CN103361327A - 异源高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种异源高效分泌表达米黑根毛霉脂肪酶的重组毕赤酵母，上述重组毕赤酵母是通过采用分子生物学技术，引入编码米黑根毛霉脂肪酶自身前导肽的基因并优化目的基因的拷贝数，构建能在巴斯德毕赤酵母表达的载体来获得的。研究表明：自身前导肽的引入大幅度增加了目的脂肪酶的分泌量，含两个拷贝的脂肪酶基因（pro-rml）的毕赤酵母重组子酶活最高，且该脂肪酶Pro-RML具有较高的水解三酰甘油酯的活力。

Description

异源高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一株高效异源表达米黑根毛霉脂肪酶的菌株。 

背景技术

脂肪酶（EC3.1.1.3）是一类能够水解三酰甘油的酶，因其可以催化水解、酯化、转酯化、氨解以及酯类的逆向合成等多种反应，因而可以应用在食品、医药、化妆品、生物柴油等生产、生活中的很多方面。被称为第三大工业用酶。 

酶法与化学法相比，因其反应条件温和、副产物少以及具有环境友好性等特点，将逐步代替高能耗高污染的化学法。 

脂肪酶的应用主要包括，在食品工业中通过应用脂肪酶分解油脂释放出的短链脂肪酸及单甘脂来改进食品的风味、香味与质构，达到食品增香的目的；乳品工业中，脂肪酶作用于乳酯并产生脂肪酸，能赋予奶制品独特的风味；作为洗涤剂的添加剂：利用脂肪酶可以水解脂肪的能力，在洗衣粉配方中加入适量的碱性脂肪酶，并与碱性蛋白酶配伍成复合酶，不仅可以明显提高洗衣粉的去污力，而且对洗涤织物的保养，抗再污染等方面有显著效果；在造纸工业中：脂肪酶以除去纸浆中的“洽脂”于改善纸的加工过程；在皮革加工过程中，利用脂肪酶对脂肪作用或与蛋白酶混合使用，将皮革或皮毛紧密相连的残余脂肪和蛋白脱除，其脱脂效果可明显提高皮革的质量。目前有越来越多的微生物来源的脂肪酶被开发出来，因为其性质的不同而在不同领域中发挥着重大的作用。 

米黑根毛霉脂肪酶是一种1,3-位置专一性的脂肪酶，作用于三酰甘油的1位和3位酯键。在工业上也有十分广泛的应用，由于其特异 性比较强，可以与单双酰脂肪酶组合用于生物柴油的制备，效果很好。 

虽然在前期研究证明该酶具有特异性并已尝试应用到生物柴油的制备中，但由于酶活不高，导致该酶成本过高，限制了其应用。因此建立高效分泌表达体系，提高酶活水平，是亟待解决的问题。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明的一个目的是提供一种高效异源表达米黑根毛霉脂肪酶的重组毕赤酵母以及其制备脂肪酶的方法。 

本发明的另一个目的是提供一种可在上述毕赤酵母中分泌表达该脂肪酶的表达载体。 

本发明的再一个目的是上述方法制备的米黑根毛霉脂肪酶在水解三酰甘油及生物柴油制备中的应用。 

为实现以上目的，本发明首先提供了一种米黑根毛霉脂肪酶（Pro-RML），其的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明从米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）菌株中克隆到包含前导肽的1,3-位置专一性的脂肪酶（Pro-RML）基因pro-rml，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因全长为（1017）bp，分析表明，GC含量为（48.9）%，编码（339）个氨基酸组成的蛋白。由该基因编码的米黑根毛霉脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该蛋白大小45—66kDa，等电点预测为4.89（http://web.expasy.org/compute_pi/），活性中心是214位Ser,327位His,273位Asp。实验表明由该基因编码的脂肪酶具有较高的酶活。通过酶学性质测定，该酶的最适反应温度为35℃，最适反应pH值为6.0，在pH5～10条件下稳定。为便于表述，将该脂肪酶命名为Pro-RML。 

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的含自身前导肽的米黑根毛霉脂肪酶的氨基酸序列（SEQ ID No.2），在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第（25）位的（Pro）替换为（Ala）。 因此，本发明含前导肽的米黑根毛霉脂肪酶还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Pro-RML同等活性的由Pro-RML衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。 

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明含前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因还包括由SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码Pro-RML的核苷酸序列。 

将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达本发明Pro-RML的基因工程菌。 

上述重组载体转化的宿主细胞优选为巴斯德毕赤酵母X-33。 

在本发明实例中，通过将含前导肽的脂肪酶基因pro-rml插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA上构建得到含不同拷贝目的基因的表达载体pPICZαA-pro-rml，其质粒图谱如附图2所示。进一步，将含有不同拷贝数的目的基因的表达载体分别转到巴斯德毕赤酵母中并筛选获得含不同拷贝数目的基因的能够表达Pro-RML的基因工程菌。优选，所述基因工程菌中pro-rml的拷贝数为2 

据此，本发明提供利用上述重组菌制备上述Pro-RML的方法，其是通过培养上述含不同拷贝数目的基因的重组菌，经诱导表达获得脂肪酶Pro-RML。所述培养条件为28℃，初始pH为7，200rpm培养120-190小时。所述诱导条件为每24小时补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0%。 

本发明通过引入自身前导肽并优化目的基因的拷贝数，构建恰当的表达载体，得到一株能够高效异源表达脂肪酶的菌株（将其命名为Lipase GH2），本发明所得到的巴斯德毕赤酵母菌株使所述脂肪酶基 因得到高效分泌表达，表达的脂肪酶大部分分泌到细胞外，降低了分离纯化成本，而且表达效率较高，在摇瓶培养的条件下，以甲醇诱导培养时，胞外分泌酶量可达800mg/L，以橄榄油为底物，检测酶活可达1200U/ml。本发明为该酶的工业化应用奠定了基础。 

附图说明

图1是目的基因DNA酶切回收电泳图，泳道1为DNA标准分子量(kb):4.5,3.0,2.0,1.2,0.8,0.50.2;泳道2:目的基因DNA酶切回收1017bp片段（箭头所指）； 

图2是单拷贝表达质粒构建流程图； 

图3是多拷贝表达质粒双酶切电泳图，其中，泳道1为DNA标准分子量(kb):15,10,7.5,5,2.5,1,0.25；泳道2：单拷贝表达质粒pPICZαA-pro-rml经BglII和BamHI双酶切后的结果，箭头所指为表达框。泳道3：3拷贝表达质粒pPICZαA-3pro-rml经BglII和BamH I双酶切后的结果，箭头所指为表达框。泳道4：6拷贝表达质粒pPICZαA-6pro-rml经BglII和BamHI双酶切后的结果，箭头所指为表达框。泳道5为DNA标准分子量(kb):15,10,7.5,5,2.5,1,0.25。 

图4是含不同拷贝目的基因的巴斯德毕赤酵母菌株，摇瓶培养胞外酶活检测结果。 

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 

本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。所涉及的 酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆（第三版）》。引物合成及测序由英骏（Invitrogen）生物公司完成。 

实施例1米黑根毛霉cDNA的制备 

1.1米黑根毛霉总RNA的提取 

（1）取适量的米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）菌丝，滤纸吸干水分，液氮研磨，加入1mlTrizol试剂（Invitrogen），振荡器振荡5min,室温静置1min; 

（2）加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min; 

（3）4℃,12000rpm,15min; 

（4）吸取上清，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀30min; 

（5）4℃,12000rpm,15min; 

（6）倒掉上清，用1ml75%乙醇洗涤沉淀，7500rpm，4℃，5min; 

（7）重复（6）步骤一次； 

（8）倒掉上清，干燥10min; 

（9）加入适量的DEPC水溶解,得到总RNA; 

1.2米黑根毛霉cDNA第一链的制备 

反转录采用由Promega公司生产的反转录酶（MMLV）具体操作如下： 

25μl反应体系将以下成分加到一个无核酸酶的离心管中： 

95℃加热5min终止反应，冷冻保存。 

实施例2含前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因pro-rml的获得及表达质粒的构建 

2.1引物设计 

根据GenBank中rml基因的序列（GenBank登录号为A02536.1），设计合成了以下一对引物： 

FW（P1）：5’—CGGAATTCGTGCCAATCAAGAG—3’ 

REV（P2）：5’—TAGTCTAGAGTACAGAGGCCTGTG—3’ 

P1、P2两端分别设计有EcoRI和NotI酶切位点（见上述序列中斜体并有下划线的部分） 

2.2含前导肽的米黑根毛霉脂肪酶pro-rml的PCR扩增 

采用P1、P2引物，以上述制得的米黑根毛霉cDNA为模板，PCR反应体系为： 

反应条件为：95℃5min；5℃40s，60℃40s，72℃1min，循环30次；72℃10min；4℃2min。 

2.3从PCR反应产物中回收目的片段 

从PCR产物中纯化回收目的基因片段采用切胶过柱的方法，PCR反应产物经过琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯的照射下切下目的基因DNA，目的基因长度为1017bp（图1），按照DNA回收试剂盒说明书（购自天根公司，产品编号为DP209-02）的方法进行回收。 

2.4TA克隆 

将PCR回收产物连接到载体pMD18-T-Simple上（购自TaKaRa公司），连接反应按照TaKaRa公司所提供的试剂盒(CodeNo.D104A)说明书操作。 

2.5目的基因连接到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA（Invitrogen公司购买） 

2.5.1单拷贝表达质粒构建 

用限制性内切酶EcoRI和NotI分别对pMD18-T-pro-rml和pPICZαA进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4连接酶将其连接，得到表达质粒pPICZαA-pro-rml，构建流程图见附图2。 

表达质粒pPICZαA-pro-rml的检测结果见附图3的泳道2，结果表明外源片段(1017bp)和载体(3.5kb)大小均正确。将连接产物转化大肠杆菌DH5α（购自上海生工生物工程有限公司）。 

2.5.2多拷贝表达质粒构建 

将带有单拷贝pPICZαA-pro-rml进行BamHⅠ和BglⅡ双酶切，得到含有pro-rml片段的表达框；将pPICZαA-pro-rml进行BamHⅠ单酶切得到含有单拷贝pro-rml的pPICZαA载体片段;将上述表达框和载体片段连接即得到二拷贝的pPICZαA-2pro-rml载体。将pPICZαA-2pro-rml载体重复上述步骤，即可得到含有更高拷贝的pPICZαA载体。多拷贝表达质粒pPICZαA-pro-rml的检测结果见附图3。将这些载体分别转入大肠杆菌DH5α中进行扩增并PCR检测，送Invitrogen公司测序，结果表明目的基因pro-rml序列为SEQ ID NO.1所示的序列，其编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，单拷贝及多拷贝序列正确。 

实施例3含前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因pro-rml在巴斯德毕赤酵母X-33中的分泌表达 

3.1巴斯德毕赤酵母X-33（Invitrogen公司购买）电转化感受态细胞 的制备及其电击转化 

（1）挑取新鲜的单菌落于5mlYPD液体培养基中，于30℃，250rpm培养12-14小时； 

（2）以0.1％的接种量接种到含500mlYPD培养基的2L三角瓶中，于30℃，250rpm培养12-14小时，使其OD600＝1.3-1.5； 

（3）在4℃下1500rpm离心5分钟，收集细胞； 

（4）用500-250ml冰预冷的无菌水洗涤细胞两次； 

（5）用20ml冰预冷的1M山梨醇溶液洗涤细胞一次； 

（6）用1ml冰预冷的1M山梨醇溶液重悬细胞，至终体积为1.5ml左右，以80μl分装于小离心管； 

3.2巴斯德毕赤酵母酵母细胞的电击转化 

（1）将准备好的约100μg/μl的非线性化含0、1、2、3、6个拷贝目的基因的表达质粒约10μl，与80μl酵母感受态细胞混匀，在冰上放置约5分钟； 

（2）把混合了DNA的感受态细胞转入冰预冷的0.2cm的电转杯；在1.5千伏的电压下转化； 

（3）然后马上加入1ml冰预冷的1M山梨醇溶液于经转化的细胞中，把细胞混匀，转入1.5ml小离心管,30℃静止1-2h。 

（4）取50-200μl涂布于含有100μg/mlYPDS平板（酵母提取物1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%,山梨醇1M,琼脂2%,），于30℃培养2至3天观察结果。 

3.3含不同拷贝数的pro-rml基因的重组菌株的筛选 

3.3.1酵母菌落PCR法鉴定正确整合的转化子 

在平板上选到阳性菌落，以5’AOX1、3’AOX1为引物，利用酵母菌落PCR的方法进一步验证得到正确整合的转化子。 

引物序列为：5’AOX1：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′ 

3’AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′ 

模板的处理方法： 

（1）用无菌的吸头挑取菌落少许，溶解到50μl的D2-Buffer（1L：异硫氰酸胍472.64g,1mol/LpH8.0Tris·HCl缓冲液50ml,β-巯基乙醇7ml）中混匀； 

（2）将混合液于100℃沸水浴5min； 

（3）12000rpm，离心30s，弃上清； 

（4）用无菌水洗涤沉淀2次； 

（5）将沉淀溶于20μl的ddH₂O，95℃作用5min； 

（6）离心后得到上清液即为模板。 

PCR反应体系： 

反应条件：95℃5min；95℃40s，60℃40s，72℃1min30s，30cycles；72℃10min。 

3.3.2采用qPCR法确定不同菌株的拷贝数 

用TIANGEN酵母基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Yeast DNA Kit,货号：DP307-02)提取筛选得到的毕赤酵母重组子的的基因组，用只含有一个拷贝pro-rml的重组子的基因组为模板，选取甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gap)为内参基因，将模板进行不同浓度的稀释,qPCR检测，分别得到目的基因pro-rml和内参基因gap的模板量的log值与Ct值之间的标准曲线。将未知样品的目的基因的Ct(pro-rml)和内参基因Ct(gap)代入公式得到目的基因和内参基因的模板量pro-rml(copy quantity)和gap(copy quantity)。拷贝数计算公式为： 

3.4巴斯德毕赤酵母中目的脂肪酶的表达 

NaOH滴定法测定脂肪酶酶活 

（1）0.05MNaOH的配置：先用无CO₂水配置5M的NaOH储液；再准确稀释50倍后，称取100℃烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾0.38g，溶于80ml无CO₂水中，标定出其准确浓度，再推算出储液浓度；0.05M的NaOH溶液以无CO₂水用储液现用现配； 

（2）PVA－橄榄油乳化液底物的配置：将橄榄油100ml,300ml2％PVA1750（聚乙烯醇）混合，加热溶化，用超声波乳化，功率300W，超声3s，间歇5s，99次，循环2次； 

（3）取5ml乳化液底物，4ml0.1MpH6.0的磷酸钠-柠檬酸缓冲液加入到150ml三角瓶中，置于恒温水浴摇床35℃，150rpm温育5min； 

（4）取1ml适当稀释的酶液加入到底物和缓冲液中，35℃150rpm反应10min后加入15ml无水乙醇终止反应； 

（5）滴加4滴酚酞作指示剂，用0.05MNaOH滴定酶解产生的脂肪酸，至反应液变粉红色停止； 

空白操作与上述一致，只是将发酵液与无水乙醇混合反应10min后加入到底物和缓冲液中。 

酶活定义为在该测定条件下，1min释放1μmol脂肪酸的酶量为一个酶活单位。 

挑取含有不同拷贝数的巴斯德毕赤酵母阳性转化子单菌落，接种于25mlBMGY培养基（1%酵母粉,2%蛋白胨,1%甘油），于28℃，200rpm摇床培养至OD₆₀₀为4.0-8.0左右，转接到装有50mlBMMY培养基（1%酵母粉,2%蛋白胨,1.0%甲醇，100mmol/l磷酸缓冲 液，pH7.0）的500ml三角瓶中，相同培养条件继续培养，每24小时补加100％甲醇于培养基至终浓度为1.0%，诱导表达6天。每隔一定的时间取样，测量其细胞密度（OD₆₀₀）和胞外的米黑根毛霉脂肪酶的酶活。 

检测结果如附图4所示，在BMMY培养基（初始pH为7.0，培养温度为28℃）摇瓶培养的条件下120小时，含两个拷贝pro-rml基因的巴斯德毕赤酵母重组子酶活达到最高1200U/ml。 

实施例4米黑根毛霉脂肪酶的应用 

1）用于水解三酰甘油酯 

以7g豆油为底物，加入2ml1200U/ml的Pro-RML毕赤酵母工程菌发酵液，在35℃水浴，180转/分振荡下，反应24小时，豆油的水解率可达44.4%。 

2）用于合成生物柴油 

以7g油酸为底物，加入2ml800U/ml的Pro-RML毕赤酵母工程菌发酵液，在35℃水浴，180转/分振荡下，反应24小时，生物柴油的转化率可达83.7%。 

Claims (10)

1.含自身前导肽的米黑根毛霉脂肪酶Pro-RML，其氨基酸序列为：

a）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

b）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述米黑根毛霉脂肪酶Pro-RML的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其为pPICZαA-pro-rml或pPICZαA-2pro-rml。

6.权利要求4或5所述的重组载体转化的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其为巴斯德毕赤酵母X-33。

8.一种制备含自身前导肽的米黑根毛霉脂肪酶Pro-RML的方法，其通过培养权利要求6或7所述的宿主细胞，诱导含前导肽的脂肪酶表达获得含前导肽的米黑根毛霉脂肪酶Pro-RML。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养条件为28℃，初始pH为7.0，200rpm培养120-190小时；诱导条件为每24小时补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0％。

10.权利要求1所述含自身前导肽的米黑根毛霉脂肪酶Pro-RML在水解三酰甘油及生物柴油制备中的应用。

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