CN106754448A - 一种重组酵母菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种重组酵母菌株及其应用。本发明所述重组酵母菌株为发酵生产香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇中一种或两种以上产物的酵母菌株，并且敲除YPL062W基因。本发明发掘了酵母中YPL062W基因的具体生物学功能，通过敲除该基因可显著提高相应发酵酵母菌株在香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇和脂肪酸产量，可作为一种优化酵母底盘细胞的新途径，应用于微生物发酵领域。

Description

一种重组酵母菌株及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组酵母菌株及其应用。
背景技术
香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸以及酵母固醇具有重要的药用价值和经济价值，然而由于植物资源稀缺、活性物质含量低、化学合成难度大等因素，限制了这些物质在医药等领域中的广泛应用。
合成生物细胞工厂针对宿主细胞(微生物等)和目标生物合成路径进行有目标地改造产生直接效益，能够降低生产成本、缩短生产周期，因此运用合成生物细胞工厂高效生产上述化合物，具有十分广阔的应用前景。酿酒酵母是公认安全的模式微生物，它生长周期短且容易高密度培养，可作食用、药用酵母，是上述物质合成的非常优秀的宿主。
目前合成生物细胞工厂存在的关键科学问题是宿主细胞与异源生物合成路径间的适配。一方面异源生物合成路径本身的代谢通量决定目标产物的产量，因此需要优化异源路径，包括优化异源基因的表达、基因来源的筛选、胞内前体物质供给等；另一方面来自宿主细胞固有的代谢和调控系统也会影响目标生物合成路径的生产能力，这就需要对底盘细胞进行深入系统的优化。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组酵母菌株，使得所述酵母菌株能够显著提高香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸以及酵母固醇的产量，同时提供该菌株的应用和发酵方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种重组酵母菌株，所述酵母菌株为发酵生产香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇中一种或两种以上产物的酵母菌株，并且敲除YPL062W基因。
本发明通过研究发现，生产香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇产物的酵母菌株中YPL062W基因，能够影响目标产物的产量，通过敲除该基因，相对于未敲除菌株能够显著提高目标产物的产量。
在本发明具体实施方式中，本发明分别以发酵生产香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇的酵母菌株进行摇瓶发酵试验，为了能够发酵生产目标产物，各酵母菌株需要引入一些必须的外源基因元件。其中，所述发酵生产香叶醇的酵母菌株包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母trp1位点上游同源序列、GAL1启动子、香叶醇合成酶编码基因GES、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段1，示意图见图1，香叶醇合成酶编码基因GES优选为来源于长春花(Catharanthusroseus)；
酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2，示意图见图2。
所述发酵生产青蒿二烯的酵母菌株包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2；
酵母trp1位点上游同源序列、GAL1启动子、青蒿二烯合成酶编码基因ADS、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段3，示意图见图3，青蒿二烯合成酶编码基因ADS优选为来源于青蒿(Artemisiaannua)。
所述发酵生产香叶基香叶醇的酵母菌株包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、香叶基香叶醇合成酶编码基因GGPPS、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段4，示意图见图4，香叶基香叶醇合成酶编码基因GGPPS优选为来源于曼地亚红豆杉(Taxus x media)。
所述发酵生产酵母固醇的酵母菌株包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2。
所述发酵生产脂肪酸的酵母菌株无需引入外源基因元件即可自行发酵生产。如果需要同时发酵生产上述多种目标产物，按照需要引入的基因片段逐一引入即可。上述各基因元件、同源序列等均以酿酒酵母菌株BY4741的基因组为模板，设计并合成合适的引物，通过PCR扩增得到，具体可参照专利CN105087406A中的记载；异源基因均为经过密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点后通过人工合成得到，其中来源于长春花(Catharanthusroseus)的香叶醇合成酶编码基因GES序列如SEQ ID NO:1所示，来源于青蒿(Artemisiaannua)的青蒿二烯合成酶编码基因ADS如SEQ ID NO:2所示，来源于曼地亚红豆杉(Taxus x media)的香叶基香叶醇合成酶编码基因GGPPS如SEQ IDNO:2所示。
在本发明具体实施方式中，所述酵母菌株为酿酒酵母菌株；所述酿酒酵母菌株可选择为CEN.PK系列酿酒酵母或BY系列酿酒酵母；其中，所述CEN.PK系列酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1C或酿酒酵母CEN.PK2-1D。
摇瓶发酵试验显示，香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇，相对于未敲除YPL062W基因的对照菌株，敲除了YPL062W基因的菌株在香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、酵母固醇产量上依次提高了0.9倍、0.68倍、1.12倍和0.69倍，而脂肪酸产量中C16:0饱和脂肪酸和C16:1不饱和脂肪酸得到显著性提高。基于这些优异的技术效果，本发明提供了所述酵母菌株在发酵生产香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇中一种或两种以上产物中的应用。
同时，本发明提供了所述重组酿酒酵母发酵生产目标产物的方法，将本发明所述重组酵母菌株接种到种子培养基中活化至对数生长中期，然后转接到发酵培养基中发酵生产香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇中一种或两种以上产物。
更为具体，所述方法将本发明所述重组酵母菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD600＝0.2转接于新鲜的25mL种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养至对数生长中期，以初始菌体浓度OD600＝0.5分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养，发酵生产香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇中一种或两种以上产物。
其中，所述种子培养基包括20g/L或40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨以及10g/L酵母浸粉；所述发酵培养基包括20g/L或40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉以及10g/L D-半乳糖。
由以上技术方案可知，本发明发掘了酵母中YPL062W基因的具体生物学功能，通过敲除该基因可显著提高相应发酵酵母菌株在香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇和脂肪酸产量，可作为一种优化酵母底盘细胞的新途径，应用于微生物发酵领域。
附图说明
图1所示为基因片段1的基因元件模式图；其中，两端TRP1LHA、TRP1RHA分别表示酵母trp1位点上、下游同源序列；
图2所示为基因片段2的基因元件模式图；其中，两端LEU2LHA、LEU2RHA分别表示酵母leu2位点上、下游同源序列；
图3所示为基因片段3的基因元件模式图；其中，两端TRP1LHA、TRP1RHA分别表示酵母trp1位点上、下游同源序列；
图4所示为基因片段4的基因元件模式图；其中，两端LEU2LHA、LEU2RHA分别表示酵母leu2位点上、下游同源序列；
图5所示为香叶醇产量柱形图；其中，纵坐标表示香叶醇，横坐标control表示未敲除YPL062W基因的菌株，△ypl062w表示敲除YPL062W基因的菌株，△/C表示△ypl062w产量/control产量；
图6所示为香叶基香叶醇产量柱形图；其中，纵坐标表示香叶基香叶醇，横坐标control表示未敲除YPL062W基因的菌株，△ypl062w表示敲除YPL062W基因的菌株，△/C表示产量提高倍数；
图7所示为青蒿二烯产量柱形图；其中，纵坐标表示青蒿二烯，横坐标control表示未敲除YPL062W基因的菌株，△ypl062w表示敲除YPL062W基因的菌株，△/C表示产量提高倍数；
图8所示为酵母固醇产量柱形图；其中，纵坐标表示酵母固醇，横坐标control表示未敲除YPL062W基因的菌株，△ypl062w表示敲除YPL062W基因的菌株，△/C表示产量提高倍数；
图9表示脂肪酸产量柱形图；其中，纵坐标表示脂肪酸，横坐标每个时间点的柱形从左至右依次表示未敲除YPL062W基因的菌株C16:0饱和脂肪酸产量、敲除YPL062W基因的菌株C16:0饱和脂肪酸产量、未敲除YPL062W基因的菌株C16:1不饱和脂肪酸产量、敲除YPL062W基因的菌株C16:1不饱和脂肪酸产量、未敲除YPL062W基因的菌株C18:0饱和脂肪酸产量、敲除YPL062W基因的菌株C18:0饱和脂肪酸产量、未敲除YPL062W基因的菌株C18:1不饱和脂肪酸产量、敲除YPL062W基因的菌株C18:1不饱和脂肪酸产量；*，p＜0.05；**，p＜0.01。
具体实施方式
本发明公开了一种重组酵母菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述菌株、方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的菌株、方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，为了便于摇瓶发酵试验的进行，本发明采用了酿酒酵母CEN.PK2-1C和酿酒酵母CEN.PK2-1D，此两种酿酒酵母为四重营养缺陷型(亮氨酸、色氨酸、组氨酸、尿嘧啶)酿酒酵母，利于筛选正确菌株，同时为了保证酿酒酵母不消耗诱导剂半乳糖，本发明敲除了酿酒酵母中的gal1、gal7和gal10三个基因，上述的这些对酵母的改动只是为了方便验证试验的进行，对最终效果的实现无影响。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：YPL062W基因的敲除对香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇和脂肪酸产量的影响
1、试验菌株的构建
脂肪酸生产菌株：
参照专利CN105087406A中的记载，敲除酿酒酵母CEN.PK2-1C中gal1、gal7、gal10三个基因，构建得到重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc0014C011(SyBE_Sc0014C012的对照菌株)；
参照专利CN105087406A中的记载，敲除酿酒酵母CEN.PK2-1C中gal1、gal7、gal10、YPL062W四个基因，构建得到重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc0014C012；
香叶醇生产菌株：
在菌株SyBE_Sc0014C011基础上整合基因片段1和基因片段2，得到菌株SyBE_Sc0014C011_Mo；
在菌株SyBE_Sc0014C012基础上整合基因片段1和基因片段2，得到菌株SyBE_Sc0014C012_Mo；
青蒿二烯生产菌株：
在菌株SyBE_Sc0014C011基础上整合基因片段3和基因片段2，得到菌株SyBE_Sc0014C011_Se；
在菌株SyBE_Sc0014C012基础上整合基因片段3和基因片段2，得到菌株SyBE_Sc0014C012_Se；
香叶基香叶醇生产菌株：
在菌株SyBE_Sc0014C011基础上整合基因片段4，得到菌株SyBE_Sc0014C011_Di；
在菌株SyBE_Sc0014C012基础上整合基因片段4，得到菌株SyBE_Sc0014C012_Di；
酵母固醇生产菌株：
在菌株SyBE_Sc0014C011基础上整合基因片段2，得到菌株SyBE_Sc0014C011_Tri；
在菌株SyBE_Sc0014C012基础上整合基因片段2，得到菌株SyBE_Sc0014C012_Tri；
采用醋酸锂法将上述相应基因片段分别转化到菌株SyBE_Sc0014C011和SyBE_Sc0014C012，通过trp1或leu2上、下游同源序列与酵母基因组上trp1或leu2位点发生重组而整合到基因组上。转化后采用SD-TRP或SD-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，单缺色氨酸或亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名。
2、基因片段的构建
基因片段1和基因片段3参照专利CN105087406A实施例3的方法，采用对应的基因元件制备获得；
基因片段2和基因片段4参照专利CN105087406A实施例4的方法，采用对应的基因元件制备获得；
3、发酵方法
种子培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；
发酵培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D-半乳糖。
(注：对于香叶醇、青蒿二烯、香叶基香叶醇生产菌株，发酵培养基还要添加20％的正十二烷)
将上述菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD600＝0.2转接于新鲜的25mL种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养至对数生长中期，以初始菌体浓度OD600＝0.5分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养，监测发酵过程中的菌体密度(OD600)及产量。
4、产量检测
香叶醇、青蒿二烯、香叶基香叶醇：发酵48小时后，发酵液12000g离心5min后取上层有机相，用正己烷稀释后进行GC-MS检测。
酵母固醇：发酵48小时后，取两等份的发酵液，4000g离心2min收集菌体，并水洗两次。将其中一份菌体置于80℃烘干至恒重，称重计算细胞干重；另一份菌体用以产物提取，具体方法为：用1mL 2N NaOH重悬细胞，置于沸水浴中煮沸10min，然后立即冰浴3min；将破碎的细胞12000rpm、4℃离心4min弃上清，加入300uL含1.5M NaOH的甲醇溶液，60℃皂化4h，加入300uL正己烷涡旋振荡10min，离心收集有机相；水相再加300uL正己烷涡旋继续振荡10min，最后离心收集有机相。将收集的有机相真空冷冻干燥后，加入100ul衍生化试剂MSTFA 30℃孵育2h，最后用正己烷稀释后进行GC-MS检测。
脂肪酸：于发酵4、12、46小时三个时间点，分别取两等份的发酵液，4000g离心2min收集菌体，并水洗两次。将其中一份菌体置于80℃烘干至恒重，称重计算细胞干重；另一份菌体用以产物提取，具体方法为：加1mL含3N HCl的甲醇溶液和100uL的氯仿，70℃孵育3h。然后冷却至室温，加入少许NaCl颗粒，涡旋15s；最后加入2mL正己烷涡旋15s，离心收集有机相进行GC-MS检测。
5、试验结果
由图5-8可知，相对于未敲除YPL062W基因的对照菌株，敲除了YPL062W基因的菌株在香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、酵母固醇产量上依次提高了0.9倍、0.68倍、1.12倍和0.69倍。
由图9可知，相对于未敲除YPL062W基因的对照菌株，敲除了YPL062W基因的菌株，C16:0饱和脂肪酸和C16:1不饱和脂肪酸的含量显著提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津大学
<120> 一种重组酵母菌株及其应用
<130> MP1624946
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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ttgcatccaa catcaccatt aaaaccattt catggtgcat ctacatcatt ggaagctttt 120
aatggtgaac atatgggttt gttgagaggt tactctaaga gaaagttgtc ttcatacaag 180
aacccagctt caagatcttc aaatgctact gttgcacaat tgttgaatcc accacaaaag 240
ggtaaaaagg cagttgaatt cgatttcaat aagtacatgg attctaaagc tatgacagtt 300
aatgaagcat tgaataaggc tattccatta agatatccac aaaagatata tgaatctatg 360
agatactcat tgttagctgg tggtaaaaga gttagaccag ttttgtgtat tgctgcatgt 420
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catactatgt ctttgatgca tgatgatttg ccatgtatcg ataacgatga tttgagaaga 540
ggtaaaccaa caaaccataa gatcttcggt gaagatactg ctgttacagc tggtaatgct 600
ttgcattcat acgcattcga acatatcgct gtttctactt caaaaacagt tggtgcagat 660
agaatcttga gaatggtttc tgaattaggt agagctactg gttcagaagg tgttatgggt 720
ggtcaaatgg ttgatattgc atctgaaggt gacccatcaa tcgatttgca aactttggaa 780
tggatccata tccataagac agctatgttg ttggaatgtt ctgttgtttg tggtgcaatt 840
attggtggtg cttcagaaat cgttatcgaa agagcaagaa gatacgctag atgtgttggt 900
ttgttgttcc aagttgttga tgatatctta gatgttacta agtcttcaga tgaattgggt 960
aaaacagctg gtaaagattt gatctctgat aaggctacat acccaaagtt gatgggttta 1020
gaaaaggcaa aggaattttc tgatgaattg ttgaacagag ctaagggtga attgtcatgt 1080
tttgatccag ttaaagctgc accattgtta ggtttggcag attacgttgc ttttagacaa 1140
aattaa 1146
<210> 2
<211> 1641
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtctttga ctgaagaaaa gccaatcaga ccaatcgcta acttcccacc atctatctgg 60
ggtgaccaat tcttgatcta cgaaaagcaa gttgaacaag gtgttgaaca aatcgttaac 120
gacttgaaga aggaagttag acaattgttg aaggaagctt tggacatccc aatgaagcac 180
gctaacttgt tgaagttgat cgacgaaatc caaagattgg gtatcccata ccacttcgaa 240
agagaaatcg accacgcttt gcaatgtatc tacgaaactt acggtgacaa ctggaacggt 300
gacagatctt ctttgtggtt cagattgatg agaaagcaag gttactacgt tacttgtgac 360
gttttcaaca actacaagga caagaacggt gctttcaagc aatctttggc taacgacgtt 420
gaaggtttgt tggaattgta cgaagctact tctatgagag ttccaggtga aatcatcttg 480
gaagacgctt tgggtttcac tagatctaga ttgtctatca tgactaagga cgctttctct 540
actaacccag ctttgttcac tgaaatccaa agagctttga agcaaccatt gtggaagaga 600
ttgccaagaa tcgaagctgc tcaatacatc ccattctacc aacaacaaga ctctcacaac 660
aagactttgt tgaagttggc taagttggaa ttcaacttgt tgcaatcttt gcacaaggaa 720
gaattgtctc acgtttgtaa gtggtggaag gctttcgaca tcaagaagaa cgctccatgt 780
ttgagagaca gaatcgttga atgttacttc tggggtttgg gttctggtta cgaaccacaa 840
tactctagag ctagagtttt cttcactaag gctgttgctg ttatcacttt gatcgacgac 900
acttacgacg cttacggtac ttacgaagaa ttgaagatct tcactgaagc tgttgaaaga 960
tggtctatca cttgtttgga cactttgcca gaatacatga agccaatcta caagttgttc 1020
atggacactt acactgaaat ggaagaattc ttggctaagg aaggtagaac tgacttgttc 1080
aactgtggta aggaattcgt taaggaattc gttagaaact tgatggttga agctaagtgg 1140
gctaacgaag gtcacatccc aactactgaa gaacacgacc cagttgttat catcactggt 1200
ggtgctaact tgttgactac tacttgttac ttgggtatgt ctgacatctt cactaaggaa 1260
tctgttgaat gggctgtttc tgctccacca ttgttcagat actctggtat cttgggtaga 1320
agattgaacg acttgatgac tcacaaggct gaacaagaaa gaaagcactc ttcttcttct 1380
ttggaatctt acatgaagga atacaacgtt aacgaagaat acgctcaaac tttgatctac 1440
aaggaagttg aagacgtttg gaaggacatc aacagagaat acttgactac taagaacatc 1500
ccaagaccat tgttgatggc tgttatctac ttgtgtcaat tcttggaagt tcaatacgct 1560
ggtaaggaca acttcactag aatgggtgac gaatacaagc acttgatcaa gtctttgttg 1620
gtttacccaa tgtctatcta a 1641
<210> 3
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggcttata ccgcaatggc agcaggaact cagtcattgc agttgaggac agtcgcctct 60
taccaggagt gcaactcaat gaggtcttgc ttcaagttga ccccattcaa gtcattccac 120
ggtgtcaact tcaacgttcc ttctttaggt gccgccaact gcgaaatcat gggtcacttg 180
aaattgggtt ctttgccata caaacagtgt tcagtatcat ctaagtcaac taagactatg 240
gcccagttgg tagatttggc agagaccgag aaagccgagg gaaaggatat cgagttcgat 300
tttaacgagt atatgaagtc taaggctgtc gctgttgatg cagccttgga taaggccatc 360
cctttggagt atccagagaa gatccatgag tctatgaggt actcattgtt ggccggagga 420
aaaagggtca gacctgcatt atgcatcgct gcttgcgagt tagtaggtgg ttctcaggac 480
ttggccatgc caaccgcatg tgccatggaa atgattcata ccatgtcatt gattcacgat 540
gatttgcctt gcatggacaa cgacgacttc agaaggggaa agcctaccaa tcacaaggtt 600
ttcggagagg acactgctgt tttagccggt gacgcattgt tatctttcgc ttttgaacac 660
atcgccgttg ccacatcaaa aactgtccca tctgacagga ccttgagagt catttctgag 720
ttgggtaaaa ccatcggttc acagggattg gtcggaggtc aggtagtcga catcacttct 780
gagggagacg ccaacgtcga cttaaagaca ttggagtgga ttcacattca caagactgcc 840
gtcttgttgg aatgctctgt tgtttctgga ggaatcttgg gtggagctac cgaggatgag 900
attgctagaa taagaagata cgccaggtgc gtcggtttgt tgttccaggt tgtcgacgac 960
attttggatg tcaccaagtc ttcagaggaa ttgggaaaga ccgccggtaa agacttattg 1020
accgacaagg ctacctaccc taagttgatg ggtttggaga aggccaaaga gtttgcagca 1080
gaattagcta ccagggcaaa ggaagagttg tcatcattcg accagatcaa ggcagcccct 1140
ttgttaggat tggccgatta catcgctttc aggcaaaact aa 1182

Claims (9)

1.一种重组酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株为发酵生产香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇中一种或两种以上产物的酵母菌株，并且敲除YPL062W基因。
2.根据权利要求1所述酵母菌株，其特征在于，所述发酵生产香叶醇的酵母菌株包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母trp1位点上游同源序列、GAL1启动子、香叶醇合成酶编码基因GES、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段1；
酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2。
3.根据权利要求1所述酵母菌株，其特征在于，所述发酵生产青蒿二烯的酵母菌株包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2；
酵母trp1位点上游同源序列、GAL1启动子、青蒿二烯合成酶编码基因ADS、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段3。
4.根据权利要求1所述酵母菌株，其特征在于，所述发酵生产香叶基香叶醇的酵母菌株包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、香叶基香叶醇合成酶编码基因GGPPS、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段4。
5.根据权利要求1所述酵母菌株，其特征在于，所述发酵生产酵母固醇的酵母菌株包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2。
6.根据权利要求1-5任意一项所述酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母菌株。
7.根据权利要求6所述酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌株为CEN.PK系列酿酒酵母或BY系列酿酒酵母。
8.根据权利要求7所述酵母菌株，其特征在于，所述CEN.PK系列酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1C或酿酒酵母CEN.PK2-1D。
9.权利要求1-8任意一项所述酵母菌株在发酵生产香叶醇、香叶基香叶醇、青蒿二烯、脂肪酸、酵母固醇中一种或两种以上产物中的应用。
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