CN102939386A

CN102939386A - 产生发酵产物的方法

Info

Publication number: CN102939386A
Application number: CN2011800293628A
Authority: CN
Inventors: R·戴恩哈默; G·科沃德-凯利; 李明; 段俊欣; 刘铮; 福山志朗; 绫部圭
Original assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes North America Inc
Current assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes North America Inc
Priority date: 2010-04-14
Filing date: 2011-04-13
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2031-04-13
Also published as: CN102939386B

Abstract

本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其中使用热稳定性糖源生成酶在发酵或SSF之前将液化醪糖化或预糖化。

Description

产生发酵产物的方法

发明领域

本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法。

发明背景

从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇在本领域是公知的。工业上，目前主要使用两种不同种类的方法。最常用的方法，通常称作“常规方法”，包括在高温使用细菌α-淀粉酶液化经糊化的淀粉，然后在葡糖淀粉酶和发酵生物的存在下进行同时糖化和发酵。另一种通常称作“生淀粉水解”方法(“RSH”方法)的公知的方法类型包括在起始糊化温度之下在酸性真菌α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的存在下同时糖化和发酵粒状淀粉。

尽管在过去十年间对于发酵产物产生方法的显著改进，仍有显著量的残余淀粉材料未转化为所需的发酵产物如乙醇。至少一些未转化的残余淀粉材料，例如糖和糊精，以无法发酵的Maillard产物的形式存在。

因此，仍有下述期望和需求：即提供从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇的方法，其可与常规方法相比提供更高的发酵产物收率。

发明内容

本发明涉及使用发酵生物从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇的方法。

在本发明的第一个方面，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇的方法，其包括下述步骤：

i)使用α-淀粉酶液化含淀粉材料；

ii)使用糖源生成酶糖化，其中所述糖源生成酶在70℃，pH 5.3具有至少70%相对活性的热稳定性(如实施例4中所述确定的)；

iii)使用发酵生物发酵。

在一个实施方案中，添加至步骤ii)的糖源生成酶是葡糖淀粉酶，如本文中的SEQ ID NO:9或PCT/CN10/071753中作为SEQ ID NO:2公开的草酸青霉(Penicillium oxalicum)葡糖淀粉酶。

发明详述

本发明人发现，本发明的方法相对于常规方法具有多种优点。如例如实施例5中所示，在方法中将在70℃，pH 5.3具有至少70%相对活性的热稳定性(如实施例4中所述确定)的葡糖淀粉酶如草酸青霉葡糖淀粉酶在预糖化(pH 5.0，70℃)过程中添加，与在液化(pH 4.5，85℃)过程中添加相同葡糖淀粉酶相比，导致更高的葡萄糖水平。当将相同的葡糖淀粉酶在液化过程中添加时，当不在发酵过程额外添加葡糖淀粉酶时，其性能不佳，导致显著较低的发酵速率和较低的乙醇效价。然而，当在预糖化过程中添加葡糖淀粉酶时，则当不在发酵过程额外添加葡糖淀粉酶时，其仍性能良好，具有降低所需的酶蛋白的潜力。此外，由于所用的酶的较高热稳定性，可减少酶剂量。本发明的方法仅需要对现存方法和方法设备进行有限的改变，因此仅需有限的资本投资。

在第一个方面本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇的方法，其包括下述步骤：

i)使用α-淀粉酶液化含淀粉材料；

ii)使用糖源生成酶糖化，其中所述糖源生成酶在70℃，pH 5.3具有至少70%相对活性的热稳定性(如实施例4中所述确定)；

iii)使用发酵生物发酵。

液化步骤i)

液化步骤i)可在本领域公知的条件下在α-淀粉酶的存在下进行。

在一个实施方案中，本发明的方法在液化步骤i)之前，进一步包括下述步骤：

a)减少含淀粉材料的粒度；

b)形成包含所述含淀粉材料和水的浆料。

含淀粉起始材料，如全谷粒，可通过磨制减少粒径，以打开其结构，并允许进一步加工。通常有两种类型的磨制方法：湿磨和干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨给出胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并通常用于使用淀粉水解物产生例如糖浆的场合。干磨和湿磨在本领域是公知的。根据本发明，优选干磨。在一个实施方案中，将粒径减少至0.05至3.0mm，优选0.1至0.5mm，或使得至少30%，优选至少50%，更优选至少70%，甚至更优选90%的含淀粉材料可穿过具有0.05至3.0mm筛网，优选0.1至0.5mm筛网的筛。在另一个实施方案中，至少50%，优选至少70%，更优选至少80%，特别是至少90%的含淀粉材料通过具有#6-8筛网的筛。

水性浆料可含有10至55w/w%干固形物(DS)，优选25至45w/w%干固形物(DS)，更优选30至40w/w%干固形物(DS)的含淀粉材料。

将浆料加热至糊化温度以上。在一个实施方案中，将浆料加热至糊化温度以上，优选至80至90℃，pH 4.5-4.8进行15至60分钟。

在一个实施方案中，在步骤i)之前将浆料在95至140℃，优选105至125℃的温度喷射蒸煮1-15分钟，优选3-10分钟，特别是约5分钟。

在一个实施方案中，液化过程中的pH是约4.0至7.0，如4.5至6.0，如约5.8，或4.5至4.8。

在一个实施方案中，所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶或真菌α-淀粉酶。

在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶是芽孢杆菌α-淀粉酶。合适的α-淀粉酶可见于下文“在液化过程中存在和/或添加的α-淀粉酶”。

在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶是热稳定性α-淀粉酶。在一个具体实施方案中，所述细菌α-淀粉酶是芽孢杆菌α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶(有时称作嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus))或其变体，其包含双缺失如R179*和G180*或I181*+G182*，特别是I181*+G182*+N193F。若其为嗜热淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，细菌α-淀粉酶通常以0.0005-5KNU每g DS，优选0.001-1KNU每gDS，如大约0.06KNU每g DS，或0.0005-5KNU(S)每g DS，优选0.001-1KNU(S)每g DS，如约0.060KNU(S)每g DS的量添加。

蛋白酶可任选地在液化步骤i)，糖化步骤ii)，和/或发酵步骤iii)，如SSF过程中存在。在一个实施方案中，所述蛋白酶是在液化步骤i)过程中添加的热稳定性蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶，如热稳定性蛋白酶在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)，如SSF过程中添加。蛋白酶包括热稳定性蛋白酶的实例，可见于下文“在本发明的方法步骤过程中添加的蛋白酶”部分。

普鲁兰酶(pullulanase)(包括淀粉普鲁兰酶)可任选地在液化步骤i)，糖化步骤ii)，和/或发酵步骤iii)，如SSF过程中存在。在一个实施方案中，所述普鲁兰酶是在液化步骤i)过程中添加的热稳定性普鲁兰酶。普鲁兰酶包括热稳定性普鲁兰酶的实例，可见于下文“在本发明的方法步骤过程中存在和/或添加的普鲁兰酶”部分。

糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)

糖化步骤ii)和发酵步骤iii)可分别(顺序)或同时进行

在一个优选的实施方案中，糖化作为预糖化进行，接着进行单独的发酵步骤iii)，或在发酵过程中完成糖化的步骤(SSF)，即，预糖化然后同时糖化和发酵(SSF)。在一个实施方案中，预糖化步骤在发酵之前完成。在一个实施方案中，在发酵步骤iii)过程中，即在糖化或预糖化之后，不添加其它糖源生成酶，如葡糖淀粉酶。

预糖化在与发酵条件(即适应于发酵生物)相比更适于添加的酶(即适于糖源生成酶如葡糖淀粉酶的条件)的条件下进行。发酵通常在显著较低温度，例如25至40℃，如约32℃进行，而糖化或预糖化通常如下所示进行。

当糖化步骤ii)作为预糖化步骤或单独的糖化步骤进行时，pH可为4至7，优选pH 4.5至5的范围。在一个实施方案中，糖化步骤ii)在50至80℃，优选60至75℃，如约70℃的温度进行。在一个实施方案中，糖化步骤ii)进行10分钟至6小时，优选30分钟至3小时，如90分钟至150分钟。

在一个实施方案中，糖化步骤ii)和发酵步骤iii)可同时进行，这广泛用于工业规模的发酵产物产生方法，如乙醇产生方法。当进行SSF时，糖化步骤ii)和发酵步骤iii)同时进行。对于糖化并无保持阶段，意指发酵生物如酵母，和酶可同时添加。SSF或单独的发酵步骤iii)根据本发明通常在25℃至40℃，如28℃至35℃，如30℃至34℃，优选约32℃的温度进行。在一个实施方案中，发酵步骤iii)或SSF持续6至120个小时，特别是24至96个小时。在一个实施方案中，pH是3.5至5，特别是3.8至4.3。

用于糖化步骤ii)的糖源生成酶可优选为葡糖淀粉酶。然而，所述糖源生成酶亦可为选自下组的酶：β-淀粉酶，产麦芽糖淀粉酶，和α-葡糖苷酶，或其组合。

糖源生成酶，包括特别是葡糖淀粉酶的实例，可见于下文“在糖化或SSF过程中存在和/或添加的糖源生成酶”部分。合适的葡糖淀粉酶的实例可见于下文“在糖化或SSF过程中存在和/或添加的糖源生成酶”。在一个优选实施方案中，所述糖源生成酶是作为PCT/CN10/071753中SEQ ID NO:2或本文中SEQ ID NO:9公开的草酸青霉(Penicillium oxalicum)葡糖淀粉酶，或其如下定义的同源物。

根据本发明，所述糖源生成酶，如特别是葡糖淀粉酶，以0.0001-20AGU/gDS，优选0.001-10AGU/g DS，特别是0.01-5AGU/g DS，如0.1-2AGU/g DS的量添加。

发酵培养基

“发酵培养基”，指发酵进行的环境，包含发酵底物，即，由发酵生物代谢的糖源。发酵培养基可包含对于发酵生物的营养物和生长刺激物。营养物和生长刺激物广泛用于发酵领域，并包含氮源如氨、尿素，维生素和矿物质，或其组合。

发酵生物

术语“发酵生物”可指任何生物，包括细菌和真菌生物，其适用于发酵方法，并能够产生所需的发酵产物。特别合适的发酵生物能够将糖如葡萄糖或麦芽糖，直接或间接发酵即转化为所需的发酵产物，如乙醇。发酵生物的实例包括真菌生物如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种(Saccharomyces spp)，具体而言，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株。

在一个实施方案中，将发酵生物添加至发酵培养基使得活的发酵生物如酵母，在每mL发酵培养基中的计数为10⁵至10¹²，优选10⁷至10¹⁰，特别是5x10⁷的范围。

商业上可获得的酵母包括例如RED STAR^TM和ETHANOL RED^TM酵母(可从Fermentis/Lesaffre，USA获得)，FALI(可从Fleischmann’s Yeast，USA获得)，SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可从EthanolTechnology，WI，USA获得)，BIOFERM AFT和XR(可从NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation，GA，USA获得)，GERT STRAND(可从Gert Strand AB，Sweden获得)，和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。

含淀粉材料

根据本发明可使用任何合适的含淀粉材料。起始材料通常基于所需的发酵产物选择。适用于本发明的方法的含淀粉材料的实例，包括全谷粒，玉米，小麦，大麦，黑麦，买罗高粱，西米，木薯，树薯，高粱，稻，豌豆，豆或甘薯，或其混合物，或从其得到的淀粉，或谷类。

亦涵盖了蜡质或非蜡质类型的玉米和大麦。

发酵产物

术语“发酵产物”意指由包括使用发酵生物的发酵步骤的方法产生的产物。根据本发明所涵盖的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H₂和CO₂)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)；以及激素。在一个优选实施方案中，所述发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇(即，可饮用的中性酒)；或工业乙醇；或用于可消费醇类工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的产物。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porters)、陈贮啤酒(lagers)、苦味酒(bitters)、麦芽酒(malt liquors)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。使用的优选发酵方法包括醇发酵方法，如本领域公知。在一个实施方案中，根据本发明获得的发酵产物是乙醇。在一个实施方案中，发酵产物是燃料乙醇，其通常与汽油混合。在一个实施方案中，发酵产物是可饮用的乙醇。

回收

在发酵之后，可将发酵产物从发酵培养基分离。可蒸馏浆料以提取所需的发酵产物。或者，可从发酵培养基通过微过滤或膜过滤技术从发酵培养基提取所需的发酵产物。所述发酵产物亦可通过汽提或本领域公知的其它方法回收。

在液化过程中存在和/或添加的α-淀粉酶

根据本发明的方法，可使用任何α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶是细菌或真菌来源的。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶是芽孢杆菌α-淀粉酶。

在另一个实施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，如特别是酸性真菌α-淀粉酶。

术语“酸性α-淀粉酶”意指α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其以有效量添加时在3至7，优选3.5至6，或更优选4-5的范围的pH具有最佳活性。

细菌α-淀粉酶

根据本发明的α-淀粉酶优选来源于芽孢杆菌属(Bacillus)。

在一个优选实施方案中，所述芽孢杆菌属(或地芽孢杆菌属(Geobacillus))α-淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus))的菌株，但亦可来源于其他芽孢杆菌菌种。涵盖的α-淀粉酶的具体实例包括示于WO 99/19467中SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，示于WO 99/19467中SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，和示于WO 99/19467中SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在一个实施方案中，所述α-淀粉酶为分别与WO 99/19467中SEQ ID NO:1、2或3中所示的任何序列具有至少60%，优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性的同一性程度的酶。

所述芽孢杆菌属α-淀粉酶亦可为变体和/或杂合体，特别是任何WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355(所有文献通过提述并入本文)中所描述的。具体而言，涵盖的α-淀粉酶变体公开于美国专利号6,093,562、6,297,038或美国专利号6,187,576(通过提述并入本文)，并包括在位置R179至G182中具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(即，BSG α-淀粉酶)变体，所述缺失优选为WO 1996/023873中公开的双缺失(参见，例如第20页第1-10行，通过提述并入本文)，优选与WO 99/19467中公开的SEQ ID NO:3中所列的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO 99/19467(通过提述并入本文)中SEQ ID NO:3的编号方式的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是与WO 99/19467中公开的SEQ ID NO:3中所列的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于Δ(181-182)的双缺失，并进一步包含N193F取代(亦表示为I181*+G182*+N193F)的芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。

在一个实施方案中，所述α-淀粉酶是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其在位置S242包含取代，优选S242A,E或Q，特别是S242Q，或任何美国专利号7,713,723(Novozymes)，WO 2010/036515(Danisco)或美国专利号7,541,026(Danisco)中要求保护的任何取代。

细菌杂合α-淀粉酶

具体涵盖的杂合α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示为WO 99/19467中的SEQ ID NO:4)的445个C端氨基酸残基和来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(示为WO 99/19467中的SEQ ID NO:5)的37个N端氨基酸残基，并具有一个或多个，特别是所有的下述取代：

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌编号方式)。亦优选具有一个或多个下述突变(或其他芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中对应的突变)的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S，和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选缺失E178和G179(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5的编号方式)。

在一个实施方案中，若细菌α-淀粉酶是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其以0.0005-5KNU每g DS，优选0.001-1KNU每g DS，如约0.050KNU每g DS，或0.0005-5KNU(S)每g DS，优选0.001-1KNU(S)每g DS，如约0.060KNU(S)每g DS的量剂量添加。

商业上可获得的α-淀粉酶产品

优选的包含α-淀粉酶的商业性组合物包括MYCOLASE^TM(来自DSM(Gist Brocades))，BAN^TM，TERMAMYL^TM SC，FUNGAMYL^TM，LIQUOZYME^TM X，LIQUOZYME^TM SC，LIQUOZYME^TM SCDS和SAN^TMSUPER，SAN^TM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASE^TM L-40,000，DEX-LO^TM，SPEZYME

FRED-L，SPEZYMEHPA，SPEZYME

ALPHA，SPEZYME

XTRA，SPEZYME

AA，SPEZYME

DELTA AA，和GC358，SPEZYME RSL(Danisco)；FUELZYME^TM-LF(Verenium Inc)，和以商品名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可从Novozymes A/S,Denmark)获得)。

在低pH热稳定的α-淀粉酶

根据本发明，用于步骤i)的α-淀粉酶可为在低pH(即pH 4.5至5.0)热稳定性α-淀粉酶。根据本发明，α-淀粉酶对于在pH 4.5至5.0的液化中的淀粉溶解具有高活性，并在pH 4.5-5.0和80至90℃，优选4.5-4.8，85℃具有高热稳定性。

更具体而言，用于液化步骤i)的α-淀粉酶可优选在pH 4.5，85℃，0.12mMCaCl₂具有至少10的T_1/2(分钟)。

在一个优选实施方案中，在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl₂的T_1/2(分钟)为至少15，如至少20，至少25，如至少30，如至少40，如至少50，如至少60，如10至70，如15至70，如20至70，如25至70，如30至70，如40至70，如50至70，如60至70。

在本发明的一个实施方案中，所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选来源于芽孢杆菌属，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是在WO 99/019467中作为SEQ ID NO:3(本文中的SEQ ID NO:1)公开的、具有双缺失I181+G182和取代N193F的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其进一步包含下述突变：

-V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F；

-V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K；

-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F；

-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N；

-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；

-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；

-A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-E129V+K177L+R179E；

-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M；

-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；

-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*；

-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；

-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；

-E129V+K177L+R179E+S242Q；

-E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-K220P+N224L+S242Q+Q254S；或

-M284V。

在本发明的方法步骤中添加的蛋白酶

根据本发明，可任选地在本发明的方法步骤中存在或添加蛋白酶。由于在液化过程中通常使用的相对高的温度，优选在液化步骤i)过程中与如上所述的α-淀粉酶一同添加热稳定性蛋白酶。在其他实施方案中，在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)，如SSF过程中添加蛋白酶。

根据本发明，所述含淀粉材料可用任何来源的蛋白酶如热稳定性蛋白酶处理。合适的蛋白酶可为真菌，细菌，包括丝状真菌和酵母，以及植物来源。

根据本发明，术语“蛋白酶”涵盖肽酶和其它蛋白质降解酶。在一个实施方案中，所述蛋白酶是内蛋白酶和/或外蛋白酶。

在一个实施方案中，所述蛋白酶如热稳定性蛋白酶，是酸性蛋白酶，即表征为在低于pH 7，例如在2至7的pH的酸性条件下水解蛋白质的能力的蛋白酶。在一个实施方案中，所述酸性蛋白酶具有2.5至3.5范围的最适pH(在37℃以0.7%w/v对高氮酪蛋白底物确定)和5至50℃的最适温度(在10mg/mL的酶浓度，在30℃在0.1M哌嗪/乙酸(盐)/甘氨酸缓冲液中进行1小时)。

在另一个实施方案中，所述蛋白酶，或热稳定性蛋白酶，是碱性蛋白酶，即表征为在高于pH 7，例如在7至11的pH的碱性条件下水解蛋白质的能力的蛋白酶。在一个实施方案中所述碱性蛋白酶来源于芽孢杆菌属优选地衣芽孢杆菌的菌株。在一个实施方案中，所述碱性蛋白酶具有7至11的范围的最适温度和在pH 9确定时，约70℃的最适温度。

在另一个实施方案中，所述蛋白酶，或热稳定性蛋白酶，是中性蛋白酶，即表征为在pH 5至8的中性条件下水解蛋白质的能力的蛋白酶。在一个实施方案中，所述碱性蛋白酶来源于芽孢杆菌属优选解淀粉芽孢杆菌的菌株。在一个实施方案中，所述碱性蛋白酶具有7至11的范围的最适pH(在25℃，用0.01-0.2AU/L的酶浓度进行10分钟反应时间确定)，和50至70℃的最适温度(在pH 8.5，在10分钟反应时间和0.03-0.3AU/L酶浓度确定)。

合适的植物蛋白酶可来源于大麦。

合适的细菌蛋白酶包括来源于解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的芽孢杆菌属蛋白酶。合适的丝状细菌蛋白酶可来源于拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)的菌株，优选是Nocardiopsis prasina NRRL 18262蛋白酶或(Nocardiopsis sp.10R)和达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonavilla)NRRL 18133(Nocardiopsisdassonavilla M58-1)，两者均描述于WO 1988/003947(Novozymes)。

合适的酸性真菌蛋白酶包括来源于曲霉属(Aspergillus)，毛霉属(Mucor)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、假丝酵母属(Candida)、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、丝核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特别涵盖的是来源于黑曲霉(Aspergillus niger)(参见，例如，Koaze等,1964,Agr.Biol.Chem.Japan,28,216)，斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)，泡盛曲霉(Aspergillusawamori)(Hayashida等,1977 Agric.Biol.Chem.,42(5),927-933)，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO 95/02044)或米曲霉(Aspergillus oryzae)的蛋白酶；公开于美国专利号4,357,357和美国专利号3,988,207的来自微小毛霉(Mucorpusillus)和米黑毛霉(Mucor miehei)的蛋白酶；或公开于例如WO 94/24880的曼赫根毛霉(Rhizomucor mehei)或细小根毛霉(Rhizomucor pusillus)的蛋白酶。

天冬氨酸蛋白酶描述于，例如，Handbook of Proteolytic Enzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编,Academic Press,San Diego,1998,270章)。天冬氨酸蛋白酶的合适的实例包括，例如，R.M.Berka等，Gene,96,313(1990)；(R.M.Berka等Gene,125,195-198)(1993)；以及Gomi等,Biosci.Biotech.Biochem.57,1095-1100(1993)公开的那些，其通过提述并入本文。

商业上可得到的产品包括ALCALASE

ESPERASE^TM、NEUTRASE

RENNILASE

NOVOZYM^TM FM 2.0L、以及NOVOZYM^TM 50006(可由Novozymes A/S、Denmark得到)以及来自Genencor Int.,Inc.USA.的SPEZYME^TM FAN。

所述蛋白酶或热稳定蛋白酶可以以0.0001至1.0wt%TS，优选0.001至0.1wt%TS的范围的浓度存在。

在一个实施方案中，所述蛋白酶是金属蛋白酶。在一个优选实施方案中，所述蛋白酶来源于嗜热子囊菌属(Thermoascus)的菌株，优选是橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株，特别是具有WO 03/048353(其通过提述并入本文)中SEQ ID NO:2的成熟部分中所示的序列的橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670。所述橙橘嗜热子囊菌蛋白酶在20至90℃具有活性，最适温度约70℃。此外，所述酶在pH 5至10具有活性，最佳为约pH 6。

用于本发明的方法，优选在液化步骤i)过程中添加的蛋白酶可为热稳定性蛋白酶，其具有以下之一：

i)作为在80℃/70℃的相对活性确定的超过20%的热稳定性值；和/或

ii)作为在85℃/70℃的相对活性确定的超过10%的热稳定性值

在一个实施方案中，所述蛋白酶具有如下的热稳定性值：

-作为在80℃/70℃的相对活性确定的超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%，和/或

-作为在85℃/70℃的相对活性确定的超过12%，超过14%，超过16%，超过18%，超过20%；和/或

-作为在80℃的残余活性确定的超过20%，超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%；和/或

-作为在84℃的残余活性确定的超过20%，超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%和/或。

纯化的变体在85℃可具有如使用实施例3中公开的Zein-BCA测定法确定的90以上，100以上的热稳定性。

“相对活性”和“残余活性”的确定如实施例2中所述确定。

蛋白酶基于其催化机理归类于下述组：

丝氨酸蛋白酶(S)，半胱氨酸蛋白酶(C)，天冬氨酸蛋白酶(A)，金属蛋白酶(M)和未知的或尚未分类的蛋白酶(U)。参见Handbook of ProteolyticEnzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编),Academic Press(1998)，特别是一般简介部分。

在一个优选实施方案中，用于本发明的方法的热稳定性蛋白酶是金属蛋白酶，其定义为属于EC 3.4.24的蛋白酶(金属内肽酶)；优选为EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)。

为了确定给定蛋白酶是否金属蛋白酶，可参照上述“Handbook ofProteolytic Enzymes”，以及其中指示的原则。此种确定可对于所有类型的蛋白酶进行，无论其为天然存在或野生型的蛋白酶，或为基因工程或合成的蛋白酶。

蛋白酶活性可使用任何合适的测定法进行测量，其中使用底物，所述底物含有与所述蛋白酶的特异性相关的肽键。

测定pH和测定温度同样应适应所述蛋白酶。

测定pH值的实例为pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例为30、35、37、40、45、50、55、60、65、70或80℃。

蛋白酶底物的实例为酪蛋白，如天青精交联的酪蛋白(Azurine-CrosslinkedCasein)(AZCLcasein)。下文在“材料和方法”部分描述了两种蛋白酶测定法，其中所谓“AZCL-酪蛋白测定法”是优选的测定法。

所述热稳定性蛋白酶可为例如野生型蛋白酶的变体，只要所述蛋白酶具有如上所定义的热稳定性性质。在一个优选实施方案中，所述蛋白酶是如上所定义的金属蛋白酶的变体。在一个实施方案中，用于本发明的方法的蛋白酶是真菌来源的，如真菌金属蛋白酶，如来源于如下的真菌金属蛋白酶：嗜热子囊菌属，优选为橙橘嗜热子囊菌的菌株，特别是橙橘嗜热子囊菌CGMCCNo.0670的菌株(归类为EC 3.4.24.39)。

在一个实施方案中，所述蛋白酶是WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或WO 2003/048353中公开的SEQ ID NO:2中所示的金属蛋白酶的成熟部分，和在本文中示为SEQ ID NO:3的具有下述突变的变体：

-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L

-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L

-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L

-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L

-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L

-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L

-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L

-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L

-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L

-D79L+S87P+A112P+D142L

-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L

-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L

-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L

-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L

-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L

-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C

-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L

-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L

-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L

-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L

-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L

-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L

-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L

-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L

-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L

-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L

-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L

-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L

-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L

-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L

-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L

-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L

-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L。

在糖化或SSF过程中存在和/或添加的糖源生成酶

根据本发明，在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)如SSF过程中存在和/或添加糖源生成酶。亦存在或添加蛋白酶如热稳定性蛋白酶。如上所述，亦可在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)过程中存在和/或添加普鲁兰酶。

术语“糖源生成酶”包括任何生成可发酵的糖的酶。糖源生成酶能够产生糖，其可被所述发酵生物用作能源，例如，当用于本发明的方法以供产生发酵产物如乙醇时。生成的糖可直接或间接转化为所需的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可使用糖源生成酶的混合物。具体的实例包括葡糖淀粉酶(其为葡萄糖生产者)，β-淀粉酶，和产麦芽糖淀粉酶(其为麦芽糖生产者)。

在一个优选实施方案中，所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，如热稳定性葡糖淀粉酶。所述糖源生成酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶，可与α-淀粉酶和任选地蛋白酶和/或普鲁兰酶一同添加或分别添加。

在一个实施方案中，所述糖源生成酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶，在85℃具有至少20%，至少30%，优选至少35%相对活性的热稳定性。在一个实施方案中，所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，其在pH 4.5具有至少80％，优选至少85%，优选至少90%，优选至少95%的相对活性。

在一个具体而优选的实施方案中，所述糖源生成酶是热稳定性葡糖淀粉酶，优选为真菌来源的，优选丝状真菌如来源于青霉属的菌株，特别是草酸青霉的菌株，其在PCT/CN10/071753(其通过提述并入本文)中作为SEQ IDNO:2公开并在本文中示于SEQ ID NO:9。

在一个实施方案中，所述热稳定性葡糖淀粉酶与PCT/CN10/071753中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:9所示的成熟多肽具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，并且甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%同一性。

在本发明的方法步骤过程中存在和/或添加的普鲁兰酶

任选地，在液化步骤i)，糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)如SSF过程中可存在或添加普鲁兰酶(包括淀粉普鲁兰酶)。在一个实施方案中，所述普鲁兰酶是在液化步骤i)过程中添加的热稳定性普鲁兰酶。热稳定性普鲁兰酶可在液化步骤i)过程中与α-淀粉酶和任选地热稳定性蛋白酶一同存在和/或添加。

所述普鲁兰酶可在本发明的方法步骤如液化步骤i)，糖化步骤ii)，发酵步骤iii)和/或同时糖化和发酵(SSF)过程中存在和/或添加。

普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41，普鲁兰6-葡聚糖水解酶)是由其水解例如支链淀粉和普鲁兰中的α-1,6-糖苷键的能力表征的脱支酶。

根据本发明涵盖的普鲁兰酶包括美国专利号4,560,651(通过提述并入本文)中公开的来自Bacillus amyloderamificans的普鲁兰酶，在WO 01/151620(通过提述并入本文)作为SEQ ID NO:2公开的普鲁兰酶，在WO 01/151620(通过提述并入本文)中作为SEQ ID NO:4公开的Bacillus deramificans，和在WO01/151620(通过提述并入本文)中作为SEQ ID NO:6公开并亦描述于FEMSMic.Let.(1994)115,97-106的来自Bacillus amyloderamificans的普鲁兰酶。

根据本发明涵盖的其它普鲁兰酶包括来自沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)的普鲁兰酶，特别是WO 92/02614中公开的来自沃氏火球菌(Pyrococcuswoesei)DSM No.3773的普鲁兰酶。

在一个实施方案中，所述普鲁兰酶是GH57普鲁兰酶。在一个实施方案中，所述普鲁兰酶含有如公开于PCT/US10/061761(其通过提述并入本文)的X47域。更具体而言，所述普鲁兰酶可来源于热球菌属(Thermococcus)的菌株，包括Thermococcus litoralis和Thermococcus hydrothermalis的菌株，如SEQ IDNO:11中所示的Thermococcus hydrothermalis普鲁兰酶，其在X47域(即SEQID NO:11和12中的氨基酸1-782)之后在位点X4被截短。所述普鲁兰酶亦可为Thermococcus litoralis和Thermococcus hydrothermalis的普鲁兰酶的杂合体或PCT/US10/061761(其通过提述并入本文)中公开的并在SEQ ID NO:12公开的具有截短位点X4的T.hydrothermalis/T.litoralis杂合体酶。

普鲁兰酶可根据本发明以有效量添加，其包括约0.0001-10mg酶蛋白每克DS的优选量，优选0.0001-0.10mg酶蛋白每克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白每克DS。普鲁兰酶活性可作为NPUN确定。用于确定NPUN的测定法描述于下文“材料和方法”部分。

合适的商业上可获得的普鲁兰酶产品包括PROMOZYME D，PROMOZYME^TM D2(Novozymes A/S,Denmark)，OPTIMAX L-300(GenencorInt.,USA)，和AMANO 8(Amano,Japan)。

在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加的其它糖源生成酶

根据本发明，在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)过程中可存在和/或添加其它糖源生成酶，优选其它葡糖淀粉酶。其它糖源生成酶亦可为选自下组的酶：β-淀粉酶，产麦芽糖淀粉酶，和α-葡糖苷酶。

在一个优选实施方案中，所述其它糖源生成酶是真菌来源的葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉的菌株；或木霉属(Trichoderma)的菌株，优选里氏木霉(T.reesei)的菌株；或踝节菌属(Talaromyces)的菌株，优选埃默森踝节菌(T.emersonii)的菌株。

在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加的其它葡糖淀粉酶

根据本发明，在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)如SSF过程中可存在和/或添加其它葡糖淀粉酶。所述其它葡糖淀粉酶可来源于任何合适的来源，例如来源于微生物或植物。优选的其它葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等,1984,EMBO J.3(5):1097-1102)，或其变体，如WO 92/00381,WO 00/04136和WO 01/04273(来自Novozymes,Denmark)中公开的那些；WO 84/02921中公开的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.,(1991)55(4),p.941-949)，或它们的变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等,1996,Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293 E/Q(Chen等,1995,Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等,1994,Biochem.J.301:275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等,1996,Biochemistry,35:8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等,1997,Protein Eng.10:1199-1204)。

其它的其它葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(之前表示为罗耳伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和(Nagasaka等，1998,“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii，Appl Microbiol Biotechnol.50:323-330))，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32,153)、杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利号4,587,215)的葡糖淀粉酶。在一个优选实施方案中，在糖化和/或发酵过程中使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中公开的埃默森踝节菌葡糖淀粉酶。

涵盖的其它细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridum)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)以及瓣环栓菌(Trametes cingulata)，纸质大纹饰孢(Pachykytospora papyracea)，以及大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)的葡糖淀粉酶，其均披露于WO 2006/069289；或WO 2007/124285中公开的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)；或其混合物。根据本发明亦涵盖了杂合体葡糖淀粉酶。所述杂合体葡糖淀粉酶的实例公开于WO2005/045018。特定的实例包括实施例1表1和4中公开的杂合体葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述并入本文)。

在一个实施方案中，所述其它葡糖淀粉酶来源于密孔菌属(Pycnoporus)，特别是如US 61/264,977中所述的密孔菌属的菌株，或来自Gloephyllum属的菌株，特别是如US 61/406,741中所述的Gloephyllum的菌株，或拟层孔菌属(Nigrofomes)的菌株，特别是US 61/411,044中公开的拟层孔菌属菌种的菌株。

涵盖的还有如下的其它葡糖淀粉酶，即与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高同一性，即，与上面提及的成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。

所述其它葡糖淀粉酶可以以0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/gDS，特别是在0.01-5AGU/g DS，如0.1-2AGU/g DS的量添加。

商业上可获得的包含其它葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L、AMG300 L、SAN^TM SUPER、SAN^TM EXTRA L、SPIRIZYME^TM PLUS、SPIRIZYME^TM FUEL、SPIRIZYME^TM B4U，SPIRIZYME^TM ULTRA和AMG^TME(来自Novozymes A/S)；OPTIDEX^TM 300，GC480，GC417(来自GenencorInt.)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(来自DSM)；G-ZYME^TM G900、G-ZYME^TM和G990ZR (来自Genencor Int.)。

产麦芽糖淀粉酶

在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)过程中存在和/或添加的其它糖源生成酶可为产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构象的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可由Novozymes A/S得到。产麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048，4,604,355和6,162,628，其通过提述并入本文。

在一个优选实施方案中，所述产麦芽糖淀粉酶可以以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。

在下述编号的段落中进一步描述本发明：

[1]一种用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其包括下述步骤：

i)使用α-淀粉酶液化含淀粉材料；

ii)使用糖源生成酶糖化，其中所述糖源生成酶具有在70℃，pH 5.3，如实施例4中所述确定的至少70%相对活性的热稳定性；

iii)使用发酵生物发酵。

[2]段1的方法，其中添加至糖化步骤ii)的糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选为真菌葡糖淀粉酶。

[3]段1或2的方法，其中添加至糖化步骤ii)的糖源生成酶，优选葡糖淀粉酶，具有在70℃，pH 5.3，至少80%，优选至少85%相对活性的热稳定性。

[4]段1-3任一项的方法，其中添加至糖化步骤ii)的糖源生成酶，优选葡糖淀粉酶，具有在pH 4.5至少80％，优选至少85％，优选至少90%的相对活性。

[5]段1-4任一项的方法，其中添加至糖化步骤ii)的糖源生成酶，优选葡糖淀粉酶，具有在pH 4.5至少80%，至少85%，至少90％，至少95％，至少100%相对活性的pH稳定性。

[6]段1-5任一项的方法，其中添加至糖化步骤ii)的糖源生成酶，优选葡糖淀粉酶，来源于青霉属的菌株，特别是来自草酸青霉的菌株作为PCT/CN10/071753中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:9公开。

[7]段1-6任一项的方法，其中添加至糖化步骤ii)的糖源生成酶与PCT/CN10/071753中的SEQ ID NO:2或本文中SEQ ID NO:9所示的成熟多肽具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，并且甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%同一性。

[8]段1-7任一项的方法，进一步其中在发酵步骤iii)过程中未添加任何其它糖源生成酶。

[9]段1-8任一项的方法，其中糖化步骤ii)在pH 4-7，优选pH 4.5-5进行。

[10]段1-9任一项的方法，其中糖化步骤ii)在50℃至80℃，优选约70℃的温度进行。

[11]段1-9任一项的方法，其中糖化步骤ii)进行10分钟至6小时，优选30分钟至3小时。

[12]段1-11任一项的方法，其中液化步骤i)使用细菌α-淀粉酶或真菌α-淀粉酶进行。

[13]段12的方法，其中所述细菌α-淀粉酶是芽孢杆菌属α-淀粉酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体，它们包含双缺失如R179*和G180*或I181*+G182*，特别是I181*+G182*+N193F；或者嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其在位置S242包含取代，优选为S242A,E或Q，特别是S242Q。

[14]段1-13任一项的方法，其中若其为嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，所述细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每g DS，优选0.001-1KNU每g DS，如约0.060KNU每g DS或0.0005-5KNU(S)每g DS，优选0.001-1KNU(S)每g DS，如约0.060KNU(S)每g DS的量使用。

[15]段1-14任一项的方法，其中在液化过程中的pH为约4.0至7.0，如4.5至6.0，优选约5.8。

[16]段1-15的方法，在液化步骤i)之前，进一步包括下述步骤：

i)磨制含淀粉材料；

ii)形成浆料，其包含经磨制的含淀粉材料和水。

[17]段16的方法，其中将所述浆料加热至起始糊化温度以上。

[18]段16或17的方法，其中将所述浆料在步骤i)之前在95至140℃，优选105至125℃的温度喷射蒸煮1-15分钟，优选3-10分钟，特别是约5分钟。

[19]段1-18的组合物，其中用于液化步骤i)的α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，特别是芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株的，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如WO99/019467中的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ IDNO:1中所示的。

[20]段1-19任一项的方法，其中用于液化步骤i)的α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有至少10的T_1/2(分钟)。

[21]段1-20任一项的方法，其中所述α-淀粉酶在pH 4.5，85℃，0.12mMCaCl₂具有至少10，如至少15，如至少20，如至少25，如至少30，如至少40，如至少50，如至少60，如10至70，如15至70，如20至70，如25至70，如30至70，如40至70，如50至70，如60至70的T_1/2(分钟)。

[22]段1-21任一项的方法，其中糖化步骤ii)和发酵步骤iii)分别或同时进行。

[23]段1-22任一项的方法，其中至少50%，优选至少70%，更优选至少80%，特别是至少90%的含淀粉材料穿过具有#6-8筛网的筛。

[24]段1-23任一项的方法，其中在步骤i)的液化之前进行喷射蒸煮步骤。

[25]段1-24任一项的方法，其中发酵在25℃至40℃，如28℃至35℃，如30℃至34℃，优选约32℃的温度进行。在一个实施方案中，发酵持续进行6至120个小时，特别是24至96个小时。

[26]段1-25任一项的方法，其中发酵产物在发酵之后回收，如通过蒸馏。

[27]段1-26任一项的方法，其中所述发酵产物是醇，优选乙醇，优选燃料乙醇、可饮用的乙醇或工业乙醇。

[28]段1-27任一项的方法，其中所述含淀粉起始材料是全谷粒。

[29]段1-28任一项的方法，其中所述含淀粉材料来源于玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、树薯、木薯淀粉、高粱、稻或马铃薯。

[30]段1-29任一项的方法，其中所述发酵生物是酵母，优选酵母属的菌株，特别是酿酒酵母的菌株。

[31]段1-30的方法，其中蛋白酶，优选真菌蛋白酶在液化步骤i)或糖化步骤ii)和/或发酵如SSF过程中存在。

[32]段1-31任一项的方法，其中蛋白酶是热稳定性蛋白酶，其具有在80℃/70℃作为相对活性确定的超过20%的热稳定性值。

[33]段1-32任一项的方法，其中所述蛋白酶具有在80℃/70℃作为相对活性确定的超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%的热稳定性。

[34]段1-33的方法，其中所述蛋白酶具有在85℃/70℃作为相对活性确定的超过12%，超过14%，超过16%，超过18%，超过20%的热稳定性。

[35]段31-34任一项的方法，其中所述蛋白酶是来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选橙橘嗜热子囊菌的菌株，特别是橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶的变体。

[36]段31-35任一项的方法，其中所述蛋白酶是作为WO 2003/048353中公开的SEQ ID NO:2的成熟部分或本文中的SEQ ID NO:3或WO2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分公开的金属蛋白酶的变体。

[37]段31-36任一项的方法，其中所述蛋白酶变体与WO 2003/048353中公开的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或本文中的SEQ ID NO:3或WO2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分具有至少75%同一性，优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，并且甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%同一性。

[38]段1-37任一项的方法，进一步其中普鲁兰酶在液化步骤i)和/或糖化步骤ii)过程中存在。

[39]段38的方法，其中在在液化步骤i)和/或糖化步骤ii)过程中存在的普鲁兰酶是家族GH57普鲁兰酶，其中所述普鲁兰酶优选含有如PCT/US10/061761中公开的X47域。

[40]段38或39的方法，其中所述普鲁兰酶来源于来自热球菌属的菌株，包括Thermococcus litoralis和Thermococcus hydrothermalis的菌株，或其杂合体。

[41]段38-40任一项的方法，其中所述普鲁兰酶是在位点X4截短的Thermococcus hydrothermalis普鲁兰酶，或具有在PCT/US10/061761中公开的截短位点X4，或示于本文中的SEQ ID NO:12的T.hydrothermalis/T.litoralis杂合体酶。

材料和方法

材料：

α-淀粉酶A：具有突变I181*+G182*+N193F，截短至491个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(本文中的SEQ ID NO:1)

葡糖淀粉酶T：约9:1比例的WO 99/28448中作为SEQ ID NO:7公开的埃默森踝节菌葡糖淀粉酶和WO 06/069289中公开的瓣环栓菌葡糖淀粉酶。

酵母：可从Red Star/Lesaffre,USA获得的RED STAR ETHANOL RED^TM。

方法：

同一性：两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数”同一性”所描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度，以及两个核苷酸序列之间的同一性程度，可通过程序“Align”确定，其为Needleman-Wunsch比对(即全局比对)。使用该程序以供多肽以及核苷酸序列的比对。使用缺省的评分矩阵BLOSUM50以供多肽比对，并使用缺省的同一性矩阵以供核苷酸比对。对于第一个缺口的残基的罚分对于多肽是-12，而对于核苷酸是-16。对于缺口的进一步的残基的罚分对于多肽是-2，而对于核苷酸是-4。

“Align”是FASTA程序包版本v20u6的一部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″,PNAS85:2444-2448,和W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparisonwith FASTP and FASTA,″Methods in Enzymology 183:63-98)。FASTA蛋白比对使用Smith-Waterman算法而对缺口大小无限制(参见“Smith-Waterman算法”，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147:195-197)。

蛋白酶测定法

AZCL-酪蛋白测定法

将0.2%蓝色底物AZCL-酪蛋白溶液搅拌悬于硼砂(Borax)/NaH₂PO₄缓冲液pH 9中。一边搅拌一边将所述溶液分配到微滴定板上(每孔100μL)，添加30μL酶试样，然后将板在Eppendorf热混合器中在45℃和600rpm温育30分钟。使用变性的酶试样(100℃煮沸20分钟)作为空白。在温育后，通过将微滴定板转移至冰上而终止反应，且通过在4℃以3000rpm离心5分钟来将有色溶液与固体分开。将60μL上清转移至微滴定板，并使用BioRad微板读数器测量在595nm的吸光度。

pNA测定法

将50μL含蛋白酶样品添加至微滴定板，并通过添加100μL 1mM pNA底物(5mg溶于100μL DMSO，并进一步用硼砂/NaH₂PO₄缓冲液pH9.0稀释至10mL)来起始所述测定法。监测OD₄₀₅在室温的增加作为蛋白酶活性的量度。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

葡糖淀粉酶活性可以用葡糖淀粉酶单位(AGU)来测量。

Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。

可使用自动分析仪系统。将变旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖在上述提及的反应中反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处确定作为起始葡萄糖浓度的量度。

AMG温育：
		底物：	麦芽糖23.2mM
缓冲液：	乙酸(盐)0.1M
		pH：	4.30±0.05
温育温度：	37℃±1
		反应时间：	5分钟
酶工作范围：	0.5-4.0AGU/mL

颜色反应：
		GlucDH：	430U/L
变旋酶：	9U/L
		NAD：	0.21mM
缓冲液：	磷酸(盐)0.12M；0.15M NaCl
		pH：	7.60±0.05
温育温度	37℃±1
		反应时间：	5分钟
波长：	340nm

更详细描述此分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可应要求由Novozymes A/S,Denmark得到，其通过提述并入本文。

α-淀粉酶活性(KNU)

淀粉分解活性可使用马铃薯淀粉作为底物来确定。该方法基于酶对于改性马铃薯淀粉的分解，并通过将淀粉/酶溶液的样本与碘溶液混合来跟踪反应。起初，形成了蓝黑色(blackish blue)，但在淀粉分解过程中，蓝色越来越淡，并逐渐变为红棕色(reddish-brown)，将其和有色玻璃标准(colored glassstandard)进行比较。

一个千Novo α-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca²⁺；以及pH 5.6)糊精化5260mg的淀粉干物质MerckAmylum Solubile所需的酶量。

更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可应对NovozymesA/S,Denmark要求而获得，该文件夹通过提述并入本文。

KNU活性

使用KNU活性确定嗜热脂肪芽孢杆菌的活性，且描述于WO 99/19467中的第35-41页(通过提述并入本文)。

普鲁兰酶活性(NPUN)的确定

以NPUN表示的内-普鲁兰酶活性相对于Novozymes普鲁兰酶标准测量。一个普鲁兰酶单位(NPUN)定义为在标准条件下(0.7%红色普鲁兰(Megazyme)，pH 5，40℃，20分钟)每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶的量。该活性使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量。

将1mL稀释的样品或标样在40℃温育2分钟。添加0.5mL 2%红色普鲁兰，0.5M KCl，50mM柠檬酸pH 5，并混合。将管在40℃温育20分钟，并通过添加2.5ml 80%乙醇来停止。将管静置于室温10至60分钟，接着以4000rpm离心10分钟。然后在510nm测量上清的OD，并使用标准曲线计算活性。

本发明在下述实施例中以更多细节描述，提供所述实施例以说明本发明，但不意欲以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。所有本文中引用的参考文献就其中描述的部分具体地通过提述并入本文。

产麦芽糖淀粉酶活性的确定(MANU)

一MANU(产麦芽糖淀粉酶Novo单位；Maltogenic Amylase Novo Unit)可定义为在37℃在10mg的麦芽三糖(Sigma M 8378)底物每ml的0.1M柠檬酸(盐)缓冲液，pH 5.0的浓度进行30分钟，每分钟释放一微摩尔麦芽糖所需的酶量。

实施例

实施例1

α-淀粉酶变体的稳定性

确定参照α-淀粉酶(具有突变I181*+G182*+N193F、截短至491个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:1))及其α-淀粉酶变体的稳定性，即，将所述参照α-淀粉酶和变体在pH 4.5和5.5以及75℃和85℃的温度与0.12mM CaCl₂一同温育，然后使用EnzChek

底物(EnzChek

Ultra Amylase测定试剂盒,E33651,Molecular Probes)确定残余活性。

将纯化的酶样品稀释至酶稀释缓冲液(10mM乙酸(盐)，0.01% TritonX100，0.12mM CaCl₂，pH 5.0)中的0.5和1或5和10ppm(微克/ml)的工作浓度。将二十微升酶样品转移至48孔PCR MTP并将180微升稳定缓冲液(150mM乙酸(盐)，150mM MES，0.01%Triton X100，0.12mM CaCl₂，pH 4.5或5.5)添加至每个孔并混合。使用两个浓度的酶一式两次进行测定。在75℃或85℃温育之前，取出20微升，并作为对照样品储藏于冰上。温育在PCR仪中在75℃和85℃进行。在温育之后，将样品在残余活性缓冲液(100mM乙酸(盐)，0.01% Triton X100，0.12mM CaCl₂，pH 5.5)中稀释至15ng/mL，并将25微升稀释的酶转移至黑色384MTP。残余活性使用EnzChek底物通过将25微升底物溶液(100微克/ml)添加至每个孔来确定。使用在485-P nm的激发滤镜和555nm的发射滤镜每分钟确定荧光进行15分钟(荧光读数器为Polarstar,BMG)。对于每个设置，将残余活性针对对照样品标准化。

假定对数衰减，则半寿期时间(T_1/2(分钟))使用如下方程式计算：T1/2(分钟)=T(分钟)*LN(0.5)/LN(%RA/100)，其中T是以分钟计的测定温育时间，而%RA是测定中确定的%残余活性。

使用该测定设置，对于参照α-淀粉酶及其变体确定了半寿期时间，如表1中所示。

表1

ND未确定

结果表明α-淀粉酶变体与参照α-淀粉酶相比具有显著更高的半寿期和稳定性。

实施例2

蛋白酶变体的制备和热稳定性的测试

使用的化学品为至少试剂级的商品。

菌株和质粒：

大肠杆菌DH12S(可从Gibco BRL获得)用于酵母质粒拯救。pJTP000是在TPI启动子调控下的酿酒酵母和大肠杆菌穿梭载体，从WO 01/92502中所述的pJC039构建，其中已插入了橙橘嗜热子囊菌M35蛋白酶基因(WO03048353)。

酿酒酵母YNG318感受态细胞：MATa Dpep4[cir+]ura3-52,leu2-D2,his4-539用于蛋白酶变体表达。其描述于J.Biol.Chem.272(15),pp 9720-9727,1997中。

培养基和底物

10X基础溶液：不含氨基酸的酵母氮基(DIFCO)66.8g/L，琥珀酸(盐)100g/l，NaOH 60g/l。

SC-葡萄糖：20%葡萄糖(即2%的最终浓度=2g/100mL))100mL/L，5%苏氨酸4mL/L，1%色氨酸10ml/l，20%酪蛋白氨基酸25ml/l，10X基础溶液100ml/l。将溶液使用0.20微米孔径的过滤器灭菌。琼脂(2%)和H₂O(大约761mL)一同高压灭菌，并将分别灭菌的SC-葡萄糖溶液添加至琼脂溶液。

YPD：细菌用蛋白胨(Bacto peptone)20g/l，酵母提取物10g/L，20%葡萄糖100mL/L。

YPD+Zn：YPD+0.25mM ZnSO₄。

20PEG/LiAc溶液：40%PEG4000 50ml，5M乙酸锂1mL。

96孔Zein微滴定板：

每个孔含有200微升的于20mM乙酸钠缓冲液pH 4.5中的0.05-0.1%的玉米醇溶蛋白(Sigma)，0.25mM ZnSO₄和1%的琼脂。

DNA操作

除非另行声明，DNA操作和转化使用如Sambrook等(1989)Molecularcloning:A laboratory manual,Cold Spring Harborlab.Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,F.M.等(编)″Current protocols in Molecular Biology″,John Wiley andSons,1995；30 Harwood,C.R.和Cutting,S.M.(编)中所述的分子生物学的标准方法进行。

酵母转化

酵母转化使用乙酸锂方法进行：将0.5微升的载体(通过限制性内切核酸酶消化)和1微升的PCR片段混合。将DNA混合物，100微升的YNG318感受态细胞，和10微升的YEAST MAKER载体DNA(Clontech)添加至12mL聚丙烯管(Falcon 2059)。添加0.6mL PEG/LiAc溶液并轻柔地混合。在30℃和200rpm温育30分钟，并在42℃温育30分钟(热激)。将其转移至eppendorf管并离心5秒。移除上清，并溶解于3mL的YPD。将细胞悬液在30℃在200rpm温育45分钟。将悬液倾至SC葡萄糖平板，并在30℃温育3日以生长菌落。通过ZymoprepYeast Plasmid Miniprep Kit(ZYMO Research)提取酵母总DNA。

DNA测序

用于DNA测序的大肠杆菌转化通过电穿孔进行(BIO-RAD Gene Pulser)。DNA质粒通过碱方法(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor)或用Qiagen

Plasmid Kit制备。DNA片段从琼脂糖凝胶通过Qiagen凝胶提取试剂盒回收。PCR使用PTC-200 DNA Engine进行。将ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer用于确定所有的DNA序列。

蛋白酶表达载体的构建

将嗜热子囊菌属M35蛋白酶基因用引物对Prot F(SEQ ID NO:4)和ProtR(SEQ ID NO:5)扩增。将所得的PCR片段与pJC039载体一同导入酿酒酵母YNG318(描述于WO 2001/92502)，所述载体经限制性酶消化以去除特异腐质霉角质酶基因。

将SC-葡萄糖平板上的酵母克隆中的质粒回收以确认内部序列，并将其命名为pJTP001。

酵母文库和定位变体的构建

酵母中的文库和定位变体通过SOE PCR方法(通过重叠延伸的剪接，参见“PCR:A practical approach”,p.207-209,Oxford University press,编者McPherson,Quirke,Taylor)，接着进行酵母体内重组来构建。

用于扩增和测序的通用引物

使用引物AM34(SEQ ID NO:6)和AM35(SEQ ID NO:7)与简并引物(AM34+反向引物和AM35+正向引物)一同制备通过SOE方法而含有任何突变的片段的DNA片段或仅扩增全蛋白酶基因(AM34+AM35)。

通过Qiagen Gel Extraction Kit从琼脂糖凝胶回收DNA片段。将所得的纯化片段与载体消化物混合。将混合的溶液导入酿酒酵母以构建文库或通过体内重组构建定位变体。

相对活性测定

将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种至含有YPD+Zn培养基的96孔微滴定板的孔，并在28℃培养3日。将培养上清施于96孔玉米醇溶蛋白微滴定板，并在至少两个温度(例如70℃和80℃)温育超过4个小时或过夜。在平板中玉米醇溶蛋白的浊度作为A630测量，而相对活性(较高温度/较低温度)作为热活性改善的指标确定。选择具有与亲本变体相比更高相对活性的克隆并确定其序列。

残余活性测定

将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种至96孔微滴定板的孔中，并在28℃培养3日。在将培养上清在某温度(80℃或84℃，以4℃作为参照)在20mM乙酸钠缓冲液pH 4.5温育10分钟之后，在65℃使用Azo-酪蛋白(Megazyme)进行测量蛋白酶活性，以确定残余活性。选择与亲本变体相比具有较高残余活性的克隆，并确定序列。

Azo-酪蛋白测定

将20微升的样品与150微升的底物溶液(4mL的12.5%乙醇中的azo酪蛋白置于96mL的20mM乙酸钠pH 4.5，含有0.01%Triton-100和0.25mMZnSO₄)混合，并温育4小时或更长时间。

在添加20微升/孔的100%三氯乙酸(TCA)溶液之后，离心平板，并移取100微升的上清以测量A440。

蛋白酶变体在米曲霉中的表达

将包含蛋白酶变体基因的构建体用于构建供曲霉属的表达载体。曲霉属表达载体由基于黑曲霉中性淀粉酶II启动子融合于构巢曲霉丙糖磷酸异构酶未翻译前导序列的表达盒(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(Tamg)组成。在质粒上还存在来自构巢曲霉曲霉属选择性标志物amdS，其使得能够以乙酰胺作为唯一氮源进行生长。将用于蛋白酶变体的表达质粒如Lassen等(2001),Appl.Environ.Microbiol.67,4701-4707中所述转化入曲霉属。对于每个构建体，分离了10至20个菌株，将其纯化并培养于摇瓶。

表达的变体的纯化

1.将0.22μm过滤的发酵样品的pH调整为4.0。

2.将样品置于具有磁力搅拌的冰浴上。添加小量等分试样的(NH₄)₂SO₄(对应于大约2.0至2.2M(NH₄)₂SO₄，而不考虑添加化合物时的体积增加)。

3.在(NH₄)₂SO₄最后一次添加之后，将样品在冰浴上以轻柔的磁力搅拌温育最少45分钟。

4.离心：配有R20A2转子的Hitachi himac CR20G High-SpeedRefrigerated Centrifuge，5℃，20000rpm，30分钟。

5.将形成的沉淀物溶解于200mL 50mM乙酸钠pH 4.0。

6.通过使用0.22微米PES PLUS膜(IWAKI)的真空吸引器过滤样品。

7.使用在冷室中超滤(来自Vivascience的Vivacell 250，配置有5kDaMWCO PES膜)过夜将样品脱盐/缓冲液交换至50mM乙酸钠pH 4.0。使用50mM乙酸钠pH 4.0将渗余物样品稀释至200ml。样品的电导率优选低于5mS/cm。

8.将样品加载于用50mM乙酸钠pH 4.0平衡的阳离子交换柱。使用3个柱体积的结合缓冲液(50mM乙酸钠pH 4.0)将未结合的样品从柱洗出，并使用线性梯度0-100%洗脱缓冲液(50mM乙酸钠+1M NaCl，pH 4.0)以10个柱体积将样品洗脱。

9.将收集的级分通过内蛋白酶测定法(参见下文)测定接着对选择的级分进行标准SDS-PAGE(还原条件)。基于内蛋白酶测定法和SDS-PAGE汇集级分。

内蛋白酶测定法

1.将Protazyme OL片/5ml 250mM乙酸钠pH 5.0通过磁力搅拌溶解(底物：来自Megazyme的内蛋白酶Protazyme AK片-cat.#PRAK 11/08)。

2.在搅拌下，将250微升的底物溶液转移至1.5mL Eppendorf管。

3.将25微升的样品添加至每个管(空白为样品缓冲液)。

4.将管在Thermomixer上在50℃振荡(1000rpm)温育15分钟。

5.将250微升的1M NaOH添加至每个管，接着进行涡旋。

6.在16,000x G和25℃离心3分钟。

7.将200微升的上清转移至MTP，并记录在590nm的吸光度。

实施例3

使用纯化的酶得到的选择的蛋白酶变体的温度概貌

纯化显示良好热稳定性的选择的蛋白酶变体，并将所述纯化的酶用于如下所述的玉米醇溶蛋白-BCA测定。在所示的高温下将酶温育60分钟之后在60℃确定残余的蛋白酶活性。

玉米醇溶蛋白-BCA测定：

进行玉米醇溶蛋白-BCA测定以检测在不同温度由变体蛋白酶从玉米醇溶蛋白释放的可溶性蛋白定量。

实验方案：

1)将10微升的10微克/mL酶溶液和100微升的0.025%玉米醇溶蛋白溶液在微滴定板(MTP)中混合。

2)在不同温度温育60分钟。

3)添加10微升的100%三氯乙酸(TCA)溶液。

4)将MTP在3500rpm离心5分钟。

5)取出15微升至新的含有100微升BCA测定溶液的MTP(PierceCat#:23225,BCA Protein Assay Kit)。

6)在60℃温育30分钟。

7)测量A562。

结果示于表5。所有测试的蛋白酶变体与野生型(WT)蛋白酶相比显示改善的热稳定性。

表5：玉米醇溶蛋白-BCA测定

实施例4

草酸青霉葡糖淀粉酶的表征

草酸青霉葡糖淀粉酶公开于本发明的SEQ ID NO:9。

底物。底物：去离子水中的1%可溶性淀粉(Sigma S-9765)

反应缓冲液：0.1M乙酸(盐)缓冲液于pH 5.3

葡萄糖浓度确定试剂盒：Wako葡萄糖测定试剂盒(LabAssay glucose,WAKO,Cat#298-65701)。

反应条件：将20微升可溶性淀粉和50微升乙酸(盐)缓冲液在pH 5.3混合，将30微升酶溶液(50微克酶蛋白/ml)添加至100微升的终体积，接着在37℃温育15分钟。

葡萄糖浓度通过Wako试剂盒确定。

所有工作平行进行。

最适温度：为了评估草酸青霉葡糖淀粉酶的最适温度，将如上所述的“反应条件”测定在20，30，40，50，60，70，80，85，90和95℃进行，结果示于表6。

表6：最适温度

根据结果可见，草酸青霉葡糖淀粉酶在给定条件下的最适温度是50至70℃，且葡糖淀粉酶在95℃保持超过80%活性。

热稳定性。为了评估草酸青霉葡糖淀粉酶的热稳定性，对反应条件测定进行修改，其中将酶溶液和乙酸(盐)缓冲液在20，30，40，50，60，70，75，80，85，90和95℃预温育15分钟。在温育之后，将20微升的淀粉添加至溶液，并如上所述进行测定。

结果示于表7。

表7：热稳定性

根据结果可见，草酸青霉葡糖淀粉酶在预温育15分钟之后在高至70℃时仍稳定，因为其保持超过80%活性。

最适pH。为了评价草酸青霉葡糖淀粉酶的最适pH，将如上所述的反应条件测定在2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.07.0，8.0，9.0，10.0和11.0进行。使用下述缓冲液：100mM琥珀酸，HEPES，CHES，CAPSO，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01%Triton X-100，pH用HCl或NaOH调整至2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0 7.0，8.0，9.0，10.0或11.0。

结果示于表8。

表8：最适pH

根据结果可见，草酸青霉葡糖淀粉酶在给定条件下在pH 5.0具有最高活性。所述草酸青霉葡糖淀粉酶在广泛的pH范围具有活性，因为其在pH 2至7保持超过50%活性。

pH稳定性。为了评估草酸青霉葡糖淀粉酶的热稳定性，将反应条件测定修改为将酶溶液(50微克/mL)在使用在最适pH部分描述的缓冲液在具有pH2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0 7.0，8.0，9.0，10.0和11.0的缓冲液中预温育20小时。在预温育之后，将20微升可溶性淀粉添加至溶液中至100微升的最终体积，并如上所述进行测定。

结果示于表9。

表9：pH稳定性

根据结果可见，草酸青霉葡糖淀粉酶在预温育20小时之后，在pH 3至pH 7稳定，且其在pH 8减少活性。

实施例5：草酸青霉葡糖淀粉酶在pH5.0和70℃在预糖化中的评估

该实施例描述了乙醇产生方法，其中在预糖化方法中使用草酸青霉葡糖淀粉酶，接着不使用其它葡糖淀粉酶进行发酵方法。将该方法与传统的、其中液化方法之后进行使用非热稳定的葡糖淀粉酶进行的SSF方法的乙醇发酵方法相比较。

浆料样品。使用在2008年5月间在National Corn to Ethanol ResearchCenter(NCERC)的中试工厂中制备的浆料样品作为本研究的起始材料。样品使用完整的磨碎的玉米(无逆流(backset))以32.0%的目标%干固形物制备。将其在pH 5.80，85℃使用0.0246KNU-s/g DS的α-淀粉酶A液化30分钟。

液化处理。使用如上所述的NCERC浆料样品作为起始材料制备了一份完全液化的玉米醪。简言之，称取大约400g的浆料醪置于1L Nalgene瓶中；将浆料醪样品使用40%H₂SO₄调整至pH 5.80。然后将0.0740KNU-s/g DS的α-淀粉酶A添加至醪，然后将其在预热的水浴中在85℃再温育1.5小时，定期混合。

预糖化。在温育之后，将醪等分入两个100mL Nalgene瓶，在水浴中冷却至70℃，然后将草酸青霉葡糖淀粉酶的等分试样添加至每个醪以达到0和0.24AGU/gDS的终酶浓度。将醪在水浴中在70℃再温育2小时，定期混合。在温育之后，将醪立即冷却至室温。使用10%NaOH将醪调整至pH 5.0，并添加尿素和青霉素至达到分别1000ppm和3ppm的终浓度。对每份醪取少许样品进行HPLC分析。

结果示于表10。结果显示在预糖化中转化为葡萄糖的淀粉的百分比通过添加草酸青霉葡糖淀粉酶而得到增强。

表10

醪	葡萄糖(g/L)	%淀粉转化为葡萄糖
			对照，预糖化中无草酸青霉葡糖淀粉酶	8.43	3.6%
预糖化中0.24AGU/g DS草酸青霉葡糖淀粉酶	136.91	58.5%

发酵。在将大约5g的醪添加至每个管之前，对每个空管进行称重。在将醪添加至合适管之后，将所有管再次称重以测量起始醪重量。然后将埃默森踝节菌葡糖淀粉酶储液添加至对照管至0.50AGU/g DS的初始剂量，但不将其它葡糖淀粉酶添加至在预糖化中接受草酸青霉葡糖淀粉酶的样品。

将来自LeSaffre Corp.的Red Star Ethanol Red酵母在32℃在自来水中重新水合30分钟(5.50g置于100mL自来水中)，然后将100μl的该悬液使用重复移液管添加至每个管。亦将去离子水添加至每个管以保持恒定的起始%DS。在将埃默森踝节菌葡糖淀粉酶、水和酵母添加至每个管之后，对其进行重新称重，然后置于设为32℃的恒温室总共54小时。每日两次将管从该室移出，涡旋混合，重新称重，然后置回该室继续发酵。

在54小时的发酵之后，将所有管涡旋、重新称重，然后发酵通过将50μl的40%H₂SO₄添加至每个管，接着充分涡旋混合来终止。将管在1500xg离心10分钟，然后将上清通过0.45μm尼龙过滤器注射器过滤至标记的HPLC小瓶。然后通过HPLC分析样品的乙醇含量。

结果示于表11。可见草酸青霉葡糖淀粉酶当在pH 5.80在70℃用于预糖化步骤时产生的乙醇的量与通过常规方法(对照)产生的乙醇的量相当。考虑到与Glucoamylase T葡糖淀粉酶活性(0.5AGU/g DS)相比，仅使用了一半量的草酸青霉葡糖淀粉酶活性，这是非常良好的结果。

表11

Claims

1.一种用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其包括下述步骤：

i)使用α-淀粉酶液化含淀粉材料；

ii)使用糖源生成酶糖化，其中所述糖源生成酶具有在70℃，pH 5.3，至少70%相对活性的热稳定性；

iii)使用发酵生物发酵。

2.权利要求1的方法，其中添加至糖化步骤ii)的糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选真菌葡糖淀粉酶。

3.权利要求1或2的方法，其中添加至糖化步骤ii)的糖源生成酶，优选葡糖淀粉酶，具有在70℃，pH 5.3，至少80%，优选至少85%相对活性的热稳定性。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中添加至糖化步骤ii)的糖源生成酶，优选葡糖淀粉酶，具有在pH 4.5至少80%，优选至少85%，优选至少90%的相对活性。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中添加至糖化步骤ii)的糖源生成酶，优选葡糖淀粉酶，具有在pH 4.5至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少100%相对活性的pH稳定性。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中添加至糖化步骤ii)的糖源生成酶，优选葡糖淀粉酶，来源于青霉属的菌株，特别是来自草酸青霉(Penicilliumoxalicum)的菌株作为PCT/CN10/071753中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQID NO:9公开。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中添加至糖化步骤ii)的葡糖淀粉酶与PCT/CN10/071753中的SEQ ID NO:2或本文中SEQ ID NO:9所示的成熟多肽具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，并且甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%同一性。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中糖化步骤ii)在50℃至80℃，优选约70℃的温度进行。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中糖化步骤ii)进行10分钟至6小时，优选30分钟至3小时。

10.权利要求1-19任一项的方法，其中液化步骤i)使用细菌α-淀粉酶或真菌α-淀粉酶进行。

11.权利要求1-10任一项的方法，在液化步骤i)之前，进一步包括下述步骤：

i)磨制含淀粉材料；

ii)形成浆料，其包含经磨制的含淀粉材料和水。

12.权利要求11的方法，其中将所述浆料加热至起始糊化温度以上。

13.权利要求11或12的方法，其中将所述浆料在步骤i)之前在95至140℃，优选105至125℃的温度喷射蒸煮1-15分钟，优选3-10分钟，特别是约5分钟。

14.权利要求1-13任一项的方法，其中用于液化步骤i)的α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有至少10的T_1/2(分钟)。

15.权利要求1-14任一项的方法，其中蛋白酶，优选真菌蛋白酶在液化步骤i)或糖化步骤ii)和/或发酵如SSF过程中存在。

16.权利要求1-15任一项的方法，其中蛋白酶是热稳定性蛋白酶，其具有在80℃/70℃作为相对活性确定的超过20%的热稳定性值。

17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述蛋白酶具有在80℃/70℃作为相对活性确定的超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%的热稳定性。

18.权利要求1-17的方法，其中所述蛋白酶具有在85℃/70℃作为相对活性确定的超过12％，超过14%，超过16％，超过18%，超过20%的热稳定性。

19.权利要求16-18任一项的方法，其中所述蛋白酶是来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株，特别是橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶的变体。

20.权利要求1-19任一项的方法，进一步其中普鲁兰酶在液化步骤i)和/或糖化步骤ii)过程中存在。