CN107043796A - 一种制备麦芽糖浆的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备麦芽糖浆的方法,属于淀粉糖转化技术领域。本发明以淀粉为底物,采用高温淀粉普鲁兰酶进行同步液化与脱支反应,然后分步或同时加入耐热β‑淀粉酶和耐热麦芽糖淀粉酶进行糖化,经过脱色、浓缩,即可获得麦芽糖浆。本工艺底物浓度高、不易污染杂菌、工艺简单,可减少淀粉制糖后期的糖液蒸发能耗,简化提取工序,有利于提高麦芽糖浆的生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备麦芽糖浆的方法,属于淀粉糖转化技术领域。
背景技术
麦芽糖是由两个葡萄糖单元经α-1,4糖苷键连接而成的还原性二糖。其具有诸多优良特性:如甜度柔和(甜度只有蔗糖的30%-40%)、入口不留后味、熬糖温度高、热稳定性好、抗结晶性好,且具有多种生理功能,可广泛应用于食品和医药工业。在食品工业中,麦芽糖浆用于制作糕点,可使糕点更加柔润、膨松可口,且色泽鲜亮;用于制作牛轧糖、沙琪玛等熬制糖浆的时候,麦芽糖的加入可以防止糖浆反砂,使成品更清澈、质地更佳;麦芽糖还可用于制造麦芽糖醇,是糖尿病、高血压患者的理想甜味剂。在医药工业中,麦芽糖在血液中代谢不需要胰岛素控制,可避免血糖升高,可用于制造麦芽糖静脉注射液。
目前,麦芽糖的制备方法通常采用以下技术路线:
(1)调浆:将淀粉调成浓度为10-25%的淀粉乳,搅拌均匀后,调节pH至5.2-6.2,加入0.2-0.5%的氯化钙,充分搅拌;(2)液化:向调好的淀粉乳中加入高温α-淀粉酶,100℃分批液化或者连续喷射液化,控制液化液DE值小于4,液化结束后加酸液调pH至4.0-4.5,并升温灭酶;(3)糖化:将液化液冷却至50-62℃,加碱液调节pH至5.0-5.5,加入β-淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶(又称麦芽三糖水解酶),利用三种酶协同作用进行糖化,反应24-60小时;(4)过滤:糖化结束后,升高糖化液温度灭酶,加入活性炭进行脱色,然后再过滤、脱盐、浓缩得到麦芽糖浆。
然而,上述制备方法仍然存在以下问题:
首先,目前大多数方法采用的高温α-淀粉酶的最适温度一般为95-100℃,而β-淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶一般为中温酶,最适温度为50-60℃。由于高温α-淀粉酶和普鲁兰酶最适温度相差较大,因此淀粉液化和脱支需要分开进行;淀粉液化程度需控制在较低(DE值一般在4左右)水平才能有利于提高麦芽糖收率;为了降低体系粘度,底物浓度一般低于20%,糖化结束时,糖液中麦芽糖浓度低,后续需要提高蒸发倍数,增加了生产成本。
其次,由于采用的β-淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶都是中温酶,糖化过程中为了有利于三种酶的协同作用,糖化反应的条件一般控制在50-62℃,反应24-60小时。该条件下容易污染杂菌(如乳酸菌等),杂菌是生长会消耗糖分,产生杂酸,进而导致反应体系pH下降及酶快速失活,因此反应后期需补加酶液;此外,杂酸的生成还会导致麦芽糖收率下降,纯度降低,后续提取的难度加大,生产成本增加。
第三,反应过程中需要多次添加酸碱、调节反应体系的pH值。首先调节体系初始pH至5.2-6.2,液化结束加酸液调pH至4.0-4.5后,再升温灭活高温α-淀粉酶;进入糖化工序后,还需要加碱液调节pH至5.0-5.5。该工艺存在多次添加酸碱,一方面导致工艺操作复杂,另外一方面酸碱的加入,会给反应体系带入较多的盐离子,后续需要脱盐,增加了纯化工序的负担。
第四,反应过程需要先升温至100℃液化,然后降温至50-62℃,再升温灭酶,最后降温脱色、过滤。整个过程升温降温幅度较大,需要消耗较多的冷凝水和蒸汽,不仅造成能源的浪费,而且增加了生产成本。
申请号为201610458938.7,公开(公告)号为CN106119316A,名称《一种提高高浓度淀粉糖化生产麦芽糖浆中麦芽糖得率的方法》的中国发明专利申请,通过两阶段温度控制以及复合酶处理,可以在高浓度淀粉底物条件下,制备麦芽糖浆,有利于减少后期的蒸发能耗。然而,该技术方案的主要目的是提高淀粉底物浓度,仍然存在需要多次添加酸碱、降温升温幅度大、存在染菌几率大的问题,无法解决上述现有的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:克服现有工艺中存在的问题,提供一种麦芽糖浆制备工艺,液化与脱支同步进行,反应温度高、淀粉底物浓度高、液化后无需灭酶,仅需调节一次初始pH,工艺简单,大幅提高麦芽糖浆制备的整体效率。
本发明以30-40%的淀粉乳为底物,采用高温淀粉普鲁兰酶(EC:3.2.1.41)进行同步液化与脱支反应,然后分步或同时加入耐热β-淀粉酶(EC:3.2.1.2.)和耐热麦芽糖淀粉酶(EC3.2.1.133)进行糖化,经过脱色、浓缩,即可获得麦芽糖浆。
具体的,本发明技术方案可包括以下步骤:
(1)将淀粉与水充分搅拌、混合,制备质量浓度(以干基计)为30-40%的淀粉乳;加入0.1-0.3%的氯化钙,再将淀粉乳的pH值调节至5.3-5.6;然后以3-6U/g淀粉的比例向淀粉乳中加入高温淀粉普鲁兰酶;混匀后,升温至95-100℃,进行同步液化和脱支,控制DE值在8-10范围内;淀粉普鲁兰酶具有双重活性,即普鲁兰多糖水解酶活性和α-淀粉酶活性;为方便计算加酶量,此处所述高温淀粉普鲁兰酶酶活力为α-淀粉酶活力;
(2)将步骤(1)所得淀粉液化液体系降温至70-75℃,并向其中加入30-60U/g耐热β-淀粉酶,充分反应18-24小时;
(3)将步骤(2)所得糖化液体系降温至65-70℃,并向其中加入20-40U/g耐热麦芽糖淀粉酶,继续搅拌反应18-22小时后,糖化后料液的麦芽糖含量达到86-92%;
(4)用无水酒精检验步骤(3)糖化后料液无糊精存在时,将反应液加热至95-100℃,保温20分钟-30分钟;
(5)将步骤(4)料液冷却至70-80℃,加入占料液固形物重量0.2-1.0%的活性炭,充分搅拌均匀后,过滤、浓缩后即得到麦芽糖浆。
在本发明的一种实施方式中,步骤(2)、(3)合并进行,即将步骤(1)所得淀粉液化液体系降温至70-75℃,并向其中加入30-60U/g耐热β-淀粉酶、20-40U/g耐热麦芽糖淀粉酶充分反应18-24小时;糖化后料液的麦芽糖含量达到86-92%。
在本发明的一种实施方式中,步骤(1)所述高温淀粉普鲁兰酶具有液化活性(类似于高温α-淀粉酶水解α-1,4-糖苷键的活性)和脱支活性(类似于普鲁兰酶水解α-1,6-糖苷键的活性)。
在本发明的一种实施方式中,步骤(1)~(3)中所述高温淀粉普鲁兰酶、耐热β-淀粉酶、耐热麦芽糖淀粉酶均来源于微生物。
本发明与现有技术相比具有以下优点:
(1)采用双功能的高温淀粉普鲁兰酶对淀粉进行同步液化和脱支反应,淀粉液化DE值可以控制的较高,淀粉底物浓度高,可以30-40%的淀粉乳为底物,而现有制备方法针对10-20%的淀粉乳,本发明有利于提高最终糖化液中麦芽糖浓度,减少后续浓缩蒸发功耗,降低生产成本。
(2)由于糖化过程中采用的耐热β-淀粉酶和耐热麦芽糖淀粉酶具有很好的热稳定性,反应可以在较高的温度下进行,高于常见的淀粉糖生产过程中杂菌的生长温度,反应体系不易污染杂菌,有利于提高产物收率,减少后续分离提取压力。
(3)由于所采用的三种酶最适pH比较接近,且在较宽的pH范围内可以保持较好的活性,因此反应只需调节一次初始pH,后续无需调节pH,不会引入过多的酸、碱,可以减轻后续脱盐纯化工序的负担,有利于简化工艺。
(4)反应过程中只需在糖化后进行一次升温灭酶,反应过程中无需多次大幅度升温、降温,有利于减少蒸汽和冷凝水的消耗,降低成本。
附图说明
图1本发明一种实施方式的工艺路线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,所述实施例仅是范例性的,不对本发明构成任何限制。
实验材料:玉米淀粉为山东西王集团公司产品;木薯淀粉为广西南宁市武鸣隆禧淀粉厂产品。大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)和pET20b为Novagen公司产品。常用化学试剂为国药集团化学试剂有限公司产品。本发明中高温淀粉普鲁兰酶、耐热β-淀粉酶和耐热麦芽糖淀粉酶均为采用基因工程方法构建重组菌株,并诱导表达获得。
实施例1
(1)高温淀粉普鲁兰酶的制备
从ATCC购买获得Thermococcus litoralis DSM5473,以该菌的基因组为模版,PCR获得序列如NCBI数据库中GeneID为16549640的序列,连接到表达载体pET20b中,再转化宿主菌株BL21(DE3);将重组菌株接种到TB培养基(甘油5g/L,蛋白胨12g/L,酵母膏24g/L,磷酸氢二钾12.54g/L,磷酸二氢钾2.31g/L,卡那霉素30μg/mL)培养,并采用IPTG诱导表达,离心后获得重组高温淀粉普鲁兰酶。酶活力测定显示发酵上清液中普鲁兰酶酶活力为36.8U/mL,α-淀粉酶酶活力为103.6U/mL。
所述淀粉普鲁兰酶具有普鲁兰酶和α-淀粉酶双重活性,可以同时水解淀粉底物中的α-1,6糖苷键和α-1,4糖苷键。酶活力测定需要分别测定普鲁兰酶和α-淀粉酶活性。使用过程中为方便计算加酶量,所述加酶量为α-淀粉酶活力。
普鲁兰酶酶活测定方法:
取1.9mL的底物(0.5%普鲁兰多糖溶解于50mM pH 5.5的磷酸缓冲液中),95℃水浴预热10min。加入0.1mL稀释的酶液样品,反应10min,加入3mL DNS,沸水浴7min。向上述反应体系中加入10mL的蒸馏水,混匀,在540nm下测量其吸光值。酶活单位定义为,在上述条件下,每分钟催化产生相当于1μmol葡萄糖还原力的还原糖的酶量定义为一个活力单位。
α-淀粉酶酶活测定方法:
准确吸取2.5mL 1%可溶性淀粉溶液(溶解于50mMpH6.0磷酸缓冲溶液),于95℃水浴预热5min,加入100μL酶液,反应5min,立即取出1mL反应液,置于含有0.5mL 0.1mol/L盐酸溶液中终止酶解反应,加入5mL稀碘液,摇匀。以稀碘液为空白,在660nm波长下测吸光度(A)。根据吸光度计算测试酶液的活力。α-淀粉酶酶活单位定义:在上述条件下,1分钟液化1mg可溶性淀粉所需的酶量定义为一个酶活力单位。
(2)耐热β-淀粉酶的制备
耐热β-淀粉酶来源于Thermoanaerobacterium thermosulfurigenesATCC 33743,耐热β-淀粉酶编码基因在NCBI数据库中的AAA23204.1。菌株基因组DNA从ATCC购买,同样采用PCR方法获得目的基因片段并连接到表达载体pET20b中,再转化宿主菌株BL21(DE3);将重组菌株接种到TB培养基培养,并采用IPTG诱导表达,离心后获得重组耐热β-淀粉酶。酶活力测定显示发酵上清液中β-淀粉酶酶活力为208.1U/mL。
β-淀粉酶样品酶活力测定:
吸取0.9mL 1%可溶性淀粉溶液(溶解于50mM pH5.5磷酸盐缓冲溶液),于70℃水浴预热5min;然后加入100μL酶液,反应10min后,立即加入0.8mL DNS溶液。沸水浴中煮沸5min。上述反应体系加适量蒸馏水并定容至13mL;混匀后用1cm比色皿在540nm波长下测吸光度(A)。根据吸光度求得测试酶液的浓度。酶活力单位定义:在上述条件下条件下,每分钟水解可溶性淀粉生成1μmol麦芽糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
(3)耐热麦芽糖淀粉酶的制备
耐热麦芽糖淀粉酶Thermotoga neapolitana LA10,耐热麦芽糖淀粉酶蛋白在NCBI数据库中的登录号为LA10_RS03670。根据大肠杆菌密码子偏好性优化编码基因序列,并通过人工合成获得目的基因片段并连接到表达载体pET29b中,再转化宿主菌株BL21(DE3);将重组菌株接种到TB培养基培养,并采用IPTG诱导表达,离心后获得重组耐热麦芽糖淀粉酶。酶活力测定显示发酵上清液中麦芽糖淀粉酶酶活力为118.0U/mL。
酶活力测定方法:
取2mL的0.5%可溶性淀粉溶液(溶解于50mM pH5.5磷酸盐缓冲液)于试管中,置于65℃水浴锅中预热10min。加入0.1mL酶液,准确计时10min,加入3mLDNS振荡均匀,放入冰水中终止反应,沸水浴煮沸7min,加入蒸馏水并定容至15mL,混匀。在540nm波长下测定吸光值并计算酶活力。酶活力单位定义:上述条件下,每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶量作为一个活力单位。
实施例2
称取500克玉米淀粉,加入适量的水制备成质量浓度(以纯淀粉干基计)为30%的淀粉乳,加入0.2%的氯化钙,调节淀粉乳的pH值至5.5,然后加入高温淀粉普鲁兰酶,该酶的加量为每克淀粉(以纯淀粉干基计)加5U(以α-淀粉酶活性计),充分搅拌混合均匀,逐步升温至95℃,控制搅拌转速为100转/分钟,液化80分钟,测定液化体系的DE值为8.1。
将淀粉液化液体系降温至70℃,并向其中加入耐热β-淀粉酶和耐热麦芽糖淀粉酶,加入量为每克纯淀粉分别加30U和40U,控制搅拌转速为150转/分钟,继续反应20小时。
取样用无水酒精检验糖化料液中无糊精存在时,将反应液加热迅速升温至100℃,保温30分钟灭酶。将料液冷却至70℃,加入占料液固形物重量0.3%的活性炭,搅拌均匀,过滤后即得到糖化液。
通过高压液相色谱检测糖液成分,结果显示体系中麦芽糖含量达到86.5%,浓度为256.8克/升。糖液再经过浓缩得到浓度为80%、麦芽糖含量为86%以上的麦芽糖糖浆。
实施例3
称取500克木薯淀粉,加入适量的水制备成质量浓度(以纯淀粉干基计)为30%的淀粉乳,加入0.1%的氯化钙,调节淀粉乳的pH值至5.6,然后加入高温淀粉普鲁兰酶,该酶的加量为每克淀粉(以纯淀粉干基计)加5U(以α-淀粉酶活性计),充分搅拌混合均匀,逐步升温至100℃,控制搅拌转速为100转/分钟,液化80分钟,测定液化体系的DE值为9.0。
将淀粉液化液体系降温至70℃,并向其中加入耐热β-淀粉酶和耐热麦芽糖淀粉酶,加入量为每克纯淀粉分别加60U和30U,控制搅拌转速为150转/分钟,继续反应20小时。
取样用无水酒精检验糖化料液中无糊精存在时,将反应液加热迅速升温至100℃,保温30分钟灭酶。将料液冷却至70℃,加入占料液固形物重量0.3%的活性炭,搅拌均匀,过滤后即得到糖化液。
通过高压液相色谱检测糖液成分,结果显示体系中麦芽糖含量达到89.3%,浓度为265.1克/升。糖液再经过浓缩得到浓度为80%、麦芽糖含量为89%以上的麦芽糖糖浆。
实施例4
称取500克玉米淀粉,加入适量的水制备成质量浓度(以纯淀粉干基计)为30%的淀粉乳,加入0.2%的氯化钙,调节淀粉乳的pH值至5.3,然后加入高温淀粉普鲁兰酶,该酶的加量为每克淀粉(以纯淀粉干基计)加3U(以α-淀粉酶活性计),充分搅拌混合均匀,逐步升温至100℃,控制搅拌转速为100转/分钟,液化80分钟,测定液化体系的DE值为9.6。
将淀粉液化液体系降温至75℃,并向其中加入耐热β-淀粉酶,加入量为每克纯淀粉加50U,控制搅拌转速为150转/分钟,继续反应18小时。再将糖化液体系降温至65℃,按照每克纯淀粉加入20U的耐热麦芽糖淀粉酶进行添加,继续控制搅拌转速为150转/分钟,反应20小时。
取样用无水酒精检验糖化料液中无糊精存在时,将反应液加热迅速升温至100℃,保温30分钟灭酶。将料液冷却至70℃,加入占料液固形物重量0.3%的活性炭,搅拌均匀,过滤后即得到糖化液。
通过高压液相色谱检测糖液成分,结果显示体系中麦芽糖含量达到91%,浓度为270.1克/升。糖液再经过浓缩得到浓度为80%、麦芽糖含量为91%的麦芽糖糖浆。
实施例5
称取500克木薯淀粉,加入适量的水制备成质量浓度(以纯淀粉干基计)为40%的淀粉乳,加入0.2%的氯化钙,调节淀粉乳的pH值至5.5,然后加入高温淀粉普鲁兰酶,该酶的加量为每克淀粉(以纯淀粉干基计)加6U(以α-淀粉酶活性计),充分搅拌混合均匀,逐步升温至100℃,控制搅拌转速为100转/分钟,液化90分钟,测定液化体系的DE值为10。
将淀粉液化液体系降温至75℃,并向其中加入耐热β-淀粉酶,加入量为每克纯淀粉加60U,控制搅拌转速为150转/分钟,继续反应20小时。再将糖化液体系降温至65℃,按照每克纯淀粉加入40U的耐热麦芽糖淀粉酶进行添加,继续控制搅拌转速为150转/分钟,反应20小时。
取样用无水酒精检验糖化料液中无糊精存在时,将反应液加热迅速升温至100℃,保温30分钟灭酶。将料液冷却至70℃,加入占料液固形物重量0.3%的活性炭,搅拌均匀,过滤后即得到糖化液。
通过高压液相色谱检测糖液成分,结果显示体系中麦芽糖含量达到92.3%,浓度为274.0克/升。糖液再经过浓缩得到浓度为80%、麦芽糖含量为92%以上的麦芽糖糖浆。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种制备麦芽糖浆的方法,其特征在于,以30-40%的淀粉乳为底物,采用高温淀粉普鲁兰酶进行同步液化与脱支反应,然后分步或同时加入耐热β-淀粉酶和耐热麦芽糖淀粉酶进行糖化,经过脱色、浓缩,即可获得麦芽糖浆。
2.根据权利要求1所述的一种制备麦芽糖浆的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)、将淀粉与水充分搅拌、混合,制备质量浓度为30-40%的淀粉乳;加入0.1-0.3%的氯化钙,再将淀粉乳的pH值调节至5.3-5.6;然后以3-6U/g淀粉的比例向淀粉乳中加入高温淀粉普鲁兰酶;混匀后,升温至95-100℃,进行同步液化和脱支,控制DE值在8-10范围内;
(2)、将步骤(1)所得淀粉液化液体系降温至70-75℃,并向其中加入30-60U/g耐热β-淀粉酶,充分反应18-24小时;
(3)、将步骤(2)所得糖化液体系降温至65-70℃,并向其中加入20-40U/g耐热麦芽糖淀粉酶,继续搅拌反应18-22小时后,糖化后料液的麦芽糖含量达到86-92%;
(4)用无水酒精检验步骤(3)糖化后料液无糊精存在时,将反应液加热至95-100℃,保温20分钟-30分钟;
(5)将步骤(4)料液冷却至70-80℃,加入占料液固形物重量0.2-1.0%的活性炭,充分搅拌均匀后,过滤、浓缩后即得到麦芽糖浆。
3.根据权利要求2所述的一种制备麦芽糖浆的方法,其特征在于,步骤(2)、(3)合并进行,即将步骤(1)所得淀粉液化液体系降温至70-75℃,并向其中加入30-60U/g耐热β-淀粉酶、20-40U/g耐热麦芽糖淀粉酶充分反应18-24小时;糖化后料液的麦芽糖含量达到86-92%。
4.根据权利要求1~3任一所述的一种制备麦芽糖浆的方法,其特征在于,步骤(1)所述高温淀粉普鲁兰酶具有液化活性和脱支活性,编码高温淀粉普鲁兰酶的基因的核苷酸序列如NCBI数据库中GeneID为16549640的序列所示。
5.根据权利要求1~3任一所述的一种制备麦芽糖浆的方法,其特征在于,步骤(1)~(3)中所述高温淀粉普鲁兰酶、耐热β-淀粉酶、耐热麦芽糖淀粉酶均来源于微生物。
6.根据权利要求4所述的一种制备麦芽糖浆的方法,其特征在于,将编码高温淀粉普鲁兰酶的基因,连接到表达载体pET20b中,再转化宿主菌株BL21(DE3);将重组菌株接种到TB培养基培养,并采用IPTG诱导表达,离心后获得重组高温淀粉普鲁兰酶。
7.一种重组表达高温淀粉普鲁兰酶的重组菌,其特征在于,将编码高温淀粉普鲁兰酶的基因,连接到表达载体pET20b中,再转化宿主菌株BL21(DE3);所述高温淀粉普鲁兰酶的基因的序列如NCBI数据库中GeneID为16549640的序列。
8.一种生产高温淀粉普鲁兰酶的方法,其特征在于,将编码高温淀粉普鲁兰酶的基因,连接到表达载体pET20b中,再转化宿主菌株BL21(DE3),将重组菌株接种到TB培养基培养,并采用IPTG诱导表达,发酵结束后,离心获得重组高温淀粉普鲁兰酶;所述高温淀粉普鲁兰酶的基因的序列如NCBI数据库中GeneID为16549640的序列。
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