CN114836406A

CN114836406A - 一种催化活力提高的琼胶酶突变体及其应用

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Publication number: CN114836406A
Application number: CN202210367635.XA
Authority: CN
Inventors: 金征宇; 叶子莹; 龙杰; 吕成; 李兴飞; 田耀旗; 周星; 陈龙; 邱超; 赵建伟
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-04-08
Filing date: 2022-04-08
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2042-04-08
Also published as: CN114836406B

Abstract

本发明公开了一种催化活力提高的琼胶酶突变体及其应用，属于基因工程技术和酶工程领域。本发明提供了一种琼胶酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第66位、第102位、第165位、第166位、第338位、第348位、第356位、第371位、第394位、第395位、第433位、第437位、第602位、第745位、第754位或第759位的氨基酸进行突变得到的，采用本发明提供的突变体的催化活性都有不同程度的提高，其中效果较为显著的突变体为R66Q、V166M及A348S，其相对酶活分别提高了2.43、2.02及2.55倍。本发明提供的琼胶酶突变体，能够提高琼胶酶的催化活性，从而提高琼胶原料的利用率及琼胶寡糖的产率，具有较好的工业应用前景。

Description

一种催化活力提高的琼胶酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种催化活力提高的琼胶酶突变体及其应用，属于基因工程技术和酶工程领域。

背景技术

红藻在所有的商业藻类植物中产量最高，在海洋中存量巨大，琼脂是其细胞壁的主要成分。琼脂作为凝胶和增稠剂，是一种公认的安全的食品添加剂，也可应用于医药工业，但附加值低。琼脂糖的主要结构是由重复β-D-半乳糖和3,6-无水-α-L-半乳糖(AHG)二糖单元连接组成。据报道，从琼脂中提取的寡糖具有多种生物活性，包括高效的抗氧化、抗炎、益生元效应、抑菌和美白等功效，极大的提高了琼脂的附加值。

降解琼脂制备琼胶寡糖(琼寡糖(AOS)和新琼寡糖(NAOS))的方法包括物理、化学和酶解三种方法，各有其独特的优缺点。物理方法包括热、微波和超声波处理，但由于琼脂降解效率低、可控性差，利用物理降解的研究较少。化学降解，如利用稀释酸、温和酸，可以裂解α(1,3)键，得到具有AHG残基的AOS，具有成本低、得率高、快速、简便等优点，然而化学法存在降解产物复杂且环境污染严重等问题。近年来酶解法凭借着产物均一、工艺简单、能耗低、无污染等特点成为研究热点。因此，酶解产琼胶寡糖被认为是可持续和最有商业化生产琼胶寡糖前景的方法。然而，琼胶酶普遍稳定性差、酶催化活性较低，极大限制其工业应用的发展，目前，商业化生产的琼胶酶仅有一种，且价格相当昂贵，因此，提高琼胶酶的催化活性，增强其稳定性以适应工业化应用，能推动琼胶酶的商业化，提高琼胶寡糖的产量，实现海洋资源高值化，具有重要的意义。

近年来，随着计算机技术在辅助蛋白质设计领域的发展，已经涌现了许多简便有效的计算策略用于设计性能增强的突变体。Janssen等人提出的FRESCO策略，将分子动力学模拟和能量分析相结合，获得稳定性提高的突变体。吴边团队设计的GRAPE计算策略，运用系统的聚类分析结合有益突变体的贪婪累积获得了优越变种DuraPETase，其对PET薄膜的降解效率提高了300倍。毛向朝课题组，采用ETSS、POPMuSiC和HOTMuSiC计算软件得到了催化活性提高了1.5倍的琼胶酶突变体K612F。

一种高效的提高催化活性的琼胶酶突变体，有助于提高琼脂糖原料利用率，增加新琼二糖的产量，赋予琼胶酶更大的工业应用价值。

发明内容

发明人前期通过对不同来源、水解琼脂糖得到不同产物的琼胶酶进行研究，发现来源于Saccharophagus degradans 2-40的琼胶酶Aga50D(NCBI登录号：ABD81904)与琼脂糖结合的晶体结构(PDB:4BQ2)已发表，且结构完整，单一产新琼二糖。

为解决上述问题，本发明提供了催化活性提高的琼胶酶突变体，以及能够表达所述琼胶酶突变体的大肠杆菌工程菌。

前期研究工作中，发明人已获得一种琼胶酶重组大肠杆菌工程菌，该大肠杆菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶。本发明在亲本氨基酸的基础上对其进行了适当的突变，从而获得了催化活性提高的突变体，为琼胶酶在工业上的应用提供了广阔的前景。

本发明提供了一种琼胶酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第66位、第102位、第165位、第166位、第338位、第348位、第356位、第371位、第394位、第395位、第433位、第437位、第602位、第745位、第754位或第759位的氨基酸进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述亲本酶琼胶酶来源于Saccharophagusdegradans 2-40。

在本发明的一种实施方式中，编码所述亲本酶琼胶酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第66位的精氨酸突变为谷氨酰胺或赖氨酸；命名为：R66Q或R66K。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第102位的谷氨酸突变为脯氨酸；命名为：E102P。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第165位的谷氨酸突变为亮氨酸；命名为：E165L。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第166位的缬氨酸突变为蛋氨酸；命名为：V166M。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第338位的丝氨酸突变为缬氨酸；命名为：S338V。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第348位的丙氨酸突变为丝氨酸；命名为：A348S。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第356位的天冬氨酸突变为天冬酰胺；命名为：D356N。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第371位的谷氨酸突变为赖氨酸；命名为：E371K。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第394位的酪氨酸突变为苯丙氨酸；命名为：Y394F。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第395位的天冬氨酸突变为谷氨酸；命名为：D395E。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第433位的苏氨酸突变为谷氨酸或谷氨酰胺；命名为：T433E或T433Q。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第437位的丝氨酸突变为苏氨酸；命名为：S437T。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第602位的赖氨酸突变为精氨酸；命名为：K602R。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第745位的蛋氨酸突变为异亮氨酸；命名为：M745I。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第754位的酪氨酸突变为色氨酸；命名为：Y754W。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的759位的的酪氨酸突变为苯丙氨酸；命名为：Y759F。

本发明还提供了编码上述突变体的基因。

本发明提供了携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pPIc9k、pHIL-S1、pPIcza、pET28a中的任意一种表达载体。

本发明提供了表达上述突变体，或含有上述基因的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以原核细胞或真核细胞为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌E.coli BL(21)DE3、毕赤酵母GS115、毕赤酵母KM71、毕赤酵母KM7中的任意一种为表达宿主。

本发明提供了一种制备上述突变体的方法，所述方法的步骤如下：

(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带琼胶酶编码基因的载体为模板进行定点突变；构建含编码突变体的基因的载体；

(2)将含编码突变体的基因的载体转化进微生物细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清即为琼胶酶突变体的粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体包括pPIc9k、pHIL-S1、pPIcza、pYAM75P6、pET28a中的任意一种。

本发明提供了一种提高琼胶酶酶活的方法，所述方法为，

将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第66位的精氨酸突变为谷氨酰胺或赖氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第102位的谷氨酸突变为脯氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第165位的谷氨酸突变为亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第166位的缬氨酸突变为蛋氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第338位的丝氨酸突变为缬氨酸；或将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的琼胶酶的第348位的丙氨酸突变为丝氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第356位的天冬氨酸突变为天冬酰胺；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第371位的谷氨酸突变为赖氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第394位的酪氨酸突变为苯丙氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第395位的天冬氨酸突变为谷氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第433位的苏氨酸突变为谷氨酸或谷氨酰胺；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第437位的丝氨酸突变为苏氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第602位的赖氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第745位的蛋氨酸突变为异亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第754位的酪氨酸突变为色氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的759位的酪氨酸突变为苯丙氨酸。

本发明还提供了一种水解琼胶的方法，所述方法为，将上述突变体，或上述重组细胞添加至含有琼胶的反应体系中，进行水解反应。

本发明还提供了一种制备新琼二糖的方法，所述方法为，利用上述突变体，或上述重组细胞反应制备得到。

本发明还保护所述突变体，或所述基因，或所述重组载体，或所述重组细胞在制备含有水解琼胶的产品或制备含有新琼二糖的产品中的应用。

本发明还保护所述突变体，或所述基因，或所述载体，或所述宿主细胞在工业、医药、生化、食品领域中的应用。

有益效果

(1)本发明公开了一种催化活性提高的琼胶酶突变体的方法，属于基因工程技术和酶工程领域。本发明在Saccharophagus degradans 2-40外切琼胶酶基础上，运用计算机辅助设计手段获得22个突变设计，其中催化活性提高的突变菌株达18个，方法有效性达81.82％。

(2)本发明公开了催化活性提高的琼胶酶突变体，属于基因工程技术和酶工程领域。本发明在Saccharophagus degradans 2-40外切琼胶酶基础上，获得催化活性提高的突变菌株R66Q、R66K、E102P、E165L、V166M、S338V、A348S、D356N、E371K、Y394F、D395E、T433E、T433Q、S437T、K602R、M745I、Y754W和Y759F。

(3)采用本发明提供的突变体的催化活性都有不同程度的提高，其中效果较为显著的突变体为R66Q、V166M及A348S，其相对酶活分别提高了2.43、2.02及2.55倍。这些突变体具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1：质粒构建示意图。

图2：野生型Aga50D及突变体纯化后的SDS-PAGE图；其中，M：蛋白质分子量标准；1：纯化后野生型Aga50D；2-23为纯化后的突变体，依次为：H61Y、R66Q、R66K、E102P、H162N、E165L、V166M、E278Q、S338V、A348S、D356N、E371K、Y394F、D395E、T433E、T433Q、S437T、K588Q、K602R、M745I、Y754W、Y759F。

图3：野生型Aga50D及其突变体的酶活表征。

图4：野生型Aga50D和突变体的最适反应温度。

图5：野生型Aga50D和突变体的最适反应pH。

图6：野生型Aga50D和突变体的动力学参数。

图7：野生型Aga50D和突变体的产物分析。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的菌株与载体：E.coli BL21(DE3)、载体pET28a。

下述实施例中所涉及的主要试剂：PrimeSTAR MAX，核酸电泳marker购自TAKARA公司，质粒提取试剂盒，DNA片段胶回收试剂盒购自Axygen公司，BCA浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，引物合成、测序及基因合成由金唯智生物科技有限公司，其他常用试剂为国产分析纯。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：称取1g蛋白胨，0.5g酵母提取物，1g NaCl。使用去离子水溶解后定容至100mL，高压灭菌锅，121℃灭菌20min。

LB固体培养基：在LB液体培养基基础上添加1.8％的琼脂粉。

LB液体抗性培养基：在LB液体培养基基础上添加卡那霉素，终浓度为50μg·mL^-1。

LB固体培养基：在LB固体培养基基础上添加卡那霉素，终浓度为50μg·mL^-1。

下述实施例中所涉及的酶的纯化方法如下：

(1)平衡：用50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.5的缓冲液平衡镍柱；

(2)上样：预处理的样品以1mL/min的流速上样；

(3)冲洗：用50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.5，20mM咪唑的缓冲液冲洗杂蛋白；

(4)洗脱：用50mM Tris-HCl，500mM NaCl，300mM咪唑，pH7.5的缓冲液洗脱并收集目的蛋白，即得到突变体的纯化酶。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

突变体酶活测定：

采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定琼胶酶活性。琼胶酶在一定的条件下催化水解琼脂糖生成还原糖，3,5-二硝基水杨酸与还原糖在热条件下还原生成棕红色氨基络合物，在一定范围内颜色深浅与还原糖量成正比，可在520nm波长下测定，计算酶活。酶活单位定义：在30℃，pH7.0条件下，每分钟催化产生相当于1μmol D-半乳糖所需的酶量定义为一个活力单位。

酶活测定步骤：

(1)预热：取2mL 1mg·mL^-1的琼脂糖溶液(pH7.0)于比色管中；

(2)反应：加入0.1mL的酶液，震荡混匀，反应20min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水浴5min，立即冷却。

(3)测量：在520nm条件下测吸光值并计算酶活。

新琼二糖(NA2)的检测方法

将酶解样品及新琼寡糖标准品(购自青岛博智汇力生物科技有限公司，纯度大于98％，稀释至1mg·mL^-1)，过0.22μm滤膜后进行离子色谱(ICS-5000，美国赛默飞世尔科技公司)检测。检测条件为：色谱柱：Dionex CarboPac PAD-200阴离子交换柱，包括分析柱(4mm×250mm)和保护柱(4mm×50mm)；流动相：100mmol·L^-1的NaOH和150mmol·L^-1的NaAc，流速为0.25mL·min^-1；安培检测器采用四电位脉冲安培法检测；柱温25℃，进样体积10μL下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1：构建突变体

(1)含有野生型琼胶酶Aga50D的重组载体pET28a-Aga50D的构建

根据NCBI公开的Saccharophagus degradans 2-40中，编码所述亲本酶琼胶酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，送至金唯智生物科技有限公司进行基因合成并重组质粒。载体为pET28a，重组质粒命名为pET28a-Aga50D。

(2)构建突变质粒(构建示意图如图1所示)

设计定点突变引物，以步骤(1)获得的pET28a-Aga50D为模板进行单点突变，构建获得含有突变体H61Y、R66Q、R66K、E102P、H162N、E165L、V166M、E278Q、S338V、A348S、D356N、E371K、Y394F、D395E、T433E、T433Q、S437T、K588Q、K602R、M745I、Y754W、Y759F的重组质粒pET28a-H61Y、pET28a-R66Q、pET28a-R66K、pET28a-E102P、pET28a-H162N、pET28a-E165L、pET28a-V166M、pET28a-E278Q、pET28a-S338V、pET28a-A348S、pET28a-D356N、pET28a-E371K、pET28a-Y394F、pET28a-D395E、pET28a-T433E、pET28a-T433Q、pET28a-S437T、pET28a-K588Q、pET28a-K602R、pET28a-M745I、pET28a-Y754W和pET28a-Y759F。PCR突变经测序验证突变成功后方可进入后续操作。

所涉及的引物序列如下：

引入H61Y突变的定点突变引物为：

H61Y-F:5’-CCCTTCAAATATTTATTTTTTAAATGCGCGTGC-3’；

H61Y-R:5’-ATAAATATTTGAAGGGACTTGATCGTTTTCAAAATCG-3’。

引入R66Q突变的定点突变引物为：

R66Q-F:5’-TTTAAATGCGCAAGCAAGTATAGAAACC-3’；

R66Q-R:5’-TTGCGCATTTAAAAAATGAATATTTGAAGGG-3’。

引入R66K突变的定点突变引物为：

R66K-F:5’-TTTAAATGCGAAAGCAAGTATAGAAACCTATACC-3’；

R66K-R:5’-GCTTTCGCATTTAAAAAATGAATATTTGAAGGG-3’。

引入E102P的定点突变引物为：

E102P-F:5’-CCATTGTGCCACCTCAGCCTTGGGATTGG-3’；

E102P-R:5’-CTGAGGTGGCACAATGGCAAGGCCAGTATAAC-3’。

引入H162N突变的定点突变引物为：

H162N-F:5’-CAAGTTAAGCGGTAACGATTTAGAAGTGCCC-3’；

H162N-R:5’-CGTTACCGCTTAACTTGGCGTAGTACG-3’。

引入E165L突变的定点突变引物为：

E165L-F:5’-GTCACGATTTATTAGTGCCCGATAGTGG-3’；

E165L-R:5’-GGGCACTAATAAATCGTGACCGCTTAAC-3’。

引入V166M突变的定点突变引物为：

V166M-F:5’-CGGTCACGATTTAGAAATGCCCGATAGTGGAGACGTTAAC-3’；

V166M-R:5’-ATCGGGCATTTCTAAATCGTGACCGCTTAACTTGGC-3’。

引入E278Q突变的定点突变引物为：

E278Q-F:5’-GTGGAACTGGCCCAACTTGATGGCAAG-3’；

E278Q-R:5’-GTTGGGCCAGTTCCACATCGCGC-3’。

引入S228V突变的定点突变引物为：

S338V-F:5’-CTATCTAATTCAGTGACCATGACTGGTTACGATTACG-3’；

S338V-R:5’-CCAGTCATGGTCACTGAATTAGATAGGCGAATAATGTCTAAACC-3’。

引入A348S突变的定点突变引物为：

A348S-F:5’-GATTACGATCAAAGCACTGTTGCTCAGCG-3’；

A348S-R:5’-GCAACAGTGCTTTGATCGTAATCGTAACCAGTCATG-3’。

引入D356N突变的定点突变引物为：

D356N-F:5’-CTCTGCCAACGATGTAACACCTGAAGACTCAAAAG-3’；

D356N-R:5’-CTTCAGGTGTTACATCGTTGGCAGAGCGCTGAGC-3’。

引入E371K突变的定点突变引物为：

E371K-F:5’-GGCAGTGAGCAAAAAATCATTTGCTACG-3’；

E371K-R:5’-GATTTTTTGCTCACTGCCATTAAACCTTTTGAG-3’。

引入Y394F突变的定点突变引物为：

Y394F-F:5’-GTTGCCAGATTTCCGATCACCCTCTCGC-3’；

Y394F-R:5’-CGGAAATCTGGCAACCAGTTAAACATTGCCG-3’。

引入D395E突变的定点突变引物为：

D395E-F:5’-GCCAGATTACGAACACCCTCTCGC-3’；

D395E-R:5’-GGGTGTTCGTAATCTGGCAACCAGTTAAAC-3’。

引入T433E突变的定点突变引物为：

T433E-F:5’-GTAAATACGGTGAAGAATACCCCGGTTCTTACTTGGATAAG-3’；

T433E-R:5’-GTAAGAACCGGGGTATTCTTCACCGTATTTACGCTCAAGG-3’。

引入T433Q突变的定点突变引物为：

T433Q-F:5’-GTAAATACGGTGAACAGTACCCCGGTTCTTACTTGGATAAG-3’；

T433Q-R:5’-GTAAGAACCGGGGTACTGTTCACCGTATTTACGCTCAAGG-3’。

引入S437T突变的定点突变引物为：

S437T-F:5’-CTTACCCCGGTACCTACTTGGATAAGTGGCGC-3’；

S437T-R:5’-CTTATCCAAGTAGGTACCGGGGTAAGTTTCACC-3’。

引入K588Q突变的定点突变引物为：

K588Q-F:5’-CTGGGGGTTACAGCTTAGTTCTTGG-3’；

K588Q-R:5’-GCTGTAACCCCCAGGCATTG-3’。

引入K602R突变的定点突变引物为：

K602R-F:5’-CGTAGATGTACGCGCGCTGCCGGTAACC-3’；

K602R-R:5’-GCGCGCGTACATCTACGCCCAAATCAAACTC-3’。

引入M745I突变的定点突变引物为：

M745I-F:5’-GTTCCAGTATATTGATTCGCCATTAACGGGCAG-3’；

M745I-R:5’-GGCGAATCAATATACTGGAACCAGTGCGCG-3’。

引入Y754W突变的定点突变引物为：

Y754W-F:5’-GGCAGAGCTTGGGATGGTGAAAACTACAATGTGGG-3’；

Y754W-R:5’-GTTTTCACCATCCCAAGCTCTGCCCGTTAATGG-3’。

引入Y759F突变的定点突变引物为：

Y759F-F:5’-GATGGTGAAAACTTTAATGTGGGTTTTGTGGATGTTACCG-3’；

Y759F-R:5’-CAAAACCCACATTAAAGTTTTCACCATCATAAGCTCTGCC-3’。

PCR反应体系如表1所示：

表1突变PCR反应体系

PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延申3min48s，共30个循环。

将目的片段胶回收后，转化至E.coli BL21(DE3)，将转化子涂布于卡那霉素(50μg/mL)LB平板，37℃静置培养过夜，待长出菌落后，挑单菌落至含有卡那霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，菌液送金唯智生物科技有限公司测定。分别得到含有正确突变体的突变体工程菌：

E.coli BL21(DE3)/pET28a-H61Y、E.coli BL21(DE3)/pET28a-R66Q、E.coli BL21(DE3)/pET28a-R66K、E.coli BL21(DE3)/pET28a-E102P、E.coli BL21(DE3)/pET28a-H162N、E.coli BL21(DE3)/pET28a-E165L、E.coli BL21(DE3)/pET28a-V166M、E.coli BL21(DE3)/pET28a-E278Q、E.coli BL21(DE3)/pET28a-S338V、E.coli BL21(DE3)/pET28a-A348S、E.coli BL21(DE3)/pET28a-D356N、E.coli BL21(DE3)/pET28a-E371K、E.coli BL21(DE3)/pET28a-Y394F、E.coli BL21(DE3)/pET28a-D395E、E.coli BL21(DE3)/pET28a-T433E、E.coli BL21(DE3)/pET28a-T433Q、E.coli BL21(DE3)/pET28a-S437T、E.coli BL21(DE3)/pET28a-K588Q、E.coli BL21(DE3)/pET28a-K602R、E.coli BL21(DE3)/pET28a-M745I、E.coli BL21(DE3)/pET28a-Y754W和E.coli BL21(DE3)/pET28a-Y759F。

按照上述方法，制备得到含有原始酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Aga50D。

实施例2：突变体酶的纯化与酶活测定

(1)摇瓶发酵生产酶

分别将实施例1得到的基因工程菌在含卡那霉素(50μg/mL)LB平板上划线，37℃培养12h后，挑取单菌落接种于卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中摇瓶发酵，37℃，转速200rpm培养12h，获得种子液。

吸取1mL种子液转移到100mL卡那霉素(50μg/mL)LB液体培养基中摇瓶发酵，37℃培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度0.5mM的IPTG，降低温度到16℃，诱导产酶，培养12h后离心收集菌体。

(2)酶的纯化

离心收集的菌体加入适量(2～3倍体积)裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，100mmol/LNaCl，pH＝7.5)重悬菌体，在冰上超声破碎15～20min，30％功率，超声2s，停3s，超声破碎后，4℃，8000rpm离心10min收集上清液，0.22μm滤膜过滤后。进行Ni²⁺柱亲和层析纯化获得酶。经过酶活测定，SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示。

分别制备得到含有野生型的琼胶酶及突变体酶H61Y、R66Q、R66K、E102P、H162N、E165L、V166M、E278Q、S338V、A348S、D356N、E371K、Y394F、D395E、T433E、T433Q、S437T、K588Q、K602R、M745I、Y754W和Y759F的纯酶液。

(3)酶活测定

采用DNS法测定琼胶酶的酶活，将野生型酶活设定为100％，突变体的催化活性都有不同程度的提高，其中效果较为显著的点有R66Q、V166M、A348S，相对酶活分别为243.42％、202.71％、255.18％，如表2及图3所示，可见，本发明的突变体具备工业应用潜力。

表2野生型及其突变体相对酶活

实施例3：酶学性质测定

为了进一步探究突变体酶的特性，对酶活提升显著的6个位点：R66Q、E165L、V166M、A348S、D356N、D395E进行进一步的酶学性质研究。

(1)最适反应温度

用pH＝7的Tris-HCl缓冲液配制终浓度为1mg·mL^-1琼脂糖底物，加入终浓度为0.2mg·mL^-1的酶液于不同温度下反应20min测定酶活，由图4可知：野生酶与突变体的最适反应温度均为30℃。

(2)最适反应pH

用50mM柠檬酸缓冲液配制pH 5～6范围的0.1％琼脂糖底物，用50mM Tris-HCl缓冲液配制pH 7～8范围的0.1％琼脂糖底物，用甘氨酸氢氧化钠缓冲液配制pH 9～10范围的0.1％琼脂糖底物，加入终浓度为0.2mg·mL^-1的酶液于不同温度下反应20min测定酶活，由图5可知野生酶与突变体的最适反应pH均为7.0，性质相似，且从图中可以看出突变体对pH的耐受性优于野生型。

(3)动力学参数

用pH＝7的Tris-HCl缓冲液配制浓度分别为1mg·mL^-1、2mg·mL^-1、3mg·mL^-1、4mg·mL^-1、5mg·mL^-1、8mg·mL^-1和10mg·mL^-1的琼脂糖底物，加入终浓度为0.2mg·mL^-1的酶液在最适反应条件下反应，然后测定还原糖的生成量，按Lineweaver-Burk法作图(如图6所示)。图中7条曲线的线型拟和方程分别为y＝589.92x+15.37(WT)、y＝522.62x+16.616(R66Q)、y＝556.86x+12.611(E165L)、y＝540.06x+32.444(V166M)、y＝513.38x+41.726(A348S)、y＝451.96x+4.873(D356N)及y＝458.91x+1.9297(D395E)。由此可推算出野生型与突变体的各项动力学参数(如表3所示)。

在最适反应条件下，野生型与突变体的动力学参数列于表3中。

表3野生型Aga50D和突变体的动力学参数。

从表中数据可见，其中R66Q、V166M、A348S的Km值较WT的降低，说明突变体与底物琼脂糖的结合能力明显上升，这一结论与前面相对酶活的结论一致。突变体的Kcat/Km比WT的都大，说明突变体的催化能力均有提高。

实施例4：酶的应用

用超纯水配制1mg·mL^-1琼脂糖底物溶液后，分别加入实施例2的步骤(2)制备得到的突变体及野生型的纯酶液：0.2mg·mL^-1的酶液(9.528U·mg^-1)，在30℃的水浴摇床中反应，转速为：200rpm，反应时间为：1h～3h，反应结束后采用沸水浴使反应终止。

每隔1h、2h、3h取出部分反应液，并离心除去反应液中未反应的多糖后，取上清液，即得酶解产物样品：新琼二糖(NA2)，分别检测上述得到的产物新琼二糖(NA2)的含量。

在反应1h后，新琼二糖产量增加平缓，水解底物基本完成；且突变体的酶解效率普遍高于野生型。30℃条件下，反应1h后的新琼二糖产量均高于野生型。

结果显示(如图7所示)，反应3h后，采用野生型酶水解琼脂糖后得到的产物新琼二糖(NA2)的产量为976.492mg/mL；

采用突变体酶R66Q水解琼脂糖后得到的产物新琼二糖(NA2)的产量为1258.013mg/mL；

采用突变体酶E165L水解琼脂糖后得到的产物新琼二糖(NA2)的产量为1322.633mg/mL，V166M为1184.657mg/mL，采用突变体酶A348S水解琼脂糖后得到的产物新琼二糖(NA2)的产量为1281.505mg/mL，采用突变体酶D395E水解琼脂糖后得到的产物新琼二糖(NA2)的产量为1096.2224mg/mL，其中，只有D356N为663.197低于野生型。

因此突变体水解琼脂糖生成新琼二糖的产量普遍高于野生型。

经检测，突变体用于水解琼脂，获得酶解产物新琼二糖(NA2)的得率普遍优于野生型。因此，本发明得到的突变体酶具有良好的工业应用价值。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种催化活力提高的琼胶酶突变体及其应用

<130> BAA220155A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 793

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Ala Ile Gly Gly Leu Val Lys Ile Asn Ile Ser Phe Ile Pro

1 5 10 15

Leu Phe Val Ile Ser Ala Ser Ile Phe Ile Gly Ala Cys Asn Ser Ser

20 25 30

Lys Leu Glu Ser Gly Val Asp Ser Asn Asn Ile Ser Pro Val Met Leu

35 40 45

Phe Asp Phe Glu Asn Asp Gln Val Pro Ser Asn Ile His Phe Leu Asn

50 55 60

Ala Arg Ala Ser Ile Glu Thr Tyr Thr Gly Ile Asn Gly Glu Pro Ser

65 70 75 80

Lys Gly Leu Lys Leu Ala Met Gln Ser Lys Gln His Ser Tyr Thr Gly

85 90 95

Leu Ala Ile Val Pro Glu Gln Pro Trp Asp Trp Ser Glu Phe Thr Ser

100 105 110

Ala Ser Leu Tyr Phe Asp Ile Val Ser Val Gly Asp His Ser Thr Gln

115 120 125

Phe Tyr Leu Asp Val Thr Asp Gln Asn Gly Ala Val Phe Thr Arg Ser

130 135 140

Ile Asp Ile Pro Val Gly Lys Met Gln Ser Tyr Tyr Ala Lys Leu Ser

145 150 155 160

Gly His Asp Leu Glu Val Pro Asp Ser Gly Asp Val Asn Asp Leu Asn

165 170 175

Leu Ala Ser Gly Leu Arg Ser Asn Pro Pro Thr Trp Thr Ser Asp Asp

180 185 190

Arg Gln Phe Val Trp Met Trp Gly Val Lys Asn Leu Asp Leu Ser Gly

195 200 205

Ile Ala Lys Ile Ser Leu Ser Val Gln Ser Ala Met His Asp Lys Thr

210 215 220

Val Ile Ile Asp Asn Ile Arg Ile Gln Pro Asn Pro Pro Gln Asp Glu

225 230 235 240

Asn Phe Leu Val Gly Leu Val Asp Glu Phe Gly Gln Asn Ala Lys Val

245 250 255

Asp Tyr Lys Gly Lys Ile His Ser Leu Glu Glu Leu His Ala Ala Arg

260 265 270

Asp Val Glu Leu Ala Glu Leu Asp Gly Lys Pro Met Pro Ser Arg Ser

275 280 285

Lys Phe Gly Gly Trp Leu Ala Gly Pro Lys Leu Lys Ala Thr Gly Tyr

290 295 300

Phe Arg Thr Glu Lys Ile Asn Gly Lys Trp Met Leu Val Asp Pro Glu

305 310 315 320

Gly Tyr Pro Tyr Phe Ala Thr Gly Leu Asp Ile Ile Arg Leu Ser Asn

325 330 335

Ser Ser Thr Met Thr Gly Tyr Asp Tyr Asp Gln Ala Thr Val Ala Gln

340 345 350

Arg Ser Ala Asp Asp Val Thr Pro Glu Asp Ser Lys Gly Leu Met Ala

355 360 365

Val Ser Glu Lys Ser Phe Ala Thr Arg His Leu Ala Ser Pro Thr Arg

370 375 380

Ala Ala Met Phe Asn Trp Leu Pro Asp Tyr Asp His Pro Leu Ala Asn

385 390 395 400

His Tyr Asn Tyr Arg Arg Ser Ala His Ser Gly Pro Leu Lys Arg Gly

405 410 415

Glu Ala Tyr Ser Phe Tyr Ser Ala Asn Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Glu

420 425 430

Thr Tyr Pro Gly Ser Tyr Leu Asp Lys Trp Arg Glu Val Thr Val Asp

435 440 445

Arg Met Leu Asn Trp Gly Phe Thr Ser Leu Gly Asn Trp Thr Asp Pro

450 455 460

Ala Tyr Tyr Asp Asn Asn Arg Ile Pro Phe Phe Ala Asn Gly Trp Val

465 470 475 480

Ile Gly Asp Phe Lys Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Phe Trp Gly Ala

485 490 495

Met Pro Asp Val Phe Asp Pro Glu Phe Lys Val Arg Ala Met Glu Thr

500 505 510

Ala Arg Val Val Ser Glu Glu Ile Lys Asn Ser Pro Trp Cys Val Gly

515 520 525

Val Phe Ile Asp Asn Glu Lys Ser Phe Gly Arg Pro Asp Ser Asp Lys

530 535 540

Ala Gln Tyr Gly Ile Pro Ile His Thr Leu Gly Arg Pro Ser Glu Gly

545 550 555 560

Val Pro Thr Arg Gln Ala Phe Ser Lys Leu Leu Lys Ala Lys Tyr Lys

565 570 575

Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ala Trp Gly Leu Lys Leu Ser Ser Trp

580 585 590

Ala Glu Phe Asp Leu Gly Val Asp Val Lys Ala Leu Pro Val Thr Asp

595 600 605

Thr Leu Arg Ala Asp Tyr Ser Met Leu Leu Ser Ala Tyr Ala Asp Gln

610 615 620

Tyr Phe Lys Val Val His Gly Ala Val Glu His Tyr Met Pro Asn His

625 630 635 640

Leu Tyr Leu Gly Ala Arg Phe Pro Asp Trp Gly Met Pro Met Glu Val

645 650 655

Val Lys Ala Ala Ala Lys Tyr Ala Asp Val Val Ser Tyr Asn Ser Tyr

660 665 670

Lys Glu Gly Leu Pro Lys Gln Lys Trp Ala Phe Leu Ala Glu Leu Asp

675 680 685

Lys Pro Ser Ile Ile Gly Glu Phe His Ile Gly Ala Met Asp His Gly

690 695 700

Ser Tyr His Pro Gly Leu Ile His Ala Ala Ser Gln Ala Asp Arg Gly

705 710 715 720

Glu Met Tyr Lys Asp Tyr Met Gln Ser Val Ile Asp Asn Pro Tyr Phe

725 730 735

Val Gly Ala His Trp Phe Gln Tyr Met Asp Ser Pro Leu Thr Gly Arg

740 745 750

Ala Tyr Asp Gly Glu Asn Tyr Asn Val Gly Phe Val Asp Val Thr Asp

755 760 765

Thr Pro Tyr Gln Glu Met Val Asp Ala Ala Lys Glu Val Asn Ala Lys

770 775 780

Ile Tyr Thr Glu Arg Leu Gly Ser Lys

785 790

<210> 2

<211> 2256

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggatccatgt tattcgattt tgaaaacgat caagtccctt caaatattca ttttttaaat 60

gcgcgtgcaa gtatagaaac ctataccggt ataaatggcg agccgagtaa agggttaaag 120

ttggcgatgc agtccaagca gcacagttat actggccttg ccattgtgcc agagcagcct 180

tgggattgga gcgagtttac ctctgctagc ttgtatttcg atatagtcag tgttggcgat 240

cattccacac aattttattt agatgttacc gaccaaaatg gcgccgtgtt tacccgcagt 300

attgatattc cagtgggtaa aatgcaatcg tactacgcca agttaagcgg tcacgattta 360

gaagtgcccg atagtggaga cgttaacgat ttaaacctcg cctctggctt gcgttctaac 420

ccgcctacat ggacatctga cgataggcag tttgtttgga tgtggggagt gaaaaattta 480

gatttgtcgg gcattgctaa aatatcgcta agtgtgcaaa gcgcaatgca cgataaaaca 540

gttattatcg ataatattcg tattcaaccc aacccgccgc aagatgaaaa cttccttgtc 600

ggtttggtag acgagtttgg ccaaaacgcc aaagttgatt acaagggtaa aatccatagt 660

ttagaagaat tgcatgcagc gcgcgatgtg gaactggccg agcttgatgg caagccaatg 720

cctagtcgct ctaagtttgg cggttggttg gccggcccca agctaaaagc tacagggtac 780

tttcgcacag aaaaaattaa cggtaaatgg atgctagtag acccagaagg gtacccttac 840

tttgctacgg gtttagacat tattcgccta tctaattcat ctaccatgac tggttacgat 900

tacgatcaag ctactgttgc tcagcgctct gccgacgatg taacacctga agactcaaaa 960

ggtttaatgg cagtgagcga aaaatcattt gctacgcgcc acctagcatc gccaacacga 1020

gcggcaatgt ttaactggtt gccagattac gatcaccctc tcgcaaatca ttataactac 1080

cgtcgctctg cgcattccgg cccactgaaa cgcggtgaag cctacagctt ctacagtgcc 1140

aaccttgagc gtaaatacgg tgaaacttac cccggttctt acttggataa gtggcgcgaa 1200

gtaacggtag acagaatgct aaactggggc tttacctcgc taggcaactg gactgaccca 1260

gcatattacg acaacaatcg cataccgttt ttcgcgaatg gttgggtaat aggggatttt 1320

aaaaccgtat ctagcggtgc ggatttttgg ggcgcaatgc cagatgtatt cgacccagaa 1380

tttaaagtgc gcgctatgga aacggcacgc gtggtttcag aagaaattaa aaatagccct 1440

tggtgcgtag gggtatttat cgataacgaa aaaagcttcg gtcgccccga ttccgataag 1500

gcgcaatacg gtattcccat tcataccctc ggtcgcccaa gcgaaggtgt gcctactagg 1560

caggcgttta gtaagctgct taaagccaaa tacaaaacta tagccgcgtt aaacaatgcc 1620

tgggggttaa agcttagttc ttgggctgag tttgatttgg gcgtagatgt aaaagcgctg 1680

ccggtaaccg atactctgcg cgcagattac tcaatgttac tttcggccta tgcggaccaa 1740

tattttaagg tggtacacgg cgcggttgaa cattacatgc cgaaccactt gtatttaggc 1800

gcacgctttc ctgattgggg aatgccaatg gaggtagtga aagctgccgc aaaatacgcc 1860

gatgtggtta gctataattc ctacaaagag ggcttgccta agcagaagtg ggctttttta 1920

gcagagctag ataagccgag tataatcggt gagtttcaca taggtgctat ggatcacggt 1980

tcgtatcacc ccggtttaat tcacgctgcg tcgcaggccg atagaggtga aatgtacaaa 2040

gattatatgc aatcggtaat tgataacccc tacttcgtag gcgcgcactg gttccagtat 2100

atggattcgc cattaacggg cagagcttat gatggtgaaa actacaatgt gggttttgtg 2160

gatgttaccg acacgccgta ccaagaaatg gtggatgcag caaaagaagt aaatgcgaaa 2220

atatacaccg aaaggctagg cagcaaataa gaattc 2256

Claims

1.一种琼胶酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第66位、第102位、第165位、第166位、第338位、第348位、第356位、第371位、第394位、第395位、第433位、第437位、第602位、第745位、第754位或第759位的氨基酸进行突变得到的。

2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的琼胶酶的第66位的精氨酸突变为谷氨酰胺或赖氨酸；或将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的琼胶酶的第102位的谷氨酸突变为脯氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第165位的谷氨酸突变为亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第166位的缬氨酸突变为蛋氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第338位的丝氨酸突变为缬氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第348位的丙氨酸突变为丝氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第356位的天冬氨酸突变为天冬酰胺；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第371位的谷氨酸突变为赖氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第394位的酪氨酸突变为苯丙氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第395位的天冬氨酸突变为谷氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第433位的苏氨酸突变为谷氨酸或谷氨酰胺；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第437位的丝氨酸突变为苏氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第602位的赖氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的琼胶酶的第745位的蛋氨酸突变为异亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第754位的酪氨酸突变为色氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的759位的的酪氨酸突变为苯丙氨酸。

3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组载体。

5.表达权利要求1或2所述突变体，或含有权利要求3所述基因，或含有权利要求4所述的重组载体的重组细胞。

6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以原核细胞或真核细胞为表达宿主。

7.一种提高琼胶酶酶活的方法，其特征在于，

将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第66位的精氨酸突变为谷氨酰胺或赖氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第102位的谷氨酸突变为脯氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第165位的谷氨酸突变为亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第166位的缬氨酸突变为蛋氨酸；或将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的琼胶酶的第338位的丝氨酸突变为缬氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第348位的丙氨酸突变为丝氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第356位的天冬氨酸突变为天冬酰胺；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第371位的谷氨酸突变为赖氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第394位的酪氨酸突变为苯丙氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第395位的天冬氨酸突变为谷氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第433位的苏氨酸突变为谷氨酸或谷氨酰胺；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第437位的丝氨酸突变为苏氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第602位的赖氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第745位的蛋氨酸突变为异亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的第754位的酪氨酸突变为色氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的琼胶酶的759位的酪氨酸突变为苯丙氨酸。

8.一种水解琼胶的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的突变体，或权利要求5或6所述的重组细胞添加至含有琼胶的反应体系中，进行水解反应。

9.一种制备新琼二糖的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的突变体，或权利要求5或6所述的重组细胞反应制备得到。

10.权利要求1或2所述突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4所述重组载体，或权利要求5所述重组细胞在制备含有水解琼胶的产品或制备含有新琼二糖的产品中的应用。