CN103820335B - 一种过表达ω3脱饱和酶基因的高山被孢霉基因工程菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及过表达ω3脱饱和酶基因（FADS15）的高山被孢霉基因工程菌株及其构建方法。本发明采用高山被孢霉（Mortierella alpina，M.alpina）尿嘧啶营养缺陷型菌株MAU1（CCFM501）为材料，运用根癌农杆菌介导的遗传操作技术，得到一株高产EPA的ω3脱饱和酶（ω3Des）过表达菌株，对产油真菌高山被孢霉的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种过表达ω3脱饱和酶基因（FADS15）的高山被孢霉基因工程菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
多不饱和脂肪酸（PUFAs）是指含有两个或两个以上双键、碳原子数为16-26的直链脂肪酸。其中，ω-3系列PUFAs和ω-6系列PUFAs都是人体所必需的脂肪酸，不能在体内合成，只能通过食物摄取。属于ω-3系列的有：ALA（α-亚麻酸，18:3）、EPA（二十碳五烯酸，20:5）和DHA（二十二碳六烯酸，22:6）等；属于ω-6系列的有：LA（亚油酸，18:2）、GLA（γ-亚麻酸，18:3）和ARA（花生四烯酸，20:4）等。在当前人们的膳食油脂中，ω-6/ω-3的比例超过10:1，大大高于人体所需最佳比例。主要是因为在传统的食用植物油如豆油、葵花籽油、花生油等中含有较多的ω-6PUFAs，但ω-3PUFAs的含量很低。大量临床研究表明ω-3PUFAs在人体对抗许多疾病，例如哮喘，癌症，糖尿病，免疫紊乱的过程中发挥着重要的作用。ω-3PUFAs还能作为合成某些激素的前体物质，例如，环前列腺素，类花生酸，白细胞三烯，前列腺素，具有多重生理功能和潜在的药用价值。但是，ω-3PUFAs的传统来源仅限于深海鱼油，随着世界人口的扩张和海洋环境的污染，海洋渔业所提供的ω-3PUFAs正在经受着巨大的压力和潜在的风险。产脂微生物作为一种经济安全的ω-3脂肪酸替代来源，正在逐渐成为当前PUFAs领域的研究热点。
高山被孢霉（Mortierella alpina，M.alpina）是一种高产油脂的真菌，其脂质主要以甘油三酯的形式积累，且ARA（ω-6PUFA）含量高达40-50%。高山被孢霉可以积累多种多不饱和脂肪酸，在液体发酵条件下，通过向培养基中添加1%（w/v）的亚麻籽油，20℃发酵培养5天后，其利用每克碳源可产出总计943.2mg的PUFAs包括：403.4mg α-亚麻酸，123.1mgARA和33.6mg EPA等。高山被孢霉作为生产食用产品的微生物已经通过美国农业部（FDA）的安全性评估，是迄今为止生产PUFAs微生物中唯一具有正式安全性评估(GRAS)的菌种。高山被孢霉是目前工业化生产ARA的主要菌株，同时也是脂质生物化学基础研究的重要模式菌。
ω3脱饱和酶(ω3 Des)的功能主要是催化ω-6脂肪酸生成ω-3脂肪酸。Shimizu等人鉴定并克隆出高山被孢霉1S-4菌株中的ω3脱饱和酶基因，并在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae）中表达，通过外源添加ARA后，能检测EPA。随后他们采用化学诱变方法得到一株高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，并使用农杆菌介导的方法过表达ω3脱饱和酶基因，提高了EPA产量。高山被孢霉中EPA产量偏低的主要原因可能是由于其自身的ω3 Des表达量过低或活性不足。所以，我们以201310347934.8的专利申请中公开的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株MAU1为受体菌株，通过过表达ω3 Des以提高重组菌中ω-3脂肪酸EPA的产量，这对产油真菌高山被孢霉的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种过表达ω3脱饱和酶(ω3 Des)基因的高山被孢霉（M.alpina）基因工程菌株。本发明的另一个目的是提供一种构建过表达ω3脱饱和酶(ω3Des)基因的高山被孢霉（M.alpina）基因工程菌株的方法。本发明再一个目的是提供一种利用本发明的基因工程菌株生产EPA的方法。
一方面，本发明提供了一种过表达ω3脱饱和酶基因的高山被孢霉MortierellaalpinaMA-ω3Des-1，该基因工程菌株于2014年02月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.8791，所述菌株是选用高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株MAU1（CCFM501）为材料构建而成。
所述菌株含有来源于M.alpina ATCC#32222的ω3脱饱和酶基因FADS15。
另一方面，本发明提供了一种构建过表达ω3脱饱和酶基因的高山被孢霉（M.alpina）基因工程菌株的方法，该方法包括如下步骤：
（1）克隆来源于M.alpina ATCC#32222的ω3脱饱和酶基因（FADS15），并通过基因工程技术将该基因插入pBIG2-ura5s-ITs质粒中，构建二元表达载体pBIG2-ura5s-FADS15；
（2）用构建的二元表达载体转化根癌农杆菌，得到含pBIG2-ura5s-FADS15质粒的根癌农杆菌；
（3）用该菌转化高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株MAU1（CCFM501），通过筛选和鉴定，获得过表达ω3脱饱和酶基因（FADS15）的M.alpina工程菌株CGMCC No.8791。
在上述方法中，所述转化的根癌农杆菌是Agrobacterium tumefaciens C58C1。
再一方面，本发明提供了一种利用所述基因工程菌株生产EPA的方法，包括以下步骤：
（1）发酵种子培养：取500μL所述基因工程菌株的孢子液（107个/mL），接种于250mL锥形瓶（含种子培养基50mL）中，28℃，200r/min摇床培养36h，将湿菌体称重加4倍体积的种子培养基用分散器打散，1%接种量接种于250mL三角锥形瓶（装液量为种子培养基50mL）中，28℃，200r/min摇床培养36h，之后重复此步骤1%接种量接种于3瓶500mL三角锥形瓶（装液量为种子培养基100mL），28℃，200r/min摇床培养36h，作为发酵用菌种；
（2）摇瓶发酵培养：分散机打散发酵用菌体后，按1%的接种量接种到500mL锥形瓶（装液量为发酵培养基200mL）中，28℃培养2天，12℃培养10天，200r/min摇床培养；
（3）收集菌体并提取脂肪酸：收集的菌体冻干研磨后，采用反复冻融破壁的方式，用有机溶剂提取脂肪酸，气相检测分析脂肪酸组成及含量。
上述方法中，提取脂肪酸的具体操作方法如下：
①收集菌体，冷冻干燥，并称重，计算生物量。
②菌体研磨后，取50mg干重菌丝，加入2mL4mol/L盐酸。
③80℃水浴0.5小时，-80℃15分钟。重复一次。80℃水浴0.5小时。
④冷却至室温，加入1mL甲醇，混匀。
⑤加入1mL氯仿，震荡10分钟。6000g离心3分钟。收集氯仿。
⑥重复⑤两次。
⑦合并氯仿（3mL），加入1mL饱和氯化钠，混匀，3000g离心3分钟。收集氯仿层于新瓶。剩余液体加入1mL氯仿，3000g离心3分钟。合并氯仿（4mL）。
⑧氮吹干燥，加入1mL乙醚，转移至洁净的已经称重的瓶中。氮吹干燥。
在所述方法中，种子培养基与发酵培养基的配方一致，其组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，1g/LKH2PO4，0.25g/LMgSO4·7H2O，10g/LKNO3，pH6.8。
本发明以申请号为201310347934.8的专利申请中公开的高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株MAU1（CCFM501）作为转化菌株，以申请号为201310524221.4的专利申请中公开的M.alpina重组基因表达系统为基础，在其基础上通过进一步的基因重组方法构建一种新的能够高表达重组ω3脱饱和酶基因（FADS15）的遗传表达系统。
本发明以高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株MAU1（CCFM501）为研究对象，通过同源表达策略获得了高山被孢霉过表达ω3脱饱和酶基因（FADS15）的工程菌株，该菌株具有较高的合成EPA的能力，产量比出发菌株提高6倍，为该基因工程菌株工业化合成EPA提供基础。
本发明所涉及的根癌农杆菌为：Agrobacterium tumefaciens C58C1（Tsuji G,Fujii S,Fujihara N,et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformationfor random insertional mutagenesis in Colletotrichum lagenarium[J].Journal ofGeneral Plant Pathology,2003,69(4):230-239.）为公开获得。
本发明所涉及的IM固体培养基，其组成为：1.74g/L K2HPO4，1.37g/L KH2PO4，0.146g/L NaCl，0.49g/L MgSO4·7H2O，0.078g/LCaCl2，0.0025g/L FeSO4·7H2O，0.53g/L(NH4)2SO4，7.8g/L MES，1.8g/L葡萄糖，0.5%甘油，20g/L琼脂，pH6.8。
本发明所涉及的SC固体培养基，其组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母氮源无氨基酸和硫酸铵，1.7g/L硫酸铵，60mg/L异亮氨酸，60mg/L亮氨酸，60mg/L苯丙氨酸，50mg/L苏氨酸，40mg/L赖氨酸，30mg/L酪氨酸，20mg/L腺嘌呤，20mg/L精氨酸，20mg/L组氨酸，10mg/L甲硫氨酸，20g/L琼脂，pH6.8。
本发明所涉及的GY固体培养基，其组成为：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/LKNO3，1g/L NaH2PO4，3g/LMgSO4·7H2O，20g/L琼脂，pH6.8。
本发明的优点在于：在高山被孢霉转化系统的基础上，采用根癌农杆菌介导的基因转化方法，经过大量的实践尝试，构建了在M.alpina中过表达ω3脱饱和酶基因（FADS15）的工程菌株。获得的M.alpina基因工程菌株具有多次传代的遗传稳定性，且生长特性和脂肪酸组成分析结果与原养型菌株无明显差别，但EPA产量相对于原始菌株提高6倍，这为该基因工程菌株工业化合成EPA提供了基础。
本发明涉及的本发明涉及的过表达ω3脱饱和酶基因（FADS15）的高山被孢霉Mortierella alpinaMA-ω3Des-1工程菌株于2014年02月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.8791。
附图说明
图1为构建的二元表达载体示意图；
图2为重组菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。琼脂糖凝胶电泳分析，M为marker；泳道1为高山被孢霉野生型对照菌株。泳道2、3、4分别为pBIG2-ura5s-FADS15转化的重组菌株：MA-ω3Des-1（CGMCC No.8791），MA-ω3Des-2，MA-ω3Des-3。
图3为高山被孢霉野生型菌株与三株基因工程菌株ω3脱饱和酶基因（FADS15）RT-qPCR的结果分析图。M.alpina为野生型对照；MA-ω3Des-1，MA-ω3Des-2，MA-ω3Des-3为重组菌株。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明做更详细的说明。
实施例1：高山被孢霉ω3脱饱和酶基因（FADS15）的克隆
根据高山被孢霉ω3脱饱和酶基因（FADS15）的序列信息，设计引物P1、P2，下划线部分分别为酶切位点NheI和SacI，以含有ω3脱饱和酶基因（FADS15）的质粒pET19b-FADS15为模板（本实验室已发表文章Haiqin Chen,Zhennan Gu,Hao Zhang,Mingxuan Wang,WeiChen,W.Todd Lowther,Yong Q.Chen*.Expression and Purification of IntegralMembrane Fatty Acid Desaturases.PLoS ONE.2013,8(3):e58139），用引物P1/P2、KOD高保真聚合酶，通过PCR对ω3脱饱和酶基因（FADS15）进行扩增，得到片段。PCR程序为：94℃30s，55℃30s，68℃1.5min，30个循环，并对PCR产物进行纯化，纯化产物1.2%的琼脂糖凝胶电泳验证。
P1(sense)：GCCATAGCTAGCAAATGGCACCCCCTCACGTTGT
P2(antisense)：
GGAAGAGAGCTCTAATGCTTGTAGAACACTACGTCT
实施例2：二元表达载体的构建
1.酶切反应
在37℃条件下，先用限制性内切酶NheI过夜酶切，PCR纯化产物ω3脱饱和酶基因片段FADS15及载体pBIG2-ura5s-ITs片段，胶回收。NheI酶切体系（100μL）为：2μL NheI-HF，1μLBSA，30μL质粒或PCR产物，10μLBuffer4（购自NEB公司，货号B7004S），57μL去离子水，37℃水浴酶切5h。
酶切产物回收，用SacI单酶切，酶切体系为（100μL）：2μL SacI，30μL质粒或PCR产物，10μL Buffer4（购自NEB公司，货号B7004S），58μL去离子水，37℃水浴酶切5h。
2.连接反应
用T4连接酶将酶切后的ω3脱饱和酶基因片段FADS15与载体pBIG2-ura5s-ITs连接，4℃连接12h，得到重组表达载体为pBIG2-ura5s-FADS15。连接体系为（10μL）：1μL目的基因酶切后片段，1μL载体酶切后片段，1μL连接酶buffer，1μL T4连接酶，6μL无菌水，4℃过夜连接。
连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化方法如下：
⑴无菌状态下取100μL感受态细胞，加入1-2μL连接产物，混匀。
⑵将⑴中感受态移入电转杯中，避免产生气泡。
⑶将电转杯放入Bio-Rad电转仪，调到合适预设程序档位，电转。
⑷电转后的感受态移至含有900μL SOC复苏培养基的离心管中，37℃，150rpm1小时。
⑸取200μL涂布于含100μg/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板上。倒置37℃培养过夜。
挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得二元表达载体pBIG-ura5s-FADS15。
其中，SOC复苏培养基是以组分20g/L Tryptone，5g/L酵母粉，0.5g/L NaCl,2.5mMKCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖构成；YEP固体培养基是以组分10g/L Tryptone，10g/L酵母粉，5g/LNaCl，20g/L琼脂，pH6.8构成的。
实施例3：根癌农杆菌介导转化MAU1（CCFM501）
在已有的国内外文献有关根癌农杆菌转化方法报道的基础上，做了适当的优化调整，具体成功实施例如下：
⑴取保存于-80℃的含有质粒pBIG2-ura5s-FADS15的根癌农杆菌C58C1于含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板划线。30℃倒置避光培养48小时。
⑵挑取单克隆接种至20mL含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的MM液体培养基中30℃，200rpm避光培养24-48小时。
⑶4000g离心5分钟收集菌体，倒掉上清。加5mLIM液体培养基重悬菌体，4000g离心5分钟，倒掉上清。加2mL IM液体培养基重悬菌体。
⑷用IM液体培养基调整菌浓度至OD600=0.3。30℃，200rpm避光培养至OD600=1.0。
⑸收集MAU1（CCFM501）（申请号为201310347934.8的专利申请中公开的M.alpina尿嘧啶营养缺陷型菌株）孢子，用血球计数器计数，调整孢子浓度到107个每100μL。
⑹取100μL根癌农杆菌与100μL孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸的IM固体培养基上。23℃避光培养36-48小时。
⑺将玻璃纸转移到含有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢噻肟的SC平板上。18℃避光过夜培养，再接着转到25℃培养。
⑻后续观察平板生长情况，如有明显菌落长出，及时用尖头镊子挖取菌落外沿（2×2mm），接种于含有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢噻肟的SC平板上（在平板背后打格子标记），25℃培养箱中培养。
⑼待SC平板上的转化子长出后，再次转接于SC平板（筛选3次），排除阴性转化子。
⑽挖出生长的菌落至GY平板，25-30℃培养至产生大量孢子。
其中，MM液体培养基,其组成为：1.74g/L K2HPO4，1.37g/LKH2PO4，0.146g/L NaCl，0.49g/L MgSO4·7H2O，0.078g/L CaCl2，0.0025g/L FeSO4·7H2O，0.53g/L(NH4)2SO4，7.8g/LMES，1.8g/L葡萄糖，0.5%甘油，pH6.8。
IM液体培养基，其组成为：1.74g/L K2HPO4，1.37g/L KH2PO4，0.146g/L NaCl，0.49g/L MgSO4·7H2O，0.078g/L CaCl2，0.0025g/LFeSO4·7H2O，0.53g/L(NH4)2SO4，7.8g/LMES，1.8g/L葡萄糖，0.5%甘油，pH6.8。
IM固体培养基，其组成为：1.74g/L K2HPO4，1.37g/L KH2PO4，0.146g/L NaCl，0.49g/L MgSO4·7H2O，0.078g/L CaCl2，0.0025g/LFeSO4·7H2O，0.53g/L(NH4)2SO4，7.8g/LMES，1.8g/L葡萄糖，0.5%甘油，20g/L琼脂，pH6.8。
SC固体培养基，其组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母氮源无氨基酸和硫酸铵，1.7g/L硫酸铵，60mg/L异亮氨酸，60mg/L亮氨酸，60mg/L苯丙氨酸，50mg/L苏氨酸，40mg/L赖氨酸，30mg/L酪氨酸，20mg/L腺嘌呤，20mg/L精氨酸，20mg/L组氨酸，10mg/L甲硫氨酸，20g/L琼脂，pH6.8。
GY固体培养基，其组成为：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L KNO3，1g/LNaH2PO4，3g/L MgSO4·7H2O，20g/L琼脂，pH6.8。
YEP固体培养基，其组成为10g/L Tryptone，10g/L酵母粉，5g/LNaCl，20g/L琼脂，pH6.8。
实施例4：高山被孢霉过表达ω3脱饱和基因（FADS15）工程菌株筛选和鉴定
⑴用4mL生理盐水冲刷GY平皿表面，收集液体于一个无菌1.5mL离心管中，过25μm滤膜。
⑵稀释三个浓度梯度，分别取200μL涂布于含有100μg/mL壮观霉素，100μg/mL头孢噻肟的GY平板上。25℃培养2-3天。
⑶随时用无菌镊子挑出长出的真菌菌丝于SC平板上，25℃培养2-3天。
⑷观察高山被孢霉平板上的生长情况。挑出在SC平板上生长的菌丝于GY斜面上。
⑸将⑷中斜面上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上传代3次，每一次传代都重复步骤⑶中描述实验。
⑹稳定遗传的菌株鉴定为高山被孢霉过表达ω3Des的基因工程菌株表型，保藏于GY斜面上。
⑺提取具有过表达ω3Des的高山被孢霉基因组。设计一对与启动子和终止子特异性结合的引物进行PCR验证：
P3(sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT
P4(antisense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC
重组菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳分析结果见图2，M为marker；泳道1为高山被孢霉野生型对照；泳道2、3、4：MA-ω3Des-1，MA-ω3Des-2，MA-ω3Des-3，为pBIG2-ura5s-FADS15转化的重组菌株，可扩增出两条大小分别为818bp和1376bp的产物条带，电泳结果说明二元表达载体成功插入到高山被孢霉基因组中。
⑻重组菌株保藏于GY斜面上。
实施例5：高山被孢霉过表达ω3脱饱和基因（FADS15）工程菌株脂肪组提取与检测
⑴将高山被孢霉原养型菌株与实施例4筛选获得的高山被孢霉过表达ω3脱饱和基因（FADS15）工程菌株接种于发酵培养基中，28℃培养2天，12℃培养8天，200r/min转速培养。
其中，发酵培养基是由组分20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，1g/LKH2PO4，0.25g/LMgSO4·7H2O，10g/LKNO3构成的。
⑵收集菌体，冷冻干燥，并称重，计算生物量。
⑶菌体研磨后，取50mg干重菌丝，加入2mL4mol/L盐酸。
⑷80℃水浴0.5小时，-80℃15分钟。重复一次。80℃水浴0.5小时。
⑸冷却至室温，加入1mL甲醇，混匀。
⑹加入1mL氯仿，震荡10分钟。6000g离心3分钟。收集氯仿。
⑺重复⑹两次。
⑻合并氯仿（3mL），加入1mL饱和氯化钠，混匀，3000g离心3分钟。收集氯仿层于新瓶。剩余液体加入1mL氯仿，3000g离心3分钟。合并氯仿（4mL）。
⑼氮吹干燥，加入1mL乙醚，转移至洁净的已经称重的瓶中。氮吹干燥。
脂肪酸组成及含量的测定方法：①分别向上述粗脂中分别加入100μL2.02μg/μL内标C15:0和1mL10%的盐酸甲醇，60℃水浴保温3h；②冷却至室温后加入1mL正己烷和1mL饱和NaCl溶液，震荡混匀，3000rpm离心3min，吸出正己烷层,再加入1mL正己烷，震荡混匀，3000rpm离心3min，吸出并合并正己烷；③37℃氮气吹干后，加入1mL正己烷，混匀，转入气相瓶，得到脂肪酸甲酯溶液；④脂肪酸甲酯分析采用GC-2010（Shimadzu Co.，Japan），色谱柱为DB-Waxetr（30m×0.32mm，0.22m）。氢火焰离子检测器检测，汽化室和检测器温度分别为240℃和260℃，分流方式进样1L，分流比10:1，载气为氮气。程序升温：初始温度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以4℃/min升到220℃，保持20min。通过与商业化的脂肪酸甲酯标准品（37种脂肪酸甲酯混标，Supelco，USA）和加入内标C15:0的质量比较，定性、定量分析样品中脂肪酸组分，其中总脂肪酸含量用单位菌体中总脂肪酸的质量表示。
表1是高山被孢霉野生型菌株与三株基因工程菌株脂肪酸产量的比较，表2是高山被孢霉野生型菌株与三株基因工程菌株脂肪组的比较。由表1和表2的结果可以看出三株基因工程菌株与对照菌株生物量和产脂率均无明显差异，但EPA产量有显著提高，其中MA-ω3Des-1EPA占总脂肪酸的比例由野生型的0.80%提高到5.80%，EPA的产量由18.76mg/L提高到137.80mg/L，提高了6倍。
表1高山被孢霉野生型菌株与三株基因工程菌株脂肪酸产量比较
表2高山被孢霉野生型菌株与三株基因工程菌株脂肪组比较
实施例6：阳性转化子中ω3脱饱和基因（FADS15）转录水平的RT-qPCR检测
根据ω3脱饱和基因（FADS15）序列和内参18SrDNA序列设计引物：
ω3DesRTF：ATGCGATCCCAGCCCACCTC
ω3DesRTR：GGCGATAGTGACCAGATCCT
18SRTF：CGTACTACCGATTGAATGGCTTAG
18SRTR：CCTACGGAAACCTTGTTACGACT
高山被孢霉总RNA提取:
⑴取出适量在液氮中冻存的菌体于无菌无酶研钵中充分研磨。
⑵加入TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)试剂1mL继续研磨后室温放置至溶解。
⑶吸取1mL⑵中液体于无酶离心管中，加入200μL三氯甲烷混均。
⑷12000rpm，4℃，离心15min吸上清于新的无酶离心管中。
⑸加入等体积异丙醇，静置15min，12000rpm，4℃，离心15min。
⑹无酶枪头吸取去出异丙醇尽量吸干。
⑺沉淀用70%乙醇洗一次，12000rpm，4℃，离心15min。
⑻无酶水溶解总RNA，-80℃储存。
⑼浓度测定：取2μL总RNA于离心管中Nanodrop2000测定浓度。
⑽跑胶：取1μg总RNA跑1.2%琼脂糖电泳检测总RNA完整性。
取0.5-1μg总RNA为模板，根据PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa,Otsu,Shiga,Japan)试剂盒说明进行操作，获得重组菌株的cDNA。使用ABI-Prism7900sequencedetection system(Applied Biosystems,CA)按照SYBRGreen PCR Master Mix(AppliedBiosystems,CA)的说明进行RT-qPCR反应。反应体系为：10μl SYBR Green PCR MasterMix，两种引物各0.5μl，8μl无酶水，1μl模板。PCR循环设置为50℃2min，95℃10min，40个循环。18SrRNA作为内参基因。所有样品测三个重复。结果如图3所示。M.alpina为野生型对照；MA-ω3Des-1，MA-ω3Des-2，MA-ω3Des-3为重组菌株，3株基因工程菌ω3脱饱和基因（FADS15）的转录量均明显高于对照菌株，提高7倍。这说明使用农杆菌介导的方法过表达ω3脱饱和酶基因（FADS15），能够明显提高ω3脱饱和酶基因（FADS15）的转录和表达。
结果表明，通过本实验的方法获得的高山被孢霉过表达ω3脱饱和酶基因（FADS15）工程菌株具有多次传代的遗传稳定性，且脂肪酸组成分析结果与野生型菌株无明显差别。所得到的基因工程菌株中EPA产量均有明显提高，其中菌株MA-ω3Des-1（CGMCCNo.8791）中EPA含量达到脂肪酸总量的5.8%，相比于野生型菌株EPA产量提高6倍。用此方法构建的基因工程菌株及构建方法为后续工业化奠定了理论及应用基础。
虽然本发明专利已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明。任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种改动与修饰。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种过表达ω3脱饱和酶基因的高山被孢霉Mortierell.alpina MA-ω3Des-1，该基因工程菌株于2014年02月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.8791；
所述菌株是选用高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株MAU1CCFM501为材料构建而成；
所述菌株含有来源于Mortierell.alpina ATCC#32222的ω3脱饱和酶基因FADS15。
2.一种构建过表达ω3脱饱和酶基因的高山被孢霉Mortierell.alpina基因工程菌株的方法，该方法包括如下步骤：
(1)克隆来源于M.alpina ATCC#32222的ω3脱饱和酶基因FADS15，并通过基因工程技术将该基因插入pBIG2-ura5s-ITs质粒中，构建二元表达载体pBIG2-ura5s-FADS15；
(2)用构建的二元表达载体转化根癌农杆菌，得到含pBIG2-ura5s-FADS15质粒的根癌农杆菌；
(3)用该菌转化高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株MAU1CCFM501，获得过表达ω3脱饱和酶基因FADS15的高山被孢霉M.alpina。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述转化的根癌农杆菌是Agrobacteriumtumefaciens C58C1。
4.利用权利要求1所述基因工程菌株生产EPA的方法，包括以下步骤：
(1)发酵种子培养：取500μL所述基因工程菌株的孢子液107个/mL，接种于250mL锥形瓶含种子培养基50mL中，28℃，200r/min摇床培养36h，将湿菌体称重加4倍体积的种子培养基用分散器打散，1％接种量接种于250mL三角锥形瓶装液量为种子培养基50mL中，28℃，200r/min摇床培养36h，之后重复此步骤1％接种量接种于3瓶500mL三角锥形瓶装液量为种子培养基100mL，28℃，200r/min摇床培养36h，作为发酵用菌种；
(2)摇瓶发酵培养：分散机打散发酵用菌体后，按1％的接种量接种到500mL锥形瓶装液量为发酵培养基200mL中，28℃培养2天，12℃培养10天，200r/min摇床培养；
(3)收集菌体并提取脂肪酸：收集的菌体冻干研磨后，采用反复冻融破壁的方式，用有机溶剂提取脂肪酸，气相检测分析脂肪酸组成及含量。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述提取脂肪酸的步骤包括以下操作：
①收集菌体，冷冻干燥，并称重，计算生物量；
②菌体研磨后，取50mg干重菌丝，加入2mL 4mol/L盐酸；
③80℃水浴0.5小时，-80℃15分钟，重复一次，80℃水浴0.5小时；
④冷却至室温，加入1mL甲醇，混匀；
⑤加入1mL氯仿，震荡10分钟，6000g离心3分钟，收集氯仿；
⑥重复⑤两次；
⑦合并氯仿3mL，加入1mL饱和氯化钠，混匀，3000g离心3分钟，收集氯仿层于新瓶，剩余液体加入1mL氯仿，3000g离心3分钟，合并氯仿4mL；
⑧氮吹干燥，加入1mL乙醚，转移至洁净的已经称重的瓶中，氮吹干燥。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述种子培养基和发酵培养基的配方一致，其组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，1g/L KH2PO4，0.25g/L MgSO4·7H2O，10g/L KNO3，pH6.8。
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