CN113307885A

CN113307885A - 一种产物特异性提高的融合蛋白及其制备直链麦芽五糖的应用

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Publication number: CN113307885A
Application number: CN202110582428.1A
Authority: CN
Inventors: 李兆丰; 韩煦; 班宵逢; 顾正彪; 李才明; 程力; 洪雁
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2041-05-26
Also published as: CN113307885B

Abstract

本发明公开了一种产物特异性提高的融合蛋白及其制备直链麦芽五糖的应用，属于酶工程技术领域。本发明通过将直链麦芽五糖生成酶基因的C端与碳水化合物结合模块20基因进行重组，以此提高酶对底物的亲和力和催化效率，以及酶对中间产物的水解程度，从而得到产物特异性提高的融合蛋白。并建立了利用该融合蛋白水解工业浓度淀粉底物制备直链麦芽五糖的反应体系，体现了该融合蛋白的应用潜力。

Description

一种产物特异性提高的融合蛋白及其制备直链麦芽五糖的应用

技术领域

本发明涉及一种产物特异性提高的融合蛋白及其制备直链麦芽五糖的应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

直链麦芽低聚糖(Maltooligosaccharide，MOS)是3～10个葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接构成的链状低聚糖，其中直链麦芽五糖(Maltopentaose，G5)是MOS的一种，由5个葡萄糖分子结合而成。G5是一种具有多重功能的新型糖源，其在食品、医药等多种领域拥有广阔的应用前景。

直链麦芽五糖生成酶(Maltopentaose-forming amylases，G5-淀粉酶)是生产直链麦芽五糖的特异性酶，该酶能水解淀粉的α-1,4-糖苷键，生成以直链麦芽五糖为主的直链麦芽低聚糖混合物，属于糖苷水解酶13家族(GH13)。

目前直链麦芽五糖的工业化酶法制备过程主要包括淀粉浆的液化、糖化、脱支及目标产物的分离纯化这几个步骤。糖化阶段是直链麦芽五糖酶法制备过程中不同于葡萄糖制备过程的独特阶段，使用直链麦芽五糖生成酶将液化后的底物转化为以直链麦芽五糖为主的直链麦芽低聚糖混合物，并添加普鲁兰酶(一种脱支酶)进行脱支反应以提高产物转化率。反应结束后，含有酶、残余淀粉底物、极限糊精和其他一些副产品的杂质被分离出去，再经真空浓缩、结晶、过滤、洗涤和干燥，最终得到直链麦芽五糖纯品。其中糖化阶段为决定最终产品品质的重要步骤，直链麦芽五糖生成酶作为生产直链麦芽五糖产品的酶制剂，其关键特性之一是产物特异性。产物特异性的高低直接决定酶解液中目标产物的浓度和纯度，以及后续对纯品的分离提纯难度。

但是现有技术当中还是存在直链麦芽五糖生成酶产物特异性比较低的情况，目前采用大多数天然来源的直链麦芽五糖生成酶制备得到直链麦芽五糖在产物中的占比仅为20％～40％，产量较低，因此，改善直链麦芽五糖生成酶的产物特异性，提高酶解主产物比例，从而节省下游分离成本，对推动直链麦芽五糖产品的发展具有重要意义。

目前，关于直链麦芽五糖生成酶产物特异性的研究思路大多从关键氨基酸类型、位置和相互作用着手，通过理性设计突变点，来改善直链麦芽五糖生成酶的产物特异性。但由于目前直链麦芽五糖生成酶结构信息的缺乏，直链麦芽五糖生成酶的结构与产物特异性之间关系的研究仍然非常有限。值得注意的是，研究发现使用定点突变技术获得的大部分突变体会造成酶产物特异性的降低，需要对酶的构效关系有较为充分的研究，才可以基于此理性设计突变点以改善酶的产物特异性；对酶产物特异性的改善往往集中于在活性中心附近进行突变，影响了酶和底物结合的稳定性，从而会对直链麦芽五糖生成酶的催化活力有负面作用；对于不同来源的直链麦芽五糖生成酶，氨基酸残基的作用可能是多重的，突变不同来源的直链麦芽五糖生成酶中对应的相同氨基酸残基，突变体的效果有时存在较大差异。因此采用定点突变的手段改善酶的产物特异性具有一定的局限。

因此，如何提高直链麦芽五糖生成酶的产物特异性，提高酶解主产物比例，成为研究的热点和难点。

发明内容

为了解决现有技术当中存在的直链麦芽五糖生成酶产物特异性比较低、直链麦芽五糖产量比较低的问题，本发明通过将直链麦芽五糖生成酶基因的C端与碳水化合物结合模块20(carbohydrate-binding module 20，CBM20)的基因进行重组，构建表达出融合蛋白，以提高酶对底物的亲和力和催化效率，以及酶对中间产物的水解程度，从而得到产物特异性提高的直链麦芽五糖生成酶。

本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白是通过所述直链麦芽五糖生成酶基因的C端与碳水化合物结合模块20的基因进行重组，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述直链麦芽五糖生成酶氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述直链麦芽五糖生成酶核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了一种编码上述融合蛋白的基因。

本发明还提供了一种含有上述融合蛋白，或上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pHT01。

本发明还提供了一种含有上述融合蛋白，或上述基因，或上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以真菌或细菌为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞为重组枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌WB600为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以pHT01为表达载体。

本发明还提供了一种生产直链麦芽五糖的方法，所述方法为：向含有底物淀粉的反应体系中分别添加α-淀粉酶、上述融合蛋白进行反应制备得到直链麦芽五糖。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括，向反应体系中加入融合蛋白之后，添加脱支酶进行反应制备得到直链麦芽五糖

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：

(1)将底物在58～62℃保温8～12min；

(2)向底物中添加α-淀粉酶，在92～97℃条件下液化10～20min，得到液化后的淀粉；

(3)将液化后的淀粉降温至35～42℃，加入融合蛋白反应32～40h后，加入脱支酶反应6～10h。

在本发明的一种实施方式中，所述底物淀粉为：木薯淀粉、麦芽糊精、玉米淀粉和可溶性淀粉中的一种或多种。

在本发明的一种实施方式中，所述底物的添加量为5％～20％(w/w)。

在本发明的一种实施方式中，所述融合蛋白的加酶量为20～30U/g(以干基淀粉计)，所述脱支酶的加酶量为2～10U/g(以干基淀粉计)。

在本发明的一种实施方式中，所述底物淀粉的处理方法：在60℃保温10min；添加2U/g淀粉的α-淀粉酶在95℃条件下液化15min，得到液化后的淀粉；将液化后的淀粉降温至40℃，加入25U/g淀粉的融合蛋白反应36h后加入5U/g的脱支酶反应8h。

在本发明的一种实施方式中，所述底物浓度为20％(w/w)。

在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶购自上海Sigma-Aldrich公司。

在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶的添加量为2U/g(以干基淀粉计)。

在本发明的一种实施方式中，所述脱支酶为普鲁兰酶，购自上海Sigma-Aldrich公司。

在本发明的一种实施方式中，所述脱支酶的添加量为5U/g(以干基淀粉计)。

在本发明的一种实施方式中，所述融合蛋白BsMFA酶的添加量为25U/g(以干基底物计)。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)以20％(w/w)的淀粉为底物，将底物在60℃保温5min；

(2)向底物中添加α-淀粉酶，在95℃条件下液化15min，得到液化后的淀粉；

(3)将液化后的淀粉降温至40℃，并加入25U/g淀粉的融合蛋白反应36h后，调整体系pH为4.5，加入5U/g的脱支酶反应8h。

本发明还提供了上述融合蛋白，或上述基因，或商行书重组载体，或上述重组细胞，或上述方法在制备含有直链麦芽五糖的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品或化学品。

有益效果

(1)直链麦芽五糖生成酶作为生产直链麦芽五糖产品的酶制剂，其关键特性之一是产物特异性。产物特异性的高低直接决定酶解液中目标产物的浓度和纯度，以及后续对纯品的分离提纯难度。与野生型直链麦芽五糖生成酶相比，本发明所得的融合蛋白BsMFA酶水解木薯淀粉、麦芽糊精、玉米淀粉和可溶性淀粉时，产物中的直链麦芽五糖比例分别相对增加38.30％、10.23％、14.99％和26.32％，产物特异性上具有显著性优势。通过融合蛋白策略改善了直链麦芽五糖生成酶的产物特异性，提高酶解主产物比例，从而节省了下游分离成本，对推动直链麦芽五糖产品的发展具有重要意义。

(2)本发明通过融合蛋白策略提高直链麦芽五糖生成酶的产物特异性，该策略克服了定点突变手段改善酶产物特异性时会对酶的催化活力产生负面作用的局限，对其他直链麦芽低聚糖生成酶的改造具有一定的指导意义。本发明提供了工业浓度上制备直链麦芽五糖的体系，最终实现淀粉底物92.67％的转化率，所得产物中直链麦芽五糖所占比例为47.71％。为工业上应用直链麦芽五糖生成酶高效制备直链麦芽五糖提供参考依据。

附图说明

图1：直链麦芽低聚糖生成酶BmMFA酶及其融合蛋白BsMFA酶SDS-PAGE电泳；其中，MK为蛋白质分子量标准。

图2：直链麦芽低聚糖生成酶BmMFA酶及其融合蛋白BsMFA酶的产物特异性比较；其中，(a)：底物为麦芽糊精；(b)：底物为木薯淀粉；(c)：底物为可溶性淀粉；(d)：底物为玉米淀粉；

图中*(p<0.05)和**(p<0.01)表示BmMFA酶与BsMFA酶水解产物中G5百分含量具有显著性差异。

图3：保温时间对酶促反应的影响。

图4：液化时间对酶促反应的影响。

图5：融合蛋白BsMFA酶加酶量对酶促反应的影响。

图6：普鲁兰酶添加量对酶促反应的影响。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的玉米淀粉购自河北玉锋实业集团有限公司；木薯淀粉购自广西红枫淀粉有限公司；麦芽糊精购自法国罗盖特公司；可溶性淀粉购自国药集团化学试剂有限公司。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

直链麦芽五糖生成酶及融合蛋白水解活力测定方法：

通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖含量变化来表征直链麦芽五糖生成酶及融合蛋白的水解活力。以NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(10mM，pH 7.0)配制1％(w/v)可溶性淀粉溶液作为底物。0.9mL底物中加入0.1mL以相同的缓冲液稀释的酶液，50℃下反应15min后加入1.0mL DNS终止反应。沸水浴5min后立即置于冰水中冷却。加入2mL去离子水混匀，540nm下测定吸光度。根据葡萄糖标准曲线计算出体系中还原糖含量，以每分钟生成1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需酶量定义为1个酶活单位(U)。

直链麦芽五糖生成酶及其融合蛋白水解产物分析方法：

将直链麦芽五糖生成酶或融合蛋白与底物在40℃下作用，反应结束后取样沸水浴30min灭酶，10000r/min离心10min，上清液稀释后过0.22μm水系超滤膜。

产物检测：以一定浓度梯度的G1～G7混合标准品为对照进行定性与定量分析，利用高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)分析产物中各组分含量。分析条件为：CarboPac PA200色谱柱，0.25M NaOH、1M NaAc和超纯水为流动相，流速0.5mL/min，柱温35℃，进样量10μL。

底物总转化率、各单糖组分在G1～G7中所占百分比、单糖得率的计算方法如下：

底物转化率＝(G1～G7总质量/底物干基质量)×100％

单糖百分含量＝(单糖组分质量/G1～G7总质量)×100％

单糖得率＝单糖百分含量×底物转化率

下述实施例中所涉及的的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。

LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加1.5％(w/v)琼脂粉。

发酵培养基：酵母粉36g/L，马铃薯淀粉7g/L，KH₂PO₄ 2.3136g/L，K₂HPO₄16.4318g/L，pH 7.0。

下述实施例中所涉及的引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列如表1所示：

表1：PCR引物设计

实施例1：含有融合蛋白的重组质粒的构建

具体步骤如下：

(1)以Bacillus megaterium基因组DNA为模板，设计引物L₁和F₁，采用PCR方法扩增出直链麦芽五糖生成酶(BmMFA酶)基因Bm-mfa(片段I)。

化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的cbm基因，与pHT01质粒酶切连接得到含有cbm基因的线性片段cbm/pHT01(片段II)。

(2)将步骤(1)制备得到的两种线性片段使用碧云天PCR纯化试剂盒纯化后，使用引物L₂和F₂进行PCR重组连接，获得含有融合蛋白的pHT01/Bs-mfa线性片段。

PCR反应体系依照STAR Primer试剂盒说明书中所设定条件：5×PrimeSTARBuffer(Mg²⁺Plus)10μL，模板DNA 1μL，正向和反向引物(10μM)均为1μL，PrimeSTAR HS DNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，最后加入超纯水32.5μL。PCR扩增条件为：98℃条件下预变性3min；98℃预变性3min；随后98℃变性10s；60℃退火15s；68℃延伸，进行30个循环；最后68℃保温10min。其中扩增片段I的延伸时间为2min，扩增pHT01/Bs-mfa线性片段的延伸时间为10min。

(3)使用碧云天DpnI试剂盒对PCR反应产物中的模板进行消化。将消化体系吹打混匀后，放置于在37℃水浴锅中反应6～8h。然后把处理后的PCR产物转化E.coli JM109提取质粒进行测序验证，筛选出测序正确的pHT01/Bs-mfa重组表达质粒。

按照上述方法，制备得到含有融合之前的直链麦芽五糖生成酶的重组质粒pHT01/Bm-mfa。

实施例2：重组枯草芽孢杆菌的构建

具体步骤如下：

(1)分别将测序正确的pHT01/Bs-mfa重组表达质粒和重组质粒pHT01/Bm-mfa转化到E.coli JM 109中，得到转化子，将转化子涂布到含有100μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体培养基中，在37℃恒温箱中培养12h；

(2)分别从步骤(1)中挑选出单菌落接种到含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200r/min条件下培养8～12h并按照质粒提取试剂盒说明书所示方法提取质粒鉴定测序。分别将构建好的目的质粒转化到表达宿主B.subtilis WB600感受态中。最终分别得到基因工程菌B.subtilis WB600/pHT01/Bs-mfa和B.subtilis WB600/pHT01/Bm-mfa。

实施例3：融合蛋白的表达

具体步骤如下：

(1)分别将实施例2制备得到的基因工程菌B.subtilis WB600/pHT01/Bs-mfa和B.subtilis WB600/pHT01/Bm-mfa接种至在LB固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中培养12h，挑取阳性单菌落接种于含有50mL LB液体培养基(在使用前添加终浓度为100μmg/mL的硫酸卡那霉素)的灭菌250mL三角瓶中，并分别置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养8-10h，分别制备得到种子液；

(2)分别将步骤(1)制备得到的种子液按照4％(v/v)的比例接种至含有50mL发酵培养基(在使用前添加终浓度为100μmg/mL的硫酸卡那霉素)的250mL三角瓶中，并置于回转式摇床中200r/min，25℃下培养60h，分别得到发酵液；

(3)分别将制备得到的发酵液在转速10000×g、4℃的条件下离心20min，上清液即为粗酶液；分别制备得到含有融合蛋白BsMFA酶的粗酶液和含有直链麦芽五糖生成酶原始酶BmMFA酶的粗酶液。

(4)粗酶液的纯化：

使用HiTrap Phenyl HP柱和强阴离子HiTrap Q-HP柱分别对上述两种粗酶液进行纯化及SDS-PAGE凝胶电泳分析。纯化方法如下：第一步纯化时，粗酶液预先用终浓度为10％(v/v)的饱和(NH₄)₂SO₄处理并离心去除沉淀，缓冲液A1为10mmol/LTris-HCl(pH7.0)，缓冲液B1为含有10％(v/v)饱和(NH₄)₂SO₄的10mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)。平衡流速和上样流速为2mL/min，洗脱流速为1mL/min。用25～30mL B1平衡疏水柱后上样；用30～40mL B1平衡疏水柱，再分别用0％～100％(v/v)A1、超纯水、0.5mmol/L NaOH依次洗脱。第二步纯化时，将经一步纯化后含有BmMFA酶的组分置于4℃的缓冲液A1中用透析袋透析48h，每6h更换一次缓冲液。缓冲液B3为含有终浓度为1mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)。平衡流速和上样流速为2mL/min，洗脱流速为1mL/min。用25～30mL B3平衡强阴离子柱后上样。用30～40mL B3平衡离子柱，再分别用0％～100％(v/v)B3、超纯水与10mmol/L NaOH溶液依次洗脱；得到含有融合蛋白BsMFA酶的纯酶液和含有直链麦芽五糖生成酶原始酶BmMFA酶的纯酶液。

电泳结果如图1所示，结果显示，两种纯化后的酶液均在相应位置处有蛋白条带，证明直链麦芽五糖生成酶及融合蛋白得到了表达。

实施例4：融合蛋白的产物特异性和水解活力的分析

具体步骤如下：

1、产物特异性分析：

(1)分别配制浓度为0.25％(w/w)的木薯淀粉、麦芽糊精、玉米淀粉和可溶性淀粉底物；

(2)分别向淀粉溶液中以20U/g加酶量(以干基底物计)分别加入实施例3制备得到的含有融合蛋白BsMFA酶的粗酶液和含有直链麦芽五糖生成酶BmMFA酶的粗酶液，在40℃下反应24h，反应结束后取样，通过离子色谱进行产物特异性分析。结果如表2和图2所示，其中每个值为三次独立实验的平均值，G1～G7分别代表葡萄糖，麦芽糖，直链麦芽三糖，直链麦芽四糖，直链麦芽五糖，直链麦芽六糖，直链麦芽七糖。

表2：BmMFA酶及BsMFA酶产物特异性比较

由表2和图2可知，与野生型相比，融合蛋白水解木薯淀粉、麦芽糊精、玉米淀粉和可溶性淀粉时产物中的G5比例分别相对增加了38.30％、10.23％、14.99％和26.32％，具有显著性差异。说明融合蛋白策略是一种改善酶产物特异性的有效手段。

2、比酶活的检测：

分别检测实施例3制备得到的含有融合蛋白BsMFA酶的粗酶液和含有直链麦芽五糖生成酶原始酶BmMFA酶的发酵上清液的粗酶活及经纯化后纯酶液的比酶活，结果如表3所示。

表3：BmMFA酶与BsMFA酶水解活力比较

¹⁾每个值为三次独立实验的平均值，同一列中不同的上标字母表示存在显著性差异(p<0.05)。

结果显示，在相同的发酵条件下，与BmMFA酶相比，BsMFA酶发酵上清液粗酶活及比酶活具有显著性提升，水解活力的提高可能由于CBM的嵌入造成酶对底物结合能力的增强。多项研究表明，尽管CBM不直接参与催化，但CBM的靶向机制有助于淀粉酶的活性，即通过增加底物周围酶的浓度，引导酶附着到不溶性底物即淀粉颗粒上，促进底物进入酶的催化结构域来帮助水解。相比较于BmMFA酶，使用水解活力进一步提高的融合蛋白BsMFA酶进行直链麦芽低聚糖的制备时也可减少实际生产过程中添加的酶量，节约生产成本。

实施例5：发酵制备直链麦芽五糖

本实施例建立使用产物特异性提高的融合蛋白酶解工业浓度(20％(w/w))底物以生产直链麦芽五糖的反应体系。选用木薯淀粉作为酶解底物，探究底物保温时间、液化时间、糖化阶段融合蛋白BsMFA酶加酶量以及脱支酶协同反应等条件对酶促反应的影响。

具体步骤如下：

1、不同的调浆时间对直链麦芽五糖产量的影响

(1)配制20％(w/w)的木薯淀粉溶液200mL，将淀粉溶液在60℃下分别保温调浆0min、5min、10min、15min，搅拌速率为200r/min，制备得到淀粉乳；

(2)向制备得到的淀粉乳中按加酶量2U/g(以干基淀粉计)加入耐高温α-淀粉酶(购自上海Sigma-Aldrich公司)后，升温至95℃充分液化15min，得到液化液；

(3)将液化液降温至40℃，在200r/min搅拌速率下，向体系中加入20U/g(以干基淀粉计)的融合蛋白，反应48h；反应过程中取不同反应时间的样液1mL进行灭酶处理，并应用HPEAC-PAD对反应产物进行直链麦芽低聚糖的含量测定，结果如表4所示：

表4：不同调浆时间对酶促反应影响

¹⁾每个值为三次独立实验的平均值

在麦芽低聚糖的工业生产过程中，将淀粉底物在60℃保温可以使淀粉分子充分溶胀，提高底物的流动性，从而促进后续酶与底物的结合。保温时间对酶促反应的结果如图3所示。

保温时间增加时，麦芽五糖的得率(G5百分含量×底物转化率)也呈现增加的趋势，保温时间为5min，反应时间为36h时，G5的得率可以达到36.64％。保温时间相同，反应时间由36h提升到48h时，G5的得率呈现下降趋势，说明此时水解反应过度，不宜再继续水解。

当由5min继续延长保温时间，G5得率与保温5min的结果没有显著性差异，因此，最终选择保温时间为5min。

2、不同的液化时间对直链麦芽五糖产量的影响

具体方法同步骤1，区别在于，调整淀粉调浆时间为5min，将步骤(2)中的液化时间分别设置为0、5、10、15、20min，结果如表5所示：

表5：不同液化时间对酶促反应影响

¹⁾每个值为三次独立实验的平均值

不同液化时间对酶促反应的影响如图4所示。随着液化时间的增加，五糖得率先增加后趋于稳定。总反应时间在36h时，液化15min的实验组G5得率达到37.20％；总反应时间在48h时，液化15min的实验组G5得率达到37.64％；当液化时间延长到20min时，G5的得率与15min相比相差不大，说明底物在15min已被充分液化；当结束反应的时间从36h延长到48h时，G5的得率提升不明显，反应进程逐渐达到极限。最终选择在95℃下液化时间15min，再降温到40℃糖化至36h。

3、融合蛋白的加酶量对直链麦芽五糖产量的影响

具体方法同步骤1，区别在于，调整淀粉调浆时间为5min，将步骤(2)中的液化时间设置为15min，分别将融合蛋白的加酶量设置为10、15、20、25、30、40U/g干基淀粉，反应36h后结束反应，结果如表6所示：

表6：BsMFA酶加酶量对酶促反应影响

BsMFA酶加酶量对酶促反应的影响如图5所示。在其他实验条件相同的情况下，随着加酶量的增加，酶解产物中G1～G7的产率逐渐增加，当BsMFA酶加酶量从10U/g增加至25U/g时，G5得率逐渐增加，在25U/g加酶量时，G5的得率为38.96％，与10U/g、15U/g和20U/g加酶量组别相比，具有显著性差异(p<0.05)。最终选择25U/g为BsMFA酶糖化反应的最佳加酶量。

4、普鲁兰酶的加酶量对直链麦芽五糖产量的影响

具体方法同步骤1，区别在于，其中在反应至36h时用0.1mol/L HCL将体系pH调整为4.5左右，随后分别按照加酶量0U/g、1U/g、2U/g、5U/g、10U/g干基淀粉加入普鲁兰酶(购自上海Sigma-Aldrich公司)，结果如表7所示：

表7：脱支酶酶加酶量对酶促反应影响

在制备直链麦芽低聚糖时，通常添加普鲁兰酶进行脱支反应，以进一步提高底物的转化率。普鲁兰酶加酶量对酶促反应的影响如图6所示，与只加BsMFA酶进行糖化的反应体系相比，向体系中添加普鲁兰酶可提高底物的转化率。当普鲁兰酶加酶量为5U/g时，G5得率可达到44.21％。当普鲁兰酶加酶量由5U/g提升到10U/g(以干基淀粉计)时，底物的转化率有轻微提升，但较高脱支酶添加量会加速α-1,4-糖苷键的水解，导致G5得率降低，仅为38.52％。最终普鲁兰酶加酶量选为5U/g。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种产物特异性提高的融合蛋白及其制备直链麦芽五糖的应用

<130> BAA210739A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 600

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Thr Val Asn Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Ala

1 5 10 15

Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Thr Asp Ala Glu Asn

20 25 30

Leu Ala Gln Lys Gly Ile Thr Ser Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys

35 40 45

Gly Thr Thr Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp

50 55 60

Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Ile Asp Ala Leu His Lys Lys Asn Ile

85 90 95

Asp Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Tyr

100 105 110

Thr Glu Thr Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ser Asn Arg Asn Val

115 120 125

Glu Val Ser Gly Asp Tyr Glu Ile Ser Ala Trp Thr Gly Phe Asn Phe

130 135 140

Pro Gly Arg Gly Asp Ser Tyr Ser Asn Phe Lys Trp Lys Trp Tyr His

145 150 155 160

Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Gly Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr

165 170 175

Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu

180 185 190

Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Phe Asp His

195 200 205

Pro Asp Val Ala Asn Glu Met Lys Lys Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn

210 215 220

Glu Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Asp

225 230 235 240

His Glu Tyr Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Gln Gln Thr Gly

245 250 255

Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Ile Gln Thr

260 265 270

Leu Asn Asn Tyr Leu Ala Lys Val Asn Tyr Asn Gln Ser Val Phe Asp

275 280 285

Ala Pro Leu His Tyr Asn Phe His Tyr Ala Ser Lys Gly Asn Gly Asn

290 295 300

Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Lys Gly Thr Val Val Ala Asn His Pro

305 310 315 320

Thr Leu Ala Val Thr Leu Val Glu Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Gln

325 330 335

Ser Leu Glu Ser Val Val Ser Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala

340 345 350

Phe Ile Leu Thr Arg Ala Glu Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp

355 360 365

Tyr Tyr Gly Thr Lys Gly Asn Ser Asn Tyr Glu Ile Pro Ala Leu Lys

370 375 380

Asp Lys Ile Asp Pro Ile Leu Thr Ala Arg Lys Asn Tyr Ala Tyr Gly

385 390 395 400

Thr Gln Arg Asp Tyr Phe Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg

405 410 415

Glu Gly Asp Ser Val His Ala Asn Ser Gly Leu Ala Thr Leu Ile Ser

420 425 430

Asp Gly Pro Gly Gly Ala Lys Trp Met Asp Val Gly Lys Asn Asn Ala

435 440 445

Gly Glu Ile Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Gln Thr Asn Thr Val Thr

450 455 460

Ile Asn Lys Asp Gly Trp Gly Gln Phe Gln Val Ser Gly Gly Ser Val

465 470 475 480

Ser Ile Tyr Val Gln Arg Val Glu Asp Cys Asp Gly Thr Asp Cys Cys

485 490 495

Thr Asn Cys Pro Thr Glu Lys Val Glu Thr Thr Phe Ser Cys Ser Asn

500 505 510

Gly Ser Thr Tyr Trp Gly Gln Ser Val Tyr Val Ile Gly Asn Gln Glu

515 520 525

Glu Leu Gly Asn Trp Asn Pro Ala His Ala Val Lys Leu Asp Ala Ser

530 535 540

Ala Tyr Pro Thr Trp Thr Gly Thr Ile Glu Leu Thr Gln Asn Thr Asp

545 550 555 560

Val Glu Trp Lys Cys Leu Lys Arg Asp Glu Gln Thr Pro Ser Asn Gly

565 570 575

Val Val Trp Gln Gly Gly Ala Asn Asn Gln Phe Asn Thr Gly Thr Thr

580 585 590

Asn Ala Tyr Pro Thr Gly Ser Phe

595 600

<210> 2

<211> 1800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatacagtta acaatggaac gctaatgcag tattttgagt ggtacgctcc gaatgatggg 60

aatcattgga atcgtttgcg tactgatgct gaaaatttag cgcaaaaagg aattacatct 120

gtttggatac cacctgcata taaaggaact acgcaaaatg acgtaggata tggagcatat 180

gatttatatg atttaggtga attcaatcaa aagggaacag tgcggacgaa atatgggacg 240

aaagcacaat tgaaatctgc aattgacgct ttacataaga aaaacatcga tgtatacggt 300

gatgtagtta tgaatcataa aggtggggct gattatacgg aaactgtcac agcagttgag 360

gtagacccga gcaatcgaaa tgttgaagta tcaggtgatt atgaaattag tgcgtggacg 420

ggatttaact ttccggggcg tggagattct tattctaatt tcaaatggaa atggtatcat 480

tttgacggaa cggattggga tgaaggaagg aaattaaacc gaatttataa atttaggggc 540

ataggtaaag cgtgggactg ggaagtgtct agcgagaatg ggaattatga ttatttgatg 600

tatgcggatc ttgattttga tcatccagat gttgcgaatg aaatgaaaaa atggggaacg 660

tggtatgcga atgaattaaa tttagatggc tttcgtttag atgctgttaa acatattgat 720

catgaatatt tgcgcgattg ggtaaatcat gtcagacagc aaacggggaa agaaatgttt 780

gcagtagctg aatattggca aaatgatatc cagactttaa ataattattt agcgaaggtc 840

aactataatc aatctgtgtt cgatgcacca cttcattata attttcatta tgcttcaaaa 900

ggaaatggga attatgatat gagaaatatt ttaaaaggaa cagtagttgc gaatcatcct 960

acacttgcag ttacgctagt tgaaaatcat gattcacagc ctggtcagtc attggaatct 1020

gtagtgagcc cttggttcaa accgttggca tatgcattta ttttaacgcg tgcagaggga 1080

tatccttctg ttttctatgg tgattactat ggtacaaaag gaaatagtaa ctatgaaatt 1140

ccagcgttaa aggacaaaat tgatccgatt ttaacggcac gaaaaaacta tgcatatggt 1200

acgcagcgtg attattttga tcatccagat gtgattggct ggacaagaga aggtgatagt 1260

gtacatgcta attctggttt agcaacatta atctctgatg gaccaggagg tgcaaagtgg 1320

atggatgttg gaaagaataa cgcaggggaa atatggtacg atattacggg taatcaaaca 1380

aatactgtaa caattaataa ggacgggtgg ggtcagttcc aagtaagtgg aggatcagtt 1440

tctatatatg tccagagggt tgaagactgt gacggtacag attgctgcac aaactgccca 1500

acagaaaaag ttgaaaccac attttcttgc tctaacggta gcacctattg ggggcaaagt 1560

gtgtatgtga ttggcaacca agaagagctt ggaaattgga accccgcaca cgcagttaaa 1620

ttagacgcga gcgcttaccc aacgtggaca ggcacgattg agcttaccca aaatacagac 1680

gtagagtgga agtgcctaaa acgtgacgaa caaaccccct caaacggcgt ggtgtggcaa 1740

ggtggcgcaa ataaccaatt taatactgga acaaccaatg cgtacccaac gggaagcttt 1800

<210> 3

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Asp Thr Val Asn Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Ala

1 5 10 15

Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Thr Asp Ala Glu Asn

20 25 30

Leu Ala Gln Lys Gly Ile Thr Ser Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys

35 40 45

Gly Thr Thr Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp

50 55 60

Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Ile Asp Ala Leu His Lys Lys Asn Ile

85 90 95

Asp Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Tyr

100 105 110

Thr Glu Thr Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ser Asn Arg Asn Val

115 120 125

Glu Val Ser Gly Asp Tyr Glu Ile Ser Ala Trp Thr Gly Phe Asn Phe

130 135 140

Pro Gly Arg Gly Asp Ser Tyr Ser Asn Phe Lys Trp Lys Trp Tyr His

145 150 155 160

Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Gly Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr

165 170 175

Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu

180 185 190

Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Phe Asp His

195 200 205

Pro Asp Val Ala Asn Glu Met Lys Lys Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn

210 215 220

Glu Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Asp

225 230 235 240

His Glu Tyr Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Gln Gln Thr Gly

245 250 255

Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Ile Gln Thr

260 265 270

Leu Asn Asn Tyr Leu Ala Lys Val Asn Tyr Asn Gln Ser Val Phe Asp

275 280 285

Ala Pro Leu His Tyr Asn Phe His Tyr Ala Ser Lys Gly Asn Gly Asn

290 295 300

Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Lys Gly Thr Val Val Ala Asn His Pro

305 310 315 320

Thr Leu Ala Val Thr Leu Val Glu Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Gln

325 330 335

Ser Leu Glu Ser Val Val Ser Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala

340 345 350

Phe Ile Leu Thr Arg Ala Glu Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp

355 360 365

Tyr Tyr Gly Thr Lys Gly Asn Ser Asn Tyr Glu Ile Pro Ala Leu Lys

370 375 380

Asp Lys Ile Asp Pro Ile Leu Thr Ala Arg Lys Asn Tyr Ala Tyr Gly

385 390 395 400

Thr Gln Arg Asp Tyr Phe Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg

405 410 415

Glu Gly Asp Ser Val His Ala Asn Ser Gly Leu Ala Thr Leu Ile Ser

420 425 430

Asp Gly Pro Gly Gly Ala Lys Trp Met Asp Val Gly Lys Asn Asn Ala

435 440 445

Gly Glu Ile Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Gln Thr Asn Thr Val Thr

450 455 460

Ile Asn Lys Asp Gly Trp Gly Gln Phe Gln Val Ser Gly Gly Ser Val

465 470 475 480

Ser Ile Tyr Val Gln Arg

485

<210> 4

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatacagtta acaatggaac gctaatgcag tattttgagt ggtacgctcc gaatgatggg 60

aatcattgga atcgtttgcg tactgatgct gaaaatttag cgcaaaaagg aattacatct 120

gtttggatac cacctgcata taaaggaact acgcaaaatg acgtaggata tggagcatat 180

gatttatatg atttaggtga attcaatcaa aagggaacag tgcggacgaa atatgggacg 240

aaagcacaat tgaaatctgc aattgacgct ttacataaga aaaacatcga tgtatacggt 300

gatgtagtta tgaatcataa aggtggggct gattatacgg aaactgtcac agcagttgag 360

gtagacccga gcaatcgaaa tgttgaagta tcaggtgatt atgaaattag tgcgtggacg 420

ggatttaact ttccggggcg tggagattct tattctaatt tcaaatggaa atggtatcat 480

tttgacggaa cggattggga tgaaggaagg aaattaaacc gaatttataa atttaggggc 540

ataggtaaag cgtgggactg ggaagtgtct agcgagaatg ggaattatga ttatttgatg 600

tatgcggatc ttgattttga tcatccagat gttgcgaatg aaatgaaaaa atggggaacg 660

tggtatgcga atgaattaaa tttagatggc tttcgtttag atgctgttaa acatattgat 720

catgaatatt tgcgcgattg ggtaaatcat gtcagacagc aaacggggaa agaaatgttt 780

gcagtagctg aatattggca aaatgatatc cagactttaa ataattattt agcgaaggtc 840

aactataatc aatctgtgtt cgatgcacca cttcattata attttcatta tgcttcaaaa 900

ggaaatggga attatgatat gagaaatatt ttaaaaggaa cagtagttgc gaatcatcct 960

acacttgcag ttacgctagt tgaaaatcat gattcacagc ctggtcagtc attggaatct 1020

gtagtgagcc cttggttcaa accgttggca tatgcattta ttttaacgcg tgcagaggga 1080

tatccttctg ttttctatgg tgattactat ggtacaaaag gaaatagtaa ctatgaaatt 1140

ccagcgttaa aggacaaaat tgatccgatt ttaacggcac gaaaaaacta tgcatatggt 1200

acgcagcgtg attattttga tcatccagat gtgattggct ggacaagaga aggtgatagt 1260

gtacatgcta attctggttt agcaacatta atctctgatg gaccaggagg tgcaaagtgg 1320

atggatgttg gaaagaataa cgcaggggaa atatggtacg atattacggg taatcaaaca 1380

aatactgtaa caattaataa ggacgggtgg ggtcagttcc aagtaagtgg aggatcagtt 1440

tctatatatg tccagagg 1458

<210> 5

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttgaagact gtgacggtac agattgctgc acaaactgcc caacagaaaa agttgaaacc 60

acattttctt gctctaacgg tagcacctat tgggggcaaa gtgtgtatgt gattggcaac 120

caagaagagc ttggaaattg gaaccccgca cacgcagtta aattagacgc gagcgcttac 180

ccaacgtgga caggcacgat tgagcttacc caaaatacag acgtagagtg gaagtgccta 240

aaacgtgacg aacaaacccc ctcaaacggc gtggtgtggc aaggtggcgc aaataaccaa 300

tttaatactg gaacaaccaa tgcgtaccca acgggaagct tt 342

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是通过所述直链麦芽五糖生成酶基因的C端与碳水化合物结合模块20的基因进行重组，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的融合蛋白的基因。

3.含有权利要求1所述融合蛋白，或权利要求2所述基因的重组载体。

4.含有权利要求1所述的融合蛋白，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述的重组载体的重组细胞。

5.一种生产直链麦芽五糖的方法，其特征在于，所述方法为：向含有底物淀粉的反应体系中分别添加α-淀粉酶、权利要求1所述的融合蛋白进行反应制备得到直链麦芽五糖。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，向反应体系中加入融合蛋白之后，添加脱支酶进行反应制备得到直链麦芽五糖。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

(1)将底物在58～62℃保温5～12min；

8.如权利要求5～7任一所述的方法，其特征在于，所述底物的添加量为5％～20％，所述α-淀粉酶加酶量为1～5U/g淀粉，所述融合蛋白的加酶量为20～30U/g淀粉，所述脱支酶的加酶量为2～10U/g淀粉。

9.如权利要求5～8任一所述的方法，其特征在于，所述底物淀粉为：木薯淀粉、麦芽糊精、玉米淀粉和可溶性淀粉中的一种或多种。

10.权利要求1所述的融合蛋白，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的重组载体，或权利要求4所述的重组细胞，或权利要求5～9任一所述的方法在制备含有直链麦芽五糖的产品中的应用。