CN108300749A - 一种用双酶法制备直链麦芽五糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用双酶法制备直链麦芽五糖的方法，属于功能糖生产技术领域。所用直链麦芽低聚糖生成酶的氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1，所用普鲁兰酶购自日本天野酶制剂集团。配制pH 5.5～6.5的淀粉或麦芽糊精溶液为底物，按50～100U/g加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶，按2～5U/g加酶量加入普鲁兰酶，于60～70℃下反应24～72小时后得到直链麦芽低聚糖浆，转化率(以葡萄糖～直链麦芽七糖计)达90％以上。其中主产物为直链麦芽五糖，百分比例可达40％以上。本发明所用的两种酶可同时加入，不需要中途调节反应温度或pH，也不需要α‑淀粉酶液化底物，不需要添加钙离子，生产工艺简单、安全且经济，具有较大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种用双酶法制备直链麦芽五糖的方法，属于功能糖生产技术领域。
背景技术
直链麦芽低聚糖是指由3-10个葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键组成的一类功能性低聚糖。其具有良好的食品加工适应性：可作为口感柔和的甜味剂；在烘焙、膨化食品中可作为水分调节剂；在冷饮中可改善冷饮的抗融性能、提高冰淇淋的膨胀率；在巧克力、果酱等食品中可有效抑制晶体结晶；在流质食品中可作为增稠剂；此外还能抑制淀粉老化和速冻食品中的蛋白质变性，从而延长保质期。
直链麦芽低聚糖还具有以下独特的生理功效：其在小肠被消化吸收，引起的血糖反应比葡萄糖平稳，能为人体缓慢而持续地供能，可用于运动员的能量补充或胰脏切除病人、肾病患者的膳食治疗；其不易被细菌发酵利用，有利于预防龋齿；其能选择性抑制肠道腐败菌的生长而促进益生菌增殖，从而维护肠道健康；此外还可以促使人体对钙的吸收，有效预防中老年人骨质疏松。因此，直链麦芽低聚糖在运动员食品、婴幼儿食品和保健食品中均有很好的应用前景。
工业上酶法生产直链麦芽低聚糖，是通过直链麦芽低聚糖生成酶水解淀粉α-1,4-糖苷键切下多个葡萄糖单元而成。现有的生产直链麦芽低聚糖的方法被日本垄断，通常需要α-淀粉酶先进行淀粉液化再由直链麦芽低聚生成酶进行糖化，并添加钙离子以改善酶的稳定性，而国内尚未实现直链麦芽低聚糖的工业化生产。在国内外实验室研究水平上，所用的底物浓度均较低(1～5％)，转化率水平一般在50％～75％左右；对于直链麦芽五糖生成酶的研究，产物中的麦芽五糖含量只有定性分析而未做定量说明，不可直接扩大并应用于工业化生产。随着直链麦芽低聚糖在各个领域中的应用前景越来越广泛，有必要在国内开发具有工业应用价值的高纯度单一直链麦芽低聚糖。
发明内容
为解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种制备麦芽五糖的方法，所述方法采用直链麦芽低聚糖生成酶和普鲁兰酶，水解淀粉或麦芽糊精生成含直链麦芽五糖的低聚糖浆。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以50～100U/g底物的添加量加入直链麦芽低聚糖生成酶，同时按2～5U/g底物的加酶量加入普鲁兰酶，水解淀粉或麦芽糊精生成含直链麦芽五糖的低聚糖浆。
在本发明的一种实施方式中，所述直链麦芽低聚糖生成酶的GenBank登录号为AIV43245.1。
在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶购自日本天野酶制剂集团。
在本发明的一种实施方式中，所述直链麦芽低聚糖生成酶由表达GenBank中的编号为AIV43245.1的酶的基因工程菌发酵获得。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌包括以Bacillussubtilis WB 600为宿主，以pST为载体，表达GenBank登录号为AIV43245.1的酶。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉包括玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉、大米淀粉或小麦淀粉。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以所述直链麦芽低聚糖生成酶和普鲁兰酶为催化剂，以pH 5.5～6.5的淀粉溶液或麦芽糊精溶液为底物，按50～100U/g底物的加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶，同时按2～5U/g底物的加酶量加入普鲁兰酶，在60～70℃下反应24～72小时。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以100U/g底物的加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶，以2U/g加酶量加入普鲁兰酶，在pH 6.0，60℃下反应24～72小时。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以80U/g底物的加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶，以5U/g加酶量加入普鲁兰酶，在pH 6.0，60～70℃反应48小时。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以50～100U/g底物的加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶，以2U/g加酶量加入普鲁兰酶，在pH 5.5，60℃下反应48小时。
本发明的第二个目的是提供一种含40％以上麦芽五糖的低聚糖浆，是由所述方法制备获得的。
本发明的第三个目的是提供所述低聚糖浆在食品、药品或保健品中的应用。
本发明还提供所述方法在制备含低聚糖的产品中的应用。
本发明的有益效果在于：
1)本发明所用的直链麦芽低聚糖生成酶由食品级枯草芽孢杆菌表达，安全无毒。该热稳定性好，且比酶活高，可以水解淀粉或麦芽糊精生成含40％以上麦芽五糖的直链麦芽低聚糖浆，同时葡萄糖含量在10％以内。可用于分离纯化得到高纯度的直链麦芽五糖，或作为功能性饮料的甜味剂，具有一定的市场竞争力；
2)本发明所用的双酶法对底物的转化率和主产物麦芽五糖的纯度较高，分别达到90％和40％以上，可以有效降低高纯度直链麦芽五糖的生产加工成本，从而更具有工业应用价值；
3)本发明所提供的生产直链麦芽五糖糖浆的方法，和其他生产淀粉糖的方法相比，不需要添加α-淀粉酶用于液化，可由直链麦芽低聚糖生成酶本身进行淀粉液化和糖化，同时，所用的普鲁兰酶和直链麦芽低聚糖生成酶的使用温度范围和pH范围有重合，可以同时加入，此外也不需要在生产过程中调节温度和pH，相对而言工艺更为简单、经济、便捷。
附图说明
图1为采用实施例1的方法制备的糖浆产品的HPAEC-PAD曲线(反应24h，稀释600倍)；G1～G7分别代表葡萄糖、麦芽糖、直链麦芽三糖、直链麦芽四糖、直链麦芽五糖、直链麦芽六糖、直链麦芽七糖。
图2为采用实施例1的方法制备的糖浆产品中样品组分及相对含量。
图3为采用实施例2的方法制备的糖浆产品中样品组分及相对含量。
具体实施方式
直链麦芽低聚糖生成酶活力的测定方法：采用DNS法。以C6H8O7-Na2HPO4缓冲液(10mM，pH 6)配制1％(w/v)可溶性淀粉溶液作为底物，在1.98mL底物中加入20μL稀释后的酶液，60℃下反应15min，加入2.0mLDNS溶液终止反应，沸水浴中显色5min后立即冰浴冷却，于540nm下测定吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算出体系中还原糖含量。以每分钟生成1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。
普鲁兰酶活力的测定方法：采用DNS法。以C6H8O7-Na2HPO4缓冲液(10mM，pH 6)配制1％(w/v)普鲁兰多糖溶液作为底物，在1.98mL底物中加入20μL稀释后的酶液，60℃下反应15min，加入2.0mLDNS溶液终止反应，沸水浴中显色5min后立即冰浴冷却，于540nm下测定吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算出体系中还原糖含量。以每分钟生成1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。
实施例1
配制pH 6.0的10％麦芽糊精(DE＝6)溶液为底物，以100U/g加酶量加入麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)，以2U/g加酶量加入普鲁兰酶，在60℃下反应24～72h，反应结束后沸水浴40min灭酶，用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品。反应24h的色谱图如图1所示。不同反应时间对应的糖浆中各组分的相对含量如图2所示，此时主产物麦芽五糖含量均达43％以上，底物转化率为90.2％～99.8％，而葡萄糖含量均在10％以内，DP值8及以上的直链低聚糖未检出，说明反应体系中底物已被水解充分，少量未被转化的底物可能以极限糊精的形式存在，方便分离。
实施例2
配制30％的麦芽糊精(DE＝6)溶液为底物，调节pH 5.5，按50U/g加酶量加入麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)，按5U/g加酶量加入普鲁兰酶，在70℃下反应72h，反应结束后沸水浴灭酶，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品的组分与含量结果如图3所示，此时糖浆中主产物麦芽五糖含量为40.5％，底物转化率达91.7％。
实施例3
配制10％的玉米淀粉溶液为底物，调节pH 6.5，按100U/g加酶量加入麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)，按2U/g加酶量加入普鲁兰酶，在60℃下反应48h，反应结束后沸水浴灭酶，经高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定，糖浆中主产物麦芽五糖含量为43.3％，底物转化率达96.5％。
实施例4
配制10％的马铃薯淀粉溶液为底物，调节pH 6.0，按80U/g加酶量加入麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)，按5U/g加酶量加入普鲁兰酶，分别在60～70℃下反应48h，反应结束后沸水浴灭酶，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品的组分与含量结果如表1所示，此时糖浆中主产物麦芽五糖含量为40.9％～42.3％，底物转化率达95％以上。
表1不同反应温度对糖浆产品中样品组分及底物转化率的影响。
实施例5
配制10％的麦芽糊精(DE＝6)溶液为底物，调节pH 5.5，分别按50U/g、75U/g、100U/g加酶量加入麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)，以2U/g加酶量加入普鲁兰酶，在60℃下反应48h，反应结束后沸水浴灭酶，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品的组分与含量结果如表2所示，此时糖浆中主产物麦芽五糖含量为40.2～43.4％，底物转化率达90％以上。
表2不同麦芽低聚糖生成酶加酶量对糖浆产品中样品组分及底物转化率的影响
实施例6：
配制10％的麦芽糊精(DE＝6)溶液为底物，调节pH 5.5，按75U/g加酶量加入麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)，分别以1U/g、2U/g、3U/g、5U/g加酶量加入普鲁兰酶，在60℃下反应48h，反应结束后沸水浴灭酶，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品的组分与含量结果如表3所示，此时糖浆中主产物麦芽五糖含量为40.03％～44.1％，2U/g～5U/g普鲁兰酶加酶量对应的底物转化率达90％以上。
表3不同普鲁兰酶加酶量对糖浆产品中样品组分及底物转化率的影响
实施例7：
配制10％的麦芽糊精(DE＝6)溶液为底物，调节pH 5.5，按75U/g加酶量加入麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)后，分别在0、12、24、36h以5U/g加酶量加入普鲁兰酶，在60℃下反应至总时长达48h，反应结束后沸水浴灭酶，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品的组分与含量结果如表4所示，此时普鲁兰酶加酶量对应的糖浆中主产物麦芽五糖含量为40.12％～43.9％，反应前24h加入普卢兰酶转化率大于90％。
表4普鲁兰酶添加时间对糖浆产品中样品组分及底物转化率的影响
对照例1：
配制10％的麦芽糊精(DE＝6)溶液为底物，调节pH 5.5，按75U/g加酶量加入麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)后，同时以5U/g加酶量加入购自诺维信公司的普鲁兰酶，在60℃下反应48h沸水浴灭酶，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品的组分与含量，其转化率为98.3％，主产物麦芽五糖含量为36.8％，均低于实施例9中相同条件下购自日本天野酶制剂公司的普鲁兰酶的效果。
对照例2：
配制10％的麦芽糊精(DE＝6)溶液为底物，调节pH 5.5，按75U/g加酶量加入麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)后，同时以5U/g加酶量加入的异淀粉酶(酶活测定方法同普鲁兰酶)(美国SIGMA公司，I5284)，在60℃下反应48h沸水浴灭酶，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品的组分与含量，其主产物麦芽五糖含量为41.0％，但转化率为86.1％，明显低于实施例9中相同条件下购自日本天野酶制剂公司的普鲁兰酶的效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种制备麦芽五糖的方法，其特征在于，所述方法采用直链麦芽低聚糖生成酶和普鲁兰酶，水解淀粉或麦芽糊精生成含直链麦芽五糖的低聚糖浆。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述直链麦芽低聚糖生成酶的添加量为50～100U/g底物；普鲁兰酶的添加量为2～5U/g底物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述直链麦芽低聚糖生成酶的GenBank登录号为AIV43245.1。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述普鲁兰酶购自日本天野酶制剂集团。
5.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述直链麦芽低聚糖生成酶由表达GenBank中的编号为AIV43245.1的酶的基因工程菌发酵获得。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淀粉包括玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉、大米淀粉或小麦淀粉。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是以所述直链麦芽低聚糖生成酶和普鲁兰酶为催化剂，以pH 5.5～.6.5的淀粉溶液或麦芽糊精溶液为底物，按50～100U/g底物的加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶，按2～5U/g底物的加酶量加入普鲁兰酶，在60～70℃下反应24～72小时。
8.权利要求1～8任一所述方法在制备含低聚糖的产品中的应用。
9.权利要求1～8任一所述方法制备的麦芽低聚糖浆。
10.权利要求9所述的麦芽低聚糖浆在食品、药品或保健品中的应用。
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