CN105296368B - 一株异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株、其构建方法及其在生产EPA中的应用 - Google Patents
一株异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株、其构建方法及其在生产EPA中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105296368B CN105296368B CN201510908895.3A CN201510908895A CN105296368B CN 105296368 B CN105296368 B CN 105296368B CN 201510908895 A CN201510908895 A CN 201510908895A CN 105296368 B CN105296368 B CN 105296368B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mpfads6
- gene
- strain
- mortierella
- mortierella alpina
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明通过来自细小微胞藻中的delta‑6脱饱和酶基因MpFADS6，提供了异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株M.alpina‑MpFADS6，本发明还提供了所述重组高山被孢霉菌株在生产EPA的用途，并通过添加1％牡丹籽油或50g/L牡丹籽粕汁的培养基中有效提高EPA产量，对产油真菌高山被孢霉的脂肪酸合成中的代谢调控基础理论研究及PUFAs的生产具有重要的意义。本发明与在高山被孢霉中过表达ω3脂肪酸脱饱和酶基因相比，EPA产量提升5倍，产量可达588.5±29.6mg/L。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，本发明涉及一株异源表达MpFADS6基因的高山被孢霉工程菌株，特别是异源表达细小微胞藻CCMP1545来源的MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株，还涉及其构建方法，以及在生产EPA中的用途。
背景技术
二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA,20:5Δ5,8,11,14,17)是一种常见的ω-3族多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFAs)。EPA等PUFAs具有抗癌、抗动脉粥样硬化、增强机体免疫力等生理功能，对维持身体健康有重要的意义。多不饱和脂肪酸的膳食补充已经明确写入美国、英国等的膳食参考指南，我国也在膳食宝塔中推荐摄入一定量的富含多不饱和脂肪酸的油脂类和奶类食品。但是，目前我国居民膳食中仍存在脂肪酸摄入不足和脂肪酸组成比例不均衡等问题。当前人们膳食油脂的主要来源是植物油脂和动物油脂，但大多数植物油脂和动物油脂ω-3PUFAs的含量很低，ω-6/ω-3比例超过10:1，大大高于最佳比例1:1。
微生物是PUFAs的主要来源之一，但绝大多数微生物合成的PUFAs以ω-6脂肪酸为主，只有少数的微生物能大量合成ω-3系列脂肪酸。例如，在一些海洋微生物中，EPA的产量要明显高于ω-6PUFAs的产量。细小微胞藻(Micromonas pusilla)CCMP1545是生产EPA的代表菌株，并且它的FADS6对ALA的转化率可达63％，而它对LA的转化率仅为4.9％。因此，细小微胞藻主要是通过ω-3脂肪酸合成途径来生产EPA的。而MpFADS6是细小微胞藻合成EPA的关键酶。
高山被孢霉(Mortierella alpina)是一种高产ω-6PUFAs的丝状真菌，脂肪酸可以积累达到细胞干重的50％，其生产的花生四烯酸(arachidonic acid[AA,20:4Δ5,8,11,14])的产量可达总脂的40～50％。作为食品级的工业产油微生物，它已经通过美国农业部(FDA)的安全性评估，是迄今为止生产PUFAs微生物中唯一具有正式安全性评估(GRAS)的菌种，同时也是脂质生物化学基础研究的重要模式菌，其产品已经成为婴幼儿奶粉的重要添加成分。但高山被孢霉产出的脂肪酸中EPA含量甚少，为了获得更高的EPA含量，现有技术通过基因工程手段提高高山被孢霉中的EPA含量。
其中，现有技术中对于改造高山被孢霉脂肪酸代谢途径的研究鲜有报道，且多局限于通过过表达ω-3脱饱和酶基因从而消耗ω-6族脂肪酸合成途径中的AA来提高EPA的产量。例如黄小云等人通过克隆高山被孢霉Mortierella alpina ATCC 32222菌株中的ω3脱饱和酶基因(ω3Des)，进一步在M.alpina尿嘧啶营养缺陷型菌株MAU1(CCFM501，CGMCCNo.8414)中实现过量表达，得到了EPA产量提高了6倍的基因工程菌株，其内容已经在申请号为CN 201410087487.1的中国专利申请中公开。Jang等人报道指出12℃发酵培养5天后，高山被孢霉能利用每克碳源生产4.3mg的EPA。Bajpai等人通过向培养基中添加2％亚麻籽油，在11℃下培养10天，高山被孢霉能生产435mg/L EPA，达到总脂肪酸含量的5.1％。逐步向培养基中添加亚麻籽油含量到4％时，EPA产量由43mg/L提高到596mg/L。2009年，Ando等采用农杆菌介导的方法，在高山被孢霉1S-4过表达ω3脂肪酸脱饱和酶基因，EPA的产量由5％提高到40％。可见，为了提高高山被孢霉的EPA产量，现有技术主要采用的思路是通过消耗AA而提高EPA产量，而通过ω3途径(ALA→EPA)改变高山被孢霉脂肪酸合成途径、通过消耗ALA而提高EPA产量的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，通过过表达FADS6基因、改变高山被孢霉脂肪酸合成途径来提高EPA产率。
本发明的思路是通过中国专利申请CN 201310347934.8公开的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株MAU1为宿主菌株，以CN 201310524221.4中公开的高山被孢霉重组基因表达系统为基础，通过根癌农杆菌(即根癌土壤杆菌)介导的方法异源表达来源于细小微胞藻CCMP1545的FADS6基因，使得重组菌株通过ω3途径生物合成EPA。
为了实现上述目的，本发明提供了一株异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉(Mortierella alpina)MpFADS6，该菌株于2015年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.11002。
其中，MpFADS6(GenBank编号为KU236373)基因来自细小微胞藻CCMP1545。
重组高山被孢霉MpFADS6的构建方法包括：
a)以含有MpFADS6基因的质粒PUC-MpFADS6为模板，利用PCR扩增获取MpFADS6基因；其中，
b)构建重组质粒pBIG2-ura5s-MpFADS6；
c)用重组质粒pBIG2-ura5s-MpFADS6转化根癌农杆菌，得到含重组质粒pBIG2-ura5s-MpFADS6的根癌农杆菌；
d)用经过转化的根癌农杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株；
e)筛选鉴定转化菌株，获得异源表达MpFADS6的重组高山被孢霉。
其中，步骤a)中扩增MpFADS6基因的引物序列如下：
P1(sense)：5’-TACCGGAATTCATGTGCCCGCCGAAGACGGACGGC-3’
P2(antisense)：5’-TCTAGCCCGGGTCAGTGCGCCTTCTCCGCCTTGCC-3’
步骤b)中，利用高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs构建重组质粒pBIG2-ura5s-MpFADS6。通用载体pBIG2-ura5s-Its是根据CN 201310524221.4中公开的高山被孢霉重组基因表达系统获得的。
步骤c)中所使用的根癌农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1。
步骤d)的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是高山被孢霉尿MAU1，该菌株公开于中国专利申请CN 201310347934.8。
另一方面，本发明还涉及重组高山被孢霉菌株在生产EPA中的应用，包括：
a)摇瓶种子培养：取500μL重组高山被孢霉菌株的孢子液(107个/mL)，接种于250mL锥形瓶(含种子培养基50mL)中，28℃，200r/min摇床培养36h，将湿菌体称重加4倍体积的种子培养基用分散器打散，作为发酵用菌种；
b)摇瓶发酵培养：分散机打散发酵用菌体后，按1％的接种量接种到250mL锥形瓶(含发酵培养基50mL)中，28℃200rpm/min摇床培养7天或28℃200rpm/min培养3天再12℃培养8天；
c)收集菌体并提取脂肪酸：真空抽滤收集菌体，水洗三次，冻干研磨后，采用反复冻融破壁的方式，用有机溶剂提取脂肪酸，气相检测分析脂肪酸组成及含量。
上述方法中，提取脂肪酸的具体操作方法如下：
①收集菌体，冷冻干燥，并称重，计算生物量。
②菌体研磨后，取50mg干重菌粉，加入2mL 6mol/L盐酸。
③80℃水浴3小时，其间在-80℃和80℃反复冻融3次，并漩涡振荡数次。
④冷却至室温，加入100μL 15:0和100μL 19:0内标，加入1mL甲醇，混匀。
⑤加入2mL氯仿，漩涡震荡20分钟。4000r/min离心2分钟。收集氯仿层。
⑥氮气吹干。
⑦加入2ml 10％盐酸-甲醇溶液，于60℃水浴3小时。
⑧加入1mL饱和氯化钠和2ml正己烷，混匀，4000g离心2分钟。收集正己烷层于新瓶。
⑨加入50mg无水硫酸钠，混匀，4000g离心3min，取1ml于气相样品瓶。
其中，种子培养基组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，1g/LKH2PO4，0.25g/LMgSO4·7H2O，10g/L KNO3，pH 6.8；
发酵培养基成分：葡萄糖50g/L，1％牡丹籽油(PSO)和0.5％Tween80或以50g/L牡丹籽粕汁(PSM)替代牡丹籽油和Tween 80，KNO313.3g/L，KH2PO43g/L，Na2SO41g/L，MgCl2·6H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O0.5g/L，pH 6.0，115℃灭菌20min。
其中，牡丹籽粕汁由以下方法得到：取200g牡丹籽粕，粉碎过筛后置于4L水中煮沸，沉淀，用4层纱布过滤，得到牡丹籽粕汁。
本发明还提供牡丹籽油或籽粕提取物在制备高山被孢霉产不饱和脂肪酸的发酵培养基中的应用。
特别地，本发明提供一种含有牡丹籽油的发酵培养基，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖50g/L，1vol‰牡丹籽油PSO、0.5vol％Tween 80，KNO313.3g/L，KH2PO43g/L，Na2SO41g/L，MgCl2·6H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L，pH 6.0，115℃灭菌20min。
本发明还提供一种含有牡丹籽粕提取物的发酵培养基，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖50g/L，50g/L牡丹籽粕提取物(PSM)，KNO313.3g/L，KH2PO43g/L，Na2SO41g/L，MgCl2·6H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O0.5g/L，pH 6.0，115℃灭菌20min。
在本发明中，牡丹籽油(PSO)和牡丹籽粕均为市场上购买获得产品，例如购自山东远方集团公司的牡丹籽油和牡丹籽粕。
本发明以CN 201310347934.8中公开的高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株MAU1(也被命名为CCFM501)作为转化菌株，以CN 201310524221.4中公开的M.alpina重组基因表达系统为基础，在其基础上通过根癌农杆菌介导，得到异源表达细小微胞藻CCMP1545来源的FADS6基因的重组高山被孢霉菌株。
本发明以高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株MAU1(也被命名为CCFM501)为研究对象，通过异源表达策略获得了高山被孢霉表达MpFADS6基因的工程菌株，该菌株具有较高的合成EPA的能力，能够有效催化转化ALA为EPA，EPA产量最高达到588.5.4±29.6mg/L，为该基因工程菌株工业化合成EPA提供基础。
本发明所涉及的根癌农杆菌为：Agrobacterium tumefaciens C58C1(Tsuji G,Fujii S,Fujihara N,et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformationfor random insertional mutagenesis in Colletotrichum lagenarium[J].Journal ofGeneral Plant Pathology,2003,69(4):230-239.)为公开获得。
本发明所涉及的IM培养基，其组成为：1.74g/L K2HPO4，1.37g/L KH2PO4，0.146g/LNaCl，0.49g/L MgSO4·7H2O，0.078g/L CaCl2，0.0025g/L FeSO4·7H2O，0.53g/L(NH4)2SO4，7.8g/L MES，1.8g/L葡萄糖，0.5％甘油，200μM乙酰丁香酮(AS)，pH 6.8。其固体培养基需添加20g/L琼脂。
本发明所涉及的MM培养基，其组成为：1.74g/L K2HPO4，1.37g/L KH2PO4，0.146g/LNaCl，0.49g/L MgSO4·7H2O，0.078g/L CaCl2，0.0025g/L FeSO4·7H2O，0.53g/L(NH4)2SO4，7.8g/L MES，1.8g/L葡萄糖，0.5％甘油。其固体培养基需添加20g/L琼脂。
本发明所涉及的SC固体培养基，其组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母氮源无氨基酸和硫酸铵，1.7g/L硫酸铵，60mg/L异亮氨酸，60mg/L亮氨酸，60mg/L苯丙氨酸，50mg/L苏氨酸，40mg/L赖氨酸，30mg/L酪氨酸，20mg/L腺嘌呤，20mg/L精氨酸，20mg/L组氨酸，10mg/L甲硫氨酸，20g/L琼脂，pH 6.8。
SC-CS是添加了壮观霉素(spectinomycin)头孢噻肟(CefotaximeSodium)抗生素的SC固体培养基。
本发明所涉及的GY固体培养基，其组成为：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/LKNO3，1g/L NaH2PO4，3g/L MgSO4·7H2O，20g/L琼脂，pH 6.8。
GY-CS是添加了壮观霉素(spectinomycin)头孢噻肟(CefotaximeSodium)抗生素的GY固体培养基。
本发明的优点在于：在已知的高山被孢霉转化系统的基础上，采用根癌农杆菌介导的基因转化方法，构建了在M.alpina中表达细小微胞藻CCMP1545来源的FADS6基因的工程菌株，其生长特性和脂肪酸组成分析结果与原养型菌株无明显差别，但在转化EPA时偏好于ω3脂肪酸合成途径、以ALA为底物转化为EPA以提高产量，EPA产量最高达到588.5.4±29.6mg/L，这为该基因工程菌株工业化合成EPA提供了基础。
本发明的高山被孢霉(Mortierella alpina)MpFADS6于2015年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.11002。
附图说明
图1为构建二元表达载体pBIG2-ura5s-MpFADS6的示意图；
图2为异源表达细小微胞藻CCMP1545来源的MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。左图：M为marker；泳道1为高山被孢霉野生型对照菌株，泳道2和3为pBIG2-ura5s-MpFADS6转化的重组菌株；泳道4为阴性对照。右图：M为marker；泳道1和2为pBIG2-ura5s-MpFADS6转化的重组菌株，泳道3和4为高山被孢霉野生型对照菌；
图3为重组高山被孢霉菌株中MpFADS6基因的相对表达水平。
图4为重组高山被孢霉菌株在5L发酵罐中(含4L发酵培养基)培养7天的生长情况。其中a为生物量，b为总脂肪酸含量，c为AA含量，d为ALA含量，e为EPA含量，f为培养基残糖，g为培养基残氮，h为溶氧曲线。除溶氧曲线外每组试验重复三次。
具体实施方式
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。在本发明中，如无特别说明，“％”均为重量百分比。
实施例1：细小微胞藻CCMP1545来源的FADS6基因(MpFADS6)的人工合成
根据细小微胞藻CCMP1545来源的MpFADS6基因的序列信息(GenBank编号为KU236373)，设计引物P1、P2，下划线分别为酶切位点EcoRI和Sma I，以含有MpFADS6基因的质粒PUC-MpFADS6为模板(上海桑尼生物技术有限公司合成)，P1/P2为引物，使用KOD高保真聚合酶通过PCR得到MpFADS6片段。PCR程序为：94℃40s，55℃40s，68℃1.5min，30个循环，并对PCR扩增产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离后回收。
P1(sense)：5’-TACCGGAATTCATGTGCCCGCCGAAGACGGACGGC-3’
P2(antisense)：5’-TCTAGCCCGGGTCAGTGCGCCTTCTCCGCCTTGCC-3’
实施例2：二元表达载体pBIG2-ura5s-MpFADS6的构建
1.酶切反应
在37℃条件下，用限制性内切酶EcoRI和Sma I酶切MpFADS6片段和载体pBIG2-ura5s-ITs片段，产物纯化回收MpFADS6片段，切胶纯化回收pBIG2-ura5s片段。酶切体系(50μL)为：1μLEcoRI(货号FD0275)，1μLSmaI(货号FD0663)，40μL质粒或PCR产物，5μL 10XBuffer(Fermentas公司)，3μL去离子水，37℃孵育2h。
2.连接反应
使用T4连接酶将酶切后的MpFADS6片段MpFADS6和载体pBIG2-ura5s连接，4℃孵育12h，得到重组表达载体pBIG2-ura5s-MpFADS6。连接体系为(10μL)：5μL目的基因酶切后片段，3μL载体酶切后片段，1μL 10X连接酶Buffer，1μL T4连接酶，4℃孵育12小时。
连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化方法如下：
1)无菌状态下取100μL感受态细胞，加入5μL连接产物，混匀。
2)将上述步骤中的感受态细胞移入电转杯中，避免产生气泡。
3)将电转杯放入Bio-Rad电转仪，调到合适预设程序档位，根据仪器使用操作说明进行电转化。
4)将转化后的感受态细胞移至含有900μL复苏培养基的离心管中，37℃，150rpm孵育1小时。
5)取200μL涂布含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板。倒置37℃培养过夜。
挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得二元表达载体pBIG2-ura5s-MpFADS6。
电击法转化根癌农杆菌C58C1感受态细胞，方法同上电击法对大肠杆菌Top10的转化。
其中，SOC复苏培养基是以组分20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，0.5g/L NaCl，0.2g/LKCl，1g/L MgCl2，20mM葡萄糖构成。
YEP固体培养基是以组分10g/L胰蛋白胨，10g/L酵母粉，5g/L NaCl，20g/L琼脂构成的。
LB固体培养基是以组分胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L构成的。
二元表达载体pBIG2-ura5s-MpFADS6构建的示意图如图1所示。
实施例3：根癌农杆菌介导转化高山被孢霉菌株MAU1(CCFM501，即CGMCC No.8414)
在已有的国内外文献有关根癌农杆菌转化方法报道的基础上，进行了适当的优化，具体如下：
1)将保存于-80℃的含pBIG2-ura5s-MpFADS6质粒的根癌农杆菌C58C1分别划线于含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板。28℃倒置避光培养48小时。
2)挑取单克隆接种至15mL含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的液体YEP培养基中28℃，200rpm避光培养36小时。
3)8000g离心5分钟收集菌体，倒掉上清。加5mL IM培养基重悬菌体，8000g离心5分钟，倒掉上清。加2mL IM培养基重悬菌体。
4)用IM培养基调整菌浓度至OD600为0.3。28℃，200rpm避光培养至OD600为1.0。
5)收集在斜面中培养4周以上的高山被孢霉CCFM501(申请号为201310347934.8的专利申请中公开的M.alpina尿嘧啶营养缺陷型菌株，即CGMCC No.8414)孢子，用血球计数器计数，调整孢子浓度到106个每100μL。
6)取100μL含pBIG2-ura5s-MpFADS6质粒的根癌农杆菌与100μL孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸的IM固体培养基上。23℃避光培养36小时。
7)将玻璃纸转移到含有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢噻肟的SC-CS平板上(壮观霉素和头孢噻肟可抑制根癌农杆菌的生长)。18℃避光过夜培养，随后转移至25℃避光培养。
8)持续观察平板生中菌落生长情况。如出现明显菌落长出，及时用尖头镊子挖取菌落外沿(大约2mm2)，接种于SC-CS平板上，28℃培养。
9)待SC-CS平板上的转化子长出菌落后，于SC-CS平板反复转接三次，排除阴性转化子。
10)阳性转化子接种于GY平板，28℃培养至产生大量孢子，分别于4℃和-80℃保藏。
其中，MM培养基成分是以组分1.74g/L K2HPO4，1.37g/L KH2PO4，0.146g/L NaCl，0.49g/L MgSO4·7H2O，0.078g/L CaCl2，0.0025g/L FeSO4·7H2O，0.53g/L(NH4)2SO4，7.8g/LMES，1.8g/L葡萄糖，0.5％甘油构成的。
IM培养基是在MM培养基的基础上添加200μM乙酰丁香酮(AS)构成的。
SC培养基是以组分5g/L酵母氮源无氨基酸和硫酸铵，1.7g/L(NH4)2SO4，20g/L葡萄糖，20mg/L腺嘌呤，30mg/L络氨酸，1mg/L甲硫氨酸，2mg/L组氨酸，4mg/L赖氨酸，4mg/L色氨酸，5mg/L苏氨酸，6mg/L异亮氨酸，6mg/L亮氨酸，6mg/L苯丙氨酸，2mg/L精氨酸为组分构成的。
GY固体培养基是以组分20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L KNO3，1g/LNaH2PO4，3g/L MgSO4·7H2O，20g/L琼脂构成的。
实施例4：高山被孢霉异源表达MpFADS6基因的工程菌株的筛选和鉴定
高山被孢霉异源表达MpFADS6工程菌株的筛选和鉴定方法包括以下步骤：
1)3mL无菌生理盐水冲刷GY平皿表面，收集孢子液于一个无菌1.5mL离心管中，过25μm滤膜。
2)稀释三个浓度梯度，分别取150μL涂布于含有100μg/mL壮观霉素，100μg/mL头孢噻肟的GY-CS平板上。25℃培养2-3天。
3)用无菌镊子挑出生长的真菌菌丝于SC-CS平板上，25℃培养2-3天。
4)观察高山被孢霉平板上的生长情况。挑出在SC-CS平板上生长的菌丝于GY斜面上。
5)将上述步骤中斜面上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上传代三次。
6)将稳定遗传的菌株鉴定为高山被孢霉异源表达MpFADS6的基因工程菌株，保藏于GY斜面上。
7)提取含有MpFADS6基因的高山被孢霉重组菌基因组。设计一对与启动子和终止子特异性结合的引物进行PCR验证：
P3(sense)：CACACACAAACCTCTCTGTGAGGAC
P4(antisense)：CAAATGAACGTATCTTATCGTGGAGG
重组菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳分析结果见图2。
左图：M为marker；泳道1为高山被孢霉野生型对照菌株。泳道2和3为pBIG2-ura5s-MpFADS6转化的重组菌株；产物条带包含ura5表达单元(818bp)和MpFADS6(1571bp)两个表达单元，泳道4为阴性对照，电泳结果说明二元表达载体成功插入到高山被孢霉基因组中。右图：M为marker；泳道1和2为pBIG2-ura5s-MpFADS6转化的重组菌株，产物条带为MpFADS6基因(1392bp)，泳道3和4为高山被孢霉野生型对照菌；
8)重组菌株保藏于GY斜面上。
实施例5：阳性转化子中MpFADS6基因的相对表达水平检测
阳性转化子中MpFADS6基因的转录水平检测方法包括以下步骤：
1)取500μL重组高山被孢霉菌株的孢子液(107个/mL)，接种于250mL锥形瓶(含种子培养基50mL)中，28℃，200r/min摇床培养36h，将湿菌体称重加4倍体积的种子培养基用分散器打散，按1％的接种量接种到250mL锥形瓶(含发酵培养基50mL)中，28℃以200rpm/min转速培养7天。
2)收集菌体并提取RNA。具体步骤为①取出适量在液氮中冻存的菌体于无菌无酶研钵中利用液氮充分研磨；②加入1mL TRIzol试剂充分研磨后室温放置至溶解；③将上述混合物吸入无酶EP管，每管1mL，加入200μL三氯甲烷混匀，7500×g，4℃，离心15min，④吸取上清于新的无酶离心管中，加入等体积异丙醇，室温静置15min，10000×g，4℃，离心15min；⑥吸除异丙醇，尽量吸干；⑦用1mL 75vol％的乙醇洗一次，10000×g，4℃，离心15min；⑧DEPC水溶解，-80℃储存。取2μL提取好的RNA，用NanoDrop2000测定浓度并进行琼脂糖凝胶电泳分析。
3)利用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit(Takara)试剂盒，将总RNA反转录得到cDNA。具体步骤为①将引物、dNTP与RNA模板预混，置于65℃水浴5min，之后立即放于冰上。取10μL预混体系、4μL 5×PrimeScript Buffer、0.5μL Rnase Inhibitor(40U/μL)、1μL PrimeScript Rtase(200U/μL)、Rnase free dH2O补足至20μL。轻轻混匀后，42℃孵育60min；95℃孵育5min终止反应。取2μL于NanoDrop2000测定浓度并进行凝胶电泳检测。
4)荧光定量PCR采用CFX connect Real-Time Systerm(Bio-Rad),20μL体系如下：8μL无酶水，10μL SYBR Green PCR Master Mix，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，1μL模板。RT-qPCR程序为：50℃保持2min；95℃保持10min；进行40个循环：95℃，15s；60℃，30s。无菌水为阴性对照，选择高山被胞霉的18S rRNA基因为内参，实验进行3个平行。根据2-ΔΔCt法计算基因的相对转录水平和倍数变化，其中ΔΔCt＝ΔCt(样品)-ΔCt(对照)。
重组高山被孢霉菌株中MpFADS6基因的相对表达水平结果见图3。MpFADS6基因的相对表达水平是野生型高山被胞霉中FADS6基因表达水平的5倍。
实施例6：高山被孢霉异源表达MpFADS6基因的工程菌株的脂肪酸提取与检测
高山被孢霉脂肪酸提取方法包括以下步骤：
1)取500μL重组高山被孢霉菌株的孢子液(107个/mL)，接种于250mL锥形瓶(含种子培养基50mL)中，28℃，200r/min摇床培养36h，将湿菌体称重加4倍体积的种子培养基用分散器打散，按1％的接种量接种到250mL锥形瓶(含发酵培养基50mL)中，28℃以200rpm/min转速培养7天，或28℃200rpm/min培养3天再12℃培养8天。
2)收集菌体，冷冻干燥，并称重，计算生物量。
3)菌体研磨后，取50mg干重菌粉，加入2mL 6mol/L盐酸。
4)80℃水浴3小时，其间在-80℃和80℃反复冻融3次，并漩涡振荡数次。
5)冷却至室温，加入100μL 15:0和100μL 19:0内标，加入1mL甲醇，混匀。
6)加入2mL氯仿，漩涡震荡20分钟。4000r/min离心2分钟。收集氯仿层。
7)氮气吹干。
8)加入2ml 10wt％盐酸-甲醇溶液(即HCl-甲醇溶液)，于60℃水浴3小时。
9)加入1mL饱和氯化钠和2ml正己烷，混匀，4000g离心2分钟。收集正己烷层于新瓶。
10)加入50mg无水硫酸钠，混匀，4000g短时离心，取1ml于气相样品瓶，得到脂肪酸甲酯溶液。
11)脂肪酸甲酯分析采用GC-2010(Shimadzu Co.，Japan)，色谱柱为DB-Waxetr(30m×0.32mm，0.22μm)。氢火焰离子检测器检测，汽化室和检测器温度分别为240℃和260℃，分流方式进样1μL，分流比10:1，载气为氮气。程序升温：初始温度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以4℃/min升到220℃，保持20min。通过与脂肪酸甲酯标准品(37种脂肪酸甲酯混标，Supelco，USA)与内标(C15:0)的质量比较，定性、定量分析样品中脂肪酸组分，其中总脂肪酸含量用单位菌体中总脂肪酸的质量表示。
表1是高山被孢霉野生型菌株与本发明的基因工程菌株脂肪酸组成的比较。
表1高山被孢霉野生型菌株与基因工程菌株脂肪组比较
由表1的结果可以看出，当恒温培养(28℃培养7天)时，本发明的高山被孢霉基因工程菌株与对照菌株产脂率和脂肪酸组成均无明显差异，而在基因工程菌中检测到的EPA产量由12.2mg/L提高到62.2mg/L，是野生型菌株的5倍。当采用更优的变温培养(28℃培养3天再12℃培养8天)时，基因工程菌株与对照菌株的生物量和产脂率略显减少，而在基因工程菌中检测到的EPA产量由22.5mg/L提高到80.1mg/L，是野生型菌株的3.6倍，比恒温培养时分别增加了18mg/L和10mg/L。这说明低温培养时，本发明的高山被孢霉更有利于其EPA的积累，实现进一步提高EPA产量。
实施例7：添加牡丹籽油或牡丹籽粕汁促进基因工程菌合成EPA
牡丹籽油中含有46％的ALA，可以作为MpFADS6的外源底物来提高基因工程菌的EPA含量，而牡丹籽粕中富含供微生物生长的碳源和氮源，其ALA含量占籽粕总质量的2％左右，因此牡丹籽粕既可以作为碳源和氮源供基因工程菌生长，也可以作为外源ALA的底物来源。
1)将高山被孢霉工程菌株M.alpina-MpFADS6以及原养型高山被孢霉菌株接种于产脂培养基中，28℃以200rpm/min转速培养7天或28℃以200rpm/min培养3天再12℃培养8天。
2)经产脂培养基培养后的工程菌的脂肪酸提取与检测参见实例6。
表2添加牡丹籽油或牡丹籽粕汁后高山被孢霉野生型菌株与基因工程菌株脂肪酸组成的比较
由表2的结果可以看出，在外源添加1‰PSO(v/v)时，本发明的基因工程菌株与对照菌株相比，生物量、总脂肪酸含量和AA含量均无明显差异；而在恒温培养和变温培养时，基因工程菌株的EPA含量比对照菌株分别提高了6倍和5倍；而变温培养相比恒温培养，基因工程菌株的EPA提高了47mg/L，显示出本发明的菌株具有突出的EPA产率，其中在变温培养时更为突出。
在外源添加50g/L PSM时，生物量发生明显变化，比外源添加1‰PSO时平均提高2倍，总脂肪酸含量和AA含量也随之提高，而在恒温培养和变温培养时，基因工程菌株的EPA含量比对照菌株分别提高了5.8倍和5.2倍，EPA含量最高达到505.0±41.9mg/L，而变温培养相比恒温培养，EPA分别提高了21mg/L和57mg/L，同样显示出本发明的菌株具有突出的EPA产率，其中在变温培养时更为突出。
另一方面，在相同的培养条件下，与表1的记载相比，外源添加1‰PSO能够显著提高EPA产量，其中对于对照菌株在恒温培养环境下，EPA产量提高了84％，变温培养下提高56％，本发明的工程菌株在恒温培养EPA产量提高65％，而在更优选的变温培养环境下，本发明的工程菌株EPA产量提高125％(由原80.1提到至179.8mg/L)。
外源添加50g/L PSM时变化更为显著，与表1相比，对照菌株在恒温培养环境下，EPA产量提高了613％(由原12.2提到至87.0mg/L)，变温培养下提高383％，本发明的工程菌株在恒温培养EPA产量提高了686％，而在更优选的变温培养环境下，本发明的工程菌株EPA产量提高605％。
可见，牡丹籽油或牡丹籽粕汁具有显著的提高EPA产量的意义。
实施例8：5升罐发酵培养基因工程菌合成EPA
发酵培养基成分：葡萄糖50g/L，50g/L牡丹籽粕汁(PSM)，KNO3 13.3g/L，KH2PO43g/L，Na2SO41g/L，MgCl2·6H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L，pH 6.0，115℃灭菌20min。上述发酵培养基中的牡丹籽粕汁由下法得到：取200g牡丹籽粕，用粉碎机粉碎，过40目筛，将过筛后的牡丹籽粕溶于4L水中煮沸，沉淀，用4层纱布过滤，得到牡丹籽粕汁。
1)将实施例7制备得到的摇瓶菌种按照1％的接种量接入含4升上述发酵培养基的5升发酵罐中，搅拌转数设为500rpm，通入0.5VVM的空气，28℃培养3天再12℃培养8天，最后12℃静置5天，维持pH6.0，以野生型M.alpina为对照组菌株。
2)分别在24h、48h、72h、96h、192h、264h和384h时收集菌体，测定各时间点MpFADS6的生物量、各主要脂肪酸含量、培养基残糖、培养基残氮及发酵过程中溶氧变化。
从图4的结果中可以看出：野生型M.alpina(图4a)和基因工程菌(图4b)的生物量、总脂肪酸含量、AA含量在整个发酵过程中没有明显差异。而随着时间的推移，基因工程菌中ALA含量逐渐下降，且从72h到96h下降最快，在发酵终点时，ALA含量仅为193.8±26.6mg/L(图4b)，而在对照菌株中，ALA含量缓慢降低至405.7±21.2mg/L(图4a)。基因工程菌中EPA含量在0～48h内积累较慢，而48h后积累速度较快，在发酵至384h时，EPA含量为588.5±29.6mg/L，而对照菌中EPA含量虽呈线性增长，但至发酵终点时仅为135.6±16.9mg/L。
随着菌体的生长，碳源呈线性逐渐消耗，而氮源在0～72h内消耗最快，从16.8±1.4g/L下降到1.3±0.9g/L，72h后氮源消耗很慢。在开始发酵的前72h内，发酵液中溶氧含量逐渐下降至60％左右，且与氮源消耗成正比例关系，而发酵温度改为12℃后，溶氧含量显著上升至80％左右，至发酵终点时稳定在90％左右。
综上所述，通过基因工程手段在M.alpina中过表达MpFADS6基因后，通过变温培养在28℃培养3天再12℃培养8天最后12℃静置5天后，EPA产量可达588.5±29.6mg/L。
本发明成功的实现了在高山被孢霉ATCC32222中通过过表达MpFADS6基因来改变其脂肪酸合成途径，从而提高EPA产量。本发明与在高山被孢霉ATCC32222中过表达ω3脂肪酸脱饱和酶基因相比，EPA产量提升5倍。用此方法构建的基因工程菌株及构建方法为后续工业化奠定了理论及应用基础。
虽然本发明专利已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明。任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种改动与修饰。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉在生产EPA中的应用，包括：
1)摇瓶种子培养：取500μL浓度为107个/mL的重组高山被孢霉菌株的孢子液，接种于含种子培养基50mL的250mL锥形瓶中，28℃200r/min摇床培养36h，将湿菌体称重，加入4倍重量的种子培养基用分散器打散，作为发酵用菌种；所述异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉是高山被孢霉(Mortierella alpina)MpFADS6，该菌株于2015年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.11002；
所述种子培养基组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，1g/L KH2PO4，0.25g/LMgSO4·7H2O，10g/L KNO3，pH 6.8；
发酵培养基成分：葡萄糖50g/L，1vol‰牡丹籽油(PSO)和0.5vol％Tween 80或50g/L牡丹籽粕汁(PSM)，KNO313.3g/L，KH2PO43g/L，Na2SO41g/L，MgCl2·6H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O0.5g/L，pH 6.0，115℃灭菌20min；
所述牡丹籽粕汁由以下方法得到：取200g牡丹籽粕，粉碎过筛后置于4L水中煮沸，沉淀，用4层纱布过滤，得到牡丹籽粕；
2)摇瓶发酵培养：发酵用菌种按1wt％的接种量接种到含发酵培养基50mL的250mL锥形瓶中，28℃200rpm/min摇床培养7天，或28℃200rpm/min培养3天再12℃培养8天；
3)收集菌体并提取脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述MpFADS6基因来自细小微胞藻CCMP1545。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述重组高山被孢霉的构建方法包括以下步骤：
a)以含有MpFADS6基因的质粒PUC-MpFADS6为模板，利用PCR扩增获取MpFADS6基因；
b)构建重组质粒pBIG2-ura5s-MpFADS6；
c)用重组质粒pBIG2-ura5s-MpFADS6转化根癌农杆菌，得到含重组质粒pBIG2-ura5s-MpFADS6的根癌农杆菌；
d)用经过转化的根癌农杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株；
e)筛选鉴定转化菌株，获得异源表达MpFADS6的重组高山被孢霉。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤a)中扩增MpFADS6基因的引物序列如下：
P1(sense)：5’-TACCGGAATTCATGTGCCCGCCGAAGACGGACGGC-3’
P2(antisense)：5’-TCTAGCCCGGGTCAGTGCGCCTTCTCCGCCTTGCC-3’。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤b)中，利用高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs构建重组质粒pBIG2-ura5s-MpFADS6。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤c)中所使用的根癌农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在步骤d)的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是高山被孢霉尿MAU1，该菌株于2013年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.8414。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤e)中筛选鉴定转化菌株的方法包括以下步骤：
1)取5mL无菌生理盐水冲刷GY平皿表面，收集孢子液，过25μm滤膜；
2)稀释获得三个浓度梯度108/L、107/L、106/L的孢子液，分别取150μL涂布于含有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢噻肟的GY-CS平板上，25℃培养2-3天；
3)用无菌镊子挑出生长的真菌菌丝于含有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢噻肟的SC-CS平板上，25℃培养2-3天；
4)观察高山被孢霉平板上的生长情况，挑出在所述SC-CS平板上生长的菌丝接种于GY斜面上；
5)将上述步骤4)中GY斜面上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上传代三次；
6)将稳定遗传的菌株鉴定为异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株，保藏于GY斜面上；
7)提取含有MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株的基因组DNA，设计一对与启动子和终止子特异性结合的引物进行PCR验证：
P3(sense)：CACACACAAACCTCTCTGTGAGGAC
P4(antisense)：CAAATGAACGTATCTTATCGTGGAGG；
8)所述重组菌株保藏于GY斜面上。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510908895.3A CN105296368B (zh) | 2015-12-10 | 2015-12-10 | 一株异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株、其构建方法及其在生产EPA中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510908895.3A CN105296368B (zh) | 2015-12-10 | 2015-12-10 | 一株异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株、其构建方法及其在生产EPA中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105296368A CN105296368A (zh) | 2016-02-03 |
| CN105296368B true CN105296368B (zh) | 2019-01-18 |
Family
ID=55194205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510908895.3A Active CN105296368B (zh) | 2015-12-10 | 2015-12-10 | 一株异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株、其构建方法及其在生产EPA中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105296368B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105861339B (zh) * | 2016-06-16 | 2019-10-18 | 江南大学 | 一株过表达gtp 环式水解酶基因的重组高山被孢霉、其构建方法及应用 |
| CN106754436B (zh) * | 2017-01-13 | 2023-07-04 | 江南大学 | 高山被孢霉ccfm698菌体的制备及其在饲料添加剂中的应用 |
| CN108384798B (zh) * | 2018-02-13 | 2020-12-29 | 江南大学 | 一种利用根癌农杆菌转化高山被孢霉菌丝的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103571762A (zh) * | 2013-10-30 | 2014-02-12 | 江南大学 | 一种高山被孢霉重组基因表达系统及其构建方法和应用 |
| CN103820335A (zh) * | 2014-03-11 | 2014-05-28 | 江南大学 | 一种过表达ω3脱饱和酶基因的高山被孢霉基因工程菌株及其构建方法 |
-
2015
- 2015-12-10 CN CN201510908895.3A patent/CN105296368B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103571762A (zh) * | 2013-10-30 | 2014-02-12 | 江南大学 | 一种高山被孢霉重组基因表达系统及其构建方法和应用 |
| CN103820335A (zh) * | 2014-03-11 | 2014-05-28 | 江南大学 | 一种过表达ω3脱饱和酶基因的高山被孢霉基因工程菌株及其构建方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Molecular Mechanism of Substrate Specificity for Delta 6 Desaturase from Mortierella alpina and Micromonas pusilla;Haisu Shi et al;《Journal of Lipid Research》;20151020;1-30 * |
| 不同地区凤丹经济性状及其籽油脂肪酸成分分析;李晓青等;《粮食与油脂》;20141231;第27卷(第4期);43-46 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105296368A (zh) | 2016-02-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Production potential of Chlorella zofingienesis as a feedstock for biodiesel | |
| CN103820335B (zh) | 一种过表达ω3脱饱和酶基因的高山被孢霉基因工程菌株及其构建方法 | |
| CN104974944B (zh) | 一种产dha的裂殖壶菌基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN103025862B (zh) | 新型破囊壶菌类微藻及用其生产生物油的方法 | |
| CN103881954B (zh) | 一株产γ-聚谷氨酸基因工程菌及其高产γ-聚谷氨酸方法 | |
| CN107709540A (zh) | 新型库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种ng7及其用途 | |
| CN103233036B (zh) | 基于基因工程策略优化耶氏解脂酵母重组菌合成共轭亚油酸 | |
| CN113234610B (zh) | 一种合成角鲨烯的酿酒酵母菌株及其应用 | |
| CN105296368B (zh) | 一株异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株、其构建方法及其在生产EPA中的应用 | |
| CN101475914B (zh) | 一种循环利用重组酿酒酵母生产低聚半乳糖的方法 | |
| CN105647822A (zh) | 一株过表达来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶的重组高山被孢霉、其构建方法及应用 | |
| CN101974441A (zh) | 一种α-葡萄糖苷酶基因工程菌及其应用 | |
| CN105567579A (zh) | 一种在高山被孢霉中表达异源ω-3脱饱和酶的重组菌株及其构建方法 | |
| CN107058144A (zh) | 一种产衣康酸的重组酵母菌株及其构建方法与应用 | |
| CN104726477A (zh) | 一种脂肪酶编码基因及其工程菌株 | |
| CN114561434B (zh) | 裂殖壶菌发酵生产epa和dha的方法 | |
| CN101892159A (zh) | 一株衣藻藻株及其应用 | |
| CN103966273B (zh) | 一种双鞭甲藻发酵生产dha的方法 | |
| CN105176848B (zh) | 一株过表达3‑磷酸甘油脱氢酶基因的高山被孢霉、其构建方法及应用 | |
| CN105861339B (zh) | 一株过表达gtp 环式水解酶基因的重组高山被孢霉、其构建方法及应用 | |
| CN113604459B (zh) | 一种磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶及其应用 | |
| CN108841734A (zh) | 一种提高高山被孢霉产不饱和脂肪酸能力的方法 | |
| CN105062906B (zh) | 一种优化有机磷水解酶酵母工程菌及其酶的生产方法 | |
| CN106754448A (zh) | 一种重组酵母菌株及其应用 | |
| CN104630079A (zh) | 一种异源表达亚油酸异构酶基因的重组高山被孢霉菌株及其构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |