CN105420220A - 一种天冬氨酸类蛋白酶及其编码基因与应用 - Google Patents

一种天冬氨酸类蛋白酶及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种天冬氨酸类蛋白酶及其编码基因与应用。所述天冬氨酸类蛋白酶是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ？ID？NO：3所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将SEQ？ID？NO：3所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有天冬氨酸类蛋白酶功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明通过基因工程技术，从南极低温菌Geomycespannorum中扩增得到天冬氨酸类蛋白酶基因，并将其转入米曲霉中成功实现异源表达。本发明提供的天冬氨酸类蛋白酶具有较高的最适反应温度，且热稳定性好，具有较好的工业应用前景。

Description

一种天冬氨酸类蛋白酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体地涉及一种天冬氨酸类蛋白酶及其编码基因与应用。
背景技术
天冬氨酸类蛋白酶(asparticprotease，EC3.4.23)是一种内切型淀粉酶，它的活性中心由两个催化性天冬氨酸残基组成。它广泛存在于动物，植物，微生物中，是一种工业酶，在食品，酿酒，饮料，制药等行业中具有广泛应用。目前已经分离并鉴定的120种天冬氨酸类蛋白酶，从数量上看微生物来源的天冬氨酸类蛋白酶占大多数。微生物中能产生酸性蛋白酶的有：Bacillus，Thermomonospor，Acinetobacter，Pseudomonas，Streptomyces，Aspergillus，Penicillus等。目前在工业上大量使用的天冬氨酸类蛋白酶主要来源于枯草芽孢杆菌属(Bacillussubtilis)，地衣(Bacilluslicheniformis)，黑曲霉(Aspergillusniger)和米曲霉(Aspergillusoryzae)。
虽然天冬氨酸类蛋白酶的工业应用和微生物的天冬氨酸类蛋白酶已经研究了几十年，并取得了一定的进展，但是符合工业应用要求的仍然有限。
近年来，一系列植物微生物天冬氨酸类蛋白酶实现了在大肠杆菌或者在酵母中的异源表达，如来源于棘孢木霉(Trichodermaasperellum)的天冬氨酸类蛋白酶被克隆到大肠杆菌中实现了可溶性表达(KaiDoua,ZhiyingWang,RongshuZhang,etal.CloningandcharacteristicanalysisofanovelasparticproteasegeneAsp55fromTrichodermaasperellumACCC30536)，即便如此，还是没有筛选得到适冷的、高效的天冬氨酸类蛋白酶，因此开发这一类新酶依旧是研究热点。1990年以来不少产蛋白酶的南极低温菌被分离和鉴定出来，1997年，M.FeniceáL等从南极维多利亚岛上分离出5株都具有蛋白酶活性的G.pannorumvar.pannorum,其中no.1显示出了显著的活力，有产业化的应用价值(参见M.FeniceáLetal.1997.ProductionofextracellularenzymesbyAntarcticfungalstrains.PolarBiol,17:275-280)。2011年，AbiramyKrishn等再次在南极岛上筛选到了数株低温下分泌蛋白酶的真菌，其中主要菌种为Geomycespannorum(参见AbiramyKrishnetal.2011.ExtracellularhydrolaseemzymeproductionbysoilfungifromKingGeorgeIsland,Antarctic.PolarBiol,34:1535-1542)。虽然已知Geomycespannorum具有客观的蛋白酶活性，但是关于其淀粉酶的基因序列和淀粉序列并没有报道，且由于该菌培养条件限制，至今还没有分离纯化出其蛋白酶，对其酶学性质也没有研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种天冬氨酸类蛋白酶及其编码基因与应用，从而解决现有技术中的天冬氨酸类蛋白酶较少符合工业应用要求的缺陷。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的一个方面，提供一种天冬氨酸类蛋白酶，所述天冬氨酸类蛋白酶是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQIDNO：3所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将SEQIDNO：3所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有天冬氨酸类蛋白酶功能的由(a)衍生的蛋白质。
该天冬氨酸类蛋白酶来源于南极低温菌Geomycespannorum(菌种保藏号CCTCCAF2014016)。
为了便于天冬氨酸类蛋白酶的纯化，可在由SEQIDNO：3限定的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6个(通常是5个) RRRRR
Poly-His 2-10个(通常是6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDk
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
C-myc 10 EQKLISEEDL
本发明还提供一种天冬氨酸类蛋白酶基因，编码如上所述的天冬氨酸类蛋白酶。
所述天冬氨酸类蛋白酶基因的碱基序列如下：1)如SEQIDNO：2所示的碱基序列；或2)在严格条件下可与SEQIDNO：2限定的碱基序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；或3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
上述(b)限定的天冬氨酸类蛋白酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的淀粉酶的编码基因可通过将SEQIDNO：2的自5′末端第1-1542位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明还提供一种重组质粒，所述重组质粒如上所述的天冬氨酸类蛋白酶基因与表达载体质粒连接构建而成。
所述表达载体质粒是米曲霉表达载体pSKNHG。
本发明还提供包含如上所述的天冬氨酸类蛋白酶基因的表达盒、转基因细胞或重组菌。
优选地，所述重组菌是将上述含有天冬氨酸类蛋白酶基因的重组质粒转入米曲霉中获得的重组菌。
本发明还提供一种制备天冬氨酸类蛋白酶的方法。
本发明所提供的制备天冬氨酸类蛋白酶的方法，是发酵培养上述含有天冬氨酸类蛋白酶基因的重组菌，得到天冬氨酸类蛋白酶。
本发明还提供一种如上所述的天冬氨酸类蛋白酶在食品，酿酒，饮料，制药行业中的应用。
该天冬氨酸类蛋白酶的最适作用温度为60℃，且在50-70℃仍然保持较高酶活力，属于中温蛋白酶，在pH1.0～5.0的区间内均具有较好的pH稳定性。
本发明通过基因工程技术，从南极低温菌Geomycespannorum中扩增得到天冬氨酸类蛋白酶基因，并将其转入米曲霉中成功实现异源表达。本发明提供的天冬氨酸类蛋白酶具有较高的最适反应温度，且热稳定性好，具有较好的工业应用前景。
附图说明
图1是本发明纯化的天冬氨酸类蛋白酶的SDS-PAGE图，其中，M为蛋白Marker，1为纯化后的GpA1蛋白；
图2是Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶的温度曲线；
图3是Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶的温度耐受性；
图4是Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶的pH曲线；
图5是Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶的pH耐受性。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂或耗材，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。实验按《分子克隆：实验室手册》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件进行，或按照厂商所建议的条件进行。
实施例1天冬氨酸类蛋白酶基因的扩增
1.1菌株及其培养
从马来西亚大学生物科学学院合作项目中获赠南极低温菌Geomycespannorum(菌种鉴定NCBI登录号：JF20026，已保藏在CCTCC，编号为AF2014016)。
用无菌水从培养10天的PDA斜面上洗下G.pannorum孢子，接种液体培养基，20℃培养7天收集菌丝体，用于基因组提取：用牙签接种奶粉固体培养基，20℃培养5天收集菌丝，用于总RNA提取。
1.2基因组提取
按照Omega真菌基因组提取试剂盒说明书进行操作。
1.3总RNA提取
按照TakaraRNA提取试剂盒说明书进行操作。
1.4cDNA第一链合成
以抽提的总mRNA为模板，用Takara试剂盒的方法获得cDNA第一链，PCR体系(如表2和表3所述)及操作步骤如下：
表2
65℃保温5min，冰上迅速冷却，向上述反应管中加入
表3
42℃45min，95℃5min，冰上冷却。
1.5Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶基因的克隆
在NCBI上找到另一株Geomycespannorum菌种的天冬氨酸蛋白酶氨基酸序列，该菌株与本申请所采用Geomycespannorum属于不同种，根据该序列设计正向引物A1f，反向引物A1r。其中：
P10f：5’ATGCCTTCTTCGGCGGCCGT3’
P10r：5’TCAAACAACAATCAACAATC3’
表4
以1.2获得的基因组为模板，采用表4所示反应体系进行PCR。反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；保存在4℃。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收，连pMD19-TSimpleVector，菌落PCR验证阳性克隆送测序，测序由华大基因完成。
1.6天冬氨酸类蛋白酶cDNA的克隆
分析1.5得到的天冬氨酸类蛋白酶基因DNA序列，根据保守氨基酸序列以3的倍数递推，同时结合NCBIBlastX比对结果，找到了可能性最大的起始密码子ATG和终止密码子TAA。在密码子上预测网站(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？group＝programs&subgroup＝gfind&topic＝fgenesh)，得到了主要可能的内含子，设计ORF的特异性引物：
P10f2：5’ATGCCTTCTTCGGCGGCCGT3’
P10r2：5’TCAAACAACAATCAACAATC3’
以1.4获得的GeomycespannorumcDNA为模板，采用特异性引物P10f2和P10r2，进行PCR扩增a-淀粉酶ORF，PCR体系如下表5所示：
表5
反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；保存在4℃。
同时以基因组为模板进行PCR，过程如1.5中所述，电泳验证DNA大于cDNA。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收，连pMD19-TSimple，菌落PCR验证阳性克隆送测序，测序由华大基因完成。将测序结果在GenBank上进行比对并分析表明，所获得的天冬氨酸类蛋白酶基因DNA由1574个核苷酸组成，序列如SEQIDNO.1所示。
比较得出内含子序列，由此获得Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶完整cDNA序列，即开放阅读框，该a-淀粉酶基因cDNA的开放阅读框cDNA由1524个核苷酸组成，序列如SEQIDNO.2所示。
该cDNA编码507个氨基酸，其序列如SEQIDNO.3所示，分子量为51.23kDa。
该Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶氨基酸序列与已报道的天冬氨酸蛋白酶氨基酸序列最高同源度为64％。因此，该基因是一个新的天冬氨酸类蛋白酶基因，将之命名为GpP10。
虽然以上提供了从野生菌株通过PCR方法获得全长天冬氨酸类蛋白酶DNA及cDNA的方法，但是，本领域的技术人员根据本发明所公开的基因序列，采用其它方法，如人工合成法，同样可以获得全长天冬氨酸类蛋白酶基因DNA及cDNA，这是显而易见的。
实施例2含有天冬氨酸类蛋白酶基因的米曲霉重组表达载体的构建及其转化
2.1引物设计
SKP10f：5’CTAGCTAGCTAGATGCCTTCTTCGGCGGCCGT3’
SKP10r：5’TCCCCCGGGGGATCAAACAACAATCAACAATC3’
2.2重组表达载体构建
以连有天冬氨酸类蛋白酶基因开放阅读框的pSKNHG为模板，用2.1所示引物进行PCR扩增；将PCR产物NheI和SmaI双酶切，然后与同样经NheI和SmaI双酶切的米曲霉表达载体pSKNHG连接，筛选，得到重组质粒(pSKNHGP10)。
2.3米曲霉感受态细胞的制备
将米曲霉斜面孢子用无菌水洗下，接入液体培养基，过夜培养。
当培养基中出现大量微小的菌丝体时，停止培养，用Miracloth过滤培养基，保留菌丝体，并使用溶液Ⅰ冲洗1～2次，保持菌丝体湿重在200mg～400mg。
将菌丝体与酶解液以1:10(每0.1g菌丝体加1mL酶解液)混合，在50mL离心管中进行酶解，于30℃摇床150rpm酶解2～3小时。
酶解后，可直接观察到菌丝体的分解，将菌丝体与酶解液的混合物用Mirocloth过滤，弃沉淀，滤液的白色浑浊即原生质体。
将原生质体液3000rpm，4℃离心10分钟，白色沉淀即原生质体，用溶液Ⅱ洗涤两次，最后使用溶液Ⅱ悬浮原生质体，可直接用于转化，也可分装在Ep管中，-20℃保存。
2.4重组表达载体的转化
将原生质体200μL与20μL质粒DNA混合，加入50μL溶液Ⅲ，于50mL离心管冰育30分钟。
加入2mL溶液Ⅲ，室温放置5～15分钟。
加入4mL溶液Ⅱ，5000rpm，4℃离心10分钟，去掉上清，400μL溶液Ⅱ悬浮。
将转化MM上下层培养基分别融化。将转化下层MM培养基倒平板。将MM上层培养基降至室温与原生质体转化液混合，迅速倒平板，均匀铺平，用锡箔纸包好平板，避光培养，置于30℃培养箱，培养3天后观察平板长势。
实施例3米曲霉重组菌的诱导表达及纯化
3.1在2.5所述MM平板上挑取重组菌的单克隆，接种糊精诱导液体培养基，20℃，200rpm培养3～5d。
3.2抽滤过膜收集上清，测酶活，测定蛋白浓度，并进行蛋白电泳。
3.3收集的上清首先用10mL含10mM咪唑的NPI溶液以1.0mL/分钟的速度加样到1mL柱体积的Ni-NTA亲和柱上。然后用依次将NPI-酶液、含20mM、50mM、200mM的NPI溶液洗脱亲和柱，分别测定洗脱液的酶活并且进行SDS-PAGE电泳，确定最佳纯化条件，并得到纯GpP10蛋白，如图1所示。
实施例4天冬氨酸类蛋白酶酶活测定
天冬氨酸类蛋白酶酶活测定采用测定酪氨酸浓度的方法进行测定。
4.1标准曲线绘制
取18支试管分成6组(每组3支，平行样)，编号，按下表6分别加入标准葡萄糖、去离子水、0.4mol/L的碳酸钠和福林-酚试剂，混匀后，放入40℃水浴保温20min，然后在721型分光光度计上进行比色测定(波长660nm)，以浓度为0mg/mL酪氨酸反位液做空白对照。
表6
4.2样品酶活的测定
取4支试管编号(1号为空白对照)，分别加入酶液1mL,1号管立即加0.4mol/LTCA溶液2mL，使酶失活，另3支样品加入lmLpH3.0、浓度为1％牛血清蛋白缓冲液，迅速混匀，并立即放入40℃恒温水浴准确计时，保温10min后，立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL，终止反应，同时向1号空白管中加入1mL2％牛血清蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温20min，取出离心或过滤除去剩余牛血清蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液1mL，分别移入另4支试管中，再加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL和己稀释的福林-酚试剂1mL，摇匀，保温显色20min后，进行比色测定(波长660nm)。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。
4.3酶活单位定义
定义一个酶活单位就是：一个天冬氨酸类蛋白酶酶活单位(U)定义为在给定条件下，5min内水解产生1mg酪氨酸所需的酶量。
实施例5a-淀粉酶酶学性质测定
5.1温度对GpP10的影响
在pH3(100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)条件下，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃测定Geomycespannorum天冬氨酸蛋白酶的活性，以最高酶活力为100％，计算其他温度条件下的相对酶活力。
用pH3的缓冲液将酶液适当稀释，分别在50℃、60℃、70℃保温，每隔5min取样(至30min，冰上迅速冷却，在50℃下测定残余酶活力，以没有热孵育的酶液酶活力为100％，计算相对酶活力，表示酶的热稳定性。
图2显示Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶温度曲线，其中GpP10最适作用温度为60℃，且在50-70℃仍然保持较高酶活力，属于中温蛋白酶。
图3显示Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶温度耐受性，GpP10在50℃条件下稳定，60℃较为稳定，而在70℃条件下孵育15min基本失活。
5.2pH对GpP10酶活力的影响
在40℃，分别在1.0、2.0、3.0(HCl-Gly)、4.0、5.0、6.0(柠檬酸-柠檬酸钠)、7.0(磷酸二氢钾-磷酸氢二钾)的条件下，测定Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶酶活力，以最高酶活力为100％，计算其他温度条件下的相对酶活力。
用上述不同缓冲液将酶液适当稀释，分别在50℃条件下孵育30min，取出置冰上迅速冷却，在pH5.0、40℃条件下测定残余酶活力，以没有孵育的酶液酶活力为100％，计算相对酶活力表示酶的pH耐受性。
图4显示Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶pH曲线，其中GpP10最适作用pH为3.0，在pH1.0～5.0区间内具有较高酶活力。
图5显示Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶pH耐受性，其中GpP10在pH1.0～5.0的区间内均具有较好的pH稳定性。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (9)

1.一种天冬氨酸类蛋白酶，其特征在于，所述天冬氨酸类蛋白酶是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由SEQIDNO：3所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(b)将SEQIDNO：3所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有天冬氨酸类蛋白酶功能的由(a)衍生的蛋白质。
2.一种天冬氨酸类蛋白酶基因，其特征在于，编码根据权利要求1所述的天冬氨酸类蛋白酶。
3.根据权利要求2所述的天冬氨酸类蛋白酶基因，其特征在于，其碱基序列如下：
1)如SEQIDNO：2所示的DNA序列；或
2)在严格条件下可与SEQIDNO：2限定的碱基序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；或
3)与1)或2)的碱基序列具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒由根据权利要求2所述的天冬氨酸类蛋白酶基因与表达载体质粒连接构建而成。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述表达载体质粒是米曲霉表达载体pSKNHG。
6.含有根据权利要求2所述的天冬氨酸类蛋白酶基因的表达盒、转基因细胞或重组菌。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将根据权利要求4所述的重组质粒转入米曲霉中获得的重组菌。
8.一种制备天冬氨酸类蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括发酵培养如权利要求7所述的含有天冬氨酸类蛋白酶基因的重组菌，得到天冬氨酸类蛋白酶。
9.如权利要求1所述的天冬氨酸类蛋白酶在食品，酿酒，饮料，制药行业中的应用。
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