CN117467647B - β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A及其编码基因与应用 - Google Patents
β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种β‑琼胶酶OUC‑AgaC4‑D242A及其编码基因与应用，属于功能酶技术领域。所述β‑琼胶酶OUC‑AgaC4‑D242A的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述β‑琼胶酶OUC‑AgaC4‑D242A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述β‑琼胶酶OUC‑AgaC4‑D242A在水解琼脂糖中的应用，或在制备新琼寡糖中的应用。本发明的β‑琼胶酶OUC‑AgaC4‑D242A可水解琼脂糖产生新琼八糖、新琼十糖等高聚合度的新琼寡糖。本发明对于β‑琼胶酶及其水解产物的研究、高聚合度新琼寡糖的工业化生产等具有重要意义，应用潜力巨大，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A及其编码基因与应用，属于功能酶技术领域。
背景技术
琼胶（Agar），又称琼脂，是从红藻细胞壁中提取出来的天然多糖，由琼脂糖（agarose）和琼脂果胶（agaropectin）组成，琼脂糖是线性的多聚物，琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。琼胶寡糖是琼胶水解后形成的聚合度（DP）为2～20的低聚糖，琼胶寡糖根据其非还原性末端的不同，分为新琼寡糖（NAOS）和琼寡糖（AOS），新琼寡糖的非还原性末端为L-AHG，琼寡糖的非还原性末端为D-Gal。近年来随着对琼胶寡糖功能活性的研究越来越深入，发现新琼寡糖表现出多种良好的生物活性功能，比如益生元、抗炎、皮肤美白、抑制肥胖、抗氧化、保肝、抗疲老等活性。不同聚合度的新琼寡糖的生物活性和功能具有一定差异，高聚合度的新琼寡糖在益生元领域中的应用潜力更高。
琼胶酶是可以将琼脂糖降解为琼胶寡糖的酶，按照裂解的糖苷键分为α-琼胶酶和β-琼胶酶。琼胶酶一般来源于微生物。目前报道的琼胶酶中β-琼胶酶占绝大多数。β-琼胶酶可以特异性地水解脂糖分子的β-1,4糖苷键产生以L-AHG作为非还原性末端的新琼寡糖。目前已被表征的β-琼胶酶中，绝大多数β-琼胶酶的水解产物是新琼二糖（NA2）、新琼四糖（NA4）、新琼六糖（NA6）等聚合度较低的新琼寡糖，仅有马翠萍等发现的β-琼胶酶AgaB的水解产物是新琼八糖（NA8）、新琼十糖（NA10）、新琼十二糖（NA12）等聚合度较高的新琼寡糖。因此，挖掘能够特异性地水解琼脂糖产生高聚合度（聚合度8～14）新琼寡糖的β-琼胶酶，对于β-琼胶酶及其水解产物的研究、高聚合度新琼寡糖的工业化生产等具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A及其编码基因与应用，属于功能酶技术领域。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A在水解琼脂糖中的应用，或在制备新琼寡糖中的应用。
进一步地，所述新琼寡糖的聚合度为4～14。
进一步地，所述新琼寡糖选自新琼四糖、新琼六糖、新琼八糖、新琼十糖、新琼十二糖、新琼十四糖中的任意一种或两种以上。更进一步地，所述新琼寡糖选自新琼八糖、新琼十糖、新琼十二糖中的任意一种或两种以上。
进一步地，具体应用时，将含β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的酶液加入到琼脂糖溶液中，在40℃下反应20分钟～24小时，得到新琼寡糖。
更进一步地，具体应用方式为：将10μL含β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的酶液加入到190μL琼脂糖溶液中，在40℃下反应20分钟，得到新琼寡糖；所述含β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的酶液中蛋白浓度为1 mg/mL，所述琼脂糖溶液的浓度为3 mg/mL；所述新琼寡糖为新琼四糖、新琼六糖、新琼八糖、新琼十糖和新琼十二糖。
本发明的β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A，是对β-琼胶酶OUC-AgaC4进行改造后得到的，β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A具有更高的酶活，是β-琼胶酶OUC-AgaC4的3.6倍。本发明的β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A，可水解琼脂糖产生新琼八糖、新琼十糖、新琼十二糖等高聚合度的新琼寡糖。本发明的β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的编码基因，可用于β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的异源表达。本发明完善了新琼寡糖的生物制备糖库，对于β-琼胶酶及其水解产物的研究、高聚合度新琼寡糖的工业化生产等具有重要意义，应用潜力巨大，应用前景广阔。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：实施例1中纯化后的酶液的SDS-PAGE电泳图，其中，Marker：标准蛋白。
图2：温度变化对相对酶活的影响示意图。
图3：pH变化对相对酶活的影响示意图。
图4：不同温度条件下保温不同时间对相对酶活的影响示意图。
图5：不同pH条件下保温24 h对相对酶活的影响示意图。
图6：实施例5中各样品的TLC图，其中，从左至右的样品分别为：标准品，空白对照和反应液。
图7：β-琼胶酶OUC-AgaC4、β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的相对酶活对比示意图。
图8：β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的酶动力学过程曲线示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
实施例1 β-琼胶酶OUC-AgaC4的挖掘
为了挖掘能制备高聚合度新琼寡糖的β-琼胶酶，本发明从海生链状小卵菌（Catenovulum maritimum）的全基因组注释数据库中筛选出了一个可能具有β-琼胶酶活性的基因（GenBank：MH005811.1），其所表达的蛋白，切除信号肽后，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，命名为β-琼胶酶OUC-AgaC4。对该基因进行密码子优化，以在大肠杆菌中进行高效表达，密码子优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。人工合成该基因片段。
β-琼胶酶OUC-AgaC4的氨基酸序列（如SEQ ID NO.1所示）：
ASTYNVYTEAQLNTALESAKNNGLDTVDTIRVNGTINIYGQIDVKSSVIITGAESNRGSKLVRRNTVFYNPLINVQYKNVTVQNITLEGIGANTNQQLLSLAGDDTSNSALINLPATSYAANPKAFSAVNVNFFDSAIGVASVGILPQDLNISYNTFQNINRAVELLRDVDRVDDALLANVSIQMNGEVIGMYGGKLNISNNLINAENMRLAISLDGGNDGAGFVGTGFQNPWSEKRQRFTDKPVYYSNTIGEAVINNNKIGYYQHSDGNVWTIGQTREFGIALATVANIYVVGNHLRTGLNYITQADGVTPVANASYGFGSAINVEHNGENIVVQANHIVVGAKGSGANAFTVLAFNDHGAFWNIAQASKNLTYADNVISGTGQNVFYAIGYRNLNMINNDVRNFNSTGPVFGCAGVVSPINNFLANVPGGYSNSYMQQNVSTKGRLWFDAVRDNGQLVGAFKGQGPRAPRSFYYLAGDDPKNPRFGDAQIVDSSSVLSCN。
密码子优化后的基因的核苷酸序列（方向5’-3’，如SEQ ID NO.2所示）：
GCAAGCACCTATAACGTGTATACCGAAGCACAGCTGAATACCGCACTGGAAAGCGCAAAAAATAATGGCCTGGATACGGTCGATACAATTCGTGTTAACGGCACCATTAATATTTATGGTCAGATTGATGTGAAAAGCAGCGTAATTATTACCGGCGCAGAAAGCAATCGTGGTAGCAAACTGGTGCGTCGTAATACCGTTTTCTATAATCCGCTGATTAACGTTCAGTATAAAAATGTTACCGTGCAGAACATCACCCTGGAAGGCATCGGTGCAAATACCAACCAGCAGCTGCTGAGCCTGGCAGGTGATGATACCTCCAATAGCGCACTGATTAATCTGCCGGCCACCAGCTATGCAGCGAATCCAAAAGCATTTAGCGCAGTGAATGTTAACTTCTTCGATAGCGCAATTGGTGTTGCAAGCGTTGGTATTCTGCCTCAGGATCTGAACATCTCTTATAATACCTTTCAGAACATCAACCGTGCAGTTGAACTGCTGCGTGATGTTGATCGTGTTGATGATGCACTGCTGGCGAATGTTAGTATTCAGATGAATGGTGAAGTTATCGGCATGTATGGCGGCAAACTGAATATTAGCAATAATCTGATTAACGCCGAAAATATGCGCCTGGCCATTAGCCTGGATGGTGGTAACGATGGTGCGGGTTTTGTTGGTACAGGTTTTCAGAATCCGTGGAGTGAAAAGCGTCAGCGCTTTACGGATAAACCGGTTTATTATAGCAATACCATTGGTGAAGCAGTTATTAATAACAATAAAATCGGCTATTATCAGCATAGCGATGGTAATGTTTGGACAATTGGTCAGACCCGTGAATTTGGTATCGCACTGGCCACCGTGGCAAACATTTATGTGGTAGGTAACCATCTGCGCACAGGCCTGAATTATATTACCCAGGCAGATGGCGTTACCCCGGTTGCAAACGCCTCTTATGGTTTTGGCTCAGCAATTAACGTGGAACATAACGGTGAAAATATTGTGGTTCAGGCAAATCATATTGTGGTTGGTGCAAAAGGTAGCGGTGCAAATGCCTTTACCGTGCTGGCCTTTAATGATCATGGCGCATTTTGGAATATTGCACAGGCAAGCAAAAACCTGACCTATGCAGATAACGTTATTAGCGGTACCGGTCAGAATGTGTTTTATGCAATTGGCTATCGTAATCTGAATATGATTAACAATGATGTGCGCAACTTTAACAGTACCGGTCCGGTTTTCGGTTGTGCAGGTGTTGTTAGTCCGATTAATAATTTTCTGGCAAATGTACCGGGTGGCTATAGCAATAGCTATATGCAGCAGAATGTGAGCACCAAAGGTCGCCTGTGGTTTGATGCAGTGCGTGATAATGGTCAGCTGGTTGGTGCATTTAAAGGTCAGGGCCCGCGTGCACCGCGTAGTTTTTATTATCTGGCAGGTGATGATCCGAAAAATCCGCGTTTTGGTGATGCACAGATTGTTGATAGCAGTTCCGTTCTGAGTTGTAAT。
实施例2 β-琼胶酶OUC-AgaC4的制备
步骤如下：
（1）重组表达载体的构建
实施例1合成的基因片段，与PET-28a克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞。使用含硫酸卡那霉素的LB平板进行阳性转化子筛选。克隆子使用T7通用引物进行菌落PCR验证后，挑取阳性克隆测序，得重组质粒。
（2）重组工程菌的构建
提取测序正确的重组质粒，转化至宿主E.coli BL21感受态细胞中，构建好的工程菌在硫酸卡那霉素抗性平板上长出。
（3）β-琼胶酶OUC-AgaC4的表达与纯化
挑取在硫酸卡那霉素抗性平板上长出的重组工程菌菌株，接种在5 mL含有30μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220 rpm培养12小时；按1%的接种量接入50 mL含有30μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220 rpm培养至OD值为0.8；加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导16小时表达β-琼胶酶。
取培养液，4℃、8000 g离心 10分钟，收集菌体，重悬于Tirs-HCl缓冲液（50 mM，pH8.0）中，超声破碎30 min，12000 g 离心40 min，上清液即为粗酶液。
粗酶液使用Ni-NTA镍柱进行亲和层析纯化，使用10 mM咪唑溶液（10 mM咪唑，150mM NaCl，50 mM Tris-HCl）平衡柱子，然后用20 mM咪唑溶液（20 mM咪唑，150 mM NaCl，50mM Tris-HCl）洗脱结合力弱的杂蛋白，200 mM咪唑溶液（200 mM咪唑，150 mM NaCl，50 mMTris-HCl）洗脱目的蛋白，收集此部分的洗脱成分，即为纯化后的酶液，进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示，纯化后的蛋白呈现单一条带，分子量约为53 KD，与预测一致。使用截留分子量为30 KD的超滤管进行浓缩，浓缩至蛋白浓度为1 mg/mL，得含β-琼胶酶OUC-AgaC4的酶液，称之为酶液1，用于下述实施例3～5的研究。
实施例3 酶活测定
使用DNS显色法测定β-琼胶酶的酶活，反应体系组成为：190μL琼脂糖溶液，10μL酶液1（实施例2制备）。40℃反应20 min。反应结束后，沸水浴10 min灭活酶终止反应，加入300μL的DNS试剂，沸水浴煮沸10 min以显色，检测540 nm处的吸光度值。
一个单位（U）的β-琼胶酶活性定义为：每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量。
经测定，实施例2的酶液1的β-琼胶酶活力为27.38 U/mL，即β-琼胶酶OUC-AgaC4的酶活为27.38 U/mg。
所述琼脂糖溶液，是由琼脂糖和水组成的，浓度为3 mg/mL。
所述琼脂糖购买自北京擎科生物科技股份有限公司，商品号为NO.TSJ001。
实施例4 β-琼胶酶OUC-AgaC4的最适反应条件的测定
最适温度的测定：在25～55℃范围内，按照实施例3的测定方法测定不同温度时的酶活，以最高酶活力为100%，计算在不同温度下的相对酶活力，结果如图2所示，最适反应温度为40℃，在30～45℃范围内活性较高，相对活性高于80%。
最适pH的测定：在pH 3.0～10.0范围内（所使用的缓冲液为：pH 3.0～6.0的柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0～8.0的磷酸盐缓冲液，pH 7.0～9.0的Tris-HCl缓冲液，pH 9.0～10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），按照实施例3的测定方法测定酶活，以最高酶活力为100%，计算在不同pH下的相对酶活力，结果如图3所示，最适pH为6.0。
温度稳定性的测定：将酶液1在不同温度（25℃、40℃、45℃、50℃、55℃）下保温不同时间（0 min，20 min，40 min，1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h），然后按照实施例3的测定方法测定酶活，以最高酶活力为100%，计算在不同温度条件下保温不同时间后的相对酶活力，结果如图4所示。由图4可知，β-琼胶酶OUC-AgaC4在最适温度40℃下孵育24 h，仍能保持80%以上活性，表明该酶具有良好的温度稳定性，但对50℃以上高温较为敏感。
pH稳定性的测定：将10μL酶液1与190μL不同pH的缓冲液（所使用的缓冲液为：pH3.0～6.0的柠檬酸盐缓冲液，pH 7.0～9.0的Tris-HCl缓冲液）混合，混合液在4℃条件下保温24 h。然后向混合液中加入琼脂糖（0.57 mg），混匀，按照实施例3的测定方法测定酶活，以最高酶活力为100%，计算在不同pH条件下保温24 h后的相对酶活力，结果如图5所示。由图5可知，β-琼胶酶OUC-AgaC4在pH 3～9之间表现出较高的稳定性，孵育24 h后仍有85%以上残余酶活，pH稳定性良好。
实施例5 β-琼胶酶OUC-AgaC4降解琼脂糖的产物鉴定
将10μL酶液1与190μL琼脂糖溶液（3 mg/mL）混合，在40℃下反应24 h；沸水浴20min以终止反应，得反应液。采用薄层层析法（TLC）分析降解产物的聚合度，标准品选用新琼寡糖混合物（2～10糖），具体如下：分别取3.5μL标准品溶液、12μL去离子水（作为空白对照）、12μL反应液，作为样品，在硅胶板上用毛细管点样。在体积比为1:1:2的正丁醇-乙酸-水混合液中进行展开，展开结束后吹风机吹干，再展开一次，然后进行二次吹干。接着置于麝香草酚显色剂（将10 mL密度为1.84 g/cm³的浓硫酸加入无水乙醇中，用无水乙醇定容至100 mL，然后加入0.5 g麝香草酚，混匀）中进行染色，100℃下显色5 min，观察各样品条带。结果如图6所示，β-琼胶酶OUC-AgaC4降解琼脂糖后，最终产物中包括新琼四糖、新琼六糖、新琼八糖、新琼十糖，以及聚合度更高的新琼十二糖、新琼十四糖等新琼寡糖（寡糖分子量越大，在TLC板上的移动速度越慢，图中新琼十糖下方的斑点即为新琼十二糖、新琼十四糖等），且产物主要是新琼八糖、新琼十糖，以及聚合度更高的新琼十二糖、新琼十四糖等新琼寡糖（代表新琼四糖、新琼六糖的斑点的颜色较浅，表明产物中新琼四糖、新琼六糖的含量较低；而代表新琼八糖、新琼十糖、新琼十二糖、新琼十四糖的斑点的颜色较深，表明它们在产物中的含量较高）。可见，β-琼胶酶OUC-AgaC4具有制备高聚合度新琼寡糖的能力。
实施例6 对β-琼胶酶OUC-AgaC4进行改造
β-琼胶酶OUC-AgaC4虽然具有制备高聚合度新琼寡糖的能力，但酶解反应速率偏低，因此本发明对其进行突变改造，以期获得具有更高酶解反应速率的β-琼胶酶。
为了增强酶与底物琼脂糖的作用方式，利用AlphaFold2蛋白质建模服务器构建了β-琼胶酶OUC-AgaC4的结构模型，与NA8分子对接后，对接结果为起点进行了100 ns尺度下的分子动力学模拟，根据模拟结果发现第242位的天冬氨酸支链长度会影响底物与催化残基的结合。因此针对此位点进行定点突变，将β-琼胶酶OUC-AgaC4的242位点的天冬氨酸改为丙氨酸，具体方式为：将β-琼胶酶OUC-AgaC4编码基因上242位天冬氨酸的密码子由“GAT”改为丙氨酸的密码子“GCG”。突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，命名为β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A。突变后的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，人工合成该基因片段。
β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的氨基酸序列（如SEQ ID NO.3所示）：
ASTYNVYTEAQLNTALESAKNNGLDTVDTIRVNGTINIYGQIDVKSSVIITGAESNRGSKLVRRNTVFYNPLINVQYKNVTVQNITLEGIGANTNQQLLSLAGDDTSNSALINLPATSYAANPKAFSAVNVNFFDSAIGVASVGILPQDLNISYNTFQNINRAVELLRDVDRVDDALLANVSIQMNGEVIGMYGGKLNISNNLINAENMRLAISLDGGNDGAGFVGTGFQNPWSEKRQRFTAKPVYYSNTIGEAVINNNKIGYYQHSDGNVWTIGQTREFGIALATVANIYVVGNHLRTGLNYITQADGVTPVANASYGFGSAINVEHNGENIVVQANHIVVGAKGSGANAFTVLAFNDHGAFWNIAQASKNLTYADNVISGTGQNVFYAIGYRNLNMINNDVRNFNSTGPVFGCAGVVSPINNFLANVPGGYSNSYMQQNVSTKGRLWFDAVRDNGQLVGAFKGQGPRAPRSFYYLAGDDPKNPRFGDAQIVDSSSVLSCN。
β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的编码基因的核苷酸序列（方向5’-3’，如SEQ ID NO.4所示）：
GCAAGCACCTATAACGTGTATACCGAAGCACAGCTGAATACCGCACTGGAAAGCGCAAAAAATAATGGCCTGGATACGGTCGATACAATTCGTGTTAACGGCACCATTAATATTTATGGTCAGATTGATGTGAAAAGCAGCGTAATTATTACCGGCGCAGAAAGCAATCGTGGTAGCAAACTGGTGCGTCGTAATACCGTTTTCTATAATCCGCTGATTAACGTTCAGTATAAAAATGTTACCGTGCAGAACATCACCCTGGAAGGCATCGGTGCAAATACCAACCAGCAGCTGCTGAGCCTGGCAGGTGATGATACCTCCAATAGCGCACTGATTAATCTGCCGGCCACCAGCTATGCAGCGAATCCAAAAGCATTTAGCGCAGTGAATGTTAACTTCTTCGATAGCGCAATTGGTGTTGCAAGCGTTGGTATTCTGCCTCAGGATCTGAACATCTCTTATAATACCTTTCAGAACATCAACCGTGCAGTTGAACTGCTGCGTGATGTTGATCGTGTTGATGATGCACTGCTGGCGAATGTTAGTATTCAGATGAATGGTGAAGTTATCGGCATGTATGGCGGCAAACTGAATATTAGCAATAATCTGATTAACGCCGAAAATATGCGCCTGGCCATTAGCCTGGATGGTGGTAACGATGGTGCGGGTTTTGTTGGTACAGGTTTTCAGAATCCGTGGAGTGAAAAGCGTCAGCGCTTTACGGCGAAACCGGTTTATTATAGCAATACCATTGGTGAAGCAGTTATTAATAACAATAAAATCGGCTATTATCAGCATAGCGATGGTAATGTTTGGACAATTGGTCAGACCCGTGAATTTGGTATCGCACTGGCCACCGTGGCAAACATTTATGTGGTAGGTAACCATCTGCGCACAGGCCTGAATTATATTACCCAGGCAGATGGCGTTACCCCGGTTGCAAACGCCTCTTATGGTTTTGGCTCAGCAATTAACGTGGAACATAACGGTGAAAATATTGTGGTTCAGGCAAATCATATTGTGGTTGGTGCAAAAGGTAGCGGTGCAAATGCCTTTACCGTGCTGGCCTTTAATGATCATGGCGCATTTTGGAATATTGCACAGGCAAGCAAAAACCTGACCTATGCAGATAACGTTATTAGCGGTACCGGTCAGAATGTGTTTTATGCAATTGGCTATCGTAATCTGAATATGATTAACAATGATGTGCGCAACTTTAACAGTACCGGTCCGGTTTTCGGTTGTGCAGGTGTTGTTAGTCCGATTAATAATTTTCTGGCAAATGTACCGGGTGGCTATAGCAATAGCTATATGCAGCAGAATGTGAGCACCAAAGGTCGCCTGTGGTTTGATGCAGTGCGTGATAATGGTCAGCTGGTTGGTGCATTTAAAGGTCAGGGCCCGCGTGCACCGCGTAGTTTTTATTATCTGGCAGGTGATGATCCGAAAAATCCGCGTTTTGGTGATGCACAGATTGTTGATAGCAGTTCCGTTCTGAGTTGTAAT。
实施例7 β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的制备
步骤如下：
（1）重组表达载体的构建
实施例6合成的基因片段，与PET-28a克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞。使用含硫酸卡那霉素的LB平板进行阳性转化子筛选。克隆子使用T7通用引物进行菌落PCR验证后，挑取阳性克隆测序，得重组质粒。
（2）重组工程菌的构建
提取测序正确的重组质粒，转化至宿主E.coli BL21感受态细胞中，构建好的工程菌在硫酸卡那霉素抗性平板上长出。
（3）β-琼胶酶OUC-AgaC4的表达与纯化
挑取在硫酸卡那霉素抗性平板上长出的重组工程菌菌株，接种在5 mL含有30μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220 rpm培养12小时；按1%的接种量接入50 mL含有30μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220 rpm培养至OD值为0.8；加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导16小时表达β-琼胶酶。
取培养液，4℃、8000 g离心 10分钟，收集菌体，重悬于Tirs-HCl缓冲液（50 mM，pH8.0）中，超声破碎30 min，12000 g 离心40 min，上清液即为粗酶液。
粗酶液使用Ni-NTA镍柱进行亲和层析纯化，使用10 mM咪唑溶液（10 mM咪唑，150mM NaCl，50 mM Tris-HCl）平衡柱子，然后用20 mM咪唑溶液（20 mM咪唑，150 mM NaCl，50mM Tris-HCl）洗脱结合力弱的杂蛋白，200 mM咪唑溶液（200 mM咪唑，150 mM NaCl，50 mMTris-HCl）洗脱目的蛋白，收集此部分的洗脱成分，使用截留分子量为30 KD的超滤管进行浓缩，浓缩至蛋白浓度为1 mg/mL，得含β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的酶液，称之为酶液2，用于下述实施例8、9的研究。
实施例8 β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A酶活的测定
按照实施例3的测定方法酶液2的酶活，并与酶液1的酶活作比较，以去离子水为空白对照，以酶液1的酶活为100%计算相对酶活，对比结果如图7所示，可见，β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的酶活是β-琼胶酶OUC-AgaC4的3.6倍，有了大幅度的提升。
另外，实施例7的定点突变改造针对的是β-琼胶酶的催化活性，对β-琼胶酶水解琼脂糖的其他性质及生成产物的种类无影响。
实施例9 β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的酶动力学过程测定
取10μL酶液2，与190μL不同浓度的琼脂糖溶液（浓度分别为5、10、15、20、25、30、35、40 mg/mL）混合，40℃下反应20 min；沸水浴10 min灭活酶终止反应，加入300μL的DNS试剂，沸水浴10 min，记录在540 nm处的吸光值，测定反应速率，并采用双倒数作图法绘制酶动力学过程曲线，计算最大反应速率和米氏常数，结果如图8所示，β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A最大反应速率Vmax为 3333μmoL/（L×min），米氏常数Km为0.33 mol/L，具有优越的催化降解能力。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (5)
1.一种β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1所述的β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A在制备新琼寡糖中的应用，其特征在于：所述新琼寡糖选自新琼八糖、新琼十糖、新琼十二糖中的任意一种或两种以上。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：具体应用时，将含β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的酶液加入到琼脂糖溶液中，在40℃下反应20分钟～24小时，得到新琼寡糖。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将10μL含β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的酶液加入到190μL琼脂糖溶液中，在40℃下反应20分钟，得到新琼寡糖；所述含β-琼胶酶OUC-AgaC4-D242A的酶液中蛋白浓度为1 mg/mL，所述琼脂糖溶液的浓度为3 mg/mL；所述新琼寡糖为新琼八糖、新琼十糖和新琼十二糖。
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| Title |
|---|
| Inducible expression of agar-degrading genes in a marine bacterium Catenovulum maritimus Q1T and characterization of a β-agarase;Zhen-Xing Xu等;Applied Microbiology and Biotechnology;20201026;第104卷;10545, 10548-10549 * |
| 来源于Wenyingzhuangia属海洋细菌的一种β-琼胶酶的克隆表达及性质研究;田雪健等;食品与发酵工业;20190218(第08期);26-32 * |
| 琼胶酶酶学研究进展;朱磊等;生命的化学;20160415;第36卷(第02期);193-197 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117467647A (zh) | 2024-01-30 |
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