CN101268195A - 产生发酵产物的方法 - Google Patents

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CN101268195A CNA2006800347190A CN200680034719A CN101268195A CN 101268195 A CN101268195 A CN 101268195A CN A2006800347190 A CNA2006800347190 A CN A2006800347190A CN 200680034719 A CN200680034719 A CN 200680034719A CN 101268195 A CN101268195 A CN 101268195A
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Abstract

本发明涉及在液化过程中使用剂量增加的α－淀粉酶，从含淀粉材料产生发酵产物，如乙醇的改进的方法，该方法与常规方法比较，使糊精转化率提高；和/或与在同样条件进行的常规方法比较，在同时糖化和发酵的过程中使糖产生酶的剂量减少。本发明的方法使得率提高。本发明还涉及产生发酵产物的改进方法，所述方法得到与常规方法基本上相同的得率，其中在同时糖化和发酵的过程中使用的糖产生酶剂量减少。

Description

产生发酵产物的方法
发明领域
本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物(如乙醇)的方法。
发明背景
大量难以通过合成产生的商业产品可以由发酵产生。这样的产品包括醇(如乙醇、甲醇、丁醇、1，3-丙二醇)；有机酸(如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸、葡萄糖酸盐、琥珀酸、2，5-二酮基-D-葡萄糖酸)；酮(如丙酮)；氨基酸(如谷氨酸)；气体(如H2和CO2)，和更多的复杂化合物，包括，例如，抗生素(如青霉素和四环素)；酶；维生素(如核黄素，B12，β-胡萝卜素)；和激素。发酵也常用于消费品醇(如啤酒和酒)、乳制品业(如酸奶和奶酪的生产)、皮革和烟草业中。
最近十年来发酵方法的产量已经显著提高。
CA 1,143,677公开了在淀粉分解或纤维素水解作用的酵素(ferment)存在下，通过发酵产生乙醇的方法。
US 5,231,017公开了产生乙醇的方法，其中在糖化过程引入蛋白酶。
WO 01/62947公开了产生乙醇的方法，其中在发酵过程中加入肌醇六磷酸酶。
WO 02/38787公开了通过发酵产生乙醇的方法，其中在存在热稳定的酸性α-淀粉酶或热稳定的产麦芽糖酸性α-淀粉酶的条件下进行第二次液化。
WO 02/074895公开了产生发酵产物的方法，其中在存在至少一种糖-源产生酶(carbohydrate-source generating enzyme)和至少一种α-淀粉酶的条件下进行发酵。
需要进一步改进发酵产物方法，如乙醇制造方法。
发明简述
在第一方面，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，该方法包括：
i)用剂量为0.05-2.6KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化含淀粉材料，
ii)用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.20-1.00AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromycesemersonii葡糖淀粉酶，和
iii)在发酵生物体存在的条件下发酵。
发酵后可任选地回收(优选通过蒸馏回收)发酵产物，如乙醇。可根据本发明使用具有上述酶活性的任何酶。在下面的“酶活性”部分列出合适的酶。然而，在优选的实施方案中，步骤i)中使用的α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶，源自芽孢杆菌属，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株或其变体。
优选实施方案中，在步骤ii)中使用的糖-源产生酶是葡萄糖-源产生酶和/或麦芽糖产生酶。
优选实施方案中，在步骤iii)中发酵使用的发酵生物体是酵母，优选源自酵母属(Saccharomyces)的菌株，优选酿酒酵母菌株。
附图简述
图1显示发酵过程中的发酵动力学。
图2显示当加入高剂量α-淀粉酶时对DE的影响。
发明详述
本发明提供从含淀粉材料产生发酵产物(优选醇，如乙醇)的方法。本发明的方法包括液化步骤和顺序进行或同时进行的糖化和发酵步骤。
本发明人发现，与常规方法中使用的剂量，即大约0.063(KNU(S)/g DS玉米)相比，通过增加液化含淀粉材料使用的α-淀粉酶的剂量，可以增加乙醇得率(yield)。考虑到α-淀粉酶将淀粉水解成糊精，而糊精不能直接用作发酵生物体如酵母的营养物的事实，这是令人惊异的发现。本发明人还发现，当液化过程中使用的α-淀粉酶剂量增加时，得到更高程度的转化，即更高的DE，与常规使用的剂量相比，可以降低糖化过程中的糖-源产生酶的剂量，而不会对乙醇得率产生负面影响。此外，发现通过加入显著更高量的α-淀粉酶(0.67KNU(S)/g DS玉米-参见实施例2)和相同或等同剂量的葡糖淀粉酶，可以得到更高的速率。此外，本发明人还惊讶地发现如果在液化中使用常规所用的α-淀粉酶剂量，并在糖化过程中降低糖-源产生酶的剂量，能够得到基本上相同的乙醇得率。这是有优势的，因为可以降低总的酶剂量。通过较高α-淀粉酶剂量获得的转化率增加可能是因为对产生发酵糖的酶的需求减少了。实施例1阐述了增加α-淀粉酶剂量和/或同时降低糖-源产生酶剂量的影响。
原材料
根据本发明，含淀粉起始材料可以源自任何含淀粉的植物材料。优选的起始材料可以选自下组：块茎、根、整粒(whole grain)；和其任何组合。在一个实施方案中，含淀粉材料由谷类获得。合适的含淀粉谷类可以选自下组：玉米(玉蜀黍)、小麦、大麦、木薯、高粱、黑麦和马铃薯；和其任何组合。玉米是优选的原材料。在本发明的方法中，含淀粉起始材料优选是整粒或至少主要是整粒。含淀粉材料还可以包括或由淀粉加工的侧流(side stream)组成，例如可能不适于产生糖浆的含C6糖的工业生产液流(process stream)。
减小含淀粉材料的粒度
在优选实施方案中，液化前可以减小含淀粉起始材料的粒度。在优选实施方案中，将材料进行干磨(dry milling)。术语“干磨”表示使用例如锤(hammer)或滚磨机(roller mill)磨制含淀粉材料。在使用整粒磨制的情况中，将整粒磨碎并用于本发明的方法中。根据本发明，也包括相似的粒度减小技术，如乳化技术和回转脉动(rotary pulsation)。
本发明的方法
本发明的方法通常可以划分为下述主要处理阶段：打开含淀粉材料的结构以进行进一步处理；液化含淀粉材料以将淀粉水解(分解)成麦芽糊精(糊精)；将液化材料顺序或同时糖化和发酵以产生小分子的可发酵糖，其可以由发酵生物体代谢并转化成期望的发酵产物；和任选地回收，例如通过蒸馏回收以纯化期望的发酵产物。
本发明方法的各个处理步骤可以分批或连续进行。所有处理步骤分批进行的方法或所有处理步骤连续进行的方法，或一个或多个处理步骤分批而一个或多个处理步骤连续进行的方法，同样地包括在本发明中。级联方法是其中一个或多个处理步骤连续进行的方法的实例，同样包括在本发明中。关于级联方法和其它特别的乙醇方法的更多信息，可以参考The Alcohol Textbook.Ethanol production by fermentation and distillation.Eds.T.P.Lyons.D.R.Kesalland J.E.Murtagh.Nottingham University Press 1995。
在第一方面，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，该方法包括：
i)用剂量为0.05-2.6KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化含淀粉材料，
ii)用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.20-1.00AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromycesemersonii葡糖淀粉酶，和
iii)在发酵生物体存在的条件下发酵。
在优选实施方案中，用剂量为0.2-2.6KNU(S)/g DS，优选0.5-2.6KNU(S)/g DS含淀粉材料的α-淀粉酶液化步骤i)中的含淀粉材料，然后用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.20-0.50AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶。
本发明还涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，该方法包括：
i)用剂量为0.070-0.50KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化含淀粉材料，
ii)用糖源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，酶的作用剂量相当于0.20-1.00AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶，和
iii)在发酵生物体存在的条件下发酵。
在优选实施方案中，
“作用剂量”可由于从一种糖-源产生酶(如葡糖淀粉酶)变成另一种而变化。
“作用剂量”定义为AGU/g DS，如下述“材料与方法”部分中AGU试验所述。本领域的技术人员可容易地测定相当于Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶(如WO 99/28448所公开，在黑曲霉宿主细胞中重组表达)的“作用剂量”，步骤如下：
1.用所述的糖-源产生酶进行实施例1中所述实验，
2.根据相当于例如11.74的乙醇得率确定的糖-源产生酶剂量(用AGU/gDS表示)，计算乘法因子(multiplication factor)(MF)。
3.使用MF在本发明范围内的剂量范围中计算“作用剂量”。
例如，以黑曲霉葡糖淀粉酶为例，相当于11.74(％w/v)的乙醇得率的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶(0.489AGU/g DS)的“作用剂量”是0.388。因此，乘法因子(MF)是：
MF＝0.388/0.489＝0.793
针对黑曲霉葡糖淀粉酶计算的“作用剂量”(以AGU/g DS表示)显示于下表中：
0.489AGU(Talaromyces)相当于0.489×0.793＝0.388AGU(黑曲霉)
  Talaromyces emersonii GA剂量AGU/g DS玉米   黑曲霉GA剂量AGU/g DS玉米
  0.244   0.194
  0.371   0.294
  0.489   0.388
在实施方案中，用剂量为0.080-0.40KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化步骤i)中的含淀粉材料，然后用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.20-0.50AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶。
在另一个实施方案中，用剂量为0.080-0.40KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化步骤i)中的含淀粉材料，然后用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.20-0.40AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶。
在实施方案中，本发明还涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，该方法包括：
i)用剂量为0.050-0.50KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化含淀粉材料，
ii)用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.020-0.40AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromycesemersonii葡糖淀粉酶，和
iii)在发酵生物体存在的条件下发酵。
在实施方案中，用剂量为0.080-0.30KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化步骤i)中的含淀粉材料，然后用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.20-0.40AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶。
在另一个实施方案中，用剂量为0.050-0.80KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化步骤i)中的含淀粉材料，然后用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.30-0.40AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶。
根据本发明，步骤i)之后的DE值(“葡萄糖当量”值)可为大约13-30，优选大约14-25，更优选17-30，更优选18-30，更优选19-30，特别是20-30的范围内，使用下文“材料与方法”部分所述的费氏滴定法确定DE值。
DE值是C6糖上还原末端的量度。纯右旋糖(葡萄糖)的DE为100。葡萄糖是还原糖。当α-淀粉酶水解淀粉中的葡萄糖-葡萄糖键时，就会暴露两个新的葡萄糖末端基团。其中至少一个基团可以作为还原糖。因此可将水解程度测定为还原糖的增加。将得到的数值与基于纯葡萄糖的标准曲线进行比较-因此得到术语葡萄糖当量。换句话说：将DE(葡萄糖当量)定义为样品中还原糖的量(测定为葡萄糖当量)，以溶解的干物质总量的w/w％表示。
液化
在步骤i)中，将含淀粉材料分解(水解)为麦芽糊精(糊精)。这个步骤称为“液化”。如上面“原材料”部分定义的含淀粉材料在步骤i)的液化之前可以减小粒度。在具体实施方案中，本发明的方法在步骤i)之前还包括如下步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度；
y)形成包含含淀粉材料与水和/或工艺水的浆料，以获得淀粉材料。
含水浆料可以包含约10-45wt-％的干燥固体含淀粉材料，优选约25-35wt-％的干燥固体含淀粉材料。在优选实施方案中，将含淀粉材料进行干磨。
浆料可以包括水和工艺水，如回流(backset)(稀釜馏物(thin stillage))、洗涤水(scrubber water)、蒸发器的冷凝物或馏出物、蒸馏中侧流汽提器(sidestripper)的水，或其它发酵产品装置的工艺水。回流是循环至前端操作的一部分液体，源自蒸馏后离心步骤的液相(稀釜馏物)。这个液相的其它部分蒸发成为糖浆并喷至干燥固相(全釜馏物)上，以产生含有可溶物质的干酒糟(DDGS)。稀釜馏物(回流)的基本上是废产物，其中产生的总体积的大约一半可以循环利用，因为对这部分材料目前没有环境友好和/或商业可行的处理方法。酸性液体(pH大约3.5-4.5)包含源自全部发酵产物产生过程的任何可溶副产物，包括一些未转化的谷物固体，通常是5-7％低浓度的干物质(DS)连同其它通常的组分，如糖、盐、金属、蛋白质、有机酸和来自裂解的发酵生物体细胞的胞内材料。在实施方案中，将包含0至70vol.-％工艺水，优选约15至60％vol.-％工艺水，特别是约30至50vol.-％工艺水的含水浆料用于液化过程，以制备含淀粉材料的浆料。
根据本发明的一个实施方案，将浆料加热至高于起始糊化温度。起始糊化温度依赖于含淀粉材料，但是可以由本领域的技术人员容易地测定。在实施方案中，将浆料加热至约60-100℃，优选约70-90℃的温度。在任选实施方案中，将液化过程中加入的α-淀粉酶总剂量的0-50％，优选约20-40％加入浆料，以开始稀释。在任选实施方案中，可将含淀粉材料的浆料进行喷射蒸煮，以使含淀粉材料在进行本发明步骤i)的α-淀粉酶处理之前糊化，该过程在约60-140℃，优选约90-120℃的温度，如约105℃，进行1-15分钟，优选3-10分钟，特别是约5分钟。根据本发明，通过在约60-100℃，优选约70-90℃的温度，用α-淀粉酶处理含淀粉材料10-200分钟，优选15-150分钟，来进行液化步骤i)。α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶，包括下面的“α-淀粉酶”部分提到的一些。优选的α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选源自芽孢杆菌属的菌株。液化可以在约pH 4.0-7.0，优选约pH 5.0-6.0进行。在实施方案中，在液化过程中加入肌醇六磷酸酶。
糖化
在步骤ii)中，将包含麦芽糊精的液化材料水解成可由合适的发酵生物体代谢的小分子可发酵糖。这个步骤称作“糖化”。根据本发明，这个步骤通过如下进行：使包含液化麦芽糊精的材料经过一种或多种糖-源产生酶，如葡萄糖-源产生酶和/或麦芽糖产生酶的处理。
糖化步骤通常在约30-70℃，如约60℃的温度，在3.0至7.0，优选3.5至6.0的pH进行，并可以持续约1-96小时。
在优选实施方案中，糖化和发酵可组合为同步糖化和发酵过程(SSF)。
在本发明的实施方案中，可包括任选的1-6小时的预发酵糖化步骤。预发酵糖化可以在本领域已知的任何合适的处理条件进行。在实施方案中，预糖化在30-70℃，如约60℃的温度，在3.0至7.0，优选3.5至6.0的pH进行。因此，在一个实施方案中，本发明的方法可以包括预糖化步骤，如本文所述，其在步骤i)中的液化之后，且在步骤ii)和/或iii)之前进行。
当使用同步糖化和发酵(SSF)时，糖化没有明显的保持阶段(holdingstage)，这意味着发酵生物体(如酵母)和一种或多种糖-源产生酶基本上一起加入。步骤ii)和iii)可以在28-38℃，优选29-37℃，特别是30-35℃，如约33℃的温度同步进行。在同步糖化的发酵过程中，pH可为3.0-7.0，优选3.5-6.0，并通常可以持续24-96小时。
在本发明的实施方案中，糖化和/或发酵过程中可以存在支链淀粉酶(pullulanase)。可以使用任何支链淀粉酶。在下面的“支链淀粉酶”部分可以找到预期的支链淀粉酶的实例。可以加入有效量的支链淀粉酶，包括1-100μg/g DS，特别是10-60μg/g DS。
发酵
发酵步骤包括，而不限于，使用发酵生物体产生下述物质的发酵：醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)；抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。发酵也包括用于如下工业的发酵：消费品醇工业(例如酒和啤酒)、乳制品业(例如发酵乳制品)、皮革业和烟草业。优选的发酵包括醇发酵，如本领域所熟知。优选的发酵是厌氧发酵，如本领域所熟知。
术语“发酵生物体”指适用于本发明期望发酵步骤iii)的任何生物体。根据本发明，合适的发酵生物体能够发酵，即，将优选DP1-3糖(特别如葡萄糖和麦芽糖(即糖-源))直接或间接转化为期望的发酵产物，如乙醇。
发酵生物体的实例包括真菌生物体，如酵母或丝状真菌。优选酵母包括酵母属菌种(Saccharomyces spp.)的菌株，特别是酿酒酵母。商业上可得到的酵母包括，例如，ETHANOL REDTM酵母(可从Fermentis/Lesaffre，USA获得)、FALI(可从Fleischmann’s Yeast，USA获得)、SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可从Ethanol Technology，WI，USA获得)、BIOFERM AFT和XR(可从NABC-North American Bioproducts Corporation，GA，USA获得)、GERT STRAND(可从Gert Strand AB，Sweden获得)和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。
发酵一直进行直到产生期望量的发酵产物，如乙醇。这通常意味着发酵进行24-96小时。发酵过程中的温度和pH是适于所述发酵生物体的温度和pH。例如对于酵母，温度和pH的范围是约28-38℃，优选29-37℃，特别是30-35℃，如约33℃，而pH的范围是，例如约pH 3.0-7.0，如约pH 3.5-6.0。
在实施方案中，发酵过程中加入蛋白酶和/或肌醇六磷酸酶。
对于乙醇生产优选的酵母包括，例如，毕赤酵母属(Pichia)和酵母属(Saccharomyces)。根据本发明，优选的酵母是酵母属(Saccharomyces)，特别是酿酒酵母或发面酵母(bakers yeast)。
回收
本发明的方法可任选地包含回收发酵产物，如乙醇；因此可将发酵产物例如乙醇从发酵醪液中分离并纯化。发酵后，可将发酵醪液蒸馏以提取，例如乙醇或其它液体发酵产物。例如，可以通过本发明的方法获得纯度高于92vol.-％乙醇的乙醇。
因此，在一个实施方案中，步骤iii)中的发酵和蒸馏步骤iv)可以同时和/或分别/顺序进行；任选后面是一个或多个进一步精制的处理步骤。
酶活
α-淀粉酶
可以使用任何合适的α-淀粉酶进行本发明的步骤i)。在优选实施方案中，可以使用细菌α-淀粉酶。
细菌α-淀粉酶
合适的α-淀粉酶的实例包括下述酶。步骤i)中使用的优选的细菌α-淀粉酶可以源自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌，或枯草芽孢杆菌的菌株。其它细菌α-淀粉酶包括源自芽孢杆菌属菌种NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM 9375的菌株的α-淀粉酶，其全部在WO95/26397中详细描述，和Tsukamoto等，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，151(1988)，pp.25-31描述的α-淀粉酶(通过引用并入本文)。
芽孢杆菌属α-淀粉酶还可以是变体和/或杂合体，特别是WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355中任一文件描述的(所有文献通过引用并入本文)。在美国专利号6,093,562、6,297,038或美国专利号6,187,576中(通过引用并入本文)公开了特别期望的α-淀粉酶变体，包括嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG α-淀粉酶)变体，其在R179至G182位点缺失一个或两个氨基酸，优选WO 1996/023873中公开的双缺失-参见例如第20页，第1-10行(通过引用并入本文)，与WO 99/19467中公开的SEQ ID NO：3中列出的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比，优选相当于Δ(181-182)，或使用WO 99/19467中SEQ ID NO：3的编号方式缺失氨基酸R179和G180(通过引用并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO 99/19467中公开的SEQID NO：3中列出的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比，具有相当于Δ(181-182)的双缺失，还包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
特别期望的杂合α-淀粉酶包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C末端氨基酸残基(示于WO 99/19467的SEQ ID NO：4)和源自解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的37个N末端氨基酸残基(示于WO 99/19467的SEQ ID NO：5)，具有下述取代：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467中SEQ ID NO：4的编号方式)。特别优选的是变体，其具有突变H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S中的一个或多个和/或176和179位点之间两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO99/19467中SEQ ID NO：5的编号方式)。
其它期望的细菌α-淀粉酶是EP 1,022,334中公开的KSM-K36α-淀粉酶，并将其保藏为FERM BP 6945，和EP 1,022,334中公开的KSM-K38α-淀粉酶，并将其保藏为FERM BP-6946。因此还有其它期望的变体，特别是WO02/31124中公开的变体(来自Novozymes A/S)。
商业上可得到的细菌α-淀粉酶产品和包含α-淀粉酶的产品包括TERMAMYLTM SC和LIQUOZYMETM SC、BAN(Novozymes A/S，Denmark)和DEX-LOTM、SPEZYMETM ETHYL、SPEZYMETM AA、SPEZYME FRED-L、SPEZYMETM  ALPHA、SPEZYME HPA  和SPEZYMETM DELTA AA、SPEZYMETM XTRA、GC 100(来自Genencor Int.，USA)、ULTRA-THIN(ValleyResearch，IN，USA)。
真菌α-淀粉酶
可用于本发明的方法的其它麦芽糖产生酶是真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，优选真菌酸性α-淀粉酶。
真菌酸性α-淀粉酶包括源自曲霉属菌株的酸性α-淀粉酶，如米曲霉和黑曲霉α-淀粉酶。
优选的真菌α-淀粉酶是Fungamy1-样α-淀粉酶，其优选源自米曲霉的菌株。在本公开中，术语“Fungamy1-样α-淀粉酶”表示与WO 96/23874中SEQID NO：10所示氨基酸序列的成熟部分显示高度同一性，即多于70％，多于75％，多于80％，多于85，多于90％，多于95％，多于96％，多于97％，多于98％，多于99％或者甚至100％同一性的α-淀粉酶。
其它优选酸性α-淀粉酶源自黑曲霉菌株。在优选实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶来自黑曲霉，其在Swiss-port/TeEMBL数据库中公开为“AMYA-ASPNG”，初级登录号为P56271，在WO 89/01969中更详细地进行了描述(实施例3)。酸性黑曲霉酸性α-淀粉酶也如WO 2004/080923(Novozymes)的SEQ ID NO：1所示，其通过引用并入本文。还期望所述酸性真菌淀粉酶的变体，其与WO 2004/080923中SEQ ID NO：1具有至少70％同一性，如至少80％或甚至至少90％同一性，如至少95％，至少96％，至少97％，或至少99％同一性。合适的商业上可得到的、源自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可从Novozymes A/S，Denmark获得)。
真菌酸性α-淀粉酶还可以是野生型酶，其包括糖结合模块(CBM)和α-淀粉酶催化域(即非杂合)，或其变体。在实施方案中，野生型酸性真菌α-淀粉酶源自川地曲霉(Aspergillus kawachii)的菌株。
真菌杂合α-淀粉酶
在其它期望的实施方案中，真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括WO 2005/003311或美国专利公开号2005/0054071(Novozymes)或WO 2006/069290或美国专利申请号60/638,614(Novozymes)中公开的，所述文献通过引用并入本文。杂合α-淀粉酶可以包括α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)和任选的接头。
期望的杂合α-淀粉酶的具体实例包括在WO 2006/059290或美国专利申请号60/638,614中公开的那些，其包括具有催化域JA118的Fungamy1变体和Athelia rolfsii SBD(WO 2006/069290或US 60/638,614中的SEQ ID NO：100)、带有Athelia rolfsii AMG接头和SBD的微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)α-淀粉酶(WO 2006/069290或US 60/638,614中的SEQ ID NO：101)，和带有Atheliarolfsii葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌(Meripilus giganteus)α-淀粉酶(WO2006/069290或US 60/638,614中的SEQ ID NO：102)。其它期望的实例是带有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的杂合微小根毛霉α-淀粉酶(其在美国专利申请号11/316,535或WO 2006/069290中以氨基酸序列SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：72和SEQ ID NO：96的组合形式，于表5中作为V039公开)。其它特别期望的杂合α-淀粉酶是美国专利申请号11/316,535或WO 2006/0692890(通过引用并入本文)中实施例4的表3、4、5和6中所列出的任一种。
期望的杂合α-淀粉酶的更多具体实例是在美国专利公开号2005/0054071中公开的那些，包括15页表3中公开的那些，如带有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
商业上可得到的包含真菌α-淀粉酶的组合物包括FUNGAMYLTM和以商标名SP288出售的的酸性真菌α-淀粉酶(可从Novozymes A/S，Denmark获得)。
糖-源产生酶
根据本发明，使用一种或多种糖-源产生酶将液化的含淀粉材料糖化。术语“糖-源产生酶”包括葡糖淀粉酶(作为葡萄糖产生者)、β-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶(作为麦芽糖产生者)。糖-源产生酶能够向本发明的方法中使用的发酵生物体提供能量，以产生期望的发酵产物。产生的糖类可以直接或间接转化成期望的发酵产物。糖-源产生酶可以是落入所述定义中酶的混合物。特别期望的组合物是至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的混合物，所述α-淀粉酶优选酸性α-淀粉酶，特别是真菌酸性α-淀粉酶(参见上面的“真菌α-淀粉酶”部分)。在优选实施方案中，真菌酸性α-淀粉酶活性(AFAU)与葡糖淀粉酶活性(AGU)之间的比值(AFAU/AGU)为至少0.1，特别为至少0.16，如在0.12-0.50的范围内或者甚至更高。
期望的葡糖淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、β-淀粉酶和真菌α-淀粉酶的实例在下面的部分中列出。
葡糖淀粉酶
根据本发明使用的葡糖淀粉酶可以源自任何合适的来源，例如，源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，具体为黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或其变体，如WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273(来自Novozymes，Denmark)所公开的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)、米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或其变体或片段。
其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等(1996)，Prot.Eng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等(1995)，Prot.Engng.8，575-582)；N182(Chen等(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等(1996)，Biochemistry，35，8698-8704)；和在A435和S436位引入Pro残基(Li等(1997)，Protein Engng.10，1199-1204)。其它葡糖淀粉酶包括Athelia rolfsii(先前称为Corticium rolfsii)葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka，Y.等(1998)Purification and properties of theraw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii，Appl MicrobiolBiotechnol 50：323-330)；踝节菌属葡糖淀粉酶，特别地，源自Talaromycesemersonii (WO 99/28448)；Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32,153)；Talaromyces duponti和Talaromyces thermophilus葡糖淀粉酶(美国专利号4,587,215)。期望的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭状芽孢杆菌属(Clostridium)，特别是嗜热解淀粉梭状芽孢杆菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶还可以来自栓菌属(genus Trametes)的菌株，优选源自Trametescingulata的菌株(如WO 2006/069289的权利要求1中所公开和限定)；或刺孢孔菌属(genus Pachykytospora)，优选源自纸质刺孢孔菌(Pachykytosporapapyracea)的菌株(如WO 2006/069289的权利要求2中所公开和限定-通过引用并入本文)。其它期望的实例是WO 2006/060062(通过引用并入本文)中作为SEQ ID NO：4公开的里氏木霉葡糖淀粉酶和与其至少80％，优选至少90％同一的其它葡糖淀粉酶，和其它源自US 10/992,187(通过引用并入本文)中作为SEQ ID NO：3公开的灰色腐质霉(Humicola grisea)的葡糖淀粉酶，或与其具有至少80％，优选至少90％同一性的序列。
商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER、SANTM EXTRA L、SPIRIZYMETM PLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETM B4U和AMGTM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM300(来自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900、G-ZYMETM和G990ZR、G-ZYMETM 480Ethanol、FERMENZYMETM L400、FERMENZYMETM C、DISTILLASETM L-400和L-500(来自Genencor Int.)。
产麦芽糖淀粉酶
产麦芽糖淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶)是能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α-构型的麦芽糖。此外，产麦芽糖淀粉酶能够水解麦芽三糖和环糊精。特别期望的产麦芽糖淀粉酶可源自芽孢杆菌属菌种，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，最优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌C599，如EP 120.693中所述。这一特殊的产麦芽糖淀粉酶具有美国专利6,162,628中SEQ ID NO：1的氨基酸1-686所示的氨基酸序列。优选的产麦芽糖淀粉酶与美国专利号6,162,628中SEQ ID NO：1的氨基酸1-686具有至少70％同一性，优选至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或特别地至少99％同一性。在WO 99/43794(通过引用并入本文)中公开了产麦芽糖淀粉酶的最优选的变体。
β-淀粉酶
用于本发明的方法的其它麦芽糖产生酶是β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)。β-淀粉酶通常用于命名外作用(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1，4-α-葡萄糖苷键的水解。
已经从各种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(W.M.Fogarty and C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，vol.15，pp.112-115，1979)。通过在40℃到65℃的范围具有最适温度和在4.5到7.0的范围具有最适pH来表征这些β-淀粉酶。优选的β-淀粉酶源自丝状真菌，如源自Rhizomucor pusilis的β-淀粉酶。
期望的β-淀粉酶包括来自大麦的β-淀粉酶：来自Genencor Int.的OPTIMALTTM BBA、
Figure A20068003471900191
BBA 1500、DBA和OPTIMALTTM ME以及来自Novozymes A/S的NOVOZYMTM WBA。
支链淀粉酶
支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖-水解酶)，是去分支酶，其特征在于它们水解例如支链淀粉(amylpectin)和支链淀粉(pullulan)中α-1，6-糖苷键的能力。
根据本发明特别期望的支链淀粉酶包括来自美国专利号4,560,651(通过引用并入本文)中公开的Bacillus amyloderamificans的支链淀粉酶、WO01/151620中作为SEQ ID NO：2公开的支链淀粉酶(通过引用并入本文)、WO01/151620中作为SEQ ID NO：4和在美国专利号5,736,375中作为SEQ ID NO：11公开的Bacillus deramificans(通过引用并入本文)，和来自WO 01/151620中作为SEQ ID NO：6公开的Bacillus acidopullulyticus的支链淀粉酶(通过引入并入本文)，其还在FEMS Mic.Let.(1994)115，97-106中有描述。
可以根据本发明以有效量加入支链淀粉酶，所述有效量包括1-100μg/gDS，特别是10-60μg/g DS的优选范围。可将支链淀粉酶活性测定为NPUN。在下面的“材料与方法”部分描述了测定NPUN的实验。
商业上可得到的合适的支链淀粉酶产品包括PROMOZYME D，PROMOZYMETM D2(Novozymes A/S，Denmark)、OPTIMAX L-300(GenencorInt.，USA)和AMANO 8(Amano，Japan)。
蛋白酶
根据本发明的方法，在发酵或SSF过程中可以存在蛋白酶。蛋白酶在本领域众所周知，指催化肽键切割的酶。合适的蛋白酶包括真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，通过在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。合适的酸性真菌蛋白酶包括源自曲霉属(Asperigillus)、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、念珠菌属(Candida)、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、Enthomophtra、耙菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、小核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的蛋白酶。特别期望的是源自如下的蛋白酶：黑曲霉(参见，例如，Koaze等，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)、Aspergillus saitoi(参见，例如，Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)、泡盛曲霉(Hayashida等，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)、棘孢曲霉(WO 95/02044)或米曲霉；和来自微小毛霉或米黑毛霉的酸性蛋白酶。
商业的蛋白酶包括GC 106和SPEZYME FAN和FERMGENTM(可从Genencor，USA获得)。合适的细菌蛋白酶(尽管不是酸性蛋白酶)包括商业上可得到的产品
Figure A20068003471900211
和
Figure A20068003471900212
(可从Novozymes A/S获得)。
优选地，蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，例如，如Handbook of ProteolyticEnzymes，Edited by A.J.Barrett，N.D.Rawlings and J.F.Woessner，Academic Press，San Diego，1998，Chapter 270所述。天冬氨酸蛋白酶合适的实例包括，例如，R.M.Berka等Gene，96，313(1990))；(R.M.Berka等Gene，125，195-198(1993))；和Gomi等Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100(1993)中公开的那些，上述文献通过引用并入本文。
可优选以10-7至10-5g活性蛋白酶蛋白质/gDS含淀粉材料，特别是10-7至5×10-6g活性蛋白酶蛋白质/gDS含淀粉材料的量加入蛋白酶。
本文描述和要求保护的发明并不局限于本文具体实施方案公开的范围，因为这些实施方案旨在阐述本发明的几个方面。任何等同的实施方案都意欲包含于本发明的范围内。实际上，从前述说明，在本文所示和所述的那些实施方案之外对本发明的各种修正，对本领域的技术人员是显而易见的。这样的修正也意欲落入所附权利要求的范围内。在发生抵触的情况下，以包括定义的本公开为准。本文引用了各种文献，通过引用将这些文献的公开整体并入本文。进一步通过下述实施例描述本发明，所述实施例不应看作是对本发明范围的限制。
材料与方法
酶：
α-淀粉酶(AA)：美国专利号6,187,576中公开的具有下述突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体：I181*+G182*+N193F，其可根据要求从NovozymesA/S，Denmark获得。
葡糖淀粉酶(GA)：WO 99/28448中作为SEQ ID NO：7公开的Talaromycesemersonii葡糖淀粉酶，其具有黑曲霉葡糖淀粉酶和黑曲霉酸性α-淀粉酶的辅助活性(side activity)。
其它材料
酵母：ETHANOL REDTM酵母(可从Fermentis/Lesaffre，USA获得)LACTOSIDETM，可从Ethanol Technology，WI，USA获得
回流(或稀釜馏物)：包含可溶性副产物的酸性液体(pH 3.5-4.5)，其源自全部乙醇产生过程并包括一些未转化玉米固体，如5-7％低浓度的干物质(DS)连同其它组分，如糖、盐、金属、蛋白质、有机酸和来自裂解的酵母细胞的胞内材料。
同一性的确定
通过GCG软件包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)中提供的计算机程序GAP确定两个氨基酸序列之间的同一性程度(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)。下述设定用于多肽序列比较：GAP产生罚分3.0和GAP延伸罚分0.1。
使用KONELAB 30 ANALYZER确定KNU(S)
样品中的BS-淀粉酶和试剂盒中的酶α-葡萄糖苷酶将底物(4，6-亚乙基(G7)-p-硝基苯基(G1)-α-D-麦芽庚糖苷(4，6-ethylidene(G7)-p-nitropheny1(G1)-alpha-D-maltoheptaoside)(亚乙基-G7PNP))水解成葡萄糖和黄色的p-硝基苯酚。
可以通过Konelab 30观察形成p-硝基苯酚的速率。以此来表示反应速率并由此表示酶活。
反应条件
反应：
pH：7.15
温度：37℃
反应时间：180秒
检测
波长：405nm
测定时间：120秒
单位定义
以KNU(S)，即千Novo单位(嗜热脂肪)测定嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶(BS-淀粉酶)相对于已知强度的酶标准物的活性。
在根据要求可从Novozymes A/S，Denmark获得的EB-SM-0221.02中更详细地描述了这种分析方法。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
将Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量，所述标准条件为37℃、pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸0.1M，反应时间5分钟。
可以使用自动分析系统。向葡萄糖脱氢酶试剂中加入变旋酶(mutarotase)，以将存在的任何α-D-葡萄糖转变成β-D-葡萄糖。在上述反应中，葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖反应形成NADH，使用光度计在340nm处测定形成的NADH，作为起始葡萄糖浓度的量度。
  AMG培育：
  底物：   麦芽糖23.2mM
  缓冲液：   乙酸/乙酸盐(acetate)0.1M
  pH：   4.30±0.05
  培育温度：   37℃±1
  反应时间：   5分钟
  酶的作用范围：   0.5-4.0AGU/mL
  颜色反应：
  GlucDH：   430U/L
  变旋酶：   9U/L
  NAD：   0.21mM
  缓冲液：   磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
  pH：   7.60±0.05
  培育温度：   37℃±1
  反应时间：   5分钟
  波长：   340nm
更详细描述这种分析方法的文件夹(EB-SM-0309.02/01)可根据要求从Novozymes A/S，Denmark获得，所述文件夹通过引用并入本文。
FAU活性的确定
将一个真菌α-淀粉酶单位(FAU)定义为基于下述标准条件每小时分解5.26g淀粉(Merck Amylum solubile Erg.B.6，批号9947275)的酶量。
底物       可溶性淀粉
温度       37℃
pH         4.7
反应时间   7-20分钟
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)的确定
酸性α-淀粉酶活性以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测定，其相对于酶标准物确定。
使用的标准物是AMG 300L(来自Novozymes A/S，葡糖淀粉酶野生型黑曲霉G1，也在Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)和WO 92/00381中公开)。在室温储存3周后，此AMG中的中性α-淀粉酶活性从约1FAU/mL降至低于0.05FAU/mL。
此AMG标准物中的酸性α-淀粉酶活性根据下述说明测定。在这种方法中，将1AFAU定义为在标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
碘与淀粉而不是与其降解产物形成蓝色复合物。因此颜色的强度与淀粉浓度成正比。使用反向比色法将淀粉酶活性测定为在指定的分析条件下淀粉浓度的减少。
             α-淀粉酶
淀粉+碘      →          糊精+寡糖
             40℃，pH 2.5
蓝/紫        t＝23秒     脱色
标准条件/反应条件：(每分钟)
底物：      淀粉，大约0.17g/L
缓冲液：    柠檬酸盐(citate)，大约0.03M
碘(I2)：    0.03g/L
CaCl2：     1.85mM
pH：        2.50±0.05
培育温度：  40℃
反应时间：  23秒
波长：         波长＝590nm
酶浓度：       0.025AFAU/mL
酶的作用范围： 0.01-0.04AFAU/mL
如果需要更多的细节，它们可以在根据要求可从Novozymes A/S获得的EB-SM-0259.02/01中找到，并通过引用并入本文。
产麦芽糖淀粉酶活性(MANU)的测定
可将一个MANU(麦芽糖淀粉酶Novo单位)定义为在底物麦芽三糖(Sigma M 8378)浓度为10mg/ml的0.1M柠檬酸缓冲液，pH 5.0，于37℃培育30分钟，每分钟释放一微摩尔麦芽糖所需的酶量。
支链淀粉酶活性(NPUN)的确定
相对于Novozymes的支链淀粉酶标准品测定以NPUN表示的内切支链淀粉酶活性。将一个支链淀粉酶单位(NPUN)定义为在标准条件下(0.7％红支链淀粉(red pullulan)(Megazyme)，pH 5，40℃，20分钟)每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。使用红支链淀粉以NPUN/ml测定活性。
将1ml稀释样品或标准品在40℃温育2分钟。加入0.5ml 2％红支链淀粉、0.5M KCl、50mM柠檬酸，pH 5并混合。试管在40℃温育20分钟，并通过加入2.5ml 80％乙醇而终止。将试管于室温静置10-60分钟，然后于4000rpm离心10分钟。在510nm处测定上清的OD，使用标准曲线计算活性。
葡萄糖当量(DE)的确定(费林滴定法)：
葡萄糖当量(DE)是淀粉(具体为整粒玉米)水解程度的量度。用于测定该量的费林滴定试验是基于在还原糖存在时，铜离子还原成亚铜离子。然后过量的铜离子将酸性介质中的碘离子还原，形成三碘离子。用标准化的硫代硫酸钠溶液滴定三碘离子。然后将未知样品的滴定量(titer)与对1.0％w/v葡萄糖溶液滴定获得的结果和只存在蒸馏水或反渗透水(零还原糖)的滴定结果进行比较，以计算相对值。
实施例
实施例1
从修正的淀粉酶剂量组合得到的乙醇得率
为了研究各种α-淀粉酶和葡糖淀粉酶剂量组合的效果，使用下述实验设计进行液化和同时糖化和发酵(SSF)实验。
表1.用于液化和SSF的实验设计
对于每个处理，n＝9(共81批发酵)
Figure A20068003471900261
由干磨的玉米粉、工艺回流和自来水产生32wt.-％DS(干物质)浆料。使用5N NaOH和1N HCl将pH调至5.89。浆料以等量分配于3个2L液化容器中，并配入相应量的α-淀粉酶(AA)。将容器放置于设为86℃的水浴中(相当于85℃的醪液温度)。每种处理的液化在搅拌下进行90分钟。完成后，立即将每个容器置于冰水浴中，使其冷却至室温。向每个容器中加入2ppmLACTOSIDETM (抗生素)和1,000ppm尿素并彻底混合。通过加入自来水将干物质水平调整至30.9％DS，使用前面所述费林滴定法获得最终的DE值(数值见表1)。
将液化产物(liquefact)转移至用于SSF阶段的50ml聚苯乙烯试管中，达到约14g醪液/试管。用21号规格针(21gauge needle)刺破螺帽使CO2逸出。对于每个液化处理(n＝3)，评价了三种剂量水平的葡糖淀粉酶(GA)(0.244、0.371和0.489AGU/g干燥固体(DS)玉米)。在每支试管中配入再水化的ETHANOL REDTM酵母，达到3.0×107活细胞/ml醪液。将试管涡漩振荡、称重，并置于33℃水浴中。通过定期称重试管和记录CO2重量减少来监控发酵过程。在每次称重前简单漩涡振荡试管。由CO2重量减少的读数，使用下述公式计算乙醇得率(g乙醇/gDS)(数据未显示)：
在表2中，以斜体表示的信息对应常规的α-淀粉酶剂量组合(基准)，以粗体表示的信息表示所有导致最终乙醇浓度在统计学上高于基准的剂量组合(α＝0.05)，而以粗斜体表示的信息表示导致乙醇浓度在统计学上等同于基准的组合(α＝0.05)。
表2.对最终乙醇浓度的72-小时HPLC分析
对于每个处理，n＝3。
数据说明单独增加AA剂量和/或同时降低GA剂量的优势。在最高的AA剂量(0.126KNU(S)/g DS玉米)观察到最明显的益处，因为看起来有相当大范围的GA剂量都产生高于常规组合的乙醇浓度。或者，可通过仅仅降低GA剂量，或通过略微增加AA剂量同时降低GA剂量而可能获得等同的乙醇水平。
实施例2
增加的发酵动力学
为了研究各种α-淀粉酶和葡糖淀粉酶剂量组合对发酵速率的影响，使用下述实验设计进行液化和同时糖化和发酵(SSF)实验：
表3.用于液化和SSF的实验设计
对于每个处理，n＝9
液化处理   AA剂量(KNU(S)/gDS玉米)   液化醪液温度(℃)   液化时间(分)   GA剂量(AGU/g DS玉米)   SSF温度(℃)   SSF时间(小时)
  液化1DE＝14.5 0.047 85 90 0.489 33 72
  液化2DE＝17.5 0.094 85 90 0.489 33 72
由干磨的玉米粉、工艺回流和自来水产生33wt.-％DS(干物质)浆料。使用5N NaOH和1N HCl将pH调至约5.8。浆料以等量分配于2L液化容器中，并配入相应量的α-淀粉酶(AA)处理。容器放置于设为86℃的水浴中(相当于85℃的醪液温度)。每种处理的液化在搅拌下进行90分钟。完成后，将每个容器立即置于冰水浴中，并使其冷却至室温。向每个容器中加入2ppmLACTOSIDETM(抗生素)和1,000ppm尿素并彻底混合。进入发酵的干物质水平为35.2％DS，使用前面所述费林滴定法获得最终的DE值(DE值见表2)。
然后将液化产物转移至用于SSF阶段的50ml聚苯乙烯试管，达到约14g醪液/试管。用21号规格针刺破螺帽使CO2泄漏。整个SSF过程将针留在螺帽中。对于每个液化处理(n＝3)，葡糖淀粉酶(GA)的剂量为0.489AGU/g干燥固体(DS)玉米。在每支试管中配入再水化的ETHANOL REDTM酵母，达到3.0×107活细胞/ml醪液。将试管漩涡振荡、称重，并置于33℃水浴中。通过定期称重试管和记录CO2重量减少来监控发酵过程。在每次称重前简单漩涡振荡试管。由CO2重量减少的读数，使用下述公式计算乙醇得率(g乙醇/g DS)(数据未显示)：
在图1中显示了发酵过程中的发酵动力学。可以看出在发酵的前24小时中发酵动力学稍快。在24小时之后，高DE醪液(17.5)的发酵速率明显增加，并导致平均乙醇得率比较低DE醪液(14.5)高5.2％。
实施例3
高剂量α-淀粉酶的DE
进行本实验以研究在高剂量α-淀粉酶时葡萄糖当量(DE)的影响。
由干磨的玉米粉、工艺回流和自来水产生32wt.-％DS(干物质)浆料，如实施例1。使用5N NaOH和1N HCl将pH调至约5.7。将浆料加入2L液化容器并置于水浴中。加入0.062KNU(S)/g DS的α-淀粉酶(AA)。醪液温度测定为84℃。液化最初在搅拌下进行150分钟。150分钟后加入2.50KNU(S)/gDS，继续再液化180分钟(即，总共330分钟)。在液化过程中，使用“材料与方法”部分所述的“费林滴定法”测定DE。
如从图2可以看出，实验显示在最初的150分钟之后DE为约15。在重新配入α-淀粉酶后，DE增加并在330分钟后达到约28的DE值。

Claims (34)

1.从含淀粉材料产生发酵产物的方法，该方法包括：
i)用剂量为0.05-2.6KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化含淀粉材料，
ii)用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.20-1.00AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromycesemersonii葡糖淀粉酶，和
iii)在发酵生物体存在的情况下发酵。
2.权利要求1的方法，其中在步骤i)中用剂量为0.2-2.6KNU(S)/g DS，优选0.5-2.6KNU(S)/g DS含淀粉材料的α-淀粉酶液化含淀粉材料，然后用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.20-0.50AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶。
3.权利要求1或2的方法，所述方法包括：
i)用剂量为0.070-0.50KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化含淀粉材料，
ii)用糖源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，酶的作用剂量相当于0.20-1.00AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶，和
iii)在发酵生物体存在的情况下发酵。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在步骤i)中用剂量为0.080-0.40KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化含淀粉材料，然后用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.20-0.50AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中在步骤i)中用剂量为0.080-0.40KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化含淀粉材料，然后用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.20-0.40AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶。
6.权利要求1-5中任一项的方法，所述方法包括：
i)用剂量为0.050-0.50KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化含淀粉材料，
ii)用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.020-0.40AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromycesemersonii葡糖淀粉酶，和
iii)在发酵生物体存在的情况下发酵。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中在步骤i)中用剂量为0.080-0.30KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化含淀粉材料，然后用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.20-0.40AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中在步骤i)中用剂量为0.050-0.080KNU(S)/g干燥固体含淀粉材料的α-淀粉酶液化含淀粉材料，然后用糖-源产生酶糖化步骤i)中获得的含淀粉材料，所述糖-源产生酶的作用剂量相当于0.30-0.40AGU/g干燥固体含淀粉材料的Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述发酵产物是乙醇。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中步骤i)中的DE值范围为13-30，优选14-25，更优选17-30，更优选18-30，更优选19-30，特别是20-30。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中在发酵后回收发酵产物，优选通过蒸馏回收。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中步骤i)在约60-100℃，优选70-90℃的温度进行10-120分钟，优选15-120分钟。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中将含淀粉材料加热至起始糊化温度以上。
14.权利要求1-13中任一项的方法，在步骤i)之前还包括如下步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度；
y)形成包含材料和水或工艺水的浆料。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中将含淀粉材料的粒度减小，优选通过碾磨进行。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中将含淀粉材料进行干磨。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中在步骤i)之前将粒度减小的含淀粉材料在60-140℃，优选90-120℃，优选约105℃的温度喷射蒸煮1-15分钟，优选3-10分钟，特别约5分钟。
18.权利要求1-17的任一项的方法，其中步骤i)中的α-淀粉酶是细菌来源，优选芽孢杆菌α-淀粉酶，特别是源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶或具有下述突变的变体：I181*+G182*，特别是I181*+G182*+N193F。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中步骤i)在4.0-7.0，优选5-6.0的pH进行。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中步骤ii)中的糖化和步骤iii)中的发酵顺序进行或同时进行(SSF)。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中步骤ii)和iii)中的糖化和发酵在28-38℃，优选29-37℃，特别是30-35℃，如约33℃的温度同时进行。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中步骤ii)和iii)中的糖化和发酵在3.0-7.0，优选3.5-6.0的pH同时进行。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中步骤ii)和iii)中的糖化和发酵顺序进行，且步骤ii)中的糖化在约30-70℃进行1-96小时。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中步骤ii)和iii)中的糖化和发酵顺序进行，且步骤iii)中的发酵在28-38℃，优选29-37℃，特别是30-35℃，如33℃的温度进行。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中步骤ii)和iii)中的糖化和发酵顺序进行，且步骤ii)中的糖化在3.0-7.0，优选3.5-6.0的pH进行。
26.权利要求1-24中任一项的方法，其中步骤ii)和iii)中的糖化和发酵顺序进行，且步骤iii)中的发酵在3.0-7.0，优选3.5-6.0的pH进行。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中糖-源产生酶选自由葡萄糖产生酶和麦芽糖产生酶组成的组。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中糖-源产生酶是葡糖淀粉酶，其优选源自真菌曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉，踝节菌属的菌株，优选特别是源自Talaromyces emersonii、Talaromyces leycettanus、Talaromyces duponti或Talaromyces thermopiles的菌株；或Athelia属的菌株，优选源自Athelia rolfsii的菌株；或栓菌属的菌株，优选源自Trametes cingulata。
29.权利要求1-28的方法，其中糖-源产生酶是产麦芽糖淀粉酶或β-淀粉酶。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中含淀粉材料选自下组：块茎、根和整粒；或其任何组合。
31.权利要求1-30中任一项的方法，其中含淀粉材料选自下组：玉米(玉蜀黍)、小麦、大麦、黑麦、高粱、木薯和马铃薯；或其任何组合。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中步骤iii)中使用的发酵生物体是酵母，如酵母属，特别是酿酒酵母。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中在步骤ii)的糖化过程中存在支链淀粉酶。
34.权利要求1-33中任一项的方法，其中加入有效量的支链淀粉酶，包括1-100μg/g DS，特别是10-60μg/g DS。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286544A (zh) * 2011-07-14 2011-12-21 中国科学院广州能源研究所 一种淀粉基燃料乙醇的清洁生产方法
CN106213496A (zh) * 2016-07-27 2016-12-14 廖兴旺 一种银杏酵素发酵生产工艺
CN108239662A (zh) * 2016-12-27 2018-07-03 中国石油天然气股份有限公司 一种木薯渣发酵生产乙醇的方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1604019B1 (en) 2003-03-10 2010-01-06 Novozymes A/S Alcohol product processes
US20110097779A1 (en) * 2008-06-23 2011-04-28 Chee-Leong Soong Processes for Producing Fermentation Products
CA2886578A1 (en) * 2012-10-10 2014-04-17 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from talaromyces emersonii for saccharification
CN107653287B (zh) * 2017-10-31 2020-10-02 新疆浙大阳光生物科技有限公司 一种硫酸粘菌素的改良发酵方法
CN110184196B (zh) * 2019-05-09 2023-04-21 慕恩（广州）生物科技有限公司 一种篮状菌及其应用
WO2021104672A1 (en) 2019-11-29 2021-06-03 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Yeast expressing heterologous glucoamylase

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5534046A (en) 1978-09-01 1980-03-10 Cpc International Inc Novel glucoamyrase having excellent heat resistance and production
US4316956A (en) * 1980-02-06 1982-02-23 Novo Industri A/S Fermentation process
CA1143677A (en) 1980-04-15 1983-03-29 Lidia S. Losyakova Process for producing ethyl alcohol from amylaceous raw stock
US4560651A (en) 1981-04-20 1985-12-24 Novo Industri A/S Debranching enzyme product, preparation and use thereof
NO840200L (no) 1983-01-28 1984-07-30 Cefus Corp Glukoamylase cdna.
US4536477A (en) 1983-08-17 1985-08-20 Cpc International Inc. Thermostable glucoamylase and method for its production
US4587215A (en) 1984-06-25 1986-05-06 Uop Inc. Highly thermostable amyloglucosidase
US4628031A (en) 1984-09-18 1986-12-09 Michigan Biotechnology Institute Thermostable starch converting enzymes
JPS62126989A (ja) 1985-11-26 1987-06-09 Godo Shiyusei Kk コルテイシウム属担子菌の生産する酵素を用いた澱粉質の無蒸煮糖化法
JP2703598B2 (ja) 1987-09-04 1998-01-26 ノボ―ノルディスク アクティーゼルスカブ アスペルギルス菌中でのタンパク質生産物の生産方法およびアスペルギルス菌中で使用するためのプロモーター
US5162210A (en) 1990-06-29 1992-11-10 Iowa State University Research Foundation Process for enzymatic hydrolysis of starch to glucose
US5231017A (en) 1991-05-17 1993-07-27 Solvay Enzymes, Inc. Process for producing ethanol
DK0605040T3 (da) 1992-12-28 2000-03-13 Genencor Int Pullulanase, mikroorganismer producerende denne fremgangsmåde il fremstilling af denne pullulanase og anvendelse deraf
DK81193D0 (da) 1993-07-06 1993-07-06 Novo Nordisk As Enzym
DK131193D0 (zh) * 1993-11-23 1993-11-23 Novo Nordisk As
ES2250969T3 (es) 1994-03-29 2006-04-16 Novozymes A/S Amilasa alcalina de bacilo.
CA2211316C (en) 1995-02-03 2013-10-01 Novo Nordisk A/S Method of designing alpha-amylase mutants with predetermined properties
US6093562A (en) 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
AU2692897A (en) 1996-04-30 1997-11-19 Novo Nordisk A/S Alpha-amylase mutants
WO1999019467A1 (en) 1997-10-13 1999-04-22 Novo Nordisk A/S α-AMYLASE MUTANTS
DE69840512D1 (en) 1997-11-26 2009-03-12 Novozymes As Thermostabile glukoamylase
AU4769999A (en) 1998-07-15 2000-02-07 Novozymes A/S Glucoamylase variants
US6403355B1 (en) 1998-12-21 2002-06-11 Kao Corporation Amylases
JP4668426B2 (ja) 1999-03-30 2011-04-13 ノボザイムス アクティーゼルスカブ α−アミラーゼ変異体
AU5805700A (en) 1999-07-09 2001-01-30 Novozymes A/S Glucoamylase variant
WO2001051620A2 (en) 2000-01-12 2001-07-19 Novozymes A/S Pullulanase variants and methods for preparing such variants with predetermined properties
WO2001062947A1 (en) 2000-02-23 2001-08-30 Novozymes A/S Fermentation with a phytase
US20020006647A1 (en) * 2000-02-23 2002-01-17 Novozymes A/S Fermentation with a phytase
EP2308979A3 (en) 2000-08-01 2011-05-04 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants with altered properties
WO2002031124A2 (en) 2000-10-13 2002-04-18 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
AU2002213841A1 (en) 2000-11-10 2002-05-21 Novozymes A/S Secondary liquefaction of starch in ethanol production
WO2002074895A2 (en) 2001-03-19 2002-09-26 Novozymes A/S Fermentation process including the use of enzymes
US20040063184A1 (en) 2002-09-26 2004-04-01 Novozymes North America, Inc. Fermentation processes and compositions
EP1604019B1 (en) 2003-03-10 2010-01-06 Novozymes A/S Alcohol product processes
EP1633878A1 (en) 2003-05-30 2006-03-15 Novozymes A/S Alcohol product processes
ES2383366T3 (es) 2003-06-25 2012-06-20 Novozymes A/S Enzimas para el tratamiento de almidón
JP2007526748A (ja) 2003-06-25 2007-09-20 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 澱粉加工用酵素
US20070190620A1 (en) 2003-07-23 2007-08-16 Novozymes North America, Inc. Saccharification processes
WO2006060062A2 (en) 2004-11-30 2006-06-08 Genencor International, Inc. Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof
EP1820129A1 (en) 2004-12-01 2007-08-22 Koninklijke Philips Electronics N.V. Activity-related document management
AU2005319073B2 (en) 2004-12-22 2011-03-17 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
US7820419B2 (en) 2005-02-07 2010-10-26 Novozymes North America Inc. Fermentation product production processes

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286544A (zh) * 2011-07-14 2011-12-21 中国科学院广州能源研究所 一种淀粉基燃料乙醇的清洁生产方法
CN102286544B (zh) * 2011-07-14 2016-03-02 中国科学院广州能源研究所 一种淀粉基燃料乙醇的清洁生产方法
CN106213496A (zh) * 2016-07-27 2016-12-14 廖兴旺 一种银杏酵素发酵生产工艺
CN108239662A (zh) * 2016-12-27 2018-07-03 中国石油天然气股份有限公司 一种木薯渣发酵生产乙醇的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1941049A2 (en) 2008-07-09
US20080268512A1 (en) 2008-10-30
US8216817B2 (en) 2012-07-10
WO2007035730A3 (en) 2007-11-15
WO2007035730A2 (en) 2007-03-29
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