CN103031289A - 一种乳糖酶及其重组表达工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳糖酶及其重组表达工程菌株，所述的菌株的保藏编号为CCTCC NO: M2012482。本发明所述里氏木霉工程菌株能高效表达米曲霉的乳糖酶，酶活达到251U/mL。所述乳糖酶最适作用pH为5.0，最适作用温度为50℃，能高效水解牛乳中的乳糖，水解率高达70%，对于工业化生产低乳糖牛乳具有潜在的应用价值。

Description

一种乳糖酶及其重组表达工程菌

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种乳糖酶及其重组表达工程菌。

背景技术

β-半乳糖苷酶（β-D半乳糖苷水解酶，β-D-galactosido-galatohydrolase，EC3.2.1.23）通常被称为乳糖酶（Lactase）。这种酶能将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖，也具有半乳糖苷的转移作用（张树政等，酶制剂工业，科学出版社，1984，p818-819）。乳糖酶存在于植物（尤其在杏、桃、苹果）、细菌（乳酸菌、大肠杆菌等）、真菌（米曲霉、黑曲霉、琉球曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、热带假丝酵母）以及放线菌（天蓝链霉菌）、动物肠道（特别是婴儿）中。

乳糖酶主要用来治疗乳糖不耐受症、处理加工牛乳、乳清等，生产低乳糖牛奶和低乳糖乳制品及减少环境污染等；例如：

1）解决乳糖不耐受症患者食用乳制品问题。由于乳糖不耐受症患者体内缺乏乳糖酶，他们就不能充分利用乳制品中的乳糖所提供的能量，乳糖在体内不能被吸收，就成为肠道微生物菌系的能源，导致乳酸和二氧化碳的形成，它们对肠道有刺激作用，并造成机体脱水进入结肠，最终导致腹泻，同时发生肠梗塞和胀气等。可通过口服乳糖酶或将乳糖酶直接加到乳制品中来解决这一问题在工业生产中可将乳糖酶加到乳制品中制成低乳糖的乳制品，一方面减轻乳糖的不耐受症的影响，另一方面可提高乳制品的营养。

2）改良浓缩乳和浓缩乳清的质量，由于乳糖的溶解度低，在低温下极易从浓缩乳和浓缩乳清中结晶析出，加入乳糖酶可防止冷冻乳及浓缩乳清中的乳糖结晶而引起乳酪蛋白的凝固。

3）改良冰激凌的品质。在冰激凌混合物中，如有12%以上的脱脂乳固形物时，贮藏及销售中会产生乳糖结晶，降低了商品价值，如脱脂固形物为16%，用酶分解其50%的乳糖后，在冰箱中放置4个月仍然稳定，同时增加了甜味，减少了砂糖的用量。

近年来，利用乳糖酶生产低聚半乳糖也受到重视，因此，乳糖酶在食品工业生产中的作用日益显著。但目前乳糖酶并未在食品工业中得到广泛的应用，主要原因是：目前乳糖酶的产量较低，销售价格过高，添加成本昂贵，市场上销售的乳糖酶主要来源于酵母，此种酶耐热性差，适用范围窄，不能满足食品工业多方面的需要，随着基因工程技术的发展，寻找研制出成本低，产量高，热稳定性强，更适合食品工业生产的乳糖酶已成为研究热点。

目前乳糖酶基因的高效表达主要集中在来源于曲霉的乳糖酶基因上，因为曲霉的乳糖酶热稳定性好，pH低，更适合食品加工的需要。丝状真菌在发酵工业上长期以来一直用于抗生素、酶类和有机酸的生产，尤其在工业用酶生产中确立了核心地位。工业用酶的国际市场每年大约数十亿美元，而且不断增长，其中近40%的酶类生产来自丝状真菌。其中瑞氏木酶表达系统具有强大的分泌异源蛋白的能力，某些瑞氏木酶菌株分泌的胞外总蛋白可达40g/L

这种高效生产和分泌蛋白的能力是细菌无法相比的，同时还能进行各种翻译后加工，如糖基化修饰、蛋白酶切割和二硫键的形成等。另外与哺乳动物细胞、昆虫等高等生物表达系统相比，木霉培养简便，成本低，而且生长迅速，容易大规模开发形成产业化，而且产物可分泌到培养基中，不需要破壁提取产物，分离纯化等下游加工过程简单。

综上所述，虽然针对乳糖酶基因的表达做了许多研究，但总体说来表达水平还较低，如何提高乳糖酶的表达水平将是研究的难点。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳糖酶及其重组表达工程菌株。本发明通过将乳糖酶基因转入里氏木霉（Trichoderma reesei）中，构建里氏木霉工程菌株。所述工程菌株能高效表达乳糖酶,进而用于水解牛乳中的乳糖,对于工业化生产低乳糖牛乳具有潜在的应用价值。

本发明一方面提供一种乳糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明一方面涉及一种里氏木霉工程菌，该工程菌携带有表达乳糖酶基因的表达载体。

所述里氏木霉工程菌ZHD-1（Trichoderma reesei ZHD-1），已于2012年11月27日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCCNO: M2012482。

本发明所述里氏木霉工程菌株能高效表达米曲霉的乳糖酶，酶活达到251U/mL。所述乳糖酶最适作用pH为5.0，最适作用温度为50℃，能高效水解牛乳中的乳糖，水解率高达70%，对于工业化生产低乳糖牛乳具有潜在的应用价值。

附图说明

图1：本发明构建的重组表达载体质粒图谱；

图2：本发明构建的里氏木霉工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，其中箭头所指为重组表达的乳糖酶。

图3：重组表达的乳糖酶作用pH-相对酶活曲线图。

图4：重组表达的乳糖酶作用温度-相对酶活曲线图。

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实验材料与溶液配制：

1. 菌株与载体

大肠杆菌菌株E.coli DH5α购自Promega公司。

2. 酶与试剂盒

限制性内切酶、连接酶、Taq酶购自TaKaRa公司底物购自Sigma公司，试剂盒购自OMIGA公司，其他试剂都为国产试剂

3. 培养基成分

LB培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaC， pH7.0；

PDA培养基：20%马铃薯、2%葡萄糖、2%琼脂

MM培养基：葡萄糖 20 g/l，(NH₄)₂SO₄ 5 g/l，KH₂PO₄ 15 g/l，MgSO₄ 0.6 g/l，CaCl₂ 0.6 g/l，FeSO₄?7H₂O 0.005 g/l，MnSO₄?H₂O 0.0016 g/l，ZnSO₄?7H₂O 0.0014 g/l，CoCl₂ 0.0012 g/l

加2%的琼脂粉即得基本固体培养基。115℃高压蒸气灭菌30 min。

转化下层培养基：

葡萄糖 10g/l，（NH₄）₂SO₄  6 g/l，KH₂PO₄ 10 g/l，MgSO₄1 g/l，柠檬酸钠  3 g/l，FeSO₄·7H2O  0.05 g/l，MnSO₄·H₂O    0.016 g/l，ZnSO₄·7H₂O   0.014 g/l，CoCl₂ 0.012 g/l，Ager powder   15 g/l。115℃高压蒸气灭菌30min。

转化上层培养基：

葡萄糖 10g/l，（NH₄）₂SO₄  6 g/l，KH₂PO₄ 10 g/l，MgSO₄1 g/l，柠檬酸钠  3 g/l，FeSO₄·7H2O  0.05 g/l，MnSO₄·H₂O    0.016 g/l，ZnSO₄·7H₂O   0.014 g/l，CoCl₂ 0.012 g/l，D-山梨醇183.2g/l ，Agarose   15 g/l。115℃高压蒸气灭菌30 min。

4. 转化用溶液

溶液Ⅰ（200ml）

1.2M sorbitol（182.17）    43.72g

0.1M KH₂PO₄   (136.09)      2.72g

初试pH值4.27；配制600ml溶液Ⅰ加3110 2M NaOH溶液到pH5.50(5.60)

溶液Ⅱ（100ml）

1M sorbitol（182.17）    18.22g

50mM Cacl₂  (147.02)      0.55g

10mM TrisHcl             1ml 1M TrisHcl( pH7.50)

初试pH值9.23；配制100ml溶液Ⅱ加298ul 2.5M HCl溶液到pH7.48(7.50)

PEG溶液

25% PEG6000                25g

50mM Cacl₂  (147.02)       0.551g

10mM Tris-Hcl              1ml 1M Tris-Hcl(pH7.50)

初试pH值7.97；配制200mlPEG溶液滴加194ul 2.5M HCl溶液到pH7.50

Ps：实验室试剂分子量：D- sorbitol 182.18; Tris碱121.1；Cacl₂ 110.99；

KH₂PO₄ 136.09

调pH值所加的NaOH及Hcl根据水的最初pH值不同会有所浮动。

实施例1米曲霉乳糖酶基因的克隆

1、米曲霉基因组总DNA的提取

米曲霉菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心10min，上清液用酚/氯仿抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静止5min, 在4℃下10000rpm离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤2遍，真空干燥，取适量的水溶解，-20℃保存备用

2、基因克隆

以提取的总DNA为模板，利用引物P1/P2进行PCR扩增。

P1： CGGGGTACCATGAAGCTCCTCTCTGTTGCTGCTG------Kpn I

P2：GCGTCTAGATTAGTATGCTCCCTTCCGCTGCTCA--------Xba I

PCR扩增条件为：94℃ 4min，94℃ 1min，63℃ 30s，72℃ 3.5min, 共30个循环，最后72℃ 10min，扩增到一条约3.5kb的特异DNA条带，电泳回收后克隆到pMD19-T载体上，得到重组载体pMD lac-19T，最后把阳性克隆送至北京华大基因研究中心进行测序分析，其氨基酸序列为SEQ.NO:1，编码核苷酸序列为SEQ.NO:2。

实施例2 表达载体的构建

提取质粒pMDlac-19T（具体步骤参照OMIGA试剂公司质粒小提试剂盒说明书），然后KpnI、XbaI双酶切pMDlac-19T质粒，胶回收lacb乳糖酶基因片段。同时木霉表达质粒pTH载体也用KpnI和XbaI双酶切胶回收。用T4连接酶把双酶切产物即克隆基因(lacb)和表达载体(PTH)22℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌DH5α。转化子PCR验证，扩增条件为：94℃ 4min，94℃ 1min，63℃ 30s，72℃ 3.5min, 共30个循环，最后72℃ 10min，阳性克隆即含有完整乳糖酶DNA的重组载体pTH-lacb，质粒图谱如图1所示。

实施例3 原生质体转化

1、菌体培养

在PDA平板上小心地盖一层玻璃纸，并用玻璃棒铺平，在玻璃纸上涂100-200u活化的孢子悬液，涂布均匀，30℃培养约16h。

2、 原生质体制备

接种里氏木霉菌丝于PDA平板上生长4 天；切取直径约3cm的菌落置于约60ml YEG（0.5%酵母粉、1%葡萄糖）的液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有10-20ml裂解酶液（Sigma L1412）酶解2-3小时；取出酶解液，加入0.7M NaCl溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10 min；弃上清，加10-20 ml STC液（20%蔗糖，50mM Tris-Cl，50mM CaCl₂）悬浮，然后3000 rpm，离心10 min；加适量STC悬浮分装（150 μl/管，10⁸个/ml）。

3、转化与验证

取2μg pTH-lacb DNA加入到150μl原生质体中，接着加入500μl25%PEG轻轻混匀，室温静置25 min；然后分2-3次再加1ml 25%PEG，轻轻混匀，室温静置25min，把原生质体加到50 ml左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基（0.1%MgSO₄, 1%KH₂PO4, 0.6%(NH₄)₂SO₄, 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇, 0.35%琼脂糖），轻轻混匀后倒入含100μg/ml潮霉素下层基础培养基平板（2%葡萄糖，0.5%(NH4)₂SO₄, 1.5%KH₂PO₄, 0.06%MgSO₄, 0.06%CaCl₂，1.5%琼脂），28℃黑暗培养数天至转化子长出。

按照实施例1中的方法提取转化子基因组DNA为模板，利用引物扩增目的验证转化子。利用实施例1中引物进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，即经过上述两个PCR反应选育和验证阳性转化子。取含有重组质粒的转化子，接种于50mL MM培养基中，30℃，250rpm振荡培养120h后，离心收集上清进行SDS-PAGE分析。结果如图2所示，箭头所指处的蛋白即为重组表达的乳糖酶，说明米曲霉的乳糖酶基因获得了高效表达。将一株获得的工程菌命名为Trichoderma reesei ZHD-1，并于2012年11月27日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2012482。

实施例4酶学性质分析

1、酶活测定

酶活测定通过测定水解底物ONPG释放硝基酚的量进行。反应混合物包括0.5ml酶稀释液，2ml底物（邻硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷）溶液（pH4.5）。混合物在37℃水浴中准确反应15min,加入2.5mL10%碳酸钠溶液摇匀，冷却至室温用蒸馏水定容至25ml。释放的硝基酚通过测定A420光吸收值的方法定量。

乳糖酶活力单位定义：在37℃，PH4.5条件下，每分钟从浓度为2.96mg/ml的邻硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷溶液分解底物生成1umol硝基酚所需的酶量为1个酶活力单位（IU）

酶活计算公式

酶活力（u/ml或u/g）=x*25*n/0.5/15

X:用回归方程计算出相当的邻硝基苯酚的mM数

25：反应结束稀释后，体系总体积（ml）

15:待测酶液与底物的反应时间（min）

0.5:加入反应液的体积（ml）

n:酶液的稀释倍数

利用上述测定方法，本发明的里氏木霉工程菌ZHD-1摇瓶发酵上清液中乳糖酶酶活为231 U/ml，而进行20L发酵罐进行深层高密度发酵，则上清液中乳糖酶酶活可达2000U/ml。

上述结果表明，本发明构建的里氏木霉工程菌能高效表达米曲霉的乳糖酶基因。

2、重组表达的乳糖酶最适作用pH分析

实验所用缓冲液为pH2.0-8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液系列，底物为邻硝基苯酚。

用pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 、7.0、8.0的缓冲液进行稀释测定，在50℃条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线（图3）。如图3所示：重组表达的乳糖酶最适作用pH为5.0。

3、重组表达的乳糖酶最适作用温度分析

摇瓶发酵的乳糖酶上清分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，pH4.5条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线（图4）。如图4所示：重组表达的乳糖酶最适作用温度为50℃。

实施例5 乳糖酶对牛乳中乳糖的水解作用实验

取新鲜牛乳10L经过净乳机净乳，92-95度杀菌5分钟，冷却至40-50度。

实验组：取其中1L牛乳按10-15U/mL添加本发明的乳糖酶，保温搅拌2-3小时；

对照组：取其中1L牛乳，不加乳糖酶，仅保温搅拌2-3小时。

分别测定实验组和对照组牛乳中乳糖和葡萄糖的含量。其中，乳糖的测定按轻工部颁标准G B 5 4 1 3一8 5方法进行；葡萄糖的含量测定用葡萄糖氧化酶一过氧化物酶法测定。

结果显示如下表所示：

上述结果表明，本发明的重组表达的乳糖酶能高效水解牛乳中的乳糖，水解率达到70%，对于工业化生产低乳糖牛乳具有潜在的应用价值。

Claims (4)

1.一种乳糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.编码权利要求1所述的乳糖酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.一种里氏木霉工程菌，所述的工程菌携带有表达权利要求2所述乳糖酶基因的表达载体。

4.如权利要求3所述的木霉工程菌，其保藏编号为：CCTCC NO：M2012482。

Images