JP2015173602A - 酵素の自然変異体の取得方法及び超耐熱性セロビオハイドロラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はさらに、前記方法により得られた新規な超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、当該超耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド、当該超耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該超耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いたセルロース分解物の製造方法を提供することも目的とする。
[1] 酵素の自然変異体を取得する方法であって、
(1)環境微生物叢メタゲノムDNAの一部について決定された塩基配列からなるゲノムデータベースから、酵素活性を有するタンパク質ORF配列を検出する工程と、
(2)前記ORF配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、1又は複数の環境微生物叢メタゲノムDNAに対してPCRクローニングを行い、当該ORF配列の全長又は部分領域がコードするアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる1又は複数のPCRクローンを得る工程と、
(3)前記工程(2)において得られた各PCRクローンについて、塩基配列及び当該塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定する工程と、
(4)前記工程(2)において得られた各PCRクローンがコードするタンパク質の酵素活性を測定する工程と、
を有することを特徴とする、酵素の自然変異体の取得方法。
[2] 酵素の変異体を製造する方法であって、
(1)環境微生物叢メタゲノムDNAの一部について決定された塩基配列からなるゲノムデータベースから、酵素活性を有するタンパク質ORF配列を検出する工程と、
(2)前記ORF配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、1又は複数の環境微生物叢メタゲノムDNAに対してPCRクローニングを行い、当該ORF配列の全長又は部分領域がコードするアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる1又は複数のPCRクローンを得る工程と、
(3)前記工程(2)において得られた各PCRクローンについて、塩基配列及び当該塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定する工程と、
(4)前記工程(2)において得られた各PCRクローンがコードするタンパク質の酵素活性を測定する工程と、
(5)前記工程(3)及び前記工程(4)の後、前記オープンリーディングフレーム配列がコードするアミノ酸配列における差異と前記酵素活性との関係を調べる工程と、
(6)前記工程(5)において得られたアミノ酸配列の差異と酵素活性との関係性に基づき、前記オープンリーディングフレーム配列がコードするアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加することにより、前記酵素活性が向上した変異体を製造する工程と、
を有することを特徴とする、酵素の変異体の製造方法。
[3] 前記環境微生物叢のメタゲノムDNAが、高温土壌由来メタゲノムDNAであり、前記酵素が、少なくとも70℃以上で酵素活性を示す耐熱性酵素である、前記[2]の酵素の変異体の製造方法。
[4] 前記酵素がセルラーゼである、前記[2]又は[3]の酵素の変異体の製造方法。
[5] (A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸(ただし、88位のセリンと、230位のフェニルアラニンと、414位のセリンを除く。)が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は
(C)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列(ただし、88位がセリンであり、230位がフェニルアラニンであり、414位がセリンである。)からなり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、超耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
[6] (a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸(ただし、88位のセリンと、230位のフェニルアラニンと、414位のセリンを除く。)が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列(ただし、88位がセリンであり、230位がフェニルアラニンであり、414位がセリンである。)からなり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(d) 配列番号2で表される塩基配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
(e) 配列番号2で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
[7] 前記[6]のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
[8] 前記[7]の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
[9] 真核微生物である、前記[8]の形質転換体。
[10] 前記[8]又は[9]の形質転換体内で、超耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する、超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
[11] 前記[5]の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記[6]の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記[10]の超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも1種以上のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物。
[12] セルロースを含む材料を、前記[5]の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記[6]の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記[8]又は[9]の形質転換体、又は前記[10]の超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法。
[13] 前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも1種以上のその他のセルラーゼを接触させる、前記[12]のセルロース分解物の製造方法。
また、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも80℃、pH5.5においてセロビオハイドロラーゼ活性を有する。このため、当該超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造に好適に用いられる。
本発明に係る酵素の自然変異体の取得方法(以下、「本発明に係る自然変異体取得方法」ということがある。)は、酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、環境微生物叢から調製されたメタゲノムDNAから、当該酵素遺伝子の自然変異体を取得することを特徴とする。
機能獲得型の突然変異だけを集め、変異体ライブラリーを作ることができれば、膨大に発生する機能不全突然変異体除去のための無駄なスクリーニングを回避でき、比較的少数のアミノ酸置換変異体の機能アッセイにより、機能向上した変異体を効率よく得ることが可能である。環境微生物叢から調製されたメタゲノムDNAには、機能獲得型の自然変異体が多く含まれている。このため、当該メタゲノムDNAを母体とすることにより、機能獲得型の変異体を効率よく取得することができる。
(1)環境微生物叢メタゲノムDNAの一部について決定された塩基配列からなるゲノムデータベースから、酵素活性を有するタンパク質ORF配列を検出する工程と、
(2)前記ORF配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、1又は複数の環境微生物叢メタゲノムDNAに対してPCRクローニングを行い、当該ORF配列の全長又は部分領域がコードするアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる1又は複数のPCRクローンを得る工程と、
(3)前記工程(2)において得られた各PCRクローンについて、塩基配列及び当該塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定する工程と、
(4)前記工程(2)において得られた各PCRクローンがコードするタンパク質の酵素活性を測定する工程。
PCRクローニングでは通常、〜10個コロニーを拾い、目的の遺伝子のクローニングを行うが、本発明に係る自然変異体取得方法では、各メタゲノムDNAサンプル当り100〜個の多数個のコロニーを拾い、遺伝子クローニングを行うことが好ましい。これにより、目的酵素遺伝子の多様なSNPを含む自然変異体から構成されるライブラリーを構築し、この自然変異体ライブラリーに対し、機能スクリーニングを行うことにより、耐熱性の向上等の酵素機能の改良を効率よく行い、酵素活性が改良された新たな変異体を効率よく製造できる。
(5)前記工程(3)及び前記工程(4)の後、前記ORF配列がコードするアミノ酸配列における差異と前記酵素活性との関係を調べる工程と、
(6)前記工程(5)において得られたアミノ酸配列の差異と酵素活性との関係性に基づき、前記ORF配列がコードするアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加することにより、前記酵素活性が向上した変異体を製造する工程。
本発明者らは、後記実施例1に示すように、日本国内の1ヶ所、5地点から採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムDNA(メタゲノムDNA)を調製し、各メタゲノムDNAを用いて、本発明に係る自然変異体取得方法を行い、耐熱性に優れた新規セロビオハイドロラーゼを得た。
最終的に、1個のオープンリーディングフレームAR19G−166から、PSA分解活性を持つ新規の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ(AR19G−166RA)を得た。オープンリーディングフレームAR19G−166は開始コドンのメチオニンが欠損した不完全長配列であったため、当該ORFからクローニングされたAR19G−166RA遺伝子は、GH6触媒領域のみから構成される部分遺伝子である。
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸(ただし、88位のセリンと、230位のフェニルアラニンと、414位のセリンを除く。)が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
(C)配列番号1で表されるアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列(ただし、88位がセリンであり、230位がフェニルアラニンであり、414位がセリンである。)からなり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする。当該超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸(ただし、88位のセリンと、230位のフェニルアラニンと、414位のセリンを除く。)が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列(ただし、88位がセリンであり、230位がフェニルアラニンであり、414位がセリンである。)からなり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
(d) 配列番号2で表される塩基配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
(e) 配列番号2で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するDNA、前記本発明に係るポリヌクレオチド、ターミネーター配列を有するDNAからなる発現カセットとして発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより行うことができ、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させ得る。従来公知のセロビオハイドロラーゼは、現宿主のレンジが狭い、つまり、異種発現が難しいものが多い。これに対して、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、大腸菌、酵母、糸状菌、高等植物葉緑体等、広範な発現宿主に発現させることができる。
本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、超耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に超耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させる。
前記本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも1種以上のその他のセルラーゼを含むセルラーゼ混合物として使用することもできる。前記本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出・精製されたものであってもよい。本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼを、その他のセルラーゼとの混合物としてセルロースの分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
本発明に係るセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼにより、セルロースを分解して分解物を得る方法である。具体的には、セルロースを含む材料を、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する。
<1> 高温土壌メタゲノムDNAの調製
日本国内の、高温の温泉が噴き出している地域から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらのサンプルは、採取時の温度33〜78℃、pH7.2〜8のレンジにあった。これら温泉土壌サンプルの内、メタゲノムDNAサンプル名称が、それぞれ、AR19、OJS2、OJS4、OJS7、OJS9である5サンプルについて、DNAを抽出した。採取した温泉土壌サンプル各10gから、DNA抽出キット(ISOIL Large for Beads ver.2、NIPPON GENE社製)を使い、DNAを抽出した。AR19はDNA量が10μg以上得られ、このうち5μgを使用し、ロシュダイアグノスティックス社製のGS FLX Titanium 454を用いてメタゲノムシーケンスを行った。残りのDNAはセルラーゼ遺伝子のPCRクローニングに用いた。一方、DNA量が少なかった(10μg以下)試料では、ゲノムDNA増幅キット(GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit、GE Healthcare社製)を用いてゲノム増幅を行った。
温泉土壌メタゲノムから抽出したゲノムDNAサンプルの一つAR19を使い、Roche社製 454 GS FLX Titanium technologyショットガンシーケンス用の標準プロトコールに従って、ショットガンシーケンスを3回行った。Roche 454の出力(sffファイル)をPyroBayes(Quinlan et al., Nature Methods,2008,vol.5,p.179-81.)にて再ベースコールし、FASTA形式の配列ファイル及びQuality値ファイルを取得した。得られたシーケンスリードは、端を切り落とし品質を上げ、454 Life SciencesのアセンブルソフトウェアNewbler version 2.3を使ってアセンブルした。アセンブルは、「minimum acceptable overlap match (mi)=0.9」、「option:−large(for large or complex genomes,speeds up assembly,but reduces accuracy.)」に設定して行った。
Qualityフィルター処理したリードと100bp以上のアセンブルコンティグは、合計330Mbpあり、このデータセットをセルラーゼ酵素遺伝子解析に用いた。リード総数2,766,332リードのうち2,040,651リードが、平均で1027bp以上のコンティグにアセンブルされ(計101,372コンティグ)、このうち最大コンティグ長は187,970bpであった。
UniProtデータベース(http://www.uniprot.org/)からEC番号が3.2.1.4(セルロース)、3.2.1.37(β−キシロシダーゼ) 、3.2.1.91(セルロース 1,4−β−セロビオシダーゼ)、3.2.1.8(エンド1,4−β−キシラナーゼ)の配列をダウンロードし(アクセス日:2009/4/13)、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアOrphelia(Hoff et al.,Nucleic Acids Research,2009,37(Web Server issue:W101-W105)を使用し、前記<2>で得たコンティグ配列から、遺伝子領域(=オープンリーディングフレーム)を推定した(Orphelia option:default(model=Net700,maxoverlap=60)。推定されたORFからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、BLASTP(blastall ver. 2.2.18)を使い、ローカルデータベースに参照した。BLASTPのoption条件は、「Filter query sequence=false」、「Expectation value(E)<1e−20」[以下、デフォルト値:Cost to open a gap=−1、Cost to extended gap=−1、X dropoff value for gapped alignment=0、Threshold for extending hits=0、Word size=default]とし、ヒットした配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。
温泉土壌メタゲノムAR19から、GH6、GH9,GH48及びその他のGHファミリーに属するセロビオハイドロラーゼ触媒領域配列を含む13個のORFが得られた。これらのORFについて、プライマーを設計し、PCRにより温泉土壌メタゲノムAR19から当該遺伝子のクローニングを行った。最終的にオープンリーディングフレームAR19G−166から、GH6ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼ遺伝子(AR19G−166RA及びAR19G−166QV)がクローニングされた。
オープンリーディングフレームAR19G−166は、474アミノ酸残基からなるポリペプチド(配列番号5)をコードしていたが、開始コドンが失われている不完全長配列であって、リンカーの部分配列とGH6触媒領域だけから構成されていた。AR19G−166のGH6触媒領域は、遺伝子AR19G−166RA及びAR19G−166QVとしてPCRクローニングされ、クロロフレクサス門中温性好気性細菌Herpetosiphon aurantiacus DSM 785のGH6グリコシドハイドロラーゼ(Genbank:ABX04776.1)と66%のアミノ酸配列同一性を示した。配列番号7で表される塩基配列からなるフォワードプライマー(5’−CACCATGTTGGACAATCCATTCATCGGAG−3’: 配列番号6で表される塩基配列の5’末端側に7塩基(CACCATG)付加したもの。当該付加配列中、3’側のATGは開始コドンであり、5’側のCACCはベクターに挿入するための配列である。)と配列番号8で表される塩基配列からなるリバースプライマー(5’−TTAGGGTTGGATCGGCGGATAG−3’)を用いたPCRクローニングにより、AR19G−166から2個の遺伝子クローン(AR19G−166RAとAR19G−166QV)が得られた。AR19G−166RAとAR19G−166QVは、299位と351位の2アミノ酸残基のみが相違していた。AR19G−166RAは、299位のアミノ酸残基がアルギニンであり、351位のアミノ酸残基がアラニンであった。AR19G−166QVは、299位のアミノ酸残基がグルタミンであり、351位のアミノ酸残基がバリンであった。
前記の5つのメタゲノムDNA(AR19、OJS2、OJS4、OJS7、OJS9)に対し、配列番号7で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号8で表される塩基配列からなるリバースプライマーを用いて、セロビオハイドロラーゼ遺伝子のPCRクローニングを行った。ヒットしたクローンをサンガーシーケンサで配列解読し、各クローンの遺伝子型とアミノ酸変異を表1及び2に示した。複数メタゲノムDNAサンプルに対してPCRクローニングを行うことにより、SNPを多数持つ自然変異体が総計46クローン得られた。これら変異体は、c6t, g51a, a69g, a201g, c259t, c433t, c450t, g456c, c531t, a627g, a896g, c1116t, c98t(A33V), t251c(I84T), c262t (P88S), g497a(R166H), c683t(T228I), c688t(L230F), a762t(E254D), a761g(E254G), c805t(R269C), a896g(R299Q), a916g(S306G), c1052t(A351V), g1078a(E360K), g1216a(A406T), t1241c(F414S)の合計、27ヵ所のSNPを示した(SNPは小文字で示し、カッコ内は、SNPにより引き起こされたアミノ酸置換を示す。)。この27ヵ所のSNPの中、14ヵ所においてアミノ酸変異が引き起こされていた(表1、表2)。これらのSNPを示したクローンは、全てにおいて、IN/DEL突然変異(DNA塩基配列の挿入及び欠損)は認められなかった。
PCRクローニングにより得られたプラスミドをヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌Rosetta−gamiB (DE3) pLysS株(Merck社製)へ導入した。目的の遺伝子をもつ大腸菌を、100mg/Lアンピシリンを含むLB培地に植菌し、OD600=0.2〜0.8程度まで培養した後、IPTG(Isopropyl−β−D(−)−thiogalactopyranoside)を添加し、さらに20時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の1/20容量の200mM 酢酸Buffer(pH5.5)を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置BioRuptorUCD−200T(コスモバイオ社製)を用いて、30秒間破砕した後に30秒間休止する処理プロセスを10回繰り返し、アミノ酸置換された目的タンパク質を含む上清を得、これを粗酵素サンプル液とした。
セロビオハオドラーゼ活性測定には、リン酸膨潤アビセル(PSA)を基質として用いた。PSAはリン酸溶液でアビセル粉末(微結晶性セルロース粉末、Merck社製)を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、pH5.0以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたPSAは全て当該方法により調製した。
PSA加水分解活性アッセイにおいて最も高い至適温度Toptを示したAR19G−166RAの3アミノ酸(P88S/L230F/F414S)変異体AR19G−166RASFSについて、酵素タンパク質を精製し、基質特異性、pH特性、温度特性(至適温度、及び熱安定性)について、詳細に酵素特性を計測した。
基質特異性はPSA、アビセル粉末、カルボキシメチルセルロース(CMC、Sigma社製)、キシラン(from Beechwood、Sigma社製)、リケナン(Lichenan、MP Biomedicals社製)、ラミナリン(from Laminaria digitata、Sigma社製)を用いて測定した。反応溶液の組成は、各基質の1%水溶液100μL、200mM 酢酸buffer(pH5.5)50μL、精製水40μL、及び精製酵素サンプル液10μLからなり、反応溶液を70℃で20分間反応させた。前記<8>と同様にして酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性(U/mg)を算出した。各計測は、3回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。
AR19G−166RASFSによるPSA加水分解活性の温度依存性を調べた。PSA加水分解活性は、反応溶液の組成を、1% PSA溶液100μL、酢酸buffer(pH5.5)50μL、精製水40μL、精製酵素サンプル液10μLとし、50、60、65、70、75、80、85、90、95、又は99℃で20分間反応させた。酵素の加水分解反応により生成された還元糖量を求め、1分間に1μmolの還元糖を生成する酵素活性を1Uとし、タンパク量で除した値を比活性(U/mg)とした。また、反応溶液に、0.5mMカルシウムイオン又は0.5mMマンガンイオンを添加して同様にしてPSA加水分解活性を測定した。
AR19G−166RASFSによるPSA加水分解活性のpH依存性を調べた。PSA加水分解活性の測定においては、基質として0.5質量%PSAを用い、マッキルベインbuffer(pH3〜8) により各pHに反応液を調整し、50、70、又は90℃で各pHにおける加水分解反応を計測した。測定結果を図6に示す。反応液の実測pH値に対する、50℃、70℃、及び90℃におけるPSA加水分解活性を計測し、プロットした。
タンパク質の熱安定性に関わる指標として、熱変性温度又は熱崩壊温度Tm(melting temperature)がしばしば使われる。一定時間の予備加温(プリインキュベーション)により酵素活性が無処理区の50%に減少するプリインキュベーション温度はタンパク質の熱崩壊温度Tmにほぼ等しく、酵素活性を計測することにより求めることができる。この方法により、AR19G−166RA及びAR19G−166RASFSの熱崩壊温度Tmを求めた。
Differential scanning fluorimetry (DSF)は、蛍光色素とリアルタイムPCR装置を用いて、タンパク質の熱変性を計測する方法の一つであり、様々なタンパク質に応用可能である。SYPRO Orange等、DSFに使われる蛍光色素は、疎水性部位と結合する無極性条件下で蛍光を発し、一方、水に溶けた極性条件下では発光が抑えられる。通常、タンパク質はその熱変性温度において折畳み構造が解け、内部にある疎水性部位がタンパク質表面に露出する。この露出した疎水性部位にSYPRO Orangが結合すると、波長470〜480nmの励起光により、波長595nm付近にピークを持つ強い蛍光を発する。タンパク質溶液の温度を一定間隔で段階的に上昇させ、蛍光強度を計測することにより、熱崩壊温度(=蛍光強度の変化点)が算出される。
Claims (13)
- 酵素の自然変異体を取得する方法であって、
(1)環境微生物叢メタゲノムDNAの一部について決定された塩基配列からなるゲノムデータベースから、酵素活性を有するタンパク質ORF配列を検出する工程と、
(2)前記ORF配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、1又は複数の環境微生物叢メタゲノムDNAに対してPCRクローニングを行い、当該ORF配列の全長又は部分領域がコードするアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる1又は複数のPCRクローンを得る工程と、
(3)前記工程(2)において得られた各PCRクローンについて、塩基配列及び当該塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定する工程と、
(4)前記工程(2)において得られた各PCRクローンがコードするタンパク質の酵素活性を測定する工程と、
を有することを特徴とする、酵素の自然変異体の取得方法。 - 酵素の変異体を製造する方法であって、
(1)環境微生物叢メタゲノムDNAの一部について決定された塩基配列からなるゲノムデータベースから、酵素活性を有するタンパク質ORF配列を検出する工程と、
(2)前記ORF配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、1又は複数の環境微生物叢メタゲノムDNAに対してPCRクローニングを行い、当該ORF配列の全長又は部分領域がコードするアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる1又は複数のPCRクローンを得る工程と、
(3)前記工程(2)において得られた各PCRクローンについて、塩基配列及び当該塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定する工程と、
(4)前記工程(2)において得られた各PCRクローンがコードするタンパク質の酵素活性を測定する工程と、
(5)前記工程(3)及び前記工程(4)の後、前記オープンリーディングフレーム配列がコードするアミノ酸配列における差異と前記酵素活性との関係を調べる工程と、
(6)前記工程(5)において得られたアミノ酸配列の差異と酵素活性との関係性に基づき、前記オープンリーディングフレーム配列がコードするアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加することにより、前記酵素活性が向上した変異体を製造する工程と、
を有することを特徴とする、酵素の変異体の製造方法。 - 前記環境微生物叢のメタゲノムDNAが、高温土壌由来メタゲノムDNAであり、前記酵素が、少なくとも70℃以上で酵素活性を示す耐熱性酵素である、請求項2に記載の酵素の変異体の製造方法。
- 前記酵素がセルラーゼである、請求項2又は3に記載の酵素の変異体の製造方法。
- (A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸(ただし、88位のセリンと、230位のフェニルアラニンと、414位のセリンを除く。)が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は
(C)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列(ただし、88位がセリンであり、230位がフェニルアラニンであり、414位がセリンである。)からなり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、超耐熱性セロビオハイドロラーゼ。 - (a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸(ただし、88位のセリンと、230位のフェニルアラニンと、414位のセリンを除く。)が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列(ただし、88位がセリンであり、230位がフェニルアラニンであり、414位がセリンである。)からなり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(d) 配列番号2で表される塩基配列と80%以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
(e) 配列番号2で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。 - 請求項6に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、少なくとも80℃、pH5.5の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。 - 請求項7に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
- 真核微生物である、請求項8に記載の形質転換体。
- 請求項8又は9に記載の形質転換体内で、超耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する、超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
- 請求項5に記載の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項6に記載の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は請求項10に記載の超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも1種以上のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物。
- セルロースを含む材料を、請求項5に記載の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項6に記載の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項8又は9に記載の形質転換体、又は請求項10に記載の超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法。
- 前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも1種以上のその他のセルラーゼを接触させる、請求項12に記載のセルロース分解物の製造方法。
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