CN114561434B - 裂殖壶菌发酵生产epa和dha的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，该方法是以裂殖壶菌为生产菌株，在发酵培养基中添加恩西地平，发酵生产多不饱和脂肪酸。本发明通过激活裂殖壶菌部分ELO/DES途径，提高裂殖壶菌发酵产物中EPA和DHA含量，采用裂殖壶菌工程菌EDG为生产菌株，使发酵产物中EPA含量提高8.73倍，DHA含量提高1.15倍。

Description

裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种裂殖壶菌的发酵方法，具体地说是裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法。
背景技术
裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)是一种富含油脂的破囊壶菌属异养海洋原生生物，因其生长速度快、易于培养等特点，被广泛应用于科研和商业生产。裂殖壶菌的脂肪酸积累以DHA(二十二碳六烯酸)、DPA(二十二碳五烯酸)、十六碳酸和十四碳酸为主，而在不同裂殖壶菌菌株中，对心血管疾病和COVID-19感染愈后更有帮助的EPA(二十碳五烯酸)等多不饱和脂肪酸(PUFA)产量不同。
裂殖壶菌HX-308产生的脂肪酸中，以十六碳酸和十四碳酸为代表的饱和脂肪酸占比达30％以上，PUFA约占总比例的60％，但其中各种PUFA含量不同，在药品、保健品开发等领域应用价值更高的EPA和DHA的含量有待进一步提高。
裂殖壶菌HX-308中的ELO/DES途径是不健全的，通过对裂殖壶菌HX-308的全基因组进行分析，发现裂殖壶菌HX-308中仅以十六碳酸为底物，通过ELO/DES途径合成EPA的部分途径保持完整，且该途径涉及的转录组中转录水平非常低(Bi et al.,(2018).Transcriptome and gene expression analysis of docosahexaenoic acid producerSchizochytrium sp.under different oxygen supply conditions)。因此，采用现有发酵技术，裂殖壶菌HX-308的发酵产物中十六碳酸比例约占20％，EPA和DHA的含量较低。
发明内容
本发明的目的，是要提供一种裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，通过外源添加恩西地平，激活裂殖壶菌部分ELO/DES途径，达到提高裂殖壶菌发酵产物中EPA和DHA含量的目的。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，以裂殖壶菌为生产菌株发酵生产多烯不饱和脂肪酸，在发酵培养基中添加恩西地平；
其中，发酵培养基和恩西地平的用量比例为1L：1～50mmol。
制得发酵培养基的pH值为6.0～7.5，制成其的原料包括：葡萄糖60～100g/L、酵母浸粉5～15g/L、硫酸钠5～12g/L、硫酸镁2～4g/L、硫酸铵4～8g/L、氯化钾1～2g/L、氯化钙0.1～0.2g/L、硫酸钾0.5～1g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、谷氨酸钠15～20g/L、七水合硫酸锌1～5mg/L、六水合氯化钴0.01～0.1mg/L、五水合硫酸铜2～6mg/L、六水合硫酸镍1～2mg/L、七水合硫酸铁8～15mg/L、泛酸钙2～4mg/L、四水合氯化锰3～5mg/L、二水合钼酸钠0.02～0.06mg/L、维生素B6 4～10mg/L和维生素B12 0.1～0.5mg/L。
进一步地，所述发酵用菌种通过以下方法得到：将所述裂殖壶菌接种于种子培养基中，培养获得一级种子；取所述一级种子接种于种子培养基中，培养获得二级种子；取所述二级种子接种于种子培养基中，培养获得三级种子，作为生产菌株；
其中，所述培养的条件为25～30℃，150～250r/min振摇培养；
种子培养基的pH为6.6，且包括：葡萄糖50g/L、酵母浸粉5g/L、硫酸钠5g/L、硫酸镁2g/L、硫酸铵6g/L、氯化钾1g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸钾0.6g/L、磷酸二氢钾1g/L、谷氨酸钠10g/L、0.1％的微量矿物质、维生素B6 5mg/L及维生素B12 0.5mg/L。
作为本发明的一种限定，所述裂殖壶菌为裂殖壶菌HX-308(Schizochytriumsp.)，其保藏编号为CCTCC No.M209059。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且已在专利号为201510417269.4的中国发明专利公开。
作为本发明的另一种限定，所述裂殖壶菌是以裂殖壶菌HX-308为野生型，且过表达裂殖壶菌C18延长酶(C18 ELO)基因和裂殖壶菌n3去饱和酶(n3DES)基因的裂殖壶菌工程菌，记为裂殖壶菌工程菌ED。
作为本发明的进一步限定，所述裂殖壶菌工程菌是将克隆所得的裂殖壶菌HX-308的C18延长酶基因和裂殖壶菌HX-308的n3去饱和酶基因，通过同源重组技术，连接入pBS-Zeo载体后，转化至裂殖壶菌HX-308所得。
作为本发明的第三种限定，所述裂殖壶菌为以裂殖壶菌HX-308为野生型，且过表达裂殖壶菌n3去饱和酶基因和突变后的裂殖壶菌C18延长酶基因(C18ELO-G)的裂殖壶菌工程菌，记为裂殖壶菌工程菌EDG。
作为本发明的进一步限定，所述突变后的裂殖壶菌C18延长酶基因的突变位点包括：第43位氨基酸由笨丙氨酸突变为丝氨酸，第103位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸，第122位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸，第150位氨基酸由苏氨酸突变为蛋氨酸，第201位氨基酸由酪氨酸突变为组氨酸且第229位氨基酸由半胱氨酸突变为精氨酸。
突变后的裂殖壶菌C18延长酶基因序列为(基因序列如SEQ NO.1所示)：
ATGCTCGAGGGGATCAAGAACATTGACGTGGCGCAGCTGGCGCCGCTGTACGATGATCTGTACATGCTGGTTCCGATCTACGCCCTGGGCGTGCCCCTGCTCAGGGCCCACTACAAGGGCGTGCCCTCCAACGCCGGGCTCTGGAAACCCATCATGGTCGTTTACAATGCGATCATGACGATCTTTTCGGCGGCATGCGCTGTAGGCATGGCATACATTGTTTGGGGTAAATTCGGCGGCAACATCAAACGTAACGAGTGCGACGCCTTCGCCAAAGCCGAGCTCTACGACTGGATTGTGTGGGTGTTTTACATGTCCAAGTACATCGAGTTTGCCGACACCTTTTTTCTCATCATCAAAGGCGAAGGCGTCTCGTGGCTCCACTACTACCACCACATTGGCGCTGCGATTGACATGGGCATCCTCTGGAAGTCTGGTACCGAGGCGATGTGGATCTTTGTCCTCTTCAACGGGACTGTGCACACGGTCATGTACGCATATTACGGCGCCGCGCTCGTGGGCTACCGTCTTAAGGGAAAGAGCATGATTACCGTCATGCAGATTGCCCAGTTCATCGTCGGCATGGGCACCTTTTACACGCACGCGAACGTGCCCTGCTTTGCCAGCAGCAGCCAGCTCATGTTTGTCTACTACTTTACCAACGCGTACGTGTTTGGCGTCCTCCGCTTCTTTCTCAACTTTTTCCTGCAAAACTACATCAAGAAGGCCCCAGCCAAGACGGGCGCCGCCCCGGTCACCAAAAAGGTCGACTAG
作为本发明的第四种限定，所述发酵生产后经脂质提取得EPA和DHA。进一步地，所述脂质提取的方法包括：
1)发酵生产结束后，在发酵培养基中加入NaOH溶液调PH至12后，加入0.01-0.5％(w/v)商用细胞破壁酶，于40～60℃，100～200r/min振荡5～15h；
2)冷却至10～30℃，加入等体积无水乙醇使破壁酶失活；
3)采用正己烷萃取，收集上层有机相；
4)重复步骤3)若干次，合并有机相，40℃旋蒸，挥干正己烷，得脂质。
作为本发明的第五种限定，在发酵生产0～36h时，向发酵培养基中添加恩西地平。
作为本发明的进一步限定，所述发酵生产的温度为25～29℃，转速为150～200rpm，发酵总时间为48～130h。
其中，C18 ELO基因序列为(基因序列如SEQ NO.2所示)：
ATGCTCGAGGGGATCAAGAACATTGACGTGGCGCAGCTGGCGCCGCTGTACGATGATCTGTACATGCTGGTTCCGATCTACGCCCTGGGCGTGCCCCTGCTCAGGGCCCACTACAAGGGCGTGCCCTTCAACGCCGGGCTCTGGAAACCCATCATGGTCGTTTACAATGCGATCATGACGATCTTTTCGGCGGCATGCGCTGTAGGCATGGCATACATTGTTTGGGGTAAATTCGGCGGCAACATCAAACGTAACGAGTGCGACGCCTTCGCCAAAGACGAGCTCTACGACTGGATTGTGTGGGTGTTTTACATGTCCAAGTACATCGAGTTTGCCGACACCTTTTTTCTCATCATCAAAGGCAAAGGCGTCTCGTGGCTCCACTACTACCACCACATTGGCGCTGCGATTGACATGGGCATCCTCTGGAAGTCTGGTACCGAGGCGACGTGGATCTTTGTCCTCTTCAACGGGACTGTGCACACGGTCATGTACGCATATTACGGCGCCGCGCTCGTGGGCTACCGTCTTAAGGGAAAGAGCATGATTACCGTCATGCAGATTGCCCAGTTCATCGTCGGCATGGGCACCTTTTACACGTACGCGAACGTGCCCTGCTTTGCCAGCAGCAGCCAGCTCATGTTTGTCTACTACTTTACCAACGCGTACGTGTTTGGCGTCCTCTGCTTCTTTCTCAACTTTTTCCTGCAAAACTACATCAAGAAGGCCCCAGCCAAGACGGGCGCCGCCCCGGTCACCAAAAAGGTCGACTAG
n3 DES基因序列为(基因序列如SEQ NO.3所示)：
ATGTGCAAGGCGGACCCAGTCGCGGTCTCCTCGCAGGAAACGTCTGCAGCTGCTCTGGCGTCCGAAGACGCGTGGATTCGGGACCTTGATCTCAAGGCCTTCGGCGCAGAAATCCGCGAACTTGGAAAAACCCTGCGCGAGAACCAAGGCGCCGCTGACGATGAGCACCTTTACAAGCTCGTGCGATGGCAGACGGGGCTCTCACTAGCCGGCCTCCTCACCATGTGGATGACGCCGAATCCATTCACCATCATCTGCCTCTCCACTGGTCTTTTTATGCGCTGGGCCATGCTCGCGCATCACGTTTGCCACAATGGCTACAGAGACACCGATGCAGGCAAACGCTTTGGCTACAACCAACTCGTCTTCGCCGTCGGCAGCCTTGTACGCCGCATTATCGACTGGGCGGACTGGATCTATCCGGAGGCTTGGAACTTGGAGCATGGCCGCCTGCACCATTACAGCCTCAACGAAAACGCCGATCCCGATGTGGTCGAGCTCAACACACGCTACTTGCAGGAAGTGGACATTCCAAGACCCCTCAAGTATCTCGTGGTTCTCTTTTTCGGCGCCACGTGGAAATTTACCTACTACAGCTCCAACACGTACTCGGCGCTCTTGCACAGCCGTCGCTTGCGGGAAGCGACGCTCAAGAACGATGAGGTCACCAAGGCGCGCCTGCAAAAGGAGGCCGTAGAATCGCGCATGATGACCGTCTTTTCCATCTTTGATGGCTCGGGCCCGAGCTGGTGGTCTACGTCCAGCTTCTTCTTCAATGTCCTCCTCCCCTTCTTTCTCCTGCGCTTTGTCGTCACGCCATTGCCTGTCTACCTTTTAATCGGTGCCGCTGCGTACAAGAACGCTATTATCAATCTTGTGCTCGCGGAACTTCTCACGAACATGCACAGCTTCCTCGCGATTGTCCCCAACCATGCAGGCCACGACATGTACAGATTTGAGACGCACTGCGAGCCGCTCAGCGATGAGTTCTTCTTGCGCCAGGTCATTGGCTCCGTTGATTTCCAAGTTGGAAACGATGTCATTGACACCTTTCACGGATTCCTTTCCTATCAGATCGAGCATCATCTCTGGCCTGATCTCTCCATGCTCTCGTACCAAAAGGCGCACCCGTTGGTCAAGGACATTTGCAAACGCCACGGTGTCCCTTTCGTTCAAGAGTCTGTCTTTGTTCGCCTCTACAAGACCGTTCGCATTTTTCTCGGTGACGATCACATGCGCCTTTTCCCACAACAGGCGCTTCACGTCGAGTGA。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
①本发明在裂殖壶菌的发酵培养基中添加恩西地平，能够激活裂殖壶菌部分ELO/DES途径，提高裂殖壶菌发酵产物中EPA和DHA含量；
②本发明在裂殖壶菌HX-308的发酵培养基中添加恩西地平，能够激活该菌部分ELO/DES途径，相较于未添加恩西地平的发酵方法，裂殖壶菌HX-308发酵产物中EPA含量提高近3倍，同时提高DHA产量；
③本发明在裂殖壶菌工程菌ED的发酵培养基中添加恩西地平，能够激活该菌部分ELO/DES途径，相较于采用裂殖壶菌HX-308且未添加恩西地平的发酵方法，发酵产物中EPA含量提高了2.90倍，同时提高DHA产量；
④本发明以同源建模和PDB数据库中同源结晶建立的高精度三维结构为基础，采用分子对接和分子动力学模拟对C18ELO基因的底物特异性进行解析，采用结合自由能拆解计算探索C18ELO蛋白催化功能的关键氨基酸和功能域，在功能解析的基础上，确定最优突变位点，以定点突变、功能域替换手段对C18ELO蛋白催化口袋与底物结合直接相互作用的氨基酸残基以及非保守氨基酸残基(通道残基)进行改造，重塑催化结合口袋，进而形成突变后的裂殖壶菌C18延长酶基因；
将突变后的裂殖壶菌C18延长酶基因，用于制备工程菌，获得发酵产物中EPA和DHA含量高的裂殖壶菌工程菌EDG；
⑤本发明在裂殖壶菌工程菌EDG的发酵培养基中添加恩西地平，能够激活该菌部分ELO/DES途径，将发酵产物中EPA含量较未添加恩西地平的裂殖壶菌HX-308发酵产物提高了8.73倍，DHA含量提高1.15倍；
本发明的裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法操作简单，适用于工业化发酵生产EPA和DHA。
下面结合附图及具体实施例对本发明作详细说明。
附图说明
图1为本发明实施例2中突变体C18ELO-G的突变位点示意图；
图2为本发明实施例9中不同恩西地平加入时间对裂殖壶菌HX-308发酵生产方法的影响结果图；
图3为本发明实施例10中不同恩西地平加入量对裂殖壶菌HX-308发酵产物的影响结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1一种裂殖壶菌HX-308发酵生产EPA和DHA的方法
本实施例包括依次进行的以下步骤：
S1.制备发酵用菌种
配制种子培养基，按照以下配比称取原料：葡萄糖50g/L、酵母浸粉5g/L、硫酸钠5g/L、硫酸镁2g/L、硫酸铵6g/L、氯化钾1g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸钾0.6g/L、磷酸二氢钾1g/L、谷氨酸钠10g/L、硫酸镍0.05mg/L、维生素B6 5mg/L及维生素B12 0.5mg/L，配制成种子培养基，调整pH至6.6。
挑选裂殖壶菌HX-308单菌落接种于50mL种子培养基中，于28℃、180r/min摇床培养24h后为一代种子；取1mL一代种子培养液接种于50mL种子培养基中，于28℃、180r/min摇床培养24h为二代种子；取1mL二代种子培养液接种于50mL种子培养基中，于28℃、180r/min摇床培养24h为三代种子，作为发酵用菌种。
S2.发酵培养
配制发酵培养基，按照以下配比称取原料：葡萄糖80g/L、酵母浸粉10g/L、硫酸钠10g/L、硫酸镁2g/L、硫酸铵6g/L、氯化钾1g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸钾0.6g/L、磷酸二氢钾1g/L、谷氨酸钠20g/L、七水合硫酸锌3mg/L、六水合氯化钴0.05mg/L、五水合硫酸铜4mg/L、六水合硫酸镍1.5mg/L、七水合硫酸铁10mg/L、泛酸钙3mg/L、四水合氯化锰4mg/L、二水合钼酸钠0.04mg/L、维生素B6 5mg/L和维生素B12 0.5mg/L，配制成发酵培养基，调整pH至7.0。
取10L发酵用菌种培养液接种于90L发酵培养基中，在28℃，180rpm条件下发酵生产，于12h加入5mol恩西地平(发酵培养基和恩西地平的用量比例为1L：50mmol)，发酵总时间为120h，发酵结束后，收集脂质。
脂质收集及鉴定方法为：向发酵培养结束后的发酵液中加入NaOH溶液调至PH为12.0后，加入0.2％的破壁酶，50℃，150r/min振荡10h；冷却至20℃，加入等体积无水乙醇使破壁酶失活，采用正己烷萃取，收集有机相，重复萃取，40℃旋蒸，挥干正己烷溶剂，得脂质；采用气相检测分析脂肪酸，结果表明，成功生产EPA和DHA。
实施例2裂殖壶菌工程菌ED和裂殖壶菌工程菌EDG的构建方法
(一)裂殖壶菌工程菌ED的构建方法
裂殖壶菌工程菌ED是以保藏编号为CCTCC No.M209059的裂殖壶菌HX-308为野生型，且过表达裂殖壶菌C18延长酶基因和裂殖壶菌n3去饱和酶基因的裂殖壶菌工程菌；它是将克隆所得的裂殖壶菌HX-308的C18延长酶基因和裂殖壶菌HX-308的n3去饱和酶基因连接入pBS-Zeo载体后，转化至裂殖壶菌HX-308所得。具体构建方法为：
(I)克隆C18ELO和n3DES基因片段
根据裂殖壶菌C18延长酶(C18ELO)基因和n3去饱和酶(n3DES)基因的序列信息，设计序列如下所示的引物P1和P2，引物P3和P4，以裂殖壶菌HX-308(Schizochytrium sp.)基因组为模版，用相应引物与PrimerStar高保真聚合酶，通过PCR体系对C18ELO和n3DES基因片段进行扩增，得到C18ELO和n3DES基因片段。PCR程序为：94℃30s，55℃30s，70℃20s，32个循环，并对PCR产物进行纯化。
P1(sense)：ATGCTCGAGGGGATCAAGAACAT
P2(antisense)：CTAGTCGACCTTTTTGGTGAC
P3(sense)：ATGTGCAAGGCGGACCCAGTCGCG
P4(antisense)：TCACTCGACGTGAAGCGCCTGTT
(II)扩增C18ELO和n3DES基因同源臂
为C18ELO基因和n3DES基因设计pBS-Zeo酶切位点两端的同源臂序列P5、P6、P7、P8，将同源臂通过PCR加到C18 ELO和n3DES基因的两端，胶回收。
P5(sense)：
TGCAGCACTCGCTCGCGCATAAATGCTCGAGGGGATCAAGAACAT
P6(antisense)：
CGCCGAGTTTGAGCGGCTAGCCTAGTCGACCTTTTTGGTGAC
P7(sense)：
GGTCACCAAAAAGGTCGACTAGATGTGCAAGGCGGACCCAGTCGCG
P8(antisense)：
CGCCGAGTTTGAGCGGCTAGCTCACTCGACGTGAAGCGCCTGTT
(III)连接反应
用gibson组装将酶切后的载体pBS-Zeo片段和C18 ELO、n3DES基因片段连接，得到重组过表达载体pBS-Zeo-C18ELO-n3DES。
采用25μL连接体系：2μL目的基因片段，1μL载体酶切后片段，2.5μL连接酶buffer，19.5μL ddH2O，50℃连接2h。
(IV)将重组过表达载体转入裂殖壶菌，构建裂殖壶菌工程菌ED
制备裂殖壶菌HX-308感受态细胞，采用电转化法将重组过表达载体pBS-Zeo-C18ELO-n3DES转化入裂殖壶菌HX-308感受态细胞，扩繁培养，获得稳定遗传的菌株，即为过表达pBS-Zeo-C18ELO-n3DES的裂殖壶菌工程菌ED。
(二)裂殖壶菌工程菌EDG的构建方法
裂殖壶菌工程菌EDG为以裂殖壶菌HX-308为野生型，且过表达裂殖壶菌n3去饱和酶基因和突变后的裂殖壶菌C18延长酶(C18ELO-G)基因的裂殖壶菌工程菌。其中C18ELO-G基因的设计方法为：
对C18ELO基因进行理性设计，以同源建模和PDB数据库中同源结晶建立的高精度三维结构为基础，采用分子对接和分子动力学模拟对C18ELO的底物特异性进行解析，采用结合自由能拆解计算探索C18ELO催化功能的关键氨基酸和功能域；在功能解析的基础上，确定最优突变位点，以定点突变、功能域替换等手段对C18ELO催化口袋与底物结合直接相互作用的氨基酸残基以及非保守氨基酸残基(通道残基)进行改造，重塑催化结合口袋，获得特异选择性强、催化效率高的突变体C18ELO-G，突变位点如图1所示。利用突变体C18ELO-G获得C18ELO-G基因。
参照(一)中步骤将C18ELO-G基因和n3DES基因在裂殖壶菌HX-308过表达，构建裂殖壶菌工程菌EDG。
实施例3～8裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法
实施例3～8分别为一种裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，具体发酵生产方法与实施例1基本相同，不同之处仅在于工艺参数中具体生产菌株、接种量或发酵生产参数设置不同，具体区别见表1；
表1实施例3～8工艺参数表
实施例3～8的发酵生产方法中其他部分与实施例1相同。
对实施例3～8发酵生产所得的脂质进行气相色谱分析，结果表明，均成功生产出EPA和DHA。
实施例9不同恩西地平加入时间对裂殖壶菌HX-308发酵生产方法的影响
本实施例提供在发酵生产0h、12h、24h和36h加入恩西地平的4种发酵方法，以不添加恩西地平的发酵方法为对照组，探究不同恩西地平加入时间对裂殖壶菌HX-308发酵产物中EPA和DHA含量的影响。
对照组不添加恩西地平，其余步骤与实施例1相同；
本实施例的其它各组发酵生产方法，除恩西地平加入时间不同外，其余步骤与实施例1相同。
计算发酵所得脂质中EPA和DHA含量，结果如图2所示，结果表明，加入恩西地平，能同时提高发酵所得脂质中EPA和DHA含量，不同恩西地平加入时间对裂殖壶菌HX-308发酵产物中EPA和DHA含量存在一定影响，其中，在发酵生产12h加入恩西地平的发酵方法，发酵所得脂质中EPA和DHA含量最高。
实施例10不同恩西地平加入量对裂殖壶菌HX-308发酵产物的影响
本实施例提供在发酵生产12h加入0mM、1mM、2mM、5mM、10mM、20mM和50mM恩西地平的7种发酵方法，探究不同恩西地平加入量对裂殖壶菌HX-308发酵产物中EPA和DHA含量的影响。
本实施例的各组发酵生产方法，除恩西地平加入量不同外，其余步骤与实施例1相同。
计算发酵所得脂质中EPA和DHA含量，结果如图3所示，结果表明，加入恩西地平，能显著提高发酵所得脂质中EPA含量，不同恩西地平加入量对裂殖壶菌HX-308发酵产物中EPA和DHA含量存在一定影响，其中，加入10mM恩西地平的发酵方法，发酵所得脂质中EPA和DHA含量最高。
对比加入0mM恩西地平的发酵方法(即不添加)和加入10mM恩西地平的发酵方法所得脂质中各组分含量，结果如表2所示；
表2不同恩西地平加入量的发酵生产方法所得脂质中各组分含量
表2结果表明，恩西地平影响发酵所得裂殖壶菌脂肪酸组成，EPA含量较不加入恩西地平提高了2.90倍，且C18:3和C20:4的含量也有了明显提高。
其中，在裂殖壶菌脂肪酸中Others包括C15:0、C17:0、不皂化物和C16:1，为本领域公知常识。
实施例11恩西地平对裂殖壶菌工程菌ED发酵产物的影响
本实施例提供采用裂殖壶菌工程菌ED为生产菌株在发酵生产12h加入10mM恩西地平的发酵方法，探究恩西地平和基因过表达对裂殖壶菌工程菌ED发酵产物的影响，发酵方法中其它步骤与实施例1相同。
计算发酵所得脂质中各组分含量，结果如表3所示；结果表明，n3DES的过表达导致了C20:4向EPA的转化，提高了产物中EPA的含量。
表3裂殖壶菌工程菌ED发酵产物中各组分含量
实施例12恩西地平对裂殖壶菌工程菌EDG发酵产物的影响
本实施例提供采用裂殖壶菌工程菌EDG为生产菌株在发酵生产12h加入10mM恩西地平的发酵方法，探究恩西地平和基因突变对裂殖壶菌发酵产物的影响，发酵方法中其它步骤与实施例1相同。
以实施例10中，在裂殖壶菌HX-308发酵生产12h加入0mM恩西地平的发酵方法为对照组；
计算两组发酵所得脂质中各组分含量，结果如表4所示；结果表明，加入恩西地平的裂殖壶菌工程菌EDG发酵生产方法，产物中EPA和DHA比例有显著提高；其中，EPA比例为对照组的8.73倍，DHA比例是对照组的1.15倍；其他脂肪酸中，C14:0和C16:0占比分别只有对照组的45％和52％。
表4裂殖壶菌工程菌EDG发酵产物中各组分含量
上述结果表明，在裂殖壶菌的发酵培养基中添加恩西地平，能够激活裂殖壶菌部分ELO/DES途径，提高裂殖壶菌发酵产物中EPA和DHA含量，尤其采用裂殖壶菌工程菌EDG为生产菌株，能显著提高EPA和DHA含量。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京师范大学
<120> 裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法
<130> 11
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
atgctcgagg ggatcaagaa cattgacgtg gcgcagctgg cgccgctgta cgatgatctg 60
tacatgctgg ttccgatcta cgccctgggc gtgcccctgc tcagggccca ctacaagggc 120
gtgccctcca acgccgggct ctggaaaccc atcatggtcg tttacaatgc gatcatgacg 180
atcttttcgg cggcatgcgc tgtaggcatg gcatacattg tttggggtaa attcggcggc 240
aacatcaaac gtaacgagtg cgacgccttc gccaaagccg agctctacga ctggattgtg 300
tgggtgtttt acatgtccaa gtacatcgag tttgccgaca ccttttttct catcatcaaa 360
ggcgaaggcg tctcgtggct ccactactac caccacattg gcgctgcgat tgacatgggc 420
atcctctgga agtctggtac cgaggcgatg tggatctttg tcctcttcaa cgggactgtg 480
cacacggtca tgtacgcata ttacggcgcc gcgctcgtgg gctaccgtct taagggaaag 540
agcatgatta ccgtcatgca gattgcccag ttcatcgtcg gcatgggcac cttttacacg 600
cacgcgaacg tgccctgctt tgccagcagc agccagctca tgtttgtcta ctactttacc 660
aacgcgtacg tgtttggcgt cctccgcttc tttctcaact ttttcctgca aaactacatc 720
aagaaggccc cagccaagac gggcgccgcc ccggtcacca aaaaggtcga ctag 774
<210> 2
<211> 774
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌HX-308（Schizochytrium sp.）
<400> 2
atgctcgagg ggatcaagaa cattgacgtg gcgcagctgg cgccgctgta cgatgatctg 60
tacatgctgg ttccgatcta cgccctgggc gtgcccctgc tcagggccca ctacaagggc 120
gtgcccttca acgccgggct ctggaaaccc atcatggtcg tttacaatgc gatcatgacg 180
atcttttcgg cggcatgcgc tgtaggcatg gcatacattg tttggggtaa attcggcggc 240
aacatcaaac gtaacgagtg cgacgccttc gccaaagacg agctctacga ctggattgtg 300
tgggtgtttt acatgtccaa gtacatcgag tttgccgaca ccttttttct catcatcaaa 360
ggcaaaggcg tctcgtggct ccactactac caccacattg gcgctgcgat tgacatgggc 420
atcctctgga agtctggtac cgaggcgacg tggatctttg tcctcttcaa cgggactgtg 480
cacacggtca tgtacgcata ttacggcgcc gcgctcgtgg gctaccgtct taagggaaag 540
agcatgatta ccgtcatgca gattgcccag ttcatcgtcg gcatgggcac cttttacacg 600
tacgcgaacg tgccctgctt tgccagcagc agccagctca tgtttgtcta ctactttacc 660
aacgcgtacg tgtttggcgt cctctgcttc tttctcaact ttttcctgca aaactacatc 720
aagaaggccc cagccaagac gggcgccgcc ccggtcacca aaaaggtcga ctag 774
<210> 3
<211> 1272
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌HX-308（Schizochytrium sp.）
<400> 3
atgtgcaagg cggacccagt cgcggtctcc tcgcaggaaa cgtctgcagc tgctctggcg 60
tccgaagacg cgtggattcg ggaccttgat ctcaaggcct tcggcgcaga aatccgcgaa 120
cttggaaaaa ccctgcgcga gaaccaaggc gccgctgacg atgagcacct ttacaagctc 180
gtgcgatggc agacggggct ctcactagcc ggcctcctca ccatgtggat gacgccgaat 240
ccattcacca tcatctgcct ctccactggt ctttttatgc gctgggccat gctcgcgcat 300
cacgtttgcc acaatggcta cagagacacc gatgcaggca aacgctttgg ctacaaccaa 360
ctcgtcttcg ccgtcggcag ccttgtacgc cgcattatcg actgggcgga ctggatctat 420
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gaggtcacca aggcgcgcct gcaaaaggag gccgtagaat cgcgcatgat gaccgtcttt 720
tccatctttg atggctcggg cccgagctgg tggtctacgt ccagcttctt cttcaatgtc 780
ctcctcccct tctttctcct gcgctttgtc gtcacgccat tgcctgtcta ccttttaatc 840
ggtgccgctg cgtacaagaa cgctattatc aatcttgtgc tcgcggaact tctcacgaac 900
atgcacagct tcctcgcgat tgtccccaac catgcaggcc acgacatgta cagatttgag 960
acgcactgcg agccgctcag cgatgagttc ttcttgcgcc aggtcattgg ctccgttgat 1020
ttccaagttg gaaacgatgt cattgacacc tttcacggat tcctttccta tcagatcgag 1080
catcatctct ggcctgatct ctccatgctc tcgtaccaaa aggcgcaccc gttggtcaag 1140
gacatttgca aacgccacgg tgtccctttc gttcaagagt ctgtctttgt tcgcctctac 1200
aagaccgttc gcatttttct cggtgacgat cacatgcgcc ttttcccaca acaggcgctt 1260
cacgtcgagt ga 1272
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
atgctcgagg ggatcaagaa cat 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ctagtcgacc tttttggtga c 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
atgtgcaagg cggacccagt cgcg 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
tcactcgacg tgaagcgcct gtt 23
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
tgcagcactc gctcgcgcat aaatgctcga ggggatcaag aacat 45
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
cgccgagttt gagcggctag cctagtcgac ctttttggtg ac 42
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ggtcaccaaa aaggtcgact agatgtgcaa ggcggaccca gtcgcg 46
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
cgccgagttt gagcggctag ctcactcgac gtgaagcgcc tgtt 44

Claims (7)

1.一种裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，以裂殖壶菌为生产菌株发酵生产多不饱和脂肪酸，其特征在于，在发酵培养基中添加恩西地平；
其中，发酵培养基和恩西地平的用量比例为1L：1~50mmol；
所述裂殖壶菌为裂殖壶菌HX-308，其保藏编号为CCTCC No.M209059。
2.根据权利要求1所述的裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，其特征在于，所述裂殖壶菌是以裂殖壶菌HX-308为野生型，且过表达裂殖壶菌C18延长酶基因和裂殖壶菌n3去饱和酶基因的裂殖壶菌工程菌。
3.根据权利要求2所述的裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，其特征在于，所述裂殖壶菌工程菌是将克隆所得的裂殖壶菌HX-308的C18延长酶基因和裂殖壶菌HX-308的n3去饱和酶基因连接入pBS-Zeo载体后，转化至裂殖壶菌HX-308所得。
4.根据权利要求1所述的裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，其特征在于，所述裂殖壶菌为以裂殖壶菌HX-308为野生型，且过表达裂殖壶菌n3去饱和酶基因和突变后的裂殖壶菌C18延长酶基因的裂殖壶菌工程菌；
所述突变后的裂殖壶菌C18延长酶基因的突变位点包括：第43位氨基酸由笨丙氨酸突变为丝氨酸，第103位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸，第122位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸，第150位氨基酸由苏氨酸突变为蛋氨酸，第201位氨基酸由酪氨酸突变为组氨酸且第229位氨基酸由半胱氨酸突变为精氨酸；
所述n3去饱和酶基因的基因序列如SEQ NO.3所示。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，其特征在于，所述发酵生产后经脂质提取得EPA和DHA。
6.根据权利要求1~4中任一项所述的裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，其特征在于，在发酵生产0~36h时，向发酵培养基中添加恩西地平。
7.根据权利要求6所述的裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，其特征在于，所述发酵生产的温度为25~29℃，转速为150~200rpm，发酵总时间为48~130h。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115873657B (zh) * 2023-02-16 2023-06-06 南京师范大学 一种无需使用有机溶剂的裂殖壶菌脂质提取方法和应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101519676A (zh) * 2009-04-03 2009-09-02 湖北福星生物科技有限公司 用裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸的方法
CN101575584A (zh) * 2009-06-18 2009-11-11 南京工业大学 一种裂殖弧菌及利用其生产dha油脂的方法
CN101638361A (zh) * 2009-05-06 2010-02-03 厦门金达威集团股份有限公司 一种从裂殖壶菌提取并精制富含二十二碳六烯酸的方法
TW201036554A (en) * 2009-03-19 2010-10-16 Martek Biosciences Corp Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
CN101999522A (zh) * 2010-09-10 2011-04-06 厦门汇盛生物有限公司 一种让哺乳动物高产dha奶的微藻全细胞粉及制备方法
EP3521439A1 (en) * 2018-01-31 2019-08-07 Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives Method for the production of triacylglycerides and fatty acids
CN111356767A (zh) * 2017-08-17 2020-06-30 赢创运营有限公司 通过限制至少两种限制性营养源增强脂质的产生
CN111836907A (zh) * 2018-01-10 2020-10-27 埃皮赛佛尔有限公司 基因组位点处核小体修饰和突变的定量方法及其临床应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201036554A (en) * 2009-03-19 2010-10-16 Martek Biosciences Corp Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
CN101519676A (zh) * 2009-04-03 2009-09-02 湖北福星生物科技有限公司 用裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸的方法
CN101638361A (zh) * 2009-05-06 2010-02-03 厦门金达威集团股份有限公司 一种从裂殖壶菌提取并精制富含二十二碳六烯酸的方法
CN101575584A (zh) * 2009-06-18 2009-11-11 南京工业大学 一种裂殖弧菌及利用其生产dha油脂的方法
CN101999522A (zh) * 2010-09-10 2011-04-06 厦门汇盛生物有限公司 一种让哺乳动物高产dha奶的微藻全细胞粉及制备方法
CN111356767A (zh) * 2017-08-17 2020-06-30 赢创运营有限公司 通过限制至少两种限制性营养源增强脂质的产生
CN111836907A (zh) * 2018-01-10 2020-10-27 埃皮赛佛尔有限公司 基因组位点处核小体修饰和突变的定量方法及其临床应用
EP3521439A1 (en) * 2018-01-31 2019-08-07 Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives Method for the production of triacylglycerides and fatty acids

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DHA高产菌SCHIZOCHYTRIUM SP.FJU-512脂肪酸组成与18S RRNA基因序列分析;黄建忠;江贤章;工业微生物;20041231(第004期);6-12 *
EFFECTS OF CULTURE CONDITIONS ON GROWTH AND DOCOSAHEXAENOIC ACID PRODUCTION FROM SCHIZOCHYTRIUM LIMACINUM;中国海洋大学学报(英文版);20081231(第001期);83-88 *
SCHIZOCHYTRIUM SP.发酵生产DHA培养基的优化;周林;卢英华;何宁;中国油脂;20071231(第006期);32-34 *
植物激素对裂殖壶菌生长与DHA含量的影响;杨青;宋益民;范鸣浩;臧晓南;徐涤;张学成;中国海洋大学学报(自然科学版);20111231;第41卷(第012期);53-57 *
裂殖壶菌SCHIZOCHYTRIUM SP.FJU-512细胞油脂的研究;张娟梅;江贤章;黄建忠;福建师范大学学报(自然科学版);20071231(第002期);75-80 *
裂殖壶菌发酵生产DHA研究进展;魏萍;马小琛;任路静;纪晓俊;何光华;刘臻;黄和;食品工业科技;20101231(第010期);398-401, 404 *

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