CN103409398B - 一种蛋白酶及突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碱性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。还公开了基于上述蛋白酶突变的对LAS-Na耐受性提升的突变蛋白酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。此外，还公开了上述蛋白酶DNA的克隆/表达载体的构建，突变及突变酶的筛选方法，并研究了重组突变酶在液体洗涤剂中的应用性能。重组突变蛋白酶在液体洗涤剂中对LAS-Na的耐受性得到明显提升。

Description

一种蛋白酶及突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和日用化工领域，涉及一种新的碱性蛋白酶基因的获取、基因突变及突变酶的制取方法；涉及编码新型碱性蛋白酶的氨基酸序列；涉及基于该蛋白酶基因突变的编码突变蛋白酶的氨基酸序列；本发明还涉及保护所述突变蛋白酶在洗涤剂尤其是液体洗涤剂，优选洗衣液中具有改进洗涤和去污的有益效果。

发明背景

蛋白酶又称肽酶，是一类催化蛋白质中肽键水解的酶。目前，用于洗涤剂中的蛋白酶主要是来源于枯草芽孢杆菌的碱性蛋白酶，枯草芽孢杆菌蛋白酶制剂的商品化已有50多年的历史，近10年间取得了巨大的进步。由于蛋白酶在洗涤剂中的作用不同于表面活性剂，其能将不易溶于水的蛋白类大分子污渍降解成更小和更易溶于水的或易被表面活性剂乳化、增溶的小分子片段，同时被蛋白大分子所黏附或包覆的其他污垢颗粒也得以快速释放，从而达到快速去污的效果。因此国外大多数洗涤产品都添加蛋白酶，如欧洲和日本加酶的粉状和液体衣料洗涤剂超过了85％，美国加酶洗涤剂则超过50％；国内大多市售洗衣粉中也都添加蛋白酶。但液体洗涤剂环境与洗衣粉不同，其中添加的蛋白酶分子与表面活性剂、自由水及助剂等直接接触。研究表明，蛋白酶稳定性随自由水含量的增加而逐渐降低，这主要是由于蛋白酶存在自降解作用，在溶液环境中相互接触并发生降解，从而使酶失活。此外，一些表面活性剂尤其是阴离子表面活性剂如LAS-Na(直链烷基苯磺酸钠)很容易使酶失去活性，这主要是液体环境中LAS-Na等具有较强离子强度和二价金属离子螯合能力的阴离子表面活性剂的存在，使酶分子的表面电荷或空间结构发生较大变化，使酶失去正确的催化构象，失去催化作用。如有研究表明subtilisin309在丙二醇和较高浓度Ca²⁺等保护及PMSF的抑制下，仍无法在单一LAS-Na和SAS(仲烷基磺酸钠)体系中长时间维持活性。因此，酶在液体洗涤产品中的稳定性研究已成为洗涤行业的一个热点问题。

目前，对于洗涤剂用蛋白酶的性质改良，主要通过筛选合适的稳定剂、减少对酶有害的表面活性剂的用量、从环境中筛选新的产蛋白酶的菌株以及对表现较好的蛋白酶进行基因突变等方式来实现。通过这些措施，针对不同的用途，已开发出多种适用于洗涤剂配方的商业化蛋白酶，如Alcalase(Maxatase)、subtilisinBPN、Savinase(subtilisin309)、Maxacal(subtilisin PB92)、Esperase(subtilisin147)以及Durazym和Maxapem等。其中最为成功的商品酶是诺维信公司的Savinase(subtilisin309)，并在其基础上开发出与其它非蛋白酶类相容性好的变体酶subtilisin KL。这些方法的共同点是野生蛋白酶来源于可培养微生物，但微生物分离培养存在明显的局限性，利用现有的技术，环境中能被培养的微生物比例不足总数的1％，大量未被培养或不能被培养的微生物具有巨大的应用潜力。

宏基因组学方法是从未培养微生物中寻找新型功能基因和活性物质的一种重要手段，至今国内外学者已经通过该技术克隆到单加氧酶、几丁质酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶等新基因，因此该方法为发现蛋白酶新基因提供了新思路。海洋约占地球表面积的71％，在分布广泛的海底沉积物中蕴藏着丰富的微生物多样性资源。到目前为止，国内外尚未有利用宏基因组技术从海底泥中获取新的碱性蛋白酶基因并针对蛋白酶的LAS-Na耐受性进行基因突变的报道。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种新型蛋白酶，特别是一种碱性蛋白酶。

本发明的另一个目的在于提供含有上述蛋白酶的液体洗涤剂。

本发明的另一个目的在于提供上述蛋白酶在液体洗涤剂中的应用。

本发明的另一个目的在于提供基于上述蛋白酶的蛋白酶突变体。

本发明的另一个目的在于提供含有上述蛋白酶突变体的液体洗涤剂。

本发明的另一个目的在于提供上述蛋白酶突变体在液体洗涤剂中的应用。

本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：

一种新型蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的蛋白酶还包括与所修饰的蛋白酶氨基酸序列具有80％以上同源性且编码所述蛋白、并在液体洗涤剂中具有改进洗涤效果的具有蛋白酶活性的衍生蛋白质。

本发明还提供了该新型蛋白酶的宏基因组学克隆载体，其通过以下方法构建，通过设计特定引物从枯草芽孢杆菌中扩增和拼接得到锚定蛋白序列和终止序列或从基因工程操作人员熟悉的国际权威数据库中查找并合成上述序列，同时在各个序列两端引入合适的酶切位点，在pBE3载体(含启动子、信号肽和前肽序列)的基础上通过酶切、连接得到具有在芽孢杆菌表面展示能力的克隆/表达载体。

所述的锚定蛋白序列选自下列序列中的1个或1组：CotB、CotC、CotX、CotG、YhcS和YhcR。

该新型蛋白酶的的宏基因组学克隆方法如下，提取海底泥的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切，连接至上述载体中，转化至宿主细胞建立宏基因组文库，再通过涂布含2％酪蛋白和适当含量的相应抗生素的LB固体(无trytone)平板筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并根据结果设计引物，从而克隆到目的基因。

上述克隆宿主细胞为细菌、酵母或真菌，优选芽孢杆菌；所用限制向内切酶为基因工程中常用限制性内切酶。

本发明还提供了编码该蛋白酶的基因。

本发明还提供了含有该蛋白酶的液体洗涤剂。

本发明还提供了基于上述蛋白酶修饰的蛋白酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列通过SEQ ID NO.1中所示的亲本蛋白酶的氨基酸序列的第162位的苏氨酸被异亮氨酸替代，第166位的酪氨酸被苏氨酸替代得到。

本发明还提供了含有该蛋白酶突变体的液体洗涤剂。

本发明还提供了基于上述蛋白酶修饰的蛋白酶突变体，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示，其氨基酸序列通过SEQ ID NO.1中所示的亲本蛋白酶的氨基酸序列的第162位的苏氨酸被异亮氨酸替代，第166位的酪氨酸被苏氨酸替代，第190位的丙氨酸被缬氨酸替代得到。

本发明还提供了含有该蛋白酶突变体的液体洗涤剂。

本发明基于上述新型碱性蛋白酶，利用随机突变和筛选方法产生蛋白酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

本发明中新型碱性蛋白酶的蛋白可以是如下(a)或者(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且编码所述蛋白并在液体洗涤剂中具有改进洗涤效果的具有蛋白酶活性的衍生蛋白质。

以上蛋白酶突变体基于所述蛋白酶的随机突变及表面活性剂，尤其是直链烷基苯磺酸钠(LAS-Na)耐受性提升进行筛选，筛选方法如下：通过设计特定引物，利用II Random Mutagenesis Kit从上述克隆载体上扩增得到含突变碱基的目的基因。并设计特定引物，利用PCR方法将上述的含有目的基因插入的载体线性化，并使其含有与目的片段同源的片段，然后通过PCR方法将获取的目的基因与线性化且含与目的基因同源片段的载体串联形成质粒多聚体并转入宿主细胞中，最后利用IVC(In Vitro Compartmentalization)体系和流式细胞仪筛选方法获得表达目的突变蛋白酶的突变子。

所述突变包括在蛋白酶基因序列任何位置发生的碱基置换或颠换；所述表达宿主细胞为细菌、酵母或真菌，优选芽孢杆菌。

使上述突变子复苏，其具体过程为：利用PCR方法对经流式细胞仪筛选得到的阳性克隆子进行复苏，然后通过PstI和BamHI双酶切后连接经同样处理的前述表达载体，并按照上述筛选方法转化表达菌株，挑取适当数目的克隆子进行培养，测定经过LAS作用后的相对酶活以及绝对酶活，挑取合适的克隆子进行测序，获得突变酶基因。

所述的蛋白酶活性测定方法为：用Tris-Hcl(pH＝8.0)缓冲液重悬菌体，取重悬液30μL并加入转录抑制剂，然后向重悬液中加入相应浓度的LAS-Na，放置10min后，向混合液中加入10μl10mM的Suc-AAPF-PNA DMSO溶液，37℃水浴14min，同时使用Tris-Hcl(pH＝8，含转录抑制剂)经相应浓度的LAS-Na处理并与10μl2％的10mM Suc-AAPF-PNA DMSO混合溶液作空白对照。反应结束后，离心混合液并取上清于405nm处测量发光值，作为衡量酶活的标准。

上述新型蛋白酶的随机突变方法及含目的基因的载体多聚体的构建方法步骤具体如下：

①目的基因的突变通过随机突变试剂盒实现。具体操作参见IIRandom Mutagenesis Kit操作说明，通过设计特定引物从上述克隆载体上扩增得到含突变碱基的目的基因。其中每50μl体系中模板量为1ng-1μg，优选10ng-100ng。所有试剂均加入PCR管后，震荡混匀，按照下列程序进行循环：95℃预变性2min，95℃变性1min，66℃退火1min，72℃延生50s，重复26个循环后72℃温育10min，降温至4℃；

所述突变包括在蛋白酶基因序列任何位置发生的碱基置换或颠换。

②含目的基因同源片段的线性化载体通过如下技术实现：通过设计特定引物，利用PCR方法将上述包含插入目的基因的载体线性化，并使其含有与目的片段同源的片段，以备后续实验应用；

所述同源片段长度介于40-400bp碱基数之间，优选50-200bp，尤其是60bp。

③将通过PCR方法获取的目的基因与线性化且含与目的基因同源片段的载体按一定比例加入PCR管中，依次加入PCR缓冲液、dNTP、高保真DNA聚合酶、DMSO和ddH₂O，建立PCR扩增体系。然后按照下列程序进行循环：98℃预变性30s，98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸4min15s，重复20个循环；然后再次98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸8min，重复15个循环后72℃温育10min，降温至4℃；

所述目的基因与载体的比例为：目的片段:载体＝(150-60):1，优选100:1，此处的比例指目的片段与载体的摩尔比。

本发明还提供了一种重组蛋白酶的制备方法，包括用上述表达载体转化表达宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组蛋白酶。

上述重组蛋白酶的制备方法中，表达宿主细胞为微生物细胞，优选为细菌、酵母或真菌，更优选芽孢杆菌，尤其是芽孢杆菌SCK6。

诱导温度为18-37℃，优选为25-35℃，最优选为30℃，培养时间为8-24h，优选8-16h，尤其是16h。

本发明所述重组突变蛋白酶在液体洗涤剂组合物，优选在洗衣液中对阴离子表面活性剂，尤其是具有较强离子强度和/或二价金属离子螯合能力的阴离子表面活性剂，特别是LAS-Na的耐受性应用。

本发明的洗涤剂组合物可用作洗衣去污剂、漂白去污剂、自动洗碗机去污剂、排水管清洗剂、人工洗牙机等的去污剂。优选用作洗衣去污剂。所述洗涤剂组合物可以是下表中的提供的模式洗涤剂，也可是商品化的液体洗涤剂，如汰渍、碧浪、奥妙、超能、立白、去渍霸、妈妈壹选、威露士或任何其他品牌外延及洗涤剂浓缩型式。

若所使用的商品洗涤剂包含酶，则使用前于90℃水浴10min灭活酶。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首先利用宏基因组技术从海底泥中得到一个新的碱性蛋白酶基因，然后通过基因工程技术对该DNA序列进行改造，以LAS-Na为筛选压力，获得对LAS-Na耐受性好的突变蛋白酶。此外，本发明获得的蛋白酶在液体洗涤剂组合物中较参照酶具有较好的LAS-Na耐受性。在含0-20％LAS-Na的洗衣液中，分别于0℃、20℃、37℃和40℃时存放2-8周，突变蛋白酶的稳定性得到明显提升。

附图说明

图1为pBE3质粒图谱；

图2为多聚体技术的制备原理图；

图3为荧光底物(Suc-AAPF)₂Rh110反应原理图；

图4质粒多聚体构建结果图；其中，泳道M为10,000bp的DNA分子量标记(Maker)，泳道1与2为多聚体；

图5为多聚体的双酶切检验电泳图，其中泳道M为10,000bp DNA marker，泳道1-3均为多聚体经BamHI和PstI双酶切实验结果；

图6为实施例1中复筛实验结果图。其中10-14号为不同酶活的Savinase稀释液：11号为1U，12号为10U，13号为100U，14号为1000U，1号为Savinase原酶液16000U，15为去离子水对照，2号和3号分别为阳性突变子；

图7为包含荧光底物(Suc-AAPF)₂Rh110的IVC体系构建结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

本领域技术人员理解，本发明所用到的“海底泥”指的是深海底的沉积泥土物质，其具有丰富的矿物质和微生物。

实施例1  宏基因组文库的建立和阳性克隆子的获得、基因克隆与表达

1、总DNA的提取：

称取5g海底泥样品(采自中国南海西南海区1340m深的海底)，加入13.5mL DNA提取缓冲液(0.1M Tris，0.1M EDTA-Na，0.1M Na₃PO₄，1.5M NaCl，1％CTAB，pH值8.0)，剧烈振荡混匀，加入300μL溶菌酶(100mg/ml)，反复颠倒5-6次，37℃水浴30min，加入1.5ml20％SDS，65℃水浴1h(期间每隔15min上下颠倒几次)，8000rpm离心5min，取上清液，用等体积氯仿抽提2次，8000rpm离心10min，取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置2h，20000rpm离心20min，弃上清，沉淀加5mL预冷的70％乙醇，20000rpm离心10min，收集DNA沉淀，风干，用适量TE缓冲液溶解。

2、试剂盒法纯化DNA：按照OMEGA胶回收试剂盒说明书进行。

3、宏基因组电泳检测：用1％琼脂糖凝胶电泳检测总DNA量和纯度。

4、酶切总DNA：用限制性内切酶BamHI部分酶切总DNA，回收2-8kb的酶切片段，方法同试剂盒法纯化DNA。

5、克隆载体pBE3的构建：

设计锚定蛋白YhcR123-yhcS的一对引物：YhcR123-yhcS-F-XhoI:TATATCTCGAGTTGGAAGCGACAGTTGAGTACGT(下划线和斜体部分为限制性酶切位点)和YhcR123-yhcS-R-PstI:CCCTGCAGACTAGTTTAAGTCACTCGTTTTCCAT(下划线和斜体部分为限制性酶切位点)；

设计终止肽序列：Terminal sequence F-NdeI:GGAATTCCATATGGAATTCCATGAGCAGTGAATTATTA(下划线和斜体部分为限制性酶切位点)和Terminal sequence R-SmaI:TCCCCCGGGGGATGAAACTGCTGAATCGGATGAATAA(下划线和斜体部分为限制性酶切位点)，并在锚定蛋白和终止肽之间加入包含常用限制性内切酶如BamHI、NotI、HindIII、SacI、NcoI、XbaI、SmaI、KpnI、SalI等的多克隆酶切位点。然后用BamHI单酶切构建好的pBE3质粒。

所述锚定蛋白及终止肽序列，来自于设计特定引物从芽孢杆菌中克隆或来源于基因工程操作人员熟悉的国际权威数据库，通过基因合成方式获取，优选如下序列:

ATGAGCAGTGAATTATTAGATGCTCTCACGATTCTTGAAAAAGAAAAAGGCATCAGTAAAGAAATTATCATCGAAGCAATCGAAGCTGCGTTAATTTCTGCTTATAAGCGGAATTTTAATCAAGCGCAAAATGTACGGGTGGATCTAAACCGTGAAACTGGCTCCATCCGTGTATTTGCAAGAAAAGATGTCGTTGACGAAGTATACGACCAGAGATTAGAAATCTCAATTGAAGAGGCACAGGGCATCCATCCGGAATATATGGTCGGCGATGTCGTCGAAATCGAAGTTACACCTAAGGATTTCGGGCGCATAGCTGCTCAAACAGCGAAGCAGGTCGTCACACAGCGTGTGCGCGAAGCTGAGCGCGGTGTGATTTATTCTGAATTTATCGACCGTGAAGAAGACATCATGACAGGGATCGTCCAGCGTCTGGACAATAAATTTATCTACGTGTCTTTAGGCAAAATAGAAGCCTTGCTGCCGGTTAATGAGCAAATGCCGAATGAAAGCTACAAGCCCCATGACCGCATTAAGGTATATATCACAAAAGTAGAAAAAACAACGAAGGGTCCGCAGATTTATGTGTCAAGAACACATCCAGGCCTGTTAAAGCGTTTGTTTGAAATTGAAGTGCCTGAAATTTATGATGGAACTGTCGAGCTAAAATCTGTTGCCAGAGAAGCCGGCGACCGTTCGAAAATTTCTGTTCGCACAGATGATCCTGACGTTGATCCTGTCGGTTCATGCGTAGGGCCTAAAGGCCAGCGTGTGCAAGCAATCGTCAATGAATTAAAAGGTGAAAAAATTGACATTGTCAACTGGTCCAGTGATCCTGTAGAATTTGTCGCGAATGCGCTCAGCCCTTCCAAAGTGCTTGATGTCATTGTTAATGAAGAAGAAAAAGCGACAACTGTTATTGTTCCTGATTACCAGCTGTCTCTGGCAATTGGAAAAAGAGGACAAAACGCACGCTTAGCTGCTAAACTGACAGGCTGGAAGATTGATATTAAGAGCGAAACGGACGCAAGAGAACTTGGAATCTATCCGAGAGAACTTGAAGAAGATGATGAGCCGCTCTTTACGGAGCCTGAAACTGCTGAATCGGATGAATAA。

并在两端设计特定的限制性内切酶酶切位点。

6、酶切片段及克隆载体的电泳检测：方法同宏基因组电泳检测。

7、酶切片段的链接：将回收得到的酶切片段和经BamHI酶切的克隆载体pBE3连接过夜，并按照OMEGA MicroCycle-Pure Kit操作回收连接产物。

8、连接产物的转化：吸取5μl的连接产物加入到200μl的芽孢杆菌SCK6(含木糖诱导的感受态因子)高效感受态细胞中，37℃200rpm培养90min，吸取全部培养液，用玻璃涂布棒涂布于含2％酪蛋白、10μg/mL卡那霉素(Kana)和10μg/ml红霉素的LB固体(去trytone)平板，37℃培养过夜。通过该方式最终构建了一个库容量达20000个转化子、多样性好的宏基因组文库。

9、文库筛选和阳性克隆子的鉴定：将涂布后的平板至于37℃培养48-96h，由于蛋白酶可以水解酪蛋白，因而阳性克隆菌落周围会产生透明圈。然后将有活的菌株挑出并接种于另一新筛选平板中，培养48h，再在平板上滴加经不同比例稀释的市售蛋白酶(Savinase)和去离子水作为阳性和阴性对照进行复筛。通过初筛和复筛，得到2株具有蛋白酶活性的阳性克隆子，见附图6。从图中看出3号的酶活性高于2号，因而对3号克隆子进行进一步研究。

从平板中将3号克隆子挑出并接种至10ml含10μg/ml Kana、10μg/ml红霉素和20μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm摇床培养过夜，取2ml菌体进行质粒提取，对插入片段测序，将测定的序列经过NCBI的BLASTn软件分析比较，发现该DNA由813个碱基组成，该DNA编码的多肽，含271个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，将其命名为S102。

实施例2  S102的基因突变与含插入突变基因的载体多聚体构建

1、S102的基因突变：

根据测序结果设计一对引物：

S102-PstI:ATTATCTGCAGGCGCAATCAGTGCCATG(下划线和斜体部分为限制性酶切位点)

S102-BamHI:AACTGCTCATACTAGGATCCGCGTGTTGCCGCTTCTGCAT(下划线和斜体部分为限制性酶切位点)；

利用两条引物，以质粒pBE3-s102为模板进行易错PCR(ep-PCR)扩增反应，PCR体系如下：

PCR条件为：95℃预变性2min，95℃变性1min，66℃退火1min，72℃延伸50s，26个循环，72℃保温10min，降温至4℃。PCR结束后，每管取1μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用相应分子量的marker作为对比，marker用量为5μl，确定DNA片段浓度，以备用。

2、含插入目的片段载体的线性化及多聚体的制备

根据上述成熟蛋白酶基因测序结果，设计一对特定引物：pBE3-YhcR-yhcS fullplasmid F:AATACCGCAACCAGCTTAGG和pBE3-YhcR-yhcS full plasmid R:AAACCACGATTATGCGCTG对质粒PBE3-PDFE-YhcR123-yhcS-s102进行扩增具体操作步骤如下：

primer star PCR反应体系

所述体系可以按照上述比例进行相应的扩大或缩小

循环程序：98℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸50s，重复30个循环后72℃温育7min，降温至4℃。PCR结束后，取1μl溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用相应分子量的marker作为对比，marker用量为5μl，确定DNA片段浓度。

回收PCR片段后，使用phusion DNA聚合酶，按照以下配方进行多聚体的制备：

所述体系可以按照上述比例进行相应的扩大或缩小。

将上述体系混匀，按照下列程序进行循环：98℃预变性30s，98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸4min15s，重复20个循环；然后再次98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸8min，重复15个循环后72℃温育10min，降温至4℃。PCR结束后，取3μl溶液进行琼脂糖凝胶电泳，使用1kb DNA marker作为对比，marker用量为5μl，确定DNA片段浓度。以每200μl芽孢杆菌感受态细胞转化1μl多聚体。

实施例3  酶活性测定方法与IVC筛选体系的构建

1、酶活的测定(Suc-AAPF-PNA法)

①取2ml菌液6,000rpm离心2min，然后用200μl的Tris-Hcl(pH＝8)缓冲液重悬菌体，取重悬液30μl进行细胞壁上的蛋白酶酶活。为了阻止新合成的蛋白酶对实验结果的干扰，加入终浓度为20μg/ml的氯霉素(转录抑制剂)。

②将30μl重悬浓缩菌液与300μl的Tris-Hcl(pH＝8)缓冲液混合，向混合液中加入10μl的10mM的Suc-AAPF-PNA DMSO溶液，37℃水浴14min，同时使用305μl的Tris-Hcl(pH＝8，含有终浓度为20μg/ml的氯霉素)与10μl的2％的10mM的Suc-AAPF-PNA DMSO混合溶液作为对照。

若对细胞壁酶活进行LAS盐的耐受能力的测试，则将相应浓度的LAS盐添加到反应液中，放置10min，再添加Suc-AAPF-PNA DMSO溶液，进行反应。

③水浴结束后，将溶液进行14,000rpm离心1min，取上清300μl于波长405nm处测量不同组别发光值的大小，作为衡量酶活的标准。

2、IVC筛选体系的构建

①以阴离子表面活性剂，优选具有较强离子强度和二价金属离子螯合能力的阴离子表面活性剂，尤其是LAS-Na为筛选压力，将表面固定有突变蛋白酶的微生物细胞在一定浓度LAS-Na溶液中于25-37℃作用10-60min，14,000rpm离心1min，用pH＝8.0的Tris-Hcl对细胞进行重悬-离心-重悬循环2-3遍，每次离心为14,000rpm,1min；浓缩细胞至5x10⁹cell/ml。

所述一定浓度LAS-Na，指LAS-Na的浓度≤2％(质量分数)，依据宿主细胞不同，选择相应浓度。芽孢杆菌优选用0.5-1％的LAS-Na溶液处理。

②使用8μm孔径的过滤滤头(whatman)对细胞菌液进行过滤，以除去聚集的细胞群体。

③将1ml浓缩后的菌液与1μl1mM的荧光染料混合，室温暗处作用10-30min，使用无菌水对菌体进行重悬-离心-重悬循环2-3次，每次离心为14,000rpm，1min。

所述的荧光染料选自双苯酰亚胺类染料如Hoechst和/或苯乙烯类染料如FM4-64中的1个或1组。

④水相溶液/油相溶液以及荧光底物配制：

a：混合水溶液：1.5％CMC(羧甲基纤维素钠平均分子量为800)与1％TritonX-102；

b：油相溶液：ABIL EM90/mineral oil＝2.9％，以及

c：荧光底物：10mM的(Suc-AAPF)₂Rh110DMSO溶液

上述三种溶液配制完成后均需要冰浴放置。

⑤取80μl的浓缩菌液冰浴放置3min，向其添加2μl10mM的(Suc-AAPF)₂Rh110DMSO溶液，混合均匀，置于10ml EP管中，向其添加800μl的油相溶液，在冰浴条件下，使用均质仪Ultra Turrax T10homogenizer于9500rpm均质5min，形成大量油包水单层包膜(w/o emulsion)。

⑥均质结束后，于冰上放置3min，向乳浊混合夜添加800μl的水相溶液，在冰浴条件下，使用均质仪Ultra Turrax T10homogenizer8000rpm均质3min，形成大量水包油包水双层包膜(w/o/w double emulsion)。

⑦将含有大量双层包膜的混合乳浊液置于37℃水浴20min，将乳浊液稀释100倍，即可用于分选流式细胞仪的阳性克隆子的筛选。

实施例4  LAS-Na耐受性提升的突变子筛选和复苏

通过流式细胞仪筛选，获得了对LAS-Na耐受性较野生型有不同程度提高的突变子。由于经过LAS作用后，芽孢杆菌细胞的存活率约为10^-4(实验结果表明)，因而需要通过PCR扩增方式对筛选出的阳性突变体的基因进行复苏。

具体操作如下：

①取出流式细胞仪分选后含阳性细胞群的乳浊液，向其中添加100μl的SCK6菌液(无插入质粒，浓度约为10⁸cell/ml)助沉。离心混合液14,000rpm1min，弃去上清，重复操作三遍，使用10μl的水重悬。

②将重悬液置于99℃水浴作用10min，离心14,000rpm1min，取上清，添加至终体积为100μl的PCR体系中，以S102-PstI和S102-BamHI对模版进行扩增。

③将扩增出来的PCR产物进行胶回收，与pBE3-YhcR123-yhcS的全质粒PCR产物进行多聚体的构建。

④将多聚体转化SCK6感受态细胞，构建新的一轮文库，涂布含2％酪蛋白、10μg/ml Kana和10μg/ml红霉素的LB固体(去trytone)平板上。

⑤根据筛选的比例，挑取适当数目的克隆子进行培养，通过SucAAPF PNA测定经过LAS作用后的相对酶活以及绝对酶活，挑取合适的克隆子进行测序。

⑥通过筛选和测序，得到2个LAS-Na耐受性提高的突变酶，M200(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)和M201(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)，耐受性测试结果见下表。然后将两株克隆子保存，并进一步研究突变酶在液体洗涤剂中的应用性能。

由上表可知，两个突变酶均表现出更强的LAS-Na耐受性。

实施例5  重组突变酶在商品化洗衣液中的应用研究

向一种商品化的洗涤剂中分别添加筛选的突变蛋白酶M200、M201、野生型蛋白酶WT和对照蛋白酶Savinase(若该洗涤剂中已经含有酶，则可通过90℃水浴10min的方式灭活酶)，因对照酶与试验用酶绝对酶活性存在一定的差异，本研究以剩余相对酶活性来表征蛋白酶在液体洗涤剂中的稳定性。

测试方法：将添加蛋白酶的洗涤剂分别置于20℃和30℃条件下储存1、2、4和8周后，按照上述酶活性测试方法，取300μl反应液于波长405nm处分别测量OD₄₀₅值，分别以对应蛋白酶的初始值作为100％，获取相对酶活性，衡量不同蛋白酶在液体洗涤剂中的稳定性。

20℃时的测试结果见下表：

从上表中可以看出，突变蛋白酶M200、M201的稳定性与添加4-FPBA稳定剂的参照酶Savinase16L的相当，且突变蛋白酶M200、M201的稳定性在野生蛋白酶WT的基础上得到明显提升。

30℃时的测试结果见下表：

从上表中可以看出，在30℃条件下，突变蛋白酶M200、M201的稳定性与添加4-FPBA稳定剂的参照酶Savinase16L的相当，且其稳定性较野生型蛋白酶WT得到明显改善。

实施例6  重组突变酶在液体洗涤剂配方中的应用

制备下表所示的液体洗涤剂配方

物料名称	含量/％
		LAS-Na	10
脂肪醇聚氧乙烯醚	11
		脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠	5
膦酸盐	1
		氯化钙	0.01
丙二醇	2
		柠檬酸钠	2
荧光增白剂	0.85
		防腐剂	0.01
颜料	0.001
		香精	0.3
蛋白酶	0.3
		水	补至100

测试方法：将添加蛋白酶的洗涤剂分别置于20℃和30℃条件下储存1、2、4和8周后，按照上述酶活性测试方法，取300μl反应液于波长405nm处分别测量OD₄₀₅值，分别以对应蛋白酶的初始值作为100％，获取相对酶活性，衡量不同蛋白酶在液体洗涤剂中的稳定性。

20℃时的测试结果见下表：

从上表中可以看出，突变蛋白酶M200、M201的稳定性与添加4-FPBA稳定剂的参照酶Savinase16L的相当，且突变蛋白酶M200、M201的稳定性在野生蛋白酶WT的基础上得到明显提升。

30℃时的测试结果见下表：

从上表中可以看出，在30℃条件下，突变蛋白酶M200、M201的稳定性与添加4-FPBA稳定剂的参照酶Savinase16L的相当，且其稳定性M200、M201较野生型蛋白酶WT得到明显改善。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种蛋白酶，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示。

2．含有权利要求1所述蛋白酶的液体洗涤剂。

3．基于权利要求1所述蛋白酶修饰的蛋白酶突变体，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2所示，其氨基酸序列通过SEQ ID NO. 1中所示的亲本蛋白酶的氨基酸序列的第162位的苏氨酸被异亮氨酸替代，第166位的酪氨酸被苏氨酸替代得到。

4．含有权利要求3所述蛋白酶突变体的液体洗涤剂。

5．基于权利要求1所述蛋白酶修饰的蛋白酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，其氨基酸序列通过SEQ ID NO. 1中所示的亲本蛋白酶的氨基酸序列的第162位的苏氨酸被异亮氨酸替代，第166位的酪氨酸被苏氨酸替代，第190位的丙氨酸被缬氨酸替代得到。

6．含有权利要求5所述蛋白酶突变体的液体洗涤剂。

7．权利要求1所述蛋白酶、权利要求3所述蛋白酶突变体或权利要求5所述蛋白酶突变体在制备液体洗涤剂中的应用。