 275 280 285 Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala 290 295 300 Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln 325 330 335 Trp Lys Lys Ile Gly Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe 340 345 350 Phe Gln Asp Ile Tyr Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly 355 360 365 Ser Thr Thr Phe Asn Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp 370 375 380 Gly Tyr Leu Ser Ile Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu 385 390 395 400 Thr Glu Gln Phe Ser Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala 405 410 415 Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln 420 425 430 Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Leu 435 440 445 Ala Val Cys Ser Ala Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr 450 455 460 Asn Thr Val Trp Pro Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser 465 470 475 480 Ser Ala Pro Cys Thr Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu 485 490 495 Ile Val Ser Thr Ser Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile 500 505 510 Pro Glu Leu Gly Asn Trp Ser Thr Ala Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala 515 520 525 Asp Ala Tyr Thr Asn Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu 530 535 540 Pro Pro Gly Thr Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp 545 550 555 560 Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro 565 570 575 Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln 580 585 590 <210> 8 <211> 1605 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220> <221> CDS <222> (1)...(1602) <221> sig_peptide <222> (1)...(72) <221> mat_peptide <222> (73)...(1602) <400> 8 atg tcg ttc cga tct cta ctc gcc ctg agc ggc ctc gtc tgc aca ggg 48 Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly -20 -15 -10 ttg gca aat gtg att tcc aag cgc gcg acc ttg gat tca tgg ttg agc 96 Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser -5 1 5 aac gaa gcg acc gtg gct cgt act gcc atc ctg aat aac atc ggg gcg 144 Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala 10 15 20 gac ggt gct tgg gtg tcg ggc gcg gac tct ggc att gtc gtt gct agt 192 Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser 25 30 35 40 ccc agc acg gat aac ccg gac tac ttc tac acc tgg act cgc gac tct 240 Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser 45 50 55 ggt ctc gtc ctc aag acc ctc gtc gat ctc ttc cga aat gga gat acc 288 Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr 60 65 70 agt ctc ctc tcc acc att gag aac tac atc tcc gcc cag gca att gtc 336 Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val 75 80 85 cag ggt atc agt aac ccc tct ggt gat ctg tcc agc ggc gct ggt ctc 384 Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu 90 95 100 ggt gaa ccc aag ttc aat gtc gat gag act gcc tac act ggt tct tgg 432 Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp 105 110 115 120 gga cgg ccg cag cga gat ggt ccg gct ctg aga gca act gct atg atc 480 Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile 125 130 135 ggc ttc ggg cag tgg ctg ctt gac aat ggc tac acc agc acc gca acg 528 Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr 140 145 150 gac att gtt tgg ccc ctc gtt agg aac gac ctg tcg tat gtg gct caa 576 Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln 155 160 165 tac tgg aac cag aca gga tat gat ctc tgg gaa gaa gtc aat ggc tcg 624 Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser 170 175 180 tct ttc ttt acg att gct gtg caa cac cgc gcc ctt gtc gaa ggt agt 672 Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser 185 190 195 200 gcc ttc gcg acg gcc gtc ggc tcg tcc tgc tcc tgg tgt gat tct cag 720 Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln 205 210 215 gca ccc gaa att ctc tgc tac ctg cag tcc ttc tgg acc ggc agc ttc 768 Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe 220 225 230 att ctg gcc aac ttc gat agc agc cgt tcc ggc aag gac gca aac acc 816 Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr 235 240 245 ctc ctg gga agc atc cac acc ttt gat cct gag gcc gca tgc gac gac 864 Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp 250 255 260 tcc acc ttc cag ccc tgc tcc ccg cgc gcg ctc gcc aac cac aag gag 912 Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu 265 270 275 280 gtt gta gac tct ttc cgc tca atc tat acc ctc aac gat ggt ctc agt 960 Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser 285 290 295 gac agc gag gct gtt gcg gtg ggt cgg tac cct gag gac acg tac tac 1008 Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr 300 305 310 aac ggc aac ccg tgg ttc ctg tgc acc ttg gct gcc gca gag cag ttg 1056 Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu 315 320 325 tac gat gct cta tac cag tgg gac aag cag ggg tcg ttg gag gtc aca 1104 Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr 330 335 340 gat gtg tcg ctg gac ttc ttc aag gca ctg tac agc gat gct gct act 1152 Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr 345 350 355 360 ggc acc tac tct tcg tcc agt tcg act tat agt agc att gta gat gcc 1200 Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala 365 370 375 gtg aag act ttc gcc gat ggc ttc gtc tct att gtg gaa act cac gcc 1248 Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala 380 385 390 gca agc aac ggc tcc atg tcc gag caa tac gac aag tct gat ggc gag 1296 Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu 395 400 405 cag ctt tcc gct cgc gac ctg acc tgg tct tat gct gct ctg ctg acc 1344 Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr 410 415 420 gcc aac aac cgt cgt aac tcc gtc gtg cct gct tct tgg ggc gag acc 1392 Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr 425 430 435 440 tct gcc agc agc gtg ccc ggc acc tgt gcg gcc aca tct gcc att ggt 1440 Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly 445 450 455 acc tac agc agt gtg act gtc acc tcg tgg ccg agt atc gtg gct act 1488 Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr 460 465 470 ggc ggc acc act acg acg gct acc ccc act gga tcc ggc agc gtg acc 1536 Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr 475 480 485 tcg acc agc aag acc acc gcg act gct agc aag acc agc acc acg acc 1584 Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr 490 495 500 cgc tct ggt atg tca ctg tga 1605 Arg Ser Gly Met Ser Leu 505 510 <210> 9 <211> 534 <212> PRT <213> Aspergillus niger <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(24) <400> 9 Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly -20 -15 -10 Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser -5 1 5 Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala 10 15 20 Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser 25 30 35 40 Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser 45 50 55 Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr 60 65 70 Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val 75 80 85 Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu 90 95 100 Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp 105 110 115 120 Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile 125 130 135 Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr 140 145 150 Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln 155 160 165 Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser 170 175 180 Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser 185 190 195 200 Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln 205 210 215 Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe 220 225 230 Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr 235 240 245 Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp 250 255 260 Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu 265 270 275 280 Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser 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495 500 Arg Ser Gly Met Ser Leu 505 510 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 102434 N= A, G, C or T <400> 10 gtnttraaya ayathgg 17 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 102435 N = A, G, C, or T <400> 11 gtnctnaaya ayathgg 17 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 117360 N= A, G, C or T <400> 12 ctrganaccc tyctyca 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 117361 <400> 13 ctraayaccc tyctyca 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 127420 N= A, G, C or T <400> 14 accctyctrc trggntt 17 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 123036 <400> 15 gtgagcccaa gttcaatgtg 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 <400> 16 agaaatcggg tatcctttca g 21 <210> 17 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 <400> 17 gctcctcatg gtggatcccc agttgtgtat atagaggatt gaggaaggaa gagaagtgtg 60 gatagaggta aattgagttg gaaactccaa gcatggcatc cttgc 105 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 139746 <400> 18 gacagatctc caccatggcg tccctcgttg 30 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 <400> 19 gacctcgagt cactgccaac tatcgtc 27 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 <400> 20 ccctcaccag gggaatgctg cagttgatg 29 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 950847 <400> 21 cgccattctc ggcgactt 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 951216 <400> 22 cgccgcggta ttctgcag 18 <210> 23 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Tal 1 <400> 23 caatataaac gacggtaccc gggagatctc caccatggcg tccctcgttg 50 <210> 24 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tal 4 <400> 24 ctaattacat catgcggccc tctagatcac tgccaactat cgtc 44 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Tal 5 <400> 25 aatttgggtc gctcctgctc g 21 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tal 6 <400> 26 cgagcaggag cgacccaaat tatttctact cctggacacg 40 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tal 7 <400> 27 gatgagatag ttcgcatacg 20 <210> 28 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tal 8 <400> 28 cgtatgcgaa ctatctcatc gacaacggcg aggcttcgac tgc 43 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tal 9 <400> 29 cgaaggtgga tgagttccag 20 <210> 30 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tal 10 <400> 30 ctggaactca tccaccttcg acctctggga agaagtagaa gg 42 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tal 11 <400> 31 gacaatactc agatatccat c 21 <210> 32 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tal 12 <400> 32 gatggatatc tgagtattgt cgagaaatat actccctcag acg 43 <210> 33 <211> 2748 <212> DNA <213> Talaromyces emersonii <400> 33 acgagatgtg tatatactgt gaaccaaact agatgatgtc agttatgctg gtctgagaac 60 tcatagaagc ccttgaaaat accccaagct agcactccaa ccctaactct gttgctctac 120 tagatcaaga cgagtactct gattgagctg caggcttgga atatatgatt agcagaaaaa 180 gggttaaaac ttgtatgaca atcagtttgt cagtactccg tagtgatgcc atgtctatag 240 agtcgacact aaggcagcat gtgaatgagt cggaaatgac aggaagcaga ttccttaaca 300 gtcatgttct ccgtgcctgc atccccacgt cacctgcaaa gatgcgacgc tactccacac 360 cggcgccttg atgtctgctg ttcctggcct agtggagccc catgcgctgc tagctcgtgg 420 tcttcgaata aatcagaata aaaaacggag taattaattg cgcccgcaac aaactaagca 480 atgtaactca atgccaagct tccgctgatg ctcttgacat ctccgtagtg gcttctttcg 540 taatttcaga cgtatatata gtagtaatgc ccagcaggcc gggataatga tggggatttc 600 tgaactctca gcttccgtac gctgaacagt ttgcttgcgt tgtcaaccat ggcgtccctc 660 gttgctggcg ctctctgcat cctgggcctg acgcctgctg catttgcacg agcgcccgtt 720 gcagcgcgag ccaccggttc cctggactcc tttctcgcaa ccgaaactcc aattgccctc 780 caaggcgtgc tgaacaacat cgggcccaat ggtgctgatg tggcaggagc aagcgccggc 840 attgtggttg ccagtccgag caggagcgac ccaaattgta ggttctttcc caccagaaat 900 tacttattta aatcagccct ctgacaggtt gaagatttct actcctggac acgtgacgca 960 gcgctcacgg ccaaatacct cgtcgacgcc ttcatcgcgg gcaacaagga cctagagcag 1020 accatccagc agtacatcag cgcgcaggcg aaggtgcaaa ctatctccaa tccgtccgga 1080 gatttatcca ccggtggctt aggtgagccc aagttcaatg tgaatgagac ggcttttacc 1140 gggccctggg gtcgtccaca gagggacgga ccagcgttga gagcgacggc cctcattgcg 1200 tatgcgaact atctcatcgt aagcttctgc tcgctgccct tctctctgct cgtatgctaa 1260 gtagtcctgt caggacaacg gcgaggcttc gactgccgat gagatcatct ggccgattgt 1320 ccagaatgat ctgtcctaca tcacccaata ctggaactca tccaccttcg gtaggcaaat 1380 gaatattccc gacacagcgt ggtactaatt tgattcagac ctctgggaag aagtagaagg 1440 atcctcattc ttcacaaccg ccgtgcaaca ccgcgccctg gtcgaaggca atgcactggc 1500 aacaaggctg aaccacacgt gctccaactg cgtctctcag gcccctcagg tcctgtgttt 1560 cctgcagtca tactggaccg gatcgtatgt tctggccaac tttggtggca gcggtcgttc 1620 cggcaaggac gtgaattcga ttctgggcag catccacacc tttgatcccg ccggaggctg 1680 tgacgactcg accttccagc cgtgttcggc ccgtgccttg gcaaatcaca aggtggtcac 1740 cgactcgttc cggagtatct atgcgatcaa ctcaggcatc gcagagggat ctgccgtggc 1800 agtcggccgc taccctgagg atgtctacca gggcgggaac ccctggtacc tggccacagc 1860 agcggctgca gagcagcttt acgacgccat ctaccagtgg aagaagatcg gctcgataag 1920 tatcacggac gttagtctgc catttttcca ggatatctac ccttctgccg cggtgggcac 1980 ctataactct ggctccacga ctttcaacga catcatctcg gccgtccaga cgtatggtga 2040 tggatatctg agtattgtcg tacgttttgc cttagattct caggtgtaaa gaaaaaaatg 2100 gaactaactc agttctagga gaaatatact ccctcagacg gctctcttac cgaacaattc 2160 tcccgtacag acggcactcc gctttctgcc tctgccctga cttggtcgta cgcttctctc 2220 ctaaccgctt cggcccgcag acagtccgtc gtccctgctt cctggggcga aagctccgca 2280 agcagcgtcc ctgccgtctg ctctgccacc tctgccacgg gcccatacag cacggctacc 2340 aacaccgtct ggccaagctc tggctctggc agctcaacaa ccaccagtag cgccccatgc 2400 accactccta cctctgtggc tgtgaccttc gacgaaatcg tcagcaccag ttacggggag 2460 acaatctacc tggccggctc gatccccgag ctgggcaact ggtccacggc cagcgcgatc 2520 cccctccgcg cggatgctta caccaacagc aacccgctct ggtacgtgac cgtcaatctg 2580 ccccctggca ccagcttcga gtacaagttc ttcaagaacc agacggacgg gaccatcgtc 2640 tgggaagacg acccgaaccg gtcgtacacg gtcccagcgt actgtgggca gactaccgcc 2700 attcttgacg atagttggca gtgagataac atccaccctt ctgtttta 2748 <210> 34 <211> 618 <212> PRT <213> Talaromyces emersonii <400> 34 Met Ala Ser Leu Val Ala Gly Ala Leu Cys Ile Leu Gly Leu Thr Pro 1 5 10 15 Ala Ala Phe Ala Arg Ala Pro Val Ala Ala Arg Ala Thr Gly Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Gln Gly Val Leu 35 40 45 Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly 50 55 60 Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser 65 70 75 80 Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ala Phe 85 90 95 Ile Ala Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile Gln Gln Tyr Ile Ser 100 105 110 Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser 115 120 125 Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe 130 135 140 Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala 145 150 155 160 Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Asp Asn Gly Glu Ala 165 170 175 Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Gln Asn Asp Leu Ser 180 185 190 Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu 195 200 205 Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu 210 215 220 Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn His Thr Cys Ser Asn 225 230 235 240 Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp 245 250 255 Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ser Gly Arg Ser Gly 260 265 270 Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala 275 280 285 Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu 290 295 300 Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile 305 310 315 320 Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro 325 330 335 Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala 340 345 350 Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys Lys Ile Gly 355 360 365 Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe Phe Gln Asp Ile Tyr 370 375 380 Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asn 385 390 395 400 Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ile 405 410 415 Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu Thr Glu Gln Phe Ser 420 425 430 Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Tyr 435 440 445 Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln Ser Val Val Pro Ala 450 455 460 Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala Val Cys Ser Ala 465 470 475 480 Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Asn Thr Val Trp Pro 485 490 495 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Cys Thr 500 505 510 Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Val Ser Thr Ser 515 520 525 Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile Pro Glu Leu Gly Asn 530 535 540 Trp Ser Thr Ala Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala Asp Ala Tyr Thr Asn 545 550 555 560 Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu Pro Pro Gly Thr Ser 565 570 575 Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp 580 585 590 Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln 595 600 605 Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln 610 615 1

Claims (31)

  1. 탈라로마이세스 에멀소나이 (Talaromyces emersonii)로부터 유래되고, SEQ ID NO: 7로 나타낸 아미노산 서열을 나타내는, 글루코아밀라제 활성을 갖는 분리된 효소.
  2. 제 1 항에 있어서, 50mM NaOAc, 0.2AGU/ml, pH 4.5, 70℃에서 100분 이상의 T1/2(반감기)를 갖는 것을 특징으로 하는 효소.
  3. 제 2 항에 있어서, 100 내지 140분 범위의 T1/2(반감기)를 갖는 것을 특징으로 하는 효소.
  4. 제 1 항에 있어서, 탈라로마이세스 에멀소나이 (Talaromyces emersonii)는 탈라로마이세스 에멀소나이 (Talaromyces emersonii) CBS 793.97임을 특징으로 하는 효소.
  5. (a) SEQ ID NO: 33으로 나타낸 DNA 서열의 글루코아밀라제 암호화 부분;
    (b) SEQ ID NO: 33 또는 이의 상보성 스트랜드에서 위치 649-2724로 나타낸 DNA 서열;
    (c) (b)의 DNA 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드와 정확하게 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는,
    탈라로마이세스 에멀소나이 (Talaromyces emersonii)로부터 유래되고, 글루코아밀라제 활성을 나타내는 효소를 암호화하는 클로닝된 DNA 서열.
  6. 제 5 항에 있어서, DNA 서열이 기탁된 탈라로마이세스 에멀소나이 (Talaromyces emersonii) CBS 793.97로부터 유래된 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
  7. 전분 가수분해물을 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 따르는 글루코아밀라제 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 DNA 서열에 의해 암호화된 글루코아밀라제의 존재하에 당화시키는 단계를 포함하는, 전부 또는 부분적으로 가수분해된 전분을 덱스트로스를 함유하는 시럽으로 전환시키는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 글루코아밀라제의 용량이 무수 고체 g당 0.05 내지 0.5AGU 범위로 존재함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 30중량% 이상의 무수 고체를 갖는 전분 가수분해물을 당화시킴을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 당화가 풀룰라나제 및 이소아밀라제 군으로부터 선택된 탈분지 효소의 존재하에 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 탈분지 효소가 바실러스 아시도풀루리티쿠스 (Bacillus acidopullulyticus) 또는 바실러스 데라미피칸스 (Bacillus deramificans)로부터 유래된 풀룰라나제 또는 슈도모나스 아밀로데라모사 (Pseudomonas amyloderamosa)로부터 유래된 이소아밀라제인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 7 항에 있어서, 당화가 3 내지 5.5의 pH 및 60 내지 80℃의 온도에서, 24 내지 72시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 따르는 글루코아밀라제 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 DNA 서열에 의해 암호화된 글루코아밀라제를 사용하는 효소성 당화 단계를 포함하는, 액화된 전분 용액을 당화시키는 방법.
  14. 전분 전환 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 따르는 글루코아밀라제 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 DNA 서열에 의해 암호화된 글루코아밀라제.
  15. 연속적 전분 전환 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 따르는 글루코아밀라제 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 DNA 서열에 의해 암호화된 글루코아밀라제.
  16. 올리고당류의 제조 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 따르는 글루코아밀라제 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 DNA 서열에 의해 암호화된 글루코아밀라제.
  17. 특수 시럽의 제조 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 따르는 글루코아밀라제 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 DNA 서열에 의해 암호화된 글루코아밀라제.
  18. 연료용 에탄올의 제조 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 따르는 글루코아밀라제 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 DNA 서열에 의해 암호화된 글루코아밀라제.
  19. 음료의 제조 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 따르는 글루코아밀라제 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 DNA 서열에 의해 암호화된 글루코아밀라제.
  20. 시트르산, 아스코르브산, 리신, 글루탐산과 같은 유기 화합물을 제조하는 발효 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 따르는 글루코아밀라제 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 DNA 서열에 의해 암호화된 글루코아밀라제.
  21. 제 1 항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에서 정의된 글루코아밀라제 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 DNA 서열에 의해 암호화된 글루코아밀라제를 제조할 수 있는 미생물 탈라로마이세스 에멀소나이 (Talaromyces emersonii) CBS 793.97 의 분리된 순수 배양물.
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Families Citing this family (171)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6352851B1 (en) 1998-07-15 2002-03-05 Novozymes A/S Glucoamylase variants
WO2000075296A1 (en) * 1999-06-02 2000-12-14 Novozymes A/S Novel glucoamylase
JP2003504046A (ja) 1999-07-09 2003-02-04 ノボザイムス アクティーゼルスカブ グルコアミラーゼ変異体
EP1370648A2 (en) 2000-08-01 2003-12-17 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants with altered properties
EP2159279A3 (en) 2001-05-15 2010-05-12 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
US20040063184A1 (en) 2002-09-26 2004-04-01 Novozymes North America, Inc. Fermentation processes and compositions
EP2194133B1 (en) * 2003-03-06 2015-12-02 BASF Enzymes LLC Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
ES2245621T3 (es) 2003-03-10 2010-05-19 Novozymes A/S Procesos para un producto alcoholico.
EP1633878A1 (en) 2003-05-30 2006-03-15 Novozymes A/S Alcohol product processes
US20040253696A1 (en) 2003-06-10 2004-12-16 Novozymes North America, Inc. Fermentation processes and compositions
US8105801B2 (en) 2003-06-25 2012-01-31 Novozymes A/S Starch process
DE602004025419D1 (de) * 2003-10-28 2010-03-25 Novozymes North America Inc Hybridenzyme
JP2008523830A (ja) 2004-12-22 2008-07-10 ノボザイムス アクティーゼルスカブ ハイブリッド酵素
WO2006066579A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Novozymes A/S Starch process
MX2007007030A (es) 2004-12-22 2007-08-14 Novozymes As Enzimas para procesamiento de almidon.
US8841091B2 (en) 2004-12-22 2014-09-23 Novozymes Als Enzymes for starch processing
CN101268195A (zh) 2005-09-20 2008-09-17 诺维信北美公司 产生发酵产物的方法
US20080280328A1 (en) 2005-11-18 2008-11-13 Novozymes A/S Glucoamylase Variants
WO2007076388A2 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Novozymes North America, Inc. Processes for producing a fermentation product
WO2007109750A2 (en) 2006-03-22 2007-09-27 Novozymes North America, Inc. Fermentation processes
US20080293607A1 (en) 2007-03-09 2008-11-27 Jones Brian E Alkaliphilic Bacillus Species alpha-Amylase Variants, Compositions Comprising alpha-Amylase Variants, And Methods of Use
EP2132308B1 (en) 2007-03-14 2011-11-16 Danisco US Inc. Trichoderma reese a-amylase enhances saccharification of corn starch
WO2008134259A1 (en) 2007-04-24 2008-11-06 Novozymes North America, Inc. Detoxifying pre-treated lignocellulose-containing materials
EP2191061B1 (en) 2007-09-03 2013-05-22 Novozymes A/S Detoxifying and recycling of washing solution used in pretreatment of lignocellulose-containing materials
CA3069361C (en) * 2007-10-09 2023-11-28 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
DK2245130T3 (da) 2008-02-04 2021-01-18 Danisco Us Inc Ts23 -alpha-amylasevarianter med ændrede egenskaber
MX2010011721A (es) 2008-04-30 2010-11-30 Danisco Inc Nuevas variantes de alfa-amilasa quimericas.
BRPI0913402B1 (pt) 2008-06-06 2019-07-02 Danisco Us Inc. Alfa amilases (amys) variantes de geobacillus stearothermophilus com propriedades melhoradas
DK2297313T3 (en) 2008-06-06 2015-06-08 Danisco Us Inc ALPHA AMYLASE VARIETIES OF BACILLUS SUBTILIS AND METHODS OF USING IT
EP2310521A2 (en) 2008-06-06 2011-04-20 Danisco US Inc. Production of glucose from starch using alpha-amylases from bacillus subtilis
US9040279B2 (en) 2008-06-06 2015-05-26 Danisco Us Inc. Saccharification enzyme composition and method of saccharification thereof
WO2010008841A2 (en) 2008-06-23 2010-01-21 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products
WO2010039812A2 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Novozymes North America, Inc. Improvement of enzymatic hydrolysis of pre-treated lignocellulose-containing material with distillers dried grains
US20110195149A1 (en) 2008-10-15 2011-08-11 Novozymes A/S Brewing process
CN102292444A (zh) 2008-11-20 2011-12-21 诺维信股份有限公司 具有淀粉分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
EP2384365A2 (en) 2008-12-30 2011-11-09 Novozymes North America, Inc. Improvement of enzymatic hydrolysis of pretreated lignocellulose-containing material with dissolved air flotation sludge
WO2010078392A2 (en) 2008-12-31 2010-07-08 Novozymes North America, Inc. Processes of producing fermentation products
WO2010088447A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
EP2213723A1 (en) 2009-01-30 2010-08-04 Novozymes A/S Isomaltose for fungus fermentation
WO2010091221A1 (en) 2009-02-06 2010-08-12 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
WO2010115028A2 (en) 2009-04-01 2010-10-07 Danisco Us Inc. Cleaning system comprising an alpha-amylase and a protease
CN102471784A (zh) 2009-07-07 2012-05-23 诺维信公司 用酶处理底物的方法
EP2454590B1 (en) 2009-07-17 2016-09-07 Novozymes A/S A method of analyzing cellulose decay in cellulosic material hydrolysis
CA2771071C (en) 2009-08-07 2020-03-10 Danisco Us Inc. Alpha-amylase blend for starch processing and method of use thereof
WO2011020910A1 (en) 2009-08-21 2011-02-24 Novozymes A/S Polypeptides having isoamylase activity and polynucleotides encoding same
CN102665425A (zh) 2009-09-30 2012-09-12 诺维信公司 馒头制备方法和馒头改进组合物
CA2778471A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Danisco Us Inc. Methods for reducing blue saccharide
US20120252086A1 (en) 2009-12-22 2012-10-04 Novozymes A/S Compositions Comprising Boosting Polypeptide And Starch Degrading Enzyme And Uses Thereof
CN102884197A (zh) 2010-01-29 2013-01-16 诺维信公司 具有酶预处理的沼气生产方法
WO2011100161A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Novozymes North America, Inc. Addition of alpha - glucosidase and cobalt for producing fermentation products from starch
WO2011123505A1 (en) 2010-03-30 2011-10-06 Novozymes North America, Inc. Processes of producing a fermentation product
ES2565060T3 (es) 2010-04-14 2016-03-31 Novozymes A/S Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos
CA2802083C (en) 2010-06-11 2018-10-09 Novozymes A/S Enzymatic flour correction
CN103140586A (zh) 2010-08-02 2013-06-05 诺维信北美公司 产生发酵产物的方法
WO2012068047A2 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Novozymes North America, Inc. Processes of producing a fermentation product
WO2012088303A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Novozymes North America, Inc. Processes for producing fermentation products
EP2661499A1 (en) 2011-01-04 2013-11-13 Novozymes A/S Process for producing biogas from pectin and lignocellulose containing material
EP2670839B1 (en) 2011-01-31 2017-11-08 Novozymes A/S Use of browned glucose for the fermentative production of thaxtomin.
ES2531247T3 (es) 2011-02-07 2015-03-12 Novozymes North America Inc Proceso para licuefacción de almidón en presencia de piridoxamina
EP2702161A1 (en) 2011-04-29 2014-03-05 Danisco US Inc. Use of cellulase and glucoamylase to improve ethanol yields from fermentation
WO2013000945A1 (en) 2011-06-28 2013-01-03 Novozymes A/S Biogas from enzyme-treated bagasse
ES2692544T3 (es) 2011-06-30 2018-12-04 Novozymes A/S Variantes de alfa-amilasa
CN103781910B (zh) 2011-07-06 2019-04-23 诺维信公司 α淀粉酶变体及其编码多核苷酸
EP2548944A1 (en) 2011-07-21 2013-01-23 AB Enzymes GmbH Process of lysing yeast cell walls
DK2734633T3 (da) 2011-07-22 2019-06-11 Novozymes North America Inc Fremgangsmåder til forbehandling af celluloseholdigt materiale og forbedring af hydrolyse deraf
US9650620B2 (en) 2011-08-26 2017-05-16 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
EP2748188A4 (en) * 2011-08-26 2015-03-18 Novozymes As POLYPEPTIDES HAVING GLUCOAMYLASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THESE POLYPEPTIDES
CN103764670A (zh) * 2011-08-26 2014-04-30 诺维信公司 具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码它的多核苷酸
CN103930543B (zh) 2011-09-06 2020-11-27 诺维信公司 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸
EP2748189B1 (en) 2011-09-09 2017-11-15 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
US9567574B2 (en) 2011-09-09 2017-02-14 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
CA2850070A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
US9353362B2 (en) 2011-10-11 2016-05-31 Novozymes A/S Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same
EP2766490B1 (en) 2011-10-11 2017-04-12 Novozymes North America, Inc. Liquefaction process for producing fermentation products
RU2014121491A (ru) 2011-10-28 2015-12-10 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Варианты вариантной альфа-амилазы, образующей мальтогексаозу
EP2785847B1 (en) 2011-12-02 2017-07-26 Novozymes A/S Liquefaction process with selected alpha-amylases and proteases
WO2013083801A2 (en) 2011-12-09 2013-06-13 Novozymes A/S Biogas from substrates comprising animal manure and enzymes
EP2794899A1 (en) 2011-12-21 2014-10-29 Novozymes, Inc. Methods for determining the degradation of a biomass material
WO2013092840A1 (en) * 2011-12-22 2013-06-27 Dupont Nutrition Biosciences Aps Polypeptides having glucoamylase activity and method of producing the same
US9315831B2 (en) 2012-03-30 2016-04-19 Danisco Us Inc. Direct starch to fermentable sugar as feedstock for the production of isoprene, isoprenoid precursor molecules, and/or isoprenoids
ES2935920T3 (es) 2012-03-30 2023-03-13 Novozymes North America Inc Procesos de elaboración de productos de fermentación
WO2013148207A2 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Danisco Us Inc. Direct starch to fermentable sugar
CA2869047C (en) 2012-03-30 2022-11-01 Novozymes North America, Inc. Processes of producing fermentation products
US8945889B2 (en) 2012-05-11 2015-02-03 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from Aspergillus clavatus for saccharification
DK2825643T3 (da) 2012-06-08 2021-11-08 Danisco Us Inc Variant-alfa-amylaser med forbedret aktivitet over for stivelsespolymerer
CN102719419B (zh) * 2012-07-02 2013-10-09 武汉新华扬生物股份有限公司 一种可以降解生淀粉的糖化酶glad3及其基因和应用
EP2869698A1 (en) 2012-07-06 2015-05-13 Novozymes A/S Liquid enzyme composition and method for enzyme recovery
US20150203807A1 (en) 2012-07-06 2015-07-23 Novozymes A/S Inactivation of a production strain using a fatty acid
EP2885417A1 (en) * 2012-08-16 2015-06-24 Danisco US Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus clavatus and isoamylase for saccharification
US20150218606A1 (en) 2012-08-16 2015-08-06 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus clavatus and pullulanase for saccharification
WO2014027062A1 (en) 2012-08-17 2014-02-20 Novozymes A/S Thermostable asparaginase variants and polynucleotides encoding same
US9879241B2 (en) 2012-09-07 2018-01-30 Novozymes A/S Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same and uses thereof
EP2922951B1 (en) 2012-11-20 2017-08-23 Danisco US Inc. Amylase with maltogenic properties
CA2894513A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus fumigatus and isoamylase for saccharification
ES2772032T3 (es) 2012-12-17 2020-07-07 Novozymes As Alfa-amilasas y polinucleótidos que las codifican
WO2014099415A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus terreus and pullulanase for saccharification
US20160053243A1 (en) 2012-12-21 2016-02-25 Danisco Us Inc. Alpha-amylase variants
WO2014099525A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Danisco Us Inc. Paenibacillus curdlanolyticus amylase, and methods of use, thereof
WO2014164800A1 (en) 2013-03-11 2014-10-09 Danisco Us Inc. Alpha-amylase combinatorial variants
WO2014200658A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis
WO2014200657A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis
WO2014200656A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces umbrinus
EP3011020A1 (en) 2013-06-17 2016-04-27 Danisco US Inc. Alpha-amylase from bacillaceae family member
ES2754203T3 (es) 2013-06-24 2020-04-16 Novozymes As Proceso de extracción de aceite a partir de vinaza diluida
DK3022300T3 (en) 2013-07-17 2018-10-22 Novozymes As : Pullulan chimeras and polynucleotides encoding them
US9951364B2 (en) 2013-09-11 2018-04-24 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products
WO2015050723A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Danisco Us Inc. Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof
US20160186102A1 (en) 2013-10-03 2016-06-30 Danisco Us Inc. Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof
WO2015057517A1 (en) 2013-10-17 2015-04-23 Danisco Us Inc. Use of hemicellulases to improve ethanol production
CN105722989B (zh) 2013-10-28 2020-12-18 丹尼斯科美国公司 发酵中的海藻糖酶
WO2015066669A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Danisco Us Inc. Proteases in corn processing
WO2015066667A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Danisco Us Inc. Proteases in wheat processing
US20160272957A1 (en) 2013-11-20 2016-09-22 Danisco Us Inc. Variant alpha-amylases having reduced susceptibility to protease cleavage, and methods of use, thereof
WO2015094714A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Danisco Us Inc. Proteases in grain processing
WO2015094809A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Danisco Us Inc. Chimeric fungal alpha-amylases comprising carbohydrate binding module and the use thereof
US10030237B2 (en) 2014-01-22 2018-07-24 Novozymes A/S Pullulanase variants and polynucleotides encoding same
JP6591993B2 (ja) 2014-02-07 2019-10-16 ノボザイムス アクティーゼルスカブ グルコースシロップ生産用組成物
CN103881993B (zh) * 2014-03-13 2015-11-18 南宁邦尔克生物技术有限责任公司 一种耐酸性高温β-淀粉酶的突变体TBA-H2及其应用
WO2015143144A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Novozymes A/S Method for enhancing activity of an x143 polypeptide
US11072786B2 (en) 2014-04-10 2021-07-27 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
EP4108087A1 (en) 2014-07-08 2022-12-28 Caravan Ingredients Inc. Sugar-producing and texture-improving bakery methods and products formed therefrom
CN106795505A (zh) 2014-10-23 2017-05-31 诺维信公司 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸
MX2017007102A (es) 2014-12-01 2017-08-24 Novozymes As Produccion mejorada de jarabes de glucosa.
WO2016196202A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
CN108350442A (zh) 2015-06-18 2018-07-31 诺维信公司 具有海藻糖酶活性的多肽及其在产生发酵产物的方法中的用途
US20180208916A1 (en) 2015-07-23 2018-07-26 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
US20200248208A1 (en) 2015-11-17 2020-08-06 Novozymes A/S Yeast Strains Suitable For Saccharification And Fermentation Expressing Glucoamylase And/Or Alpha-Amylase
DK3387124T3 (da) 2015-12-09 2021-08-23 William Cuevas Kombinatoriske alfa-amylasevarianter
CN108699572A (zh) 2015-12-22 2018-10-23 诺维信公司 使用磷脂酶c增加发酵产物得率的方法
CN108699579A (zh) * 2015-12-31 2018-10-23 Cj第制糖株式会社 使用具有耐热性及耐酸性的酸热菌菌种衍生的脱支酶从淀粉糖制备葡萄糖的方法以及由此制备的葡萄糖
WO2017173324A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
WO2017173190A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
US11015212B2 (en) 2016-10-17 2021-05-25 Novozymes A/S Methods of reducing foam during ethanol fermentation
WO2018098381A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Novozymes A/S Improved yeast for ethanol production
CN110072997A (zh) 2016-11-23 2019-07-30 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽和编码其的多核苷酸
US20210292723A1 (en) 2016-11-29 2021-09-23 Novozymes A/S Alpha-Amylase Variants and Polynucleotides Encoding Same
GB201620658D0 (en) * 2016-12-05 2017-01-18 Univ Stellenbosch Recombinant yeast and use thereof
WO2018184004A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Danisco Us Inc Alpha-amylase combinatorial variants
MX2019014142A (es) 2017-06-02 2020-02-07 Novozymes As Levadura mejorada para produccion de etanol.
WO2018226569A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Danisco Us Inc Use of betaine to stabilize and/or increase the activity of enzymes in stressful environments
MX2019014889A (es) 2017-06-28 2020-02-13 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad trehalasa y polinucleotidos que los codifican.
MX2020001282A (es) 2017-08-08 2020-03-12 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad trehalasa y uso de los mismos en proceso de produccion de productos de fermentacion.
BR112020003866A2 (pt) 2017-08-30 2020-09-08 Novozymes A/S processo para produção de um produto de fermentação, e, composição.
WO2019055455A1 (en) 2017-09-15 2019-03-21 Novozymes A/S MIXTURES OF ENZYMES AND METHODS FOR IMPROVING THE NUTRITIONAL QUALITY OF ANIMAL FEED
US20200248159A1 (en) 2017-10-04 2020-08-06 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
BR112020007814A2 (pt) 2017-10-23 2020-10-20 Novozymes A/S processos para reduzir e/ou prevenir um aumento nos níveis de ácido lático em um sistema de fermentação de biocombustível e para produção de um produto de fermentação a partir de um material contendo amido, e, uso de um polipeptídeo, ou uma composição enzimática
BR112020009525A2 (pt) 2017-11-14 2020-11-03 Danisco Us Inc. alfa-amilase, composição e método
US20220348967A1 (en) 2018-01-29 2022-11-03 Novozymes A/S Microorganisms With Improved Nitrogen Utilization For Ethanol Production
EP3752626A1 (en) 2018-02-15 2020-12-23 Novozymes A/S Improved yeast for ethanol production
AU2019231645B2 (en) * 2018-03-09 2023-05-11 Danisco Us Inc Glucoamylases and methods of use thereof
MX2020012754A (es) 2018-05-31 2021-02-26 Novozymes As Procesos para mejorar el crecimiento y la productividad de la levadura.
CN112368393A (zh) 2018-07-11 2021-02-12 诺维信公司 用于生产发酵产物的方法
MX2021000893A (es) 2018-07-25 2021-03-31 Novozymes As Levadura que expresa enzimas para la producción de etanol.
AU2019359187A1 (en) 2018-10-08 2021-04-29 Novozymes A/S Enzyme-expressing yeast for ethanol production
WO2020160126A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and use thereof for improving the nutritional quality of animal feed
CA3128139A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 Novozymes A/S Polypeptides having pullulanase activity suitable for use in liquefaction
US20220186266A1 (en) 2019-04-02 2022-06-16 Novozymes A/S Process For Producing A Fermentation Product
CN114466594A (zh) 2019-07-09 2022-05-10 杜邦营养生物科学有限公司 脂肪包衣的微粒状酶组合物
EP4004029A1 (en) 2019-07-26 2022-06-01 Novozymes A/S Microorganisms with improved nitrogen transport for ethanol production
US20220279818A1 (en) 2019-08-05 2022-09-08 Novozymes A/S Enzyme blends and processes for producing a high protein feed ingredient from a whole stillage byproduct
CN114127124A (zh) 2019-08-06 2022-03-01 诺维信公司 用于提高酶表达的融合蛋白
WO2021046073A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Dupont Nutrition Biosciences Aps Feed composition
EP4031661A1 (en) 2019-09-16 2022-07-27 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucanase activity and polynucleotides encoding same
BR112022011271A2 (pt) 2019-12-10 2022-09-06 Novozymes As Célula hospedeira recombinante, composição, métodos para produzir um derivado de uma célula e um produto de fermentação, e, uso de uma célula hospedeira recombinante
AR120775A1 (es) 2019-12-16 2022-03-16 Novozymes As Procesos para obtener productos de fermentación
WO2021163030A2 (en) 2020-02-10 2021-08-19 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
CN114908073B (zh) * 2020-02-27 2023-07-07 天津科技大学 糖化酶突变体及其应用
BR112023008361A2 (pt) 2020-11-02 2023-12-12 Novozymes As Variantes de glucoamilase e polinucleotídeos codificando as mesmas
EP4352241A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Novozymes A/S Engineered microorganism for improved ethanol fermentation
AU2022349014A1 (en) 2021-09-27 2024-04-04 International N&H Denmark Aps Feed additive compositions and methods for using the same
WO2023225510A1 (en) 2022-05-17 2023-11-23 Dupont Nutrition Biosciences Aps Feed additive comprising enzyme combinations

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4247637A (en) * 1978-09-01 1981-01-27 Cpc International Inc. Highly thermostable glucoamylase and process for its production
EP0135138A2 (en) * 1983-08-17 1985-03-27 Cpc International Inc. A novel thermostable glucoamylase and method for its production
EP0255124A2 (en) * 1986-07-29 1988-02-03 Hitachi, Ltd. Thermostable glucoamylase, a method for production of glucose using same and a plant for production thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4587215A (en) * 1984-06-25 1986-05-06 Uop Inc. Highly thermostable amyloglucosidase
US4628031A (en) * 1984-09-18 1986-12-09 Michigan Biotechnology Institute Thermostable starch converting enzymes
US5602004A (en) * 1994-07-20 1997-02-11 Novo Nordisk Biotech, Inc. Thermophilic fungal expression system

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4247637A (en) * 1978-09-01 1981-01-27 Cpc International Inc. Highly thermostable glucoamylase and process for its production
EP0135138A2 (en) * 1983-08-17 1985-03-27 Cpc International Inc. A novel thermostable glucoamylase and method for its production
EP0255124A2 (en) * 1986-07-29 1988-02-03 Hitachi, Ltd. Thermostable glucoamylase, a method for production of glucose using same and a plant for production thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU1434299A (en) 1999-06-16
KR20010032489A (ko) 2001-04-25
ATE421578T1 (de) 2009-02-15
EP1032654B1 (en) 2009-01-21
ES2321043T3 (es) 2009-06-01
DK1032654T3 (da) 2009-05-11
EP1032654A1 (en) 2000-09-06
WO1999028448A1 (en) 1999-06-10
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