WO2013087043A1

WO2013087043A1 - 黄杆菌属菌株与内切褐藻胶裂解酶编码基因及制备与应用

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Publication number: WO2013087043A1
Application number: PCT/CN2013/070853
Authority: WO
Inventors: 杜昱光; 黄李淑馨; 李曙光; 赵小明; 曹海龙; 刘航
Original assignee: 中国科学院大连化学物理研究所
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2013-01-22
Publication date: 2013-06-20
Also published as: CN102994407A; CN102994407B

Abstract

提供了一种来源于土壤新分离的菌株Flavobacterium sp.S20的内切褐藻胶裂解酶Alg2A的基因序列，其制备方法及应用。还提供了一种制备该褐藻胶裂解酶Alg2A的方法，其利用基因工程的技术方法，将该Alg2A的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株。用该菌株异源表达制备的褐藻胶裂解酶Alg2A，具有降解褐藻酸钠制备褐藻酸钠寡糖的功能，可应用于化工、农业、食品、饲料添加、医药、海藻遗传工程等领域。

Description

黄杆菌属菌株与内切褐藻胶裂解酶编码基因及制备与应用技术领域

本发明涉及一种内切褐藻胶裂解酶 Alg2A的基因序列及其制备方法和应用。本发明还提供了该内切褐藻胶裂解酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明的内切褐藻胶裂解酶 Alg2A可广泛应用于化工、农业、食品、词料添加、医药及海藻遗传工程等领域。背景技术

广阔的海洋蕴藏着丰富的海藻资源，而其中主要由蓝藻、绿藻、红藻和褐藻四大类组成。褐藻胶 (algin) 是一种直链酸性多糖，在天然状态下，褐藻胶在褐藻细胞壁中主要的存在形式为水溶性褐藻酸钠（sodium alginate) 钾等碱金属盐类和水不溶性褐藻酸 (alginic acid)及其与 2价以上金属离子结合的褐藻酸盐类（alginates^ 目前市场上的褐藻酸钠（商品名为海藻酸钠）或其他褐藻酸盐主要是从褐藻中获得。研究发现降解褐藻酸钠所得到的寡糖具有多种生物活性，比如免疫调节、促生长、诱导植物抗性和提高蛋白质稳定性等，因而可广泛应用于化工、农业、食品、词料添加和医药等领域（窦勇, 广西轻工业, 2009, 10:12-13)。褐藻酸钠可用多种方法降解，包括化学降解法、物理降解法和酶降解法。化学降解法以酸降解为主，但该方法降解条件难以控制，操作较复杂，耗时长。物理降解法包括辐射法和超声法等，一般与其他降解法一起使用，降解产物的极限分子质量为 50ku左右，不易制得寡糖。而用褐藻胶裂解酶降解褐藻酸钠具有降解条件温和，得率高等优点，且因为酶的底物专一性，能为后续研究寡糖化学结构提供信息，故而褐藻胶裂解酶逐步成为优先降解褐藻酸钠的方法。另外，褐藻胶裂解酶还能应用于肺囊肿性纤维化症的治疗、海藻词料加工及海藻遗传工程等领域的研究（Wong TY et al. Annual Review of Microbiology, 2000, 54:289-340)。

褐藻酸裂解酶来源于海洋动植物和多种微生物（包括海洋细菌、土壤细菌和真菌）。褐藻酸钠裂解酶按其底物专一性可分为两大类： 1, 4-β-ϋ-甘露糖醛酸片段裂解酶 (Ec 4.2.2.3)和 1, 4-a-L-古罗糖醛酸片段裂解酶 (EC 4.2.2.11)。至今，褐藻胶裂解酶的生产大多依赖原始产酶动植物或微生物来获得酶蛋白，此种方法虽然能有效的获得一定量的酶蛋白，但产量有限，成本较高，较难满足实际应用需求。随着生物技术的发展，提供了利用基因工程高效生产褐藻胶裂解酶的技术方法。 Dong Eim Kim等根据已知的相关功能基因的相似序列设计 PCR引物，从 Streptomyces sp. ALG-5菌株中克隆到了一个褐藻胶裂解酶基因，并在 Escherichia coli BL21 (DE3)中成功表达（Kim et al. Marine Biotechnology. 2009. 11:10-16)。采用这一策略必须对相关基因序列有一定的了解才能设计 PCR引物，并且找到的是某一类结构或功能相似蛋白质中的新分子，较难发现全新的基因。

将产酶菌株构建其基因组文库，可以突破 PCR克隆基因的限制，充分挖掘和利用微生物的基因资源，再结合功能筛选的方法，能够发现全新的基因。 Caswell等从 Klebsiella pneumoniae PG1菌株的基因组文库中克隆到对聚古罗糖醛酸片段特异性降解的褐藻胶裂解酶基因，该酶的分子量为 28kDa ( Caswell et al. Gene, 1989, 75:127-134)。 Maki和 Kraiwattanapong等人从 Pseudomonas sp. OS-ALG-9菌株的基因组文库中先后克隆到了两个褐藻胶裂解酶基因，一个是对聚甘露糖醛酸片段特异性降解的 aly，该基因编码区长 1365bp，编码了 398个氨基酸，分子量约 50kDa (Maki et al. Journal of General Microbiology, 1993, 139: 987-993 )。另一个是 alyll，该基因编码区长 2141bp，编码了 713个氨基酸，分子量约 79kDa(Kraiwattanapong et al. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1997, 61(11): 1853-1857)。迄今为止，对于黄杆菌产褐藻胶裂解酶研究较少。 Takeuchi等人用柱层析法从 Flavobacterium multivolum K-ll 所产的粗酶液中纯化到了两种褐藻胶裂解酶，一种是分子量为 43kDa 的聚古罗糖醛酸裂解酶（ EC 4.2.2.11 ) ( Takeuchi et al. Food Science and Technology International.1997.3 (1)： 22-26)，另一种是分子量为 32kDa，对聚古罗糖醛酸片段和聚甘露糖醛酸片段这两种片段底物降解速率相同的褐藻胶裂解酶（Takeuchi et al. Food Science and Technology International. 1997. 3 (4): 388-392)。 An等人新分离到一株产褐藻胶裂解酶的 Flavobacterium sp. LXA菌株，他们从该菌株的发酵培养液中用硫酸铵沉淀法部分纯化了褐藻胶裂解酶，并将酶用于褐藻胶寡糖的生产及活性研究（An et al. Journal of Applied Microbiology. 2009. 106: 161-170)。目前来源于黄杆菌的褐藻胶裂解酶基因尚未见报道。发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产褐藻胶裂解酶的黄杆菌属新菌株，其为黄杆菌 S20, 分类命名：黄杆菌 Flavobacterium sp.，保藏编号： CGMCC NO.5026。

本发明的第二个目的是提供一种新型高效的内切褐藻胶裂解酶 Alg2A及其编码基因。

本发明的第三个目的是提供一种制备新型高效内切褐藻胶裂解酶 Alg2A的方法。本发明的第四个目的是提供含有所述的内切褐藻胶裂解酶 Alg2A基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的另一个目的是提供新型高效内切褐藻胶裂解酶 Alg2A在褐藻酸钠降解中的应用。

本发明所提供的内切褐藻胶裂解酶 Alg2A，来源于土壤中分离纯化的黄杆菌属新菌株 Flavobacterium sp. S20，其氨基酸序列具有如下特征之一：

1 )序列表中的 SEQ ID N0.2从氨基端开始的第 1-288或 23-288位氨基酸残基序列，其中 1-22位为信号肽， 23-288位为有活性的褐藻胶裂解酶 Alg2A的氨基酸。

2)将序列表中的 SEQ ID N0.2从氨基端开始的第 1-288或 23-288位氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代和 /或缺失和 /或添加后具有降解褐藻酸钠活性的蛋白质。

3) 与序列表中的 SEQ ID N0.2所限定的氨基酸序列的同源性达到 80%及以上且具有降解褐藻酸盐活性的蛋白质。

本发明还提供了内切褐藻胶裂解酶 Alg2A的编码基因（命名为 alg2A)，具有下述核苷酸序列特征之一：

1 ) 序列表中 SEQ ID N0.1的脱氧核糖核酸（DNA) 序列；

2) 编码序列表中 SEQ ID N0.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸（DNA) 序列；

3 )与 SEQ ID N0.1限定的脱氧核糖核酸（DNA)序列的同源性达到 80%及以上，且能编码降解褐藻酸盐蛋白质的脱氧核糖核酸（DNA) 序列。本发明的褐藻胶裂解酶 Alg2A的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的 Alg2A的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶 Alg2A的方法，是将编码基因 alg2A克隆入重组表达载体，导入宿图图图图图图

主细胞，获得重组表达的内切褐藻胶裂解酶。

所述的重组表达内切褐藻胶裂解酶 Alg2A的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达内切褐藻胶裂解酶 Alg2A的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞 (如 Escherichia coli BL21、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli DH5a 等)、酵母菌宿主细胞 (如 Saccharomyces cerevisiae、 Pichia pastoris 、 Kluyveromyces lactis等）、枯草杆菌宿主细胞（如 Bacillus subtilis R25、 Bacillus subtilis 9920等）、乳酸菌宿主细胞（如 Lactic acid bacteria COCCIOI等）、放线菌宿主细胞（如 Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞 (如 Trichoderma viride， Trichoderma reesei, Aspergillus niger Aspergillus nidulans等)、昆虫细胞 (如 Bombyx mori， Antharaea eucalypti等) 或哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢细胞 CHO，幼小仓鼠肾脏细胞 BHK、中国仓鼠肺细胞 CHL等）。

本发明的 Alg2A来源于土壤中分离纯化的黄杆菌属新菌株 Flavobacterium sp. S20 通过对 Flavobacterium sp. S20基因组 DNA文库的活性筛选，获得能够降解褐藻酸钠的阳性克隆，进一步通过测序、同源比对的方法获得内切褐藻胶裂解酶 Alg2A的全长编码序列，该基因编码区长 867bp，编码了 288个氨基酸，分子量约 33kD，属于褐藻胶裂解酶家族 2。大肠杆菌重组表达获得的 Alg2A，以褐藻酸钠为底物时，在 45 V、 pH8.5的条件下具有最高酶活性，比活达 300U/mg。相对于褐藻酸钠和聚甘露糖醛酸片段（polyM) 这两种底物， Alg2A对聚古洛糖醛酸片段（polyG) 有更高的降解活性。

本发明的内切褐藻胶裂解酶 Alg2A可广泛应用化工、农业、食品、词料添加、医药及海藻遗传工程等领域。附图说明

图 1 : 内切褐藻胶裂解酶 Alg2A的蛋白质三维结构模型。

图 2 : 重组内切褐藻胶裂解酶 Alg2A 表达及纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图

( SDS-PAGE) o 各泳道加入的样品分别是： M: 蛋白质标识物（marker), 条带自上至下大小为 116kD， 66.2kD， 45kD, 35kD, 25kD, 18.4kD, 14.4kD_; 泳道 1 : 重组菌破壁后上清，上样量 10μ1，泳道 2:重组菌破碎后上清经镍柱纯化的流出液，上样量 10μ1，泳道 3: lOOmmol的咪唑洗脱收集液，上样量 10μ1。

3： ρΗ值对内切褐藻胶裂解酶 Alg2A的活性影响曲线。

4：温度对内切褐藻胶裂解酶 Alg2A的活性影响曲线。

5：温度对内切褐藻胶裂解酶 Alg2A的稳定性影响曲线。

6： pH值对内切褐藻胶裂解酶 Alg2A的稳定性影响曲线。

7：内切褐藻胶裂解酶 Alg2A的底物偏好性曲线。

8：内切褐藻胶裂解酶 Alg2A降解褐藻酸钠所得产物的电喷雾质谱（ESI-MS) 分析图。

黄杆菌属的菌株，其为黄杆菌 S20，分类命名：黄杆菌 Flavobacterium sp. , 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3号中国科学院微生物研究所，保藏编号： CGMCC NO.5026, 保藏日期 2011 年 07月 05日。具体实施方式

实施例 1 黄杆菌属新菌株 Flavobacterium sp. S20的培养及产褐藻胶裂解酶所采用的菌种为黄杆菌 S20，挑取 Flavobacterium sp.S20菌株（CGMCC NO.5026) 的单克隆接种到 50ml液体培养基中，接着放入温度为 30°C、转数为 220rpmin的摇床培养 48小时后，将培养液离心收集 Flavobacterium sp.S20菌体且保留上清培养基。用 5ml磷酸盐缓冲液（20mM, pH7.0) 重悬菌体后超声破菌。

使用的液体培养基配方为（g/L): 牛肉膏 5g、葡萄糖 15g、酵母浸粉 1.0g、 NaCl 5.0g、 MgS0₄-7H₂0 0.5g CaCl₂ 0.2g、 KH₂P0₄ 1.0g FeS0₄-7H₂0 0.02g, pH值为 7.0。

酶活力单位（U) 定义：每分钟催化褐藻酸钠产生 Ιμηιοΐ还原糖所需要的酶量。根据二硝基水杨酸测褐藻胶裂酶酶活的方法（Qing-Da An et al. Process Biochemistry, 2008, 43: 842-847)，测得 Flavobacterium sp.S20菌株的液体培养基中酶活为 0.37U/ml，而该菌体裂解液酶活为 1.34U/ml，所以用 50ml液体培养基培养 Flavobacterium sp.S20 菌株 48h得到的培养液总褐藻胶裂解酶酶活是 1.71U/ml。

实施例 2 Flavobacterium sp. S20菌株基因组 DNA的提取

取 2ml过夜培养的黄杆菌 S20新鲜菌液，离心（ 12,000rmp, 3min)收集菌体。用磷酸盐缓冲液（20mM, pH7.0) 洗菌体三次，加入 650μ1 DNA抽提缓冲液（100mM Tris-HCl; 100mM Na₂EDTA; 100mM Na₃PO₄; 1.5M NaCl; 1% (w/v) 十六烷基三甲基溴化铵； pH8.0)，混勾后，置 -80°C冷冻，接着放置在 65 °C水浴中融化，如此反复冻融三次。冷却后加入 4μ1溶菌酶（100mg/L) 于摇床中水平振荡（37°C， 225rpm) 30min, 接着加入 3μ1蛋白酶 K (20mg/mL) 后继续振荡 30min，最后加入 50μ1 20% (w/v) 十二烷基硫酸钠，混勾后， 65 °C保温 2h (每隔 20min上下颠倒离心管混勾）。 12,000 rpm室温离心 10min，收集上清液，加入 500μ1的饱和酚：氯仿：异戊醇 (体积比为 25 : 24： 1)抽提两次，接着加入 250μ1氯仿：异戊醇（体积比为 24: 1 ) 抽提一次后加入 0.6倍体积的异丙醇，室温放置 20min后， 12,000rpm离心 15min。沉淀用体积浓度为 70%的乙醇漂洗，干燥后用 60μ1 ΤΕ 缓冲液（ 10mM Tris-HCl, ImM Na₂EDTA， pH8.0) 溶解，加入 Ιμΐ核糖核酸酶（去除 RNA) 后放入 -20°C保存。

实施例 3 Flavobacterium sp. S20菌株总基因组 DNA文库的构建与从文库中筛选表达褐藻胶裂解酶活性的克隆

用 Sau3A I酶对抽提出的黄杆菌 S20菌株基因组 DNA进行随机酶切，琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物获得 3-10kb的 DNA片段。将这些片段与经 BamHI酶切并用碱性磷酸酶去除 5'端磷酸基的 pGEMllz载体连接，连接产物转化大肠杆菌 ToplO菌株，转化产物涂布于含有 X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚- 3 -0-半乳糖苷， 4(^g/ml)、 IPTG (异丙基 -β-D- 硫代吡喃半乳糖苷， 4(^g/ml)、 Amp (氨苄西林, 5( g/ml)的 Luria-Bertani培养基固体平板上， 37°C培养 12~16h。将长出的白色大肠杆菌转化子挑取到 96孔培养板孔中（200μ1 LB 培养基 /孔）， 37°C培养 12~16h后每个培养板孔中加入 150μ1体积浓度为 50%甘油，然后保存于 -80°C，保存于 96孔培养板孔中的所有白色大肠杆菌转化子即为黄杆菌 S20菌株的基因组 DNA文库克隆。 Sau3A I酶、 BamHI酶及碱性磷酸酶均购于宝生物公司，酶与底物反应的体系、温度和时间均按照公司提供的产品说明操作。

将 Flavobacterium sp. S20菌株的基因组文库克隆接种于 96孔培养板中，每个孔装有 200μ1 Luria-Bertani培养基（含氨苄西林 50 μ g/ml)， 37°C培养 12h后离心收集菌体。每孔加入 20μ1磷酸缓冲液（20mM, pH7.0) 后，将菌体放置 -80°C冷冻，接着置于 37°C融化，如此重复冻融三次使菌体破裂。用前面所述的二硝基水杨酸法检测所有文库克隆的菌体裂解液是否有酶活，结果显示编号为 VII 2H的文库克隆表达褐藻胶裂解酶活性，将该文库克隆所含的重组质粒命名为 pGEMllz-VII 2H。

实施例 4 重组质粒 pGEMllz-VII 2H上表达褐藻胶裂解酶活性的基因的测序及其序列分析

将表达褐藻胶裂解酶活性重组质粒 pGEMllz-VII 2H送去英潍捷基公司测序。用 NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) 上的软件对测序结果进行分析。所用到的 NCBI分析软件是 Open Reading Frame Finder ( ORF Finder, http:/7wvvw.ncbi.nlni. nih.gov/gorfygorf.htnil) 禾口 Basic Local Alignment Search Tool (. BLAST， http://blast.ncbi.nlm.nih, gov/Blast.cgi )。

NCBI分析结果显示重组质粒 pGEMl lz-Vn 2H上携带一个褐藻胶裂解酶基因（命名为 alg2A)，该基因编码区长 867bp，其核苷酸序列如 SEQ ID NO 1所示。 alg2A和 Lacinutrix sp. 5H-3-7-4的全基因组序列（NCBI注册号： CP002825.1 ) 中的 520个核苷酸有 71%的同源性。

alg2A编码的褐藻胶裂解酶 Alg2A由 288个氨基酸组成，其氨基酸序列如 SEQ ID NO 2所示，蛋白质的理论分子量约为 33kD。用 Simple Modular Architecture Research Tool (SMART, http://smart.embl-heidelberg.de/)分析褐藻胶裂解酶 Alg2A的结构信息，结果显示 N端开始至第 22个氨基酸是信号肽序列，而第 23-288位氨基酸属于褐藻胶裂解酶家族 2。用 SWISS-MODEL同源建模服务器（http://swissmodel.expasy.org) 对褐藻胶裂解酶 Alg2A的蛋白质三维结构进行同源建模，最终得到的 Alg2A蛋白质三维结构模型如图 1所示。

实施例 5 alg2A基因在大肠杆菌中的重组表达

以上述的重组质粒 pGEMllz-VII 2H为模板，用下述引物对进行 PCR扩增。引物对如下：正向引物 Alg2A-F ：

( CATATGCAGGATAAAAAATCAAAAAGCAAAACTG )，反向引物 Alg2A-R： ( CTCGAG ATG AGTAACTTGTAAAGAATAT ) ,正向引物下划线标注的是限制性内切酶 Ned I位点，反向引物下划线标注的是限制性内切酶 Xho I位点。 Taq DNA聚合酶购自宝生物公司， PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。 PCR反应条件： 94 °C预变性 5分钟，然后 94°C变性 30秒 -50°C退火 30秒 -72°C延伸 1分钟， 30个循环，最后 72 V延伸 10分钟。将 PCR产物用 Ned I和 Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切的 PCR产物。将购于美国 Novagen公司的产物 pET-21a载体用 Ned I和 Xho I 双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切载体大片段。 Ned I和 Xho I均购于宝生物公司，酶与底物反应的体系、温度和时间均按照公司提供的产品说明操作。将经过双酶切的 PCR产物与同样经过双酶切 pET-21a载体连接，连接产物转化大肠杆菌 Top 10菌株后涂布于含有 5(^g/ml氨苄西林的 Luria-Bertani培养基固体平板上， 37 °C培养 14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有 5(^g/ml 氨苄西林的液体 Luria-Bertani 培养基中培养，提取质粒；将质粒用正向引物 Alg2A-F 和反向引物 Alg2A-R进行菌落 PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒送去英潍捷基公司测序，结果表明，在 pET-21a的 Ned I和 Xho I酶切位点之间插入 SEQ ID NO 1所示的 alg2A基因，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为 pET21a-Alg2A。

将 pET21a-Alg2A转化大肠杆菌菌株 BL21(DE3) (购自美国 Novagen公司），然后按照该公司提供的操作步骤进行褐藻胶裂解酶 Alg2A诱导表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测褐藻胶裂解酶 Alg2A的纯化情况，结果如图 2所示，纯化后的褐藻胶裂解酶 Alg2A在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例 6 褐藻胶裂解酶 Alg2A的酶学性质分析

( 1 ) pH和温度对酶活性的影响

将质量浓度为 1%褐藻酸钠底物、纯化的 Alg2A酶液以及不同 pH值的 20mM

Tris-HCl缓冲液 (pH 范围为 6.0-10.0) 按 8:2:10 (体积比) 的比例混合后，在 40 °C 反应 10分钟，按前述的二硝基水杨酸法测酶活力。结果显示 Alg2A在 pH 8.5时达到最大活力，表明 Alg2A的最适反应 pH为 8.5 (如图 3 )。

在最适 pH下，将质量浓度为 1%褐藻酸钠底物、纯化的 Alg2A酶液以及 20mM Tris-HCl缓冲液（pH8.5 )按 8:2: 10 (体积比）的比例混合，分别在不同温度（20°C -70 V ) 反应 10分钟，按前述的二硝基水杨酸法测酶活力。结果显示 Alg2A在 45 °C时达到最大活力，表明 Alg2A的最适反应温度为 45 °C (如图 4)。

将质量浓度为 1%褐藻酸钠底物、纯化的 Alg2A酶液以及 50mM Tris-HCl缓冲液按 8:2: 10 (体积比）的比例混合后，在最适温度和最适 pH下反应 10分钟，按前述的二硝基水杨酸法测酶活力，接着用购于博彩公司的蛋白质定量试剂盒测定 Alg2A酶液的蛋白含量，结果表明重组 Alg2A对褐藻酸钠的比活为 300U/mg。

(2) pH和温度对酶稳定性的影响

将在不同温度（20°C-50°C ) 下热处理 lh后的 Alg2A酶液与质量浓度为 1%褐藻酸钠底物溶液按 2:8 (体积比）的比例混合，然后在最适温度和最适 pH下测定剩余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为 100%相对活力（relativie activity), 结果表明 Alg2A在低于 40°C的温度下具有较好的热稳定性（如图 5 )。

将在 30°C，不同的 pH (pH4-10) 预孵育 24h后的 Alg2A酶液与质量浓度为 1% 褐藻酸钠底物溶液按 2:8 (体积比）的比例混合，然后在最适温度和最适 pH下测定剩余酶活，以不经过 pH处理的酶液酶活定义为 100%相对活力（relativie activity), 结果显示在 pH5〜 10的范围内， Alg2A酶活仍保持 60%以上，表明 Alg2A对 pH值耐受范围较广（如图 6)。

( 3 ) Alg2A的底物偏好性

将纯化的 Alg2A分别与质量浓度为 1%的褐藻酸钠、聚甘露糖醛酸片段（polyM) 和聚古洛糖醛酸片段（polyG) 三种不同底物按 2:8 (体积比）的比例混合，然后在 30°C , pH8.5条件下反应。取不同反应时间点的产物测其 235nm紫外吸收值，发现随着酶解时间延长， 235nm 吸收值逐渐增加，根据紫外法测褐藻胶裂解酶的原理

( Qing-Da An et al. Process Biochemistry, 2008, 43: 842-847)，证实 Alg2A是裂解酶。另外，如图 7所示， Alg2A对聚古洛糖醛酸片段降解速率快于对褐藻酸钠和聚甘露糖醛酸片段的降解，表明 Alg2A偏好降解聚古洛糖醛酸片段。

实施例 7 金属离子对 Alg2A活性的影响

将质量浓度为 1%褐藻酸钠底物、纯化的 Alg2A酶液以及 50mM Tris-HCl缓冲液 (pH8.5 ) 按 8:2: 10 (体积比）的比例混合，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的离子终浓度为 5mM或 10mM，然后在 45。C反应 10分钟，按前述的二硝基水杨酸法测酶活力。对照组为不加任何金属离子时 Alg2A的活性 (设定为 100%)，结果如下表所示。实验结果显示， K⁺、 Na⁺能增加 Alg2A活性， Li⁺、 Mg²⁺对 Alg2A活性基本无影响， Ca²⁺、 Fe²⁺等其他离子对酶活呈现抑制作用。

表 1：金属离子对 Alg2A活性的影响

实施例 8 Alg2A降解褐藻酸钠所得产物的电喷雾质谱（ESI-MS ) 分析将质量浓度为 1%褐藻酸钠底物、纯化的 Alg2A酶液以及 50mM Tris-HCl缓冲液按 8:2: 10 (体积比）的比例混合后，在 pH8.5， 45 °C条件下反应，选取不同酶解时间 (0.5、 1、 1.5、 2小时)的产物进行电喷雾质谱分析。电喷雾质谱条件为采用正离子模式，离子源电压： 4.5kV_; 鞘气流速： 30 arb_; 毛细管温度： 275~300 °C _; 管镜电压： 250V; 扫描范围： 150-2000。

其中酶解 2小时的电喷雾质谱图如图 8所示。质谱图上显示 Alg2A降解褐藻酸钠 2 小时的产物中有一系列不同聚合度的褐藻酸钠寡糖，该结果充分证明了 Alg2A 属于内切褐藻胶裂解酶。因此，内切褐藻胶裂解酶 Alg2A可被用于褐藻酸钠寡糖的制备以及与褐藻酸钠降解相关的领域，包括化工、农业、食品、词料添加、医药及海藻遗传工程等。

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Claims

1. 黄杆菌属的菌株，其为黄杆菌 S20，分类命名：黄杆菌 Flavobacterium sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号中国科学院微生物研究所，保藏编号： CGMCC NO.5026, 保藏日期 2011年 07月 05日。

2. —种来源于权利要求 1所述菌株（Flavobacterium sp. S20)的内切褐藻胶裂解酶基因 Alg2A，其核苷酸序列具有如下特征之一：

1 ) 具有序列表中 SEQ ID N0.1的脱氧核糖核酸（DNA) 序列；

2) 编码 SEQ ID N0.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸（DNA) 序列；

3 )具有与序列表中 SEQ ID N0.1所限定的脱氧核糖核酸（DNA)序列的同源性达到 80%及以上，且能编码降解褐藻酸盐的蛋白质的脱氧核糖核酸（DNA) 序列。

3. 按照权利要求 2所述的内切褐藻胶裂解酶基因编码的内切褐藻胶裂解酶，其编码的氨基酸序列具有如下特征之一：

1 )序列表中 SEQ ID N0.2从氨基端开始的第 1-288或第 23-288位氨基酸残基序列；

2)将序列表中的 SEQ ID N0.2从氨基端开始的第 1-288或 23-288 位氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代和 /或缺失和 /或添加后，具有降解褐藻酸盐活性的蛋白质；

3 )与序列表中 SEQ ID N0.2所限定的氨基酸序列的同源性达到 80%及以上且具有降解褐藻酸盐活性的蛋白质。

4. 一种制备如权利要求 3所述的内切褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于：是将权利要求 2所述的内切褐藻胶裂解酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切褐藻胶裂解酶；

所述的重组表达内切褐藻胶裂解酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。

5. 按照权利要求 4所述的方法，其特征在于：用于重组表达内切褐藻胶裂解酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞，哺乳动物细胞中的一种。

6. 一种如权利要求 3所述的内切褐藻胶裂解酶在褐藻酸盐降解中的应用，其特征在于：具有如下用途之一或二种以上；

1 ) 用于断裂褐藻酸盐或褐藻多糖的糖苷键，获得褐藻酸盐寡糖；

2) 用于降解红藻、或褐藻细胞壁中的褐藻酸盐组分，抽提原生质体，原生质体可用于食品及藻类研究；

或 3 )用于破坏致病菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)所形成的菌膜中褐藻酸钠成分，可用于治疗铜绿假单胞菌引起的肺囊肿性纤维化症或其他感染。

7. 如权利要求 6所述的应用，其特征在于：所述内切褐藻胶裂解酶 Alg2A与其他褐藻胶降解酶混合后，用于协同断裂褐藻酸盐糖苷键方面的应用。