CN112941089B

CN112941089B - 褐藻胶裂解酶突变基因、褐藻胶裂解酶突变体、含该突变体的工程菌及构建方法和应用

Info

Publication number: CN112941089B
Application number: CN202110189613.4A
Authority: CN
Inventors: 张志凯; 迟艳; 李峰; 王学江; 于蒙爱
Original assignee: Wuzhoufeng Agricultural Science & Technology Co ltd
Current assignee: Wuzhoufeng Agricultural Science & Technology Co ltd
Priority date: 2021-02-19
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2041-02-19
Also published as: CN112941089A

Abstract

本发明公开了一种褐藻胶裂解酶突变基因、褐藻胶裂解酶突变体、含该突变体的工程菌及构建方法和应用。本发明还公开利用基因工程的技术方法，将该新褐藻胶裂解酶的突变基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达来制备的褐藻胶裂解酶突变体mAlgNJU‑03，具有降解褐藻酸钠制备褐藻酸钠寡糖并改变了寡糖聚合度的功能。本发明提供的褐藻胶裂解酶突变体mAlgNJU‑03可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。

Description

褐藻胶裂解酶突变基因、褐藻胶裂解酶突变体、含该突变体的工程菌及构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株褐藻胶裂解酶突变基因、突变体及其应用。

背景技术

我国拥有广阔的海域面积，其中蕴含着丰富的海洋生物资源，尤其是海藻资源。褐藻主要包括海带、裙带等，其细胞壁中富含的褐藻胶是一种直链酸性多糖，在天然状态下，褐藻胶的主要存在状态为水溶性的褐藻酸钠(sodium alginate)、褐藻酸钾等褐藻酸盐类和水不溶性的褐藻酸(alginic acid)。目前市场上的褐藻酸钠(商品名为海藻酸钠)或其他褐藻酸盐主要是从褐藻中获得。研究发现降解褐藻酸钠所得到的寡糖具有多种生物活性，比如免疫调节、促生长、诱导植物抗性和提高蛋白质稳定性等，因而可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加和医药等领域(刘航,天然产物研究与开发,2012,24:201-204)。褐藻酸钠可用多种方法降解，包括化学降解法、物理降解法和酶降解法。化学降解法以酸降解为主，但该方法降解条件难以控制，操作较复杂，耗时长。物理降解法包括辐射法和超声法等，一般与其他降解法一起使用，降解产物的极限分子质量为50kDa左右，不易制得寡糖。而用褐藻胶裂解酶降解褐藻酸钠具有降解条件温和，得率高等优点，且因为酶的底物专一性，能为后续研究寡糖化学结构提供信息，故而褐藻胶裂解酶逐步成为优先降解褐藻酸钠的方法。另外，褐藻胶裂解酶还能应用于肺囊肿性纤维化症的治疗、海藻饲料加工及海藻遗传工程等领域的研究(Wong TY et al.Annual Review of Microbiology,2000,54:289-340)。

褐藻酸裂解酶来源于海洋动植物和多种微生物(包括海洋细菌、土壤细菌和真菌)。褐藻酸钠裂解酶按其底物专一性可分为两大类：1,4-D-甘露糖醛酸片段裂解酶(EC4.2.2.3)和1,4-L-古罗糖醛酸片段裂解酶(EC 4.2.2.11)。至今，褐藻胶裂解酶的生产大多依赖原始产酶动植物或微生物来获得酶蛋白，此种方法虽然能有效的获得一定量的酶蛋白，但产量有限，成本较高，较难满足实际应用需求。随着生物技术的发展，提供了利用基因工程高效生产褐藻胶裂解酶的技术方法。Dong Eun Kim等根据已知的相关功能基因的相似序列设计PCR引物，从Streptomyces sp.ALG-5菌株中克隆到了一个褐藻胶裂解酶突变基因，并在Escherichia coli BL21(DE3)中成功表达(Kim et al.MarineBiotechnology.2009.11:10-16)。采用这一策略必须对相关基因序列有一定的了解才能设计PCR引物，并且找到的是某一类结构或功能相似蛋白质中的新分子，较难发现全新的基因。

随着高通量测序技术的不断发展，越来越多的产褐藻胶裂解酶的微生物基因组序列得以测定，这使得通过基因组挖掘技术来分析序列信息，对编码褐藻胶裂解酶的基因进行钓取变得简洁快速，Badur AH等对来源于海洋的一株细菌Vibrio splendidus的基因组进行序列测定，通过分析发现该菌株中含有4个编码褐藻胶裂解酶的基因，对其进行了基因克隆和在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的重组表达(Badur et alAppl.Environ.Microbiol.2015.81：1865-1873)；目前获得褐藻胶裂解酶大多数是专一性降解均聚甘露糖醛酸的褐藻胶裂解酶，少数是具有具有降解古洛糖醛酸活性的褐藻胶裂解酶，而具有广泛底物特异性的褐藻胶裂解酶则非常稀少，只有来源于Pseudoalteromonassp.的褐藻胶裂解酶Aly-SJ02(李建伟,Marine Drugs,2011,21:1374-80)，来源于白蚁肠道的Isoptericola halotolerans的褐藻胶裂解酶AlyIH(窦文芳等,CarbohydratePolymers,2013,98:1476-82)等具有广泛底物特异性的酶活力较低，而且稳定性差，其中AlyIH只是获得了纯化的酶，尚未获得其编码基因，不能进行重组表达和分子改造；而且大多数褐藻胶裂解酶(包括CN 107099545 A)活性较低，得到的寡糖多为2到4糖。根据前人文献报道，很多酶都有两个loop环，容易形成与底物结合的裂隙，改变loop附近的氨基酸残基是探讨酶特性较佳策略(R.He,A.C.Reyes,T.L.Amyes,J.P.Richard,EnzymeArchitecture:The Role of a Flexible Loop in Activation of Glycerol-3-phosphate Dehydrogenase for Catalysis of Hydride Transfer,Biochemistry-Us 57(23)(2018)3227-3236)，有可能会改变产物的大小。相对于CN 107099545 A,我们将原褐藻胶裂解酶突变基因核苷酸序列(GenBank Accession No.:KY062661.1中的GAAGAC碱基(第1009到1004位点)缺失后克隆到质粒中pET21a(+)，得到重组载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了褐藻胶酶突变体。其中337E和338D位于原酶(其序列GenBank accessionNo.ASA33933.1)的左边loop环突起位置(Figure 1A)。缺失这两个残基，loop环中的内部突起消除(Figure 1B)。相对于CN 107099545 A原来的酶，本发明涉及的重组褐藻胶裂解酶突变体具有高活性和高稳定性的特点，其降解产物寡糖的聚合度提高(主要是三糖、四糖、五糖和六糖)，具有很好的工业化应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种新型褐藻胶裂解酶突变基因及突变体。

本发明还要解决的技术问题是，提供包含上述褐藻胶裂解酶突变体的工程菌及其构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供所述褐藻胶裂解酶突变基因及褐藻胶裂解酶突变体的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种褐藻胶裂解酶突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种褐藻胶裂解酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

包含上述褐藻胶裂解酶突变基因的工程菌，该菌株中导入了褐藻胶裂解酶突变基因，所述的褐藻胶裂解酶突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述产褐藻胶裂解酶突变基因的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将褐藻胶裂解酶突变基因克隆到质粒中，得到重组载体；

(2)将重组载体转化宿主菌，得到产褐藻胶裂解酶突变体的工程菌。

步骤(1)中，所述的质粒为pET21a(+)。

步骤(2)中，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

上述褐藻胶裂解酶突变基因在裂解褐藻酸盐和褐藻多糖中的应用在本发明的保护范围之内。

上述包含褐藻胶裂解酶突变基因的工程菌在发酵产褐藻胶裂解酶中的应用在本发明的保护范围之内。

有益效果：

本发明的mAlgNJU-03来源于海洋细菌Vibrio sp.NJ-04，通过定点突变，获得编码褐藻胶裂解酶突变体mAlgNJU-03的DNA突变序列，该基因编码区长13539bp，编码450个氨基酸，其中1-21个氨基酸为信号肽，理论分子量为50.6kDa，属于多糖裂解酶7家族。大肠杆菌重组表达获得的mmAlgNJU-03，对于褐藻胶、polyM和polyG均具有较高活性，属于双功能褐藻胶裂解酶。本发明涉及的重组褐藻胶裂解酶突变体具有高活性和高稳定性的特点，其降解产物寡糖的聚合度提高(主要是二糖、三糖、四糖、五糖和六糖)，降解产物中寡糖的含量提高，降解能力更强，具有很好的工业化应用前景，可广泛用于化工、农业、食品和饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。

附图说明

图1：褐藻胶裂解酶AlgNJU-03和突变体mAlgNJU-03的蛋白质三维结构模型。A,AlgNJU-03。大圈是loop环的范围，小圈是337E和338D形成的突起。B,mAlgNJU-03

图2：重组褐藻胶裂解酶突变体mAlgNJU-03表达纯化的聚丙烯酰氨凝胶电泳图(SDS-PAGE)。

图3:温度、pH对于褐藻胶裂解酶突变体mAlgNJU-03的活性及稳定性影响曲线。

图4：褐藻胶裂解酶降解褐藻胶、polyM和polyG所得产物的电喷雾质谱(ESI-MS)分析图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：菌株Vibrio sp.NJU-03的培养及鉴定

所采用的菌株来源于采集自黄海海域的海藻样品，经分离得到一株产褐藻胶裂解酶的菌株NJ-04，使用的选择性培养基的配方为：

牛肉膏5g、葡萄糖15g、酵母浸粉1.0g、NaCl 5.0g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、CaCl₂ 0.2g、KH₂PO₄ 1.0g、FeSO₄·7H₂O 0.02g，pH值为7.0。固体培养基添加1.5％的琼脂。

将菌落接入100mL液体培养基中进行富集培养，30℃，150rpm培养36h。取4mL已经培养好的菌液，置于2mL tube管中，5000g，10min充分离心。弃去上清，用180μL消化液(Digestion Solution)将菌体重悬，再加入20μL蛋白酶K，充分混匀后，56℃温育30min。加入20μL RnaseA，充分混匀后，室温放置10min。加入200μL裂解液(Lysis Solution)，快速混匀，过程不要超过15s。加入400μL 50％(v/v)乙醇溶液，充分混匀。将上述溶液转移至吸附柱中，静置1min，离心6000g，1min，弃废液，将吸附柱转移至一个新的2mL tube管中。加入500μL wash buffer I，8000g，1min离心，弃废液。加入500μL wash buffer II，8000g，1min离心，弃废液。重复一次。将空吸附柱12000g，3min离心，将柱内残留液体充分甩干。在吸附柱基质膜中间位置加入200μL洗脱液(Elution Buffer)静置1min，8000g，1min离心，即得基因组。

实施例2：褐藻胶裂解酶突变体mAlgNJU-03编码基因的克隆与鉴定

根据Vibrio sp.JCM 19052基因中的推测的褐藻胶裂解酶突变基因序列设计如下扩增引物：上游引物forward primer(5’-ATGAAAAGCAAGTTAGTCAA-3’)，和下游引物reviseprimer(5’-CGGGAATTCATACCCGTCG-3’)。突变引物：上游引物forward primer(5’-GCGCATGAACCTAACGAAGACGCGTCATCAGATCCAGAG-3’)，和下游引物revise primer(5’-CTGGATCTGATGACGCGTCTTCGTTAGGTTCATGCGCAAAG-3’)。以提取的菌株基因组为模板，进行重叠PCR扩增得到褐藻胶裂解酶突变体mAlgNJU-03基因全长序列。

PCR条件为：94℃预变性3min，随后以94℃30s、55℃30s、72℃2min进行30个循环，最后在72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳显示在1.3kb左右一条特异性条带，将其从琼脂糖凝胶上切下，采用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化。

将纯化的DNA片段连接到克隆载体pEASY-Blunt Zero Cloning vector上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在LB固体培养基(含有氨苄青霉素)中培养后，挑取白色菌落使用扩增引物进行PCR验证。PCR条件为94℃预变性3min，随后以94℃30s、55℃30s、72℃2min进行30个循环，最后在72℃延伸10min。测序所得基因序列设计巢式PCR引物来按照上述条件来克隆褐藻胶裂解酶突变基因的全长。将出现特异性条带所对应的重组菌株大量培养，使用质粒提取试剂盒进行质粒抽提，进行测序分析。结果表明褐藻胶裂解酶突变基因的全核苷酸序列全长1338bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码445个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，蛋白理论分子量为47.8kDa。用NTI-vector对褐藻胶裂解酶mAlgNJU-03与PL7家族其他酶序列进行同源比对，如图1所示。

SEQ ID NO.1：mAlgNJU-03编码基因开放阅读框(ORF)全长1344bp，编码褐藻胶裂解酶的成熟酶序列。

SEQ ID NO.2：褐藻胶裂解酶mAlgNJU-03结构中包含一个褐藻胶裂解酶家族2(Alginate Lyase 2family)结构域。

实施例3：褐藻胶裂解酶mAlgNJU-03重组表达载体构建。

根据褐藻胶裂解酶突变基因全序列设计上游引物(5’-CGCGGATCCATGAAAAGCAAGTTAGTCAA-3’)和下游引物(5’-CCGCTCGAGCGGGAATTCATACCCGTCG-3’)，突变引物：上游引物forward primer(5’-GCGCATGAACCTAACGAAGACGCGTCATCAGATCCAGAG-3’)，和下游引物revise primer(5’-CTGGATCTGATGACGCGTCTTCGTTAGGTTCATGCGCAAAG-3’)。进行重叠PCR扩增得到褐藻胶裂解酶突变体mAlg NJU-03基因全长序列。PCR条件为：94℃预变性3min，随后以94℃30s、55℃30s、72℃2min进行30个循环，最后在72℃延伸10min。PCR产物用NdeI和XhoI进行酶切后回收；将大肠杆菌表达载体pET21a(+)同样用NdeI和XhoI进行酶切后回收，将其与上述所得目的基因连接后转化大肠杆菌DH5α中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。用质粒提取试剂盒抽提阳性转化子质粒，使用NdeI和XhoI进行酶切验证，得到长度分别为5.5kb和1.5kb左右两个片段，证明褐藻胶裂解酶突变基因已经克隆到表达载体pET21a(+)上，将此重组质粒命名为pET21a-mAlgNJU-03。

实施例4：褐藻胶裂解酶突变体mAlgNJU-03基因在大肠杆菌中的重组表达与纯化制备。

将重组表达质粒pET21a-mAlgNJU-03转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行褐藻胶裂解酶突变体mAlgNJU-03诱导表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测褐藻胶裂解酶突变体mAlgNJU-03的纯化情况，结果如图2所示，纯化后的突变体mAlgNJU-03在电泳胶上呈现单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例5：褐藻胶裂解酶突变体mAlgNJU-03的酶学性质分析。

1、pH和温度对酶活性的影响

将质量浓度为1％褐藻酸钠底物、纯化的mAlgNJU-03酶液以及不同pH值的20mMTris-HCl、磷酸盐、醋酸盐缓冲液(pH范围为2.0-11.0)按9:1:10(体积比)的比例混合后，在30℃反应10分钟，紫外吸收法测酶活力。结果显示mAlgNJU-03在pH 8.0时达到最大活力，表明mAlgNJU-03的最适反应pH为8.0。在最适pH下，将质量浓度为1％褐藻酸钠底物、纯化的mAlgNJU-03酶液以及20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)按9:1:10(体积比)的比例混合，分别在不同温度(20℃-70℃)反应10分钟，按紫外吸收法测酶活力。结果显示mAlgNJU-03在30℃时达到最大活力，表明mAlgNJU-03的最适反应温度为30℃(如图3-a,c)。

2、pH和温度对酶稳定性的影响

将在不同温度(20℃-80℃)下热处理30min后的mAlgNJU-03酶液与质量浓度为1％褐藻酸钠底物溶液按1:9(体积比)的比例混合，然后在最适温度和最适pH下测定剩余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力(relativie activity)，结果表明mAlgNJU-03在低于40℃的温度下具有较好的热稳定性；将在30℃，不同的pH(pH4-10)预孵育24h后的mAlgNJU-03酶液与质量浓度为1％褐藻酸钠底物溶液按1:9(体积比)的比例混合，然后在最适温度和最适pH下测定剩余酶活，以不经过pH处理的酶液酶活定义为100％相对活力(relativie activity)，结果显示在pH6～10的范围内，mAlgNJU-03酶活仍保持70％以上，表明mAlgNJU-03对pH值耐受范围较广(如图3-b,d)。

3、mAlgNJU-03的酶活性及动力学

将纯化的mAlgNJU-03分别与质量浓度为0.1％的褐藻酸钠、聚甘露糖醛酸片段(polyM)和聚古洛糖醛酸片段(polyG)三种不同底物按1:9(体积比)的比例混合，然后在30℃,pH7.0条件下反应。取不同反应时间点的产物测其235nm紫外吸收值，发现随着酶解时间延长，235nm吸收值逐渐增加，根据紫外法测褐藻胶裂解酶的原理(Qing-Da An etal.Process Biochemistry,2008,43:842–847)，证实mAlgNJU-03是裂解酶突变体。另外，如图4所示，mAlgNJU-03对聚古洛糖醛酸片段、褐藻酸钠和聚甘露糖醛酸片段的降解均具有较好的降解活性，尤其对于褐藻胶的降解活性最高，表明mAlgNJU-03是一个双功能褐藻胶裂解酶，具有较好的工业应用前景。同时，该酶对于三种不同底物均具有较好的底物亲和力。

表1.褐藻胶裂解酶mAlgNJU-03的底物特异性及酶动力学

实施例6：金属离子对mAlgNJU-03活性的影响

将质量浓度为1％褐藻酸钠底物、纯化的mAlgNJU-03酶液以及50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)按8:2:10(体积比)的比例混合，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的离子终浓度为1mM和5mM，然后在30℃反应10分钟，按前述的紫外吸收法测酶活力。对照组为不加任何金属离子时mAlgNJU-03的活性(设定为100％)，结果如下表所示。实验结果显示，Mg²⁺、Co^2+、Ca²⁺能增加mAlgNJU-03活性，Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等其他离子对酶活呈现抑制作用。

表2.金属离子对于mAlgNJU-03酶活性的影响

实施例7：褐藻胶裂解酶mAlgNJU-03(或突变体m)对三种底物的降解产物的ESI-MS分析。

将质量浓度为0.1％底物(褐藻酸钠、polyM和polyG)、纯化的酶液以及50mM Tris-HCl缓冲液按9:1:10(体积比)的比例混合后，在pH7.0，30℃条件下反应，对酶解72小时后的产物进行电喷雾质谱分析。电喷雾质谱条件为采用正离子模式，离子源电压：4.5kV；鞘气流速：30arb；毛细管温度：275～300℃；管镜电压：250V；扫描范围：150-2000。如图4所示。

采用高效液相色谱法检测原酶降解产物以及酶突变体降解产物的寡糖含量，流动相为0.1mol/L氯化钠，柱温25℃，检测波长235nm，流速0.5ml/min，检测结果如下：

寡糖含量/％	二糖	三糖	四糖	五糖	六糖	小计
							AlgNJU-03(未突变)	42.3	18.5	9.4	0	0	70.2
mAlgNJU-03(突变体)	23.6	21.4	15.9	13.7	10.5	85.1

序列表

<110> 五洲丰农业科技有限公司

<120>褐藻胶裂解酶突变基因、褐藻胶裂解酶突变体、含该突变体的工程菌及构建方法和应用

<130> SG20160919001

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 2

<211> 445

<212> PRT

<213> 弧菌（Vibrio sp.NJU-03）

<400> 2

Met Lys Ser Lys Leu Val Asn Ile Val Gly Ser Ala Val Leu Leu Ser

1 5 10 15

Ser Phe Ala Ala His Ser Ala Glu Val Asn Leu Val Asn Pro Ser Phe

20 25 30

Glu Gln Asp Phe Ser Gly Trp Thr Glu Val Asp Pro Thr Ala Val Ser

35 40 45

Gly Val Ala Tyr Asp Gly Ala Lys Ser Ala Lys Phe Ser Gly Asn Gly

50 55 60

Ala Arg Leu Glu Gln Ser Val Pro Val Thr Ser Asn Thr Glu Tyr Thr

65 70 75 80

Leu Ser Ala Tyr Val Leu Ala Asp Ala Asn Ile Gly Val Glu Val Gly

85 90 95

Ser Asp Thr Phe Ser Lys Thr Ala Ser Asn Ser Asp Trp Ala Gln Thr

100 105 110

Thr Ile Thr Phe Asn Ser Gly Asp Ala Thr Glu Ile Thr Ile Phe Gly

115 120 125

Glu Tyr Ser Gly Ala Glu Gly Arg Val Asp Leu Phe Lys Leu Thr Ser

130 135 140

Ser Glu Ile Ile Asp Pro Pro Thr Thr Ser Leu Pro Val Phe Asp Leu

145 150 155 160

Asp Pro Ala Leu Pro Pro Ser Gly Asn Phe Asp Leu Leu Asp Trp Lys

165 170 175

Leu Asp Leu Pro Val Asp Asp Asn Gly Asn Ala Ser Gly Asp Ala Gln

180 185 190

Glu Val Lys Glu Gly Glu Leu Ser Ser Gly Phe Glu Asn Ser Glu Phe

195 200 205

Phe Tyr Thr Gly Asp Asp Gly Gly Leu Val Phe Ile Ser Pro Val Glu

210 215 220

Gly Ala Thr Thr Ser Ala Asn Thr Lys Tyr Thr Arg Ser Glu Met Arg

225 230 235 240

Glu Met Leu Arg Arg Gly Asp Thr Ser Ile Ser Thr Thr Gly Ile Thr

245 250 255

Lys Asn Asn Trp Val Phe Ala Ser Ala Pro Ser Asp Asp Gln Asn Asn

260 265 270

Ser Gly Gly Val Asp Gly Val Leu Glu Ala Thr Leu Ala Val Asn Ala

275 280 285

Val Thr Thr Thr Gly Asp Ser Ser Gln Val Gly Arg Val Ile Val Gly

290 295 300

Gln Ile His Ala Asn Asn Asp Glu Pro Ile Arg Leu Tyr Tyr Arg Leu

305 310 315 320

Leu Pro Gly His Thr Lys Gly Ser Leu Tyr Phe Ala His Glu Pro Asn

325 330 335

Ala Ser Ser Asp Pro Glu Gln Phe Ile Asn Leu Ile Gly Ser Ser Ala

340 345 350

Ser Asn Ala Ser Glu Pro Glu Asp Gly Ile Ala Leu Asn Glu Leu Phe

355 360 365

Phe Tyr Arg Ile Glu Val Gln Gly Asn Gln Leu Ile Val Thr Ile Lys

370 375 380

Arg Asp Asp His Glu Asp Val Thr Glu Thr Val Asp Met Thr Thr Ser

385 390 395 400

Gly Tyr Asp Val Ser Gly Gln Tyr Met Tyr Phe Lys Ala Gly Val Tyr

405 410 415

Asn Gln Asn Asn Ser Gly Asp Pro Thr Asp Tyr Val Gln Ala Thr Phe

420 425 430

Tyr Tyr Leu Thr Asn Ser His Asp Gly Tyr Glu Phe Pro

435 440 445

Claims

1.一种褐藻胶裂解酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.包含褐藻胶裂解酶突变体的工程菌，其特征在于，菌株中导入了褐藻胶裂解酶突变体，所述的褐藻胶裂解酶突变体的序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求2所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 将原褐藻胶裂解酶突变基因核苷酸序列GenBank Accession No.: KY062661.1中的GAAGAC碱基第1009到1014位点缺失后克隆到质粒中pET21a（+），得到重组载体；

(2) 将得到的重组载体转化宿主菌，得到产褐藻胶裂解酶突变体的工程菌。

4.根据权利要求3所述的工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

5.权利要求1所述褐藻胶裂解酶突变体在裂解褐藻酸盐和褐藻多糖中的应用。

6.权利要求2所述包含褐藻胶裂解酶突变体的工程菌在发酵产褐藻胶裂解酶中的应用。