CN108192885A - 一种提高米曲霉脂肪酶异源表达的方法 - Google Patents

一种提高米曲霉脂肪酶异源表达的方法 Download PDF

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CN108192885A CN201711492981.6A CN201711492981A CN108192885A CN 108192885 A CN108192885 A CN 108192885A CN 201711492981 A CN201711492981 A CN 201711492981A CN 108192885 A CN108192885 A CN 108192885A
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汪钊
黄丽娟
章银军
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Abstract

本发明公开了一种提高米曲霉脂肪酶异源表达的方法，所述方法是将米曲霉脂肪酶基因导入毕赤酵母中获得重组毕赤酵母基因工程菌，将重组酵母基因工程菌进行发酵培养，将发酵液分离提取，获得米曲霉脂肪酶。重组毕赤酵母工程菌的胞外表达的米曲霉脂肪酶可以应用于高效催化制备手性APP类除草剂的关键中间体R‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸乙酯((R)‑EHPP)和R‑2‑苯氧基丙酸乙酯。

Description

一种提高米曲霉脂肪酶异源表达的方法
(一)技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组毕赤酵母异源表达米曲霉脂肪酶的方法及其应用。
(二)背景技术
脂肪酶(EC 3.1.1.3)属于ɑ/β水解酶家族，它能催化水解、酯化、酯交换等多种反应，在食品、洗涤、制革、饲料、制药等领域应用广泛。脂肪酶的来源主要有动物、植物和微生物，其中微生物来源的脂肪酶具有催化活性多样性、稳定性好、高产量、可批量生产等优点，因此微生物来源的脂肪酶应用更广泛。据估计，细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其他真菌23个属的微生物均可产脂肪酶。来源于洋葱伯克霍尔德菌、荧光假丝单胞菌、米黑根毛霉、疏棉状嗜热丝孢菌、皱褶假丝酵母和南极假丝酵母的脂肪酶是目前常见的商品脂肪酶。
米曲霉来源的基因在酵母里表达，目前国内外主要研究的是米曲霉糖苷酶和蛋白酶基因在酵母里的表达，对米曲霉脂肪酶基因的研究比较少。日本Jinichi Toida研究组对米曲霉脂肪酶的酶结构、性质和编码基因方面进行了较为深入的研究，研究的比较多的是L1(cutinase)、L2(mono-and diacylglycerol lipase)和L3(triacylglycerol lipase)。本课题组前期通过大量产脂肪酶微生物的筛选，获得高脂肪酶活性的米曲霉菌株WZ007，对其进行微生物菌种诱变改造、产酶条件和酶学性质等系统研究，并成功应用于生物素手性中间体内酯、R-硫辛酸和手性农药中间体R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯((R)-EHPP)的高效拆分制备与短链香料酯催化合成等反应中。
当前我国使用的手性农药约占总农药的40％左右，各国的农药工作者也都十分关注和重视光学活性农药的研究。APP类除草剂是具有高药效的单一异构体典型代表，在手性农药中占有相当大的比例。目前，合成这种手性中间体的方法主要是化学合成法，但反应条件苛刻、环境污染大、纯度不高。生物酶法能够克服化学法合成的一些合成的不足，本课题组前期成功利用米曲霉WZ007冻干菌粉生物制备(R)-EHPP的光学纯度达到99.0％以上。因此，构建一种成熟的异源分泌表达系统，使米曲霉脂肪酶基因能够得到高效表达具有很大的现实意义和发展前景。
目前，脂肪酶的生产主要采用异源蛋白表达的策略。异源蛋白表达时的影响因素有很多，主要分为两大类：外因和内因。外因有培养基、培养条件等；内因有基因密码子偏爱性，基因拷贝数、载体的性能等。巴斯德毕赤酵母表达系统是一种成熟高效的真核表达系统，它不仅具有原核表达系统繁殖迅速、费用低廉及操作方便的特点，还具有真核表达系统能对表达的目的蛋白进行正确加工、折叠及适度糖基化的优点，由于对营养要求低，培养基成份简单廉价，可进行高密度高产量的发酵培养，满足工业化生产的需求。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种重组毕赤酵母高效分泌米曲霉脂肪酶的方法及其应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
本发明提供一种提高米曲霉脂肪酶异源表达的方法，所述方法是将米曲霉脂肪酶基因导入毕赤酵母中获得重组毕赤酵母基因工程菌，将重组酵母基因工程菌进行发酵培养，将发酵液分离提取，获得米曲霉脂肪酶。
进一步，所述米曲霉脂肪酶基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33。
进一步，所述重组毕赤酵母基因工程菌的制备方法为：将米曲霉脂肪酶基因插入表达载体pPICZɑA，构建表达质粒AOL-pPICZɑA；将表达质粒AOL-pPICZɑA导入毕赤酵母中，通过抗性梯度筛选获得能够表达米曲霉脂肪酶基因的重组毕赤酵母基因工程菌。
进一步，所述表达质粒AOL-pPICZɑA的构建是将米曲霉脂肪酶基因插入pPICZɑA载体EcoR I和Kpn酶切位点之间所得。
进一步，所述发酵培养方法为：将重组毕赤酵母基因工程菌接种至BMMY发酵培养基，在30℃，初始pH为6.0，200rpm条件下进行发酵培养，每隔24h补加体积终浓度为1.0％甲醇进行诱导，发酵培养结束后，将发酵液离心，收集上清液，得到含有米曲霉脂肪酶的粗酶液；BMMY发酵培养基终浓度组成为：酵母粉1％、蛋白胨2％、0.1mol/L pH6.0磷酸钾缓冲液、无氨基酵母氮源1.34％、生物素4×10-5％、甲醇0.5％，溶剂为去离子水，pH为6.0。
所述重组酵母基因工程菌在发酵培养前先进行活化和扩大培养，然后将扩大培养液以体积浓度1-2％的接种量接种至BMMY发酵培养基，所述活化培养为：将重组毕赤酵母基因工程菌接种至YPD培养基，在30℃培养1d，获得活化菌体；所述YPD培养基质量终浓度组成为：1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖，溶剂为去离子水，pH值自然；所述扩大培养是将活化菌体接种至BMGY培养基，在30℃培养1d，获得扩大培养液；所述BMGY培养基质量终浓度组成为：酵母粉1％、蛋白胨2％、0.1mol/L pH6.0磷酸钾缓冲液、无氨基酵母氮源1.34％、生物素4×10-5％、甘油1％，溶剂为去离子水，pH为6.0。
本发明通过前人在实验室通过大量产脂肪酶微生物的筛选，获得高脂肪酶活性的米曲霉菌株WZ007中获取脂肪酶基因，经过密码子优化后，在巴斯德毕赤酵母X-33中进行胞外表达，经过初筛和复筛得到最佳重组菌株。其中，米曲霉脂肪酶基因的密码子优化方法为：根据巴斯德毕赤酵母密码子的偏好，利用Codon Optimization By Generalbiol软件进行密码子优化，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因全长(762)bp，编码(254)个氨基酸组成的蛋白。
胞外表达的方法为：(1)经过密码子优化的米曲霉脂肪酶基因与载体pPICZɑA连接，得到携带目的基因的重组质粒。(2)将重组质粒转化E.coliDH5ɑ，筛选阳性克隆。(3)提取重组质粒转入毕赤酵母X-33，经初筛和复筛后得到重组菌株。(3)重组菌株在YPD培养基中过夜培养，转接到BMGY扩大培养基中培养，离心弃上清，用BMMY发酵培养基重悬，转接到BMMY培养基中培养，在30℃、200rpm培养144h，其中每24h补加1.0％的甲醇进行诱导，重组脂肪酶得到表达。
本发明还涉及所述的胞外表达的米曲霉脂肪酶在催化合成手性APP类除草剂的关键中间体R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯和R-2-苯氧基丙酸乙酯中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明通过将米曲霉脂肪酶在毕赤酵母中表达，获得一株高效分泌米曲霉脂肪酶的重组毕赤酵母菌株，发酵144h时，胞外酶活为1300U/ml。毕赤酵母工程菌表达的米曲霉脂肪酶为胞外酶，省去了米曲霉WZ007原始菌株发酵后破碎细胞的工作，而且酶蛋白的表达量是原先的20倍以上。在催化合成手性APP类除草剂的关键中间体R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯((R)-EHPP)中的应用中，在3h内(R)-EHPP产率达到99％以上。
(四)附图说明
图1：目的基因aol PCR产物，泳道M：DNA标准分子量(Kb)；泳道1：目的基因aol片段；
图2：重组质粒AOL-pPICZɑA及双酶切电泳图，泳道M：DNA标准分子量(Kb)；泳道1：重组质粒AOL-pPICZɑA；泳道2：重组质粒经EcoR I和Kpn双酶切后结果，箭头所指为目的基因aol片段；
图3：米曲霉脂肪酶SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白标准分子量(KDa)；泳道1：甲醇诱导144h后上清液；泳道2：甲醇诱导前上清液。
(五)具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，旨在帮助阅读者理解本发明的实质，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1 AOL-pPICZɑA质粒的构建
1、引物设计
根据GenBank中米曲霉(Aspergillus oryzae，中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M206105，已在专利申请ZL200610154832.4和CN201610527146.0公开)WZ007的AOL基因的序列(GenBank登录号为KP975533)，经密码子优化后，设计合成了以下一对引物：
FW(L1)：CCGGAATTCCATTTAGCAATAAAATCATTGTTCG(SEQ ID No.2)；
REV(L2)：
CGGGGTACCGATTAGTTAGCAGCTGCCACAGCGAAC(SEQID No.3)。
L1，L2两端分别设计有EcoR I和Kpn酶切位点(见上述序列中下划线部分)
2、目的基因aol的PCR扩增
采用L1、L2引物，以委托南京基诺美生物科技有限公司合成的AOL-PUC57质粒为模板，PCR反应体系为：
反应条件为：98℃2min，98℃10s，60℃5s，72℃1min，循环30次，72℃2min，琼脂糖凝胶电泳检测图见图1。
3、载体pPICZɑA和目的基因的双酶切
用限制性内切酶EcoR I和Kpn分别对目的基因aol和载体pPICZɑA进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4连接酶将其连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ(购自TaKara公司)，在含zeocin抗性平板上筛选阳性克隆，并PCR检测，送TsingKe公司测序，测序结果显示目的基因序列(基因aol的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)正确。双酶切检测图见图2。
4、线性化质粒的制备
重组AOL-PPICZɑA质粒的提取参考Takarag公司高纯度质粒小提试剂盒的使用说明书。用限制性内切酶Sac I对重组质粒进行单酶切，酶切反应体系为：
反应条件为：37℃反应4h，用纯化试剂盒对酶切产物进行纯化，用微量核酸定量仪对线性化质粒的纯度和浓度进行测定，获得线性化质粒AOL-PPICZɑA。
实施例2aol基因的毕赤酵母重组菌株筛选
1、巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)X-33(购自Invitrogen公司)电转化感受态细胞的制备及其电击转化：
(1)挑取新鲜的巴斯德毕赤酵母X-33单菌落于5ml YPD液体培养基中，于30℃，200rpm过夜培养；YPD液体培养基质量组成为：酵母粉1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％，溶剂为去离子水，pH值自然。
(2)取步骤(1)适量接种到50ml YPD培养基中，使初始OD600为0.1，于30℃，200rpm培养10-14小时，使其OD600＝0.8-1.0；
(3)取步骤(2)30ml培养液于50ml离心管中，4℃，3000rpm，离心5min，收集细胞；
(4)步骤(3)细胞用35ml、4℃冰预冷的无菌水洗涤两次；
(5)步骤(4)细胞全部转移至25ml、4℃冰预冷的YPD液体培养基，加入500μl、1M的DTT，于30℃，200rpm培养1小时，4℃，3000rpm，离心5min，收集细胞。
(6)步骤(5)细胞用25ml、4℃冰预冷的1M山梨醇水溶液洗涤1次；
(7)步骤(6)细胞用1ml、4℃冰预冷的1M山梨醇水溶液重悬细胞，得到该状态下的细胞的即为酵母感受态细胞，以80μl每管分装于1.5ml灭菌离心管中。
2、巴斯德毕赤酵母细胞的电击转化
(1)将实施例1准备好的10μl的线性化质粒AOL-pPICZɑA(约100ng/μl)，与80μl酵母感受态细胞混合，冰浴5min；
(2)把混合物转入4℃预冷的0.2cm的电转杯中；
(3)按电压1.5KV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间5ms的条件进行电击转化；
(4)立即加入1ml 1M山梨醇水溶液混匀，将转化液转入1.5ml离心管中，于30℃静置孵育1h；
(5)取200μl涂布于含200μg/ml zeocin YPDS平板，于30℃培养2-3天观察结果。YPDS平板质量终浓度组成：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，山梨醇1M，琼脂粉2％，溶剂为去离子水，pH值自然。
3、含aol基因的重组菌株的筛选
(1)将200μg/ml zeocin YPDS平板上长出来的单菌落逐次转移到含500，1000，2000μg/ml zeocin的YPDS平板上进行抗性梯度筛选阳性重组菌株；
(2)将含2000μg/ml zeocin的YPDS平板上筛选到的菌落转移到橄榄油罗丹明B显色平板(质量终浓度组成：1.34％YNB，0.5％甲醇，4×10-5％生物素，1％橄榄油，0.001％罗丹明B，2％琼脂，溶剂为蒸馏水，pH7.5-8.5)，每块平板每隔24h添加200μl甲醇进行诱导，培养一周后，选择产生透明圈大的一株重组菌株进行后续试验研究；
(3)酵母基因组PCR法验证步骤(2)中筛选到的重组菌株中目的基因是否正确整合，酵母基因组的提取按Ezup柱式酵母组DNA抽提试剂盒(购自上海生工公司)说明进行操作。以酵母基因组为模板，以5’AOX1、3’AOX1为引物，进行PCR方法验证。引物序列为：
5’AOX1：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’(SEQ ID No.4)
3’AOX1：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’(SEQ ID No.5)
PCR反应体系为：
反应条件为：98℃2min，98℃10s，60℃5s，72℃1min，循环30次，72℃2min。
实施例3巴斯德毕赤酵母中AOL脂肪酶的表达
1、将实施例2筛选获得的一株分泌表达米曲霉脂肪酶的重组毕赤酵母菌株接种至BMMY发酵培养基，在30℃、200rpm培养144h，其中每24h补加体积终浓度为1.0％的甲醇进行诱导，得到的发酵液即为粗酶液，酶活为1300U/ml。BMMY发酵培养基质量终浓度组成为：酵母粉1％、蛋白胨2％、0.1mol/L pH6.0磷酸钾缓冲液、无氨基酵母氮源1.34％、生物素4×10-5％、甲醇0.5％，溶剂为去离子水，pH为6.0。
2、脂肪酶分子量的确定：发酵液上清与蛋白上样缓冲液结合，进行SDS-PAGE电泳检测，电泳图见图3，目的蛋白条带大小为29KDa。
3、p-NPA法测定脂肪酶酶活：向2.8ml 50mM pH 7.0磷酸盐缓冲液加入0.1ml p-NPA(30mM)于40℃预热4min，向其中加入0.1ml步骤1中的粗酶液，40℃水浴反应3min后，用1ml无水乙醇终止反应；空白操作用灭活酶液代替粗酶液，与上述操作一致；酶活定义：在该测定条件下，每分钟催化产生1μmol脂肪酸所需要酶量定义为1U。
实施例4酶液
(1)将实施例3重组毕赤酵母基因工程菌接种至YPD培养基，在30℃培养1d，获得活化菌体；所述YPD培养基质量终浓度组成为：1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖，溶剂为去离子水，pH值自然；
(2)将活化菌体接种至BMGY培养基，在30℃培养1d，获得扩大培养液；所述BMGY培养基质量终浓度组成为：酵母粉1％、蛋白胨2％、0.1mol/L pH6.0磷酸钾缓冲液、无氨基酵母氮源1.34％、生物素4×10-5％、甘油1％，溶剂为去离子水，pH为6.0。
(3)将步骤(2)扩大培养液以体积浓度2％接种至BMMY发酵培养基，在30℃、200rpm培养144h，其中每24h补加体积终浓度为1.0％的甲醇进行诱导，获得的发酵液即为粗酶液，发酵液的酶活为1300U/ml。BMMY发酵培养基质量终浓度组成为：酵母粉1％、蛋白胨2％、0.1mol/L pH6.0磷酸钾缓冲液、无氨基酵母氮源1.34％、生物素4×10-5％、甲醇0.5％，溶剂为去离子水，pH为6.0。
实施例5巴斯德毕赤酵母表达的AOL脂肪酶制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯
利用实施例4表达的米曲霉脂肪酶催化合成手性APP类除草剂的关键中间体R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯((R)-EHPP)，在含20ml蒸馏水的50ml三口烧瓶中加入0.5g(R,S)-EHPP、100μl实施例4中制备的粗酶液，在pH 7.0、35℃条件下反应3h，利用等体积乙酸乙酯萃取两次，(R)-EHPP e.e.值为99.5％，收率达到99％以上。以米曲霉(Aspergillusoryzae)WZ007野生菌整细胞催化相同反应，(R)-EHPP收率仅为90％，e.e.值为99.2％。
实施例6巴斯德毕赤酵母表达的AOL脂肪酶制备R-2-苯氧基丙酸乙酯
利用实施例4表达的米曲霉脂肪酶催化合成手性APP类除草剂的关键中间体R-2-苯氧基丙酸乙酯，在含20ml蒸馏水的50ml三口烧瓶中加入0.5g R-2-苯氧基丙酸乙酯、100μl实施例4中制备的粗酶液，在pH7.0、35℃条件下反应3h。利用等体积乙酸乙酯萃取两次，R-2-苯氧基丙酸乙酯e.e.值为99.5％，收率达到99％以上。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种提高米曲霉脂肪酶异源表达的方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 762
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
catttagcaa taaaatcatt gttcgtcagt cttcttggcg caagtgtttt ggcatctcct 60
cttccctcaa atgcattggt tgaacgtaac gcaccattaa atgagttctt gtctgcattg 120
ttatcccatc tacccgcaat tgatggaacc attgatgccg tgagtggagt gataacggac 180
tttgaccaat tgttggccga tttgacgggt gctaggacta ctcaaaacgg ctatattggt 240
gtgtgcacgg actacaccgt gctattcgcc aggggtactt ccgagcctgg caacgtaggt 300
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gcagccggat ctaaaagtat ggcctccctg gcaggagagg tactttccaa atgtccagat 480
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gtaccaggtg cagtgcagtt cgctgtggca gctgctaact aa 762
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
ccggaattcc atttagcaat aaaatcattg ttcg 34
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
cggggtaccg attagttagc agctgccaca gcgaac 36
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
gactggttcc aattgacaag c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims (7)

1.一种提高米曲霉脂肪酶异源表达的方法，其特征在于所述方法是将米曲霉脂肪酶基因导入毕赤酵母中获得重组毕赤酵母基因工程菌，将重组酵母基因工程菌进行发酵培养，将发酵液分离提取，获得米曲霉脂肪酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述米曲霉脂肪酶基因核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)X-33。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组毕赤酵母基因工程菌的制备方法为：将米曲霉脂肪酶基因插入表达载体pPICZɑA，构建表达质粒AOL-pPICZɑA；将表达质粒AOL-pPICZɑA导入毕赤酵母中，通过抗性梯度筛选获得能够表达米曲霉脂肪酶基因的重组毕赤酵母基因工程菌。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述表达质粒AOL-pPICZɑA的构建是将米曲霉脂肪酶基因插入pPICZɑA载体EcoR I和Kpn酶切位点之间所得。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养方法为：将重组毕赤酵母基因工程菌接种至BMMY发酵培养基，在30℃，初始pH为6.0，200rpm条件下进行发酵培养，每隔24h补加体积终浓度为1.0％甲醇进行诱导，发酵培养结束后，将发酵液离心，收集上清液，得到含有米曲霉脂肪酶的粗酶液；所述BMMY发酵培养基质量终浓度组成为：酵母粉1％、蛋白胨2％、0.1mol/L pH6.0磷酸钾缓冲液、无氨基酵母氮源1.34％、生物素4×10-5％、甲醇0.5％，溶剂为去离子水，pH为6.0。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组酵母基因工程菌在发酵培养前先进行活化和扩大培养，然后将扩大培养液以体积浓度1～2％的接种量接种至BMMY发酵培养基，所述活化培养为：将重组毕赤酵母基因工程菌接种至YPD培养基，在30℃培养1d，获得活化菌体；所述YPD培养基质量终浓度组成为：1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖，溶剂为去离子水，pH值自然；所述扩大培养是将活化菌体接种至BMGY培养基，在30℃培养1d，获得扩大培养液；所述BMGY培养基质量终浓度组成为：酵母粉1％、蛋白胨2％、0.1mol/L pH6.0磷酸钾缓冲液、无氨基酵母氮源1.34％、生物素4×10-5％、甘油1％，溶剂为去离子水，pH为6.0。
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